Sử dụng kỹ thuật cộng hưởng từ hạt nhân phân tích nước tiểu hỗ trợ chẩn đoán ung thư đại trực tràng (tóm tắt)

Trong nghiên cứu ung thư phương pháp nghiên cứu mới là phân tích phổ đồ, kết hợp với xử lý thống kê dữ liệu phổ theo nguyên tắc Phân tích tổng thể chất chuyển hóa metabolomics.. Mục tiêu

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VŨ THỊ KIM NGỌC

SỬ DỤNG KỸ THUẬT CỘNG HƯỞNG TỪ HẠT NHÂN PHÂN TÍCH NƯỚC TIỂU HỖ TRỢ CHẨN ĐOÁN

Công trình được hoàn thành tại:

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - HCM

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Phạm Ngọc Sơn PGS.TS Trần Lê Quan

Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Sào Trung

Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Tiến Tài

Phản biện 3: TS Trần thị Như Trang

Phản biện độc lập 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Tài

Phản biện độc lập 2: PGS.TS Hà Thúc Huy

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp nhà nước, họp tại trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – HCM vào lúc giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- 1 Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM

- 2 Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên-HCM

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ung thư đại-trực tràng trở thành một trong ba loại ung thư hàng đầu ở cả nam giới và nữ giới [4] Chẩn đoán phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm là yếu tố cực kỳ quan trọng Phương pháp chẩn đoán ung thư đại-trực tràng phổ biến nhất hiện nay là nội soi đại tràng sigma hoặc nội soi với sinh thiết khối u Đây là cách thức chẩn đoán xâm lấn phức tạp chi phí cao Trong nghiên cứu ung thư phương pháp nghiên cứu mới là phân tích phổ

đồ, kết hợp với xử lý thống kê dữ liệu phổ theo nguyên tắc Phân tích tổng thể chất chuyển hóa (metabolomics) Một số công trình nghiên cứu gần đây cũng sử dụng kỹ thuật NMR tuy nhiên mẫu nghiên cứu là mô hình động vật (chuột) số lượng mẫu rất hạn chế không phù hợp với một kỹ thuật thống kê

2 Mục tiêu đề tài

Luận án được thực hiện với số lượng mẫu lớn và mẫu là nước tiểu của người Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu là: a/ Dựa trên phổ NMR, so sánh bức tranh tổng thể các chất chuyển hóa trong mẫu nước tiểu của nhóm bệnh nhân ung thư đại-trực tràng và nhóm người không bệnh b/ Xác định

sự thay đổi chất chuyển hóa trong nước tiểu bệnh nhân ung thư đại-trực tràng So sánh kết quả với các công trình nghiên cứu tương tự trên thế giới c/ Thiết lập mô hình phân biệt nước tiểu bệnh nhân ung thư đại-trực tràng

so với người không bệnh Mô hình này được đề xuất là một công cụ hỗ trợ chẩn đoán phát hiện sớm ung thư đại-trực tràng theo cách không xâm lấn

3 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Kết quả thu được, ngoài việc cung cấp thêm dữ kiện khoa học về

sự rối loạn chuyển hóa chất trong quá trình tiến triển bệnh ung thư đại-trực tràng còn hy vọng đưa đến một kỹ thuật chẩn đoán mới không xâm lấn nhẹ nhàng cho bệnh nhân nhanh chóng và dễ dàng hơn các kỹ thuật hiện đang áp dụng Về mặt kinh tế có thể kết hợp chẩn đoán đồng thời nhiều

loại bệnh cùng với chẩn đoán ung thư đại tràng chỉ trong một lần phân tích mẫu nước tiểu giúp tiết kiệm chi phí xét nghiệm Về mặt xã hội phương pháp chẩn đoán mới giúp mọi tầng lớp bệnh nhân đều có cơ hội tầm soát phát hiện sớm bệnh ung thư đại tràng giảm gánh nặng cho gia đình và xã hội về khoản chi phí lớn để điều trị bệnh ung thư

4 Tính mới của đề tài

Đề tài thực hiện theo phương pháp nghiên cứu tổng thể chất chuyển hóa chưa có nghiên cứu tương tự tại Việt nam Đề tài cho thấy khả

năng phát triển kỹ thuật NMR như một kỹ thuật chẩn đoán sàng lọc mới

Mặc khác kết quả luận án này sẽ đóng góp vào thành tựu của các nghiên cứu phân tích tổng thể chất chuyển hóa, đem đến sự thay đổi lớn về cách tiếp cận y tế trong chăm sóc sức khỏe

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

sigma; X quang [4]

1.2 Sinh hóa nước tiểu

Các tính chất hóa lý như: số lượng, màu, mùi, tỷ trọng pH… thay đổi theo điều kiện sinh lý và bệnh lý [1] Thành phần vô cơ của nước tiểu gồm các ion như: Na+, Cl-, Ca+2, NH4

+, Mg+2, PO4

-3, SO4 -2…ít có giá trị xét

nghiệm lâm Thành phần hữu cơ chứa chủ yếu là urea; acid uric, các

xuất ra nước tiểu Khoảng 20-30 chất chuyển hóa thông thường đã được

nghiên cứu định lượng [32]

1.3 Phân tích tổng thể chất chuyển hóa (metabolomics)

Mục đích nghiên cứu nhằm so sánh bức tranh tổng quát về các chất chuyển hóa của một cá thể này với một cá thể khác hay một tập hợp này với một tập hợp khác Từ đó nhận ra những đặc trưng khác biệt như kiểu so sánh dấu vân tay (giai đoạn fingerprinting) Sau đó xác định chất chuyển hóa nào trong số đó đóng vai trò chất đánh dấu sinh học gây nên sự khác biệt (giai đoạn profiling) Biến số trong Phân tích tổng thể chất chuyển hóa thường khoảng vài trăm biến Số lượng mẫu (cỡ mẫu) nghiên cứu cũng phải lớn tương ứng [62] Ứng dụng quan trọng nhất của phương pháp phân tích tổng thể chất chuyển hóa là nghiên cứu chất đánh dấu sinh học ung thư

[59, 64, 72] và thuốc điều trị ung thư [14, 30, 68, 72, 83]

1.4 Kỹ thuật cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Các tín hiệu trên phổ NMR thể hiện chính xác thành phần và cấu trúc phân tử các chất chuyển hóa thông qua độ dịch chuyển hóa học và hình dạng tín hiệu (mũi đơn hay mũi đa) Phần lớn các nghiên cứu đều dùng phổ proton 1H-NMR-NOESY [10, 46, 75] Sau khi ghi phổ việc nhận danh phổ dựa trên phổ chuẩn của nước tiểu và phổ chuẩn của hàng trăm chất chuyển hóa có sẳn trong các thư viện phổ như: BioMagResBank [71], Human Metabolome Database (http://www.hmdb.ca) [3] Cường độ tín hiệu proton trong H2O rất lớn nên cần dùng kỹ thuật Xóa ghép mũi H2O Các phổ NMR khác như: phổ 13

C-NMR có độ phân tán phổ rộng hơn nhiều

so với phổ 1H-NMR, tuy nhiên độ nhạy kém và thời gian ghi phổ kéo dài [8] Phổ 2D-NMR (NMR hai chiều) không bị chồng lấp tín hiệu cộng hưởng nên có thể phát hiện và nhận danh nhiều chất chuyển hóa hơn so với phổ 1D-NMR (NMR một chiều) nhưng thời gian thâu phổ kéo dài [37, 57, 67], phổ biến là các phổ : HSQC; TOCSY ; COSY; HMBC

1.5 Phân tích dữ liệu đa biến (MVA)

Tùy theo mục đích nghiên cứu, có thể dùng nhiều kỹ thuật khác nhau: 1- Kỹ thuật Phân tích cấu tử chính (Principal Component

Analysis – PCA) nhằm đánh giá khái quát về một tập hợp mẫu Kỹ thuật

này không áp đặt bất kỳ tính chất nào cho tập hợp mẫu (unsupervised modelling), cho phép nhận biết đúng bản chất của tập hợp mẫu (các mẫu tương tự nhau hay khác biệt), phát hiện các xu hướng phân bố tự nhiên trong tập hợp mẫu (sự phân nhóm các điểm lệch…); 2- Kỹ thuật Bình

phương cực tiểu riêng phần (Partial Least Square - PLS) nhằm dự đoán tính chất của một mẫu Một tập hợp mẫu được phân nhóm một cách có định

hướng theo một tính chất đặc trưng đã biết trước (supervised modelling)

Sự phân nhóm tạo thành mô hình PLS Khi đã có mô hình PLS có thể đưa vào một mẫu mới, xem mẫu được phân bố vào nhóm nào trên mô hình Từ

đó dự đoán tính chất đặc trưng của mẫu [17]

Dữ liệu đầu vào cần ở dạng bảng số - gọi là Bảng X Với bảng X gồm N dòng (N mẫu/phổ) và K cột (K khoảng chia phổ), có thể biểu diễn dưới dạng N điểm phổ trong không gian K chiều Nguyên lý kỹ thuật PCA

là làm giảm đáng kể số chiều của bộ dữ liệu mà vẫn mô tả gần đúng nhất sự phân bố các mẫu PCA lập không gian mới, mỗi chiều ứng với một biến ảo mới, gọi là Cấu Tử Chính (PC) Mỗi PC là hàm số tuyến tính của các biến

số K ban đầu Sự phân bố của tập hợp mẫu trong không gian PC mới gọi là

mô hình PCA Trong không gian 3 chiều mới, ví dụ PC1-PC2-PC3, chiếu tất cả điểm phổ lên mặt phẳng tọa độ tạo bởi PC1-PC2 như hình

Các mẫu có thành phần tương tự nhau sẽ có điểm phổ nằm gần nhau trong mặt phẳng PC1- PC2 Tọa độ của mẫu trên một trục PC chính là phương sai của mẫu theo phương tương ứng gọi là điểm số (Score) Mặt phẳng tạo bởi PC1 - PC2 và hình chiếu các điểm phổ gọi là Biểu đồ điểm

số PC1-PC2 Các điểm lệch (outlier) là những điểm nằm tách biệt trên biểu

đồ gây ảnh hưởng lớn đến sự phân bố của mô hình làm cho mô hình bị lệch về phía chúng

Biểu đồ tải trọng một chiều trông như phổ 1

H-NMR Cường độ tín hiệu thể hiện mức độ đóng góp của biến số tương ứng trên 1 cấu tử chính gọi là tải trọng (loading) Tín hiệu có cường độ mạnh chính là những tín hiệu chủ yếu gây ra sự phân nhóm các điểm phổ Quan sát Biểu đồ một chiều có thể xác định chất chuyển hóa nào (tương ứng với tín hiệu có cường độ mạnh) đã góp phần quan trọng vào sự phân nhóm các mẫu Biểu

đồ tải trọng hai chiều biễu diễn tải trọng của các biến số trên 2 cấu tử chính như hình 1.4

Hình1.4: Biểu đồ tải trọng một chiều và hai chiều

Nguyên lý kỹ thuật PLS: PLS cũng bắt đầu với bảng dữ liệu X Ngoài ra, cần một bảng thông tin thứ cấp, gọi là bảng Y Mỗi dòng trong bảng Y là một mẫu tương tự bảng X Nhưng mỗi cột trong bảng Y là một nhóm thông tin thứ cấp Thông tin thứ cấp có thể là bất kỳ loại dữ liệu nào Giá trị biến Y không phải là đại lượng vật lý đo lường mà là một chỉ số Thông thường giá trị biến Y là 2 chỉ số 0 và 1 Kỹ thuật PLS tìm mối tương

quan tốt nhất giữa bảng X và Y, theo điều kiện áp đặt là thông tin trong bảng Y Vậy có thể sử dụng mô hình PLS để dự đoán thông tin bị thiếu của một mẫu khác Các mô hình PLS cũng như PCA gồm Biểu đồ điểm số và Biểu đồ tải trọng

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vấn đề y đức của nghiên cứu

Nghiên cứu này tuân thủ đúng y đức vì: Bệnh nhân được giải thích

rõ mục tiêu và đồng ý tham gia nghiên cứu; việc lấy mẫu nước tiểu không gây nguy hiểm; Tên địa chỉ bệnh nhân được giữ bí mật; Bệnh nhân không trả thêm phí…

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Mẫu được thu thập tại Trung tâm Chẩn đoán Y khoa MEDIC từ tháng 3/2013 đến tháng 10/2014 (18 tháng) Sau đó mẫu được phân tích mẫu tại Phòng thí nghiệm phân tích trung tâm-ĐHKHTN-ĐH QG TPHCM, Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm-Sở KHCN TPHCM

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu là Nghiên cứu cắt ngang Mẫu lấy trọn tại một thời điểm Dân số nghiên cứu là tất cả bệnh nhân đến khám vì bệnh

lý đại-trực tràng và được làm nội soi chẩn đoán Tiêu chuẩn loại trừ là các bệnh lý về rối loạn chuyển hóa gồm đái tháo đường suy thận mãn Tiêu chuẩn vàng là nội soi đại-trực tràng kết hợp sinh thiết sang thương Cỡ mẫu trung bình cho nghiên cứu cắt ngang tính toán được bằng 73 mẫu

2.4 Chuẩn hóa quy trình

Hình 2.1: Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu

Bác sĩ phỏng vấn bệnh nhân để ghi nhận Bảng khảo sát thông in (Phụ lục 1) lập Danh sách bệnh nhân (Phụ lục 2); thu thập kết quả nội soi đại tràng và kết quả xét nghiệm giải phẫu bệnh; thu thập mẫu nước tiểu

theo Phương pháp lấy mẫu nước tiểu sạch giữa dòng, bảo quản ở -80o C

không quá 1 tháng đến khi đem phân tích

Mẫu chuyển từ bệnh viện sang được xử lý theo các bước: Rã đông mẫu nước tiểu đến nhiệt độ phòng trong 20 ÷ 30 phút; Ly tâm 6.000 vòng /phút trong 5 ÷ 10 phút để tách cặn rắn; Chuyển 540 µl lớp dung dịch trong vào ống nghiệm 1.500 µl; Bổ sung 60 µl dung dịch đệm (pH 7 4); Làm đều

mẫu bằng cách ngâm bồn siêu âm trong 3 phút rồi rút mẫu cho vào ống đo NMR 5mm [43 57] Thiết bị phân tích là hệ NMR Bruker AVANCE III

500 Ultrashield Plus Cryo Chu trình xung 1D-NOESY- PRESAT có xóa ghép tín hiệu H2O Số lần quét NS = 32 Tổng thời gian là 4 – 5 phút/mẫu Phổ 1

H-NMR được xử lý trên phần mềm Topspin version 3.1 – Bruker Sau các bước xử lý trên phổ NMR được chuẩn hóa hay còn gọi là đồng bộ hóa trước khi đưa vào phân tích thống kê đa biến: PCA PLS bằng phần mềm AMIX version 3.9.12 - Bruker BioSpin

Đồng bộ hóa gồm các bước : chia khoảng phổ 1

H-NMR theo hình chữ nhật; cắt vùng phổ cần quan sát 9.50 ppm - 0.50 ppm; chia nhỏ phổ thành các khoảng có độ rộng 0.05 ppm; chọn kiểu tích phân: cường độ (tích phân) từng khoảng phổ chia nhỏ được lấy theo tỷ lệ trên giá trị tổng cường

độ của phổ; xác định tỷ xích giữa các phổ (scaling) theo cường độ tổng (scale to total intensity) ; gán cho tổng cường độ các phổ một giá trị bằng nhau ; loại bỏ vùng phổ không phân tích từ 6.5 ppm - 4.5 ppm

Phân tích thống kê đa biến: PCA PLS bằng tính năng của phần mềm AMIX theo nguyên lý như mục 1.5

Đánh giá phương pháp NMR Độ Nhạy (Sensivity) và Độ Đặc Hiệu (Specificity) đồng thời xác định giá trị tiên đoán dương giá trị tiên đoán

âm của phương pháp Đánh giá sự phù hợp của phương pháp NMR so với phương pháp tiêu chuẩn vàng bằng chỉ số Jacob Cohen’s Kappa

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Hình 3.1: Phổ 1H-NMR 500MHz từ 9.5 – 0.0 ppm của mẫu lành mã số

0022 : 1-creatinine / creatine, 2- hippurate, 3- glycine, 4- citrate, 5- trimethylamine N-oxide, 6- lactate, 7- alanine, 8- dimethylamine, 9- taurine

Hình 3.2: Phổ 1H-NMR 500MHz từ 9.5 – 0.0 ppm của mẫu bệnh mã số

1126 : 1-creatinine / creatine, 2- hippurate, 3- glycine, 4- citrate, 5-

trimethylamine N-oxide, 6- lactate, 7- alanine, 8- dimethylamine, 9- taurine

Phổ thu được có sự tương đồng với phổ chuẩn mẫu nước tiểu đã được công bố trong nhiều tài liệu [44, 61, 66, 79] Điều này chứng tỏ rằng quá trình thu thập bảo quản xử lý mẫu và ghi phổ NMR là phù hợp các quy trình điều kiện chuẩn trong những nghiên cứu trên thế giới

3.2 Nhận danh phổ NMR

Có 30 chất chuyển hóa chính trong thành phần 2 loại mẫu nước tiểu được nhận danh và liệt kê trong bảng 3.2

Bảng 3.2: Các chất chuyển hóa chính trên phổ H-NMR

STT Chất chuyển hóa Vị trí cộng hưởng (ppm)

1 Creatinine

/ Creatine

4.07(s), 3.05(s) 4,02(s), 2.94(s)

29 Guanidoacetate 3.79(s)

30 Methionine 3.85(m), 2.63(m), 2.20(m), 2.11(m)

(s)-mũi đơn (d)-mũi đôi (t)-mũi ba (q)-mũi bốn, (m)-mũi đa

3.3 Mô hình PCA thể hiện xu hướng phân nhóm của tập hợp mẫu

Kết quả phân tích PCA thu được Biểu đồ điểm số theo PC1 và PC2 như hình 3.6:

Hình 3.6: Biểu đồ điểm số PCA theo PC1-PC2 thể hiện xu hướng phân nhóm tập hợp mẫu -Dấu màu đỏ: mẫu bệnh Dấu màu xanh: mẫu lành Nhận xét:

 Số cấu tử chính tối thiểu để đạt độ tin cậy 95% là 4 PC Tổng mức độ giải thích của các cấu tử chính quan trọng nhất là 59.04%

 Vùng Biểu đồ điểm số về phía âm của trục PC1 có 139 điểm phổ của mẫu lành (ký hiệu dấu màu xanh) Tuy nhiên có thêm 8 điểm lạc của mẫu bệnh (ký hiệu dấu màu đỏ) âm tính giả mang mã số: 1317 1334 1069

1303, 1013, 1321, 1294, 1302

 Vùng Biểu đồ điểm số về phía dương của trục PC1 có 69 điểm phổ của mẫu bệnh (ký hiệu dấu màu đỏ) Tuy nhiên có thêm 13 điểm lạc của mẫu lành (ký hiệu dấu màu xanh) dương tính giả mang mã số: 0085 0265

0206, 0115, 0214, 0188, 0287, 0117, 0238, 0221, 0169, 0244, 0171

3.4 Mô hình PLS dùng chẩn đoán ung thư đại-trực tràng

VÙNG MẪU BỆNH VÙNG MẪU LÀNH

Biểu đồ điểm số PCA chỉ mới là biểu đồ thể hiện sự phân bố tự nhiên của tập hợp mẫu chưa phải biểu đồ dùng chẩn đoán sàng lọc bệnh Biểu đồ PLS dùng chẩn đoán sàng lọc bệnh phải được xây dựng trên bộ cơ

sở dữ liệu đã được khẳng định chắc chắn về tính chất đặc trưng của mẫu, bằng một phương pháp phân tích khác đã cho kết quả biết trước Các mẫu bệnh hay lành, ngoài việc đã được khẳng định tình trạng bệnh theo kết quả nội soi và giải phẫu bệnh (giá trị “0” và “1”) cũng cần là những mẫu đã được phân bố chính xác trên Biểu đồ điểm số PCA Vì vậy khi xây dựng

mô hình PLS cần loại bỏ 8 mẫu âm tính giả và 13 mẫu dương tính giả Số mẫu còn lại là: số mẫu lành = 139 mẫu số mẫu bệnh = 69 mẫu

Kết quả phân tích PLS thu được Biểu đồ điểm số theo PLS1 và PLS2 như hình 3.7:

Hình 3.7: Biểu đồ điểm số PLS theo PLS1-PLS2 dùng chẩn đoán ung thư đại-trực tràng – Dấu màu đỏ: mẫu bệnh Dấu màu xanh: mẫu lành Nhận xét:

 Số cấu tử chính tối thiểu để đạt độ tin cậy 95% là 4 PLS trong đó tổng mức độ giải thích của các biến X là 46.93% tổng mức độ giải thích của các biến Y là 88.03%

 Với biểu đồ hình 3.7 dùng chức năng Prediction của phần mềm AMIX

thuộc mô hình không và phân bố vào vùng nào trên biểu đồ Nếu điểm phổ mới được phân bố trong vùng mẫu bệnh tức kết quả chẩn đoán sàng lọc bằng phương pháp NMR nghi ngờ bệnh nhân bị ung thư đại-trực tràng Nếu điểm phổ mới được phân bố trong vùng mẫu lành tức kết quả chẩn đoán sàng lọc bằng phương pháp NMR dự đoán bệnh nhân không bị ung thư đại-trực tràng

3.5 Xác định chất đánh dấu sinh học ung thƣ đại-trực tràng

Quy luật biến đổi thành phần chất chuyển hóa của mẫu nước tiểu ung thư đại-trực tràng được xác định bằng các Biểu đồ tải trọng PCA như hình 3.8

Hình 3.8: Các biểu đồ PCA thể hiện sự góp phần các chất chuyển hóa tạo

nên sự phân nhóm điểm phổ trên trục PC1

A- Biểu đồ điểm số theo PC1-PC2, B- Biểu đồ tải trọng hai chiều theo

PC1-PC2, C- Biểu đồ tải trọng một chiều theo PC1; Dấu màu đỏ: mẫu bệnh

- Dấu màu xanh: mẫu lành

 Nhận xét Biểu đồ tải trọng hai chiều (hình 3.8-B):

Trên Biểu đồ tải trọng hai chiều (hình 3.8-B) mỗi điểm ứng với một khoảng chia phổ gồm 131 khoảng cạnh mỗi điểm có ghi giá trị độ dịch chuyển hóa học (ppm) Hướng phân bố những khoảng giá trị độ dịch chuyển hóa học trên Biểu đồ tải trọng hai chiều (hình 3.8-B) tương quan hướng phân bố của các điểm phổ (mẫu) trên Biểu đồ điểm số (hình 3.8-A) Hình 3.9 thể hiện chi tiết Biểu đồ tải trọng hai chiều (hình 3.8-B) cho thấy

rõ các khoảng giá trị độ dịch chuyển hóa học nào (tức các chất chuyển hóa tương ứng) đã gây ra sự phân nhóm điểm phổ (tức các mẫu) trên trục PC1 của Biểu đồ điểm số (hình 3.8-A):

Hình 3.9-A: Trích Biểu đồ tải trọng hai chiều theo PC1-PC2

(hình 3.8 – B) - Phần nữa trái