HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ BÍCH NGỌC NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ BỆNH THIẾU MÁU CHI CẤP TÍNH TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG BẰNG GHÉP ĐỒNG LOÀI TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ Chuyên ngành: Sinh lý
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
VŨ BÍCH NGỌC
NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ BỆNH THIẾU MÁU CHI CẤP TÍNH TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG BẰNG GHÉP ĐỒNG LOÀI TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ
Chuyên ngành: Sinh lý học Người và Động vật
Mã số chuyên ngành: 62 42 30 01
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Tp Hồ Chí Minh - Năm 2017
Trang 2Công trình được hoàn thành tại: PTN Nghiên cứu và Ứng dụng tế
bào gốc, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia
TP.HCM
Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Tạ Thành Văn
Phản biện 1: PGS.TS Trương Quang Bình
Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Văn Thuận
Phản biện 3: TS Trần Hoàng Ngọc Ái
Phản biện độc lập 1: PGS.TS Lê Văn Đông
Phản biện độc lập 2: TS Trần Hoàng Ngọc Ái
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TP.HCM
vào lúc 09 giờ 00 ngày 31 tháng 05 năm 2017
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM
- Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên
Trang 3TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Thiếu máu cục bộ chi được coi là giai đoạn cuối của bệnh lý về động mạch ngoại biên, ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng cuộc sống Thiếu máu cục bộ cấp tính chi được xác định trong 12% dân số trưởng thành ở
Mỹ Một năm sau khi được chẩn đoán, 25% bệnh nhân sẽ tử vong, 30% phải cắt cụt chi, và chỉ 45% còn lại sống mà còn giữ được 2 chi Năm năm sau đó, hơn 60% bệnh nhân sẽ tử vong do thiếu máu cục bộ cấp tính chi Thống kê tại Viện Tim mạch Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh nhân BĐMCD điều trị nội trú tại Viện tăng từ 1,7% (2003) lên tới 2,5% (2006) và 3,4% (2007)
Đến nay, hầu hết các liệu pháp điều trị cho bệnh đều dựa trên nguyên tắc phá bỏ huyết khối bằng các thuốc, bằng sóng siêu âm hoặc bằng phương pháp can thiệp nội mạch nhằm tái thiết lập dòng máu Và khi phương pháp can thiệp nội mạch không có hiệu quả, phương pháp phẫu thuật bắc cầu động mạch sẽ được thực hiện Tuy nhiên, khi tất cả các phương pháp truyền thống đều thất bại, bệnh nhân có thể phải đối mặt với nguy cơ cắt cụt chi hoặc tử vong
Liệu pháp tế bào gốc đang trở thành phương pháp điều trị đầy hứa hẹn cho việc tái tạo mạch máu mới Các nghiên cứu gần đây cho thấy tế bào gốc trung mô tuỷ xương (BM-MSC) có thể cảm ứng tạo mạch máu mới trên mô hình chuột thiếu máu chi cấp tính cũng như trên người trưởng thành Ngoài BM-MSC, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ (AD-MSC) có đặc tính tương tự AD-MSC có thể biệt hoá thành các tế bào nội mô hoặc tế bào
có nguồn gốc trung mô khác như mô cơ Ghép AD-MSC cũng đã được nhiều báo cáo cho thấy tính hiệu quả của chúng trong việc tái tạo mô tổn thương và giúp tái tạo mạch máu mới
Mặc dù một số nghiên cứu cho thấy việc cấy ghép AD-MSC và MSC đều cho hiệu quả trong điều trị bệnh thiếu máu chi cấp tính trên mô hình chuột, đến nay vẫn còn ít thông tin và bằng chứng khoa học so sánh
Trang 4Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu điều trị bệnh thiếu máu chi cấp tính trên chuột nhắt trắng bằng ghép đồng loài tế bào gốc trung mô” nhằm thử nghiệm điều trị bệnh bằng
liệu pháp tế bào gốc với nguồn tế bào gốc trung mô từ tuỷ xương và từ mô
mỡ Đề tài được thực hiện với các mục tiêu như sau:
Mục tiêu tổng quát:
Đánh giá hiệu quả điều trị thực nghiệm bệnh thiếu máu chi cấp tính trên
mô hình chuột sử dụng BM-MSC và AD-MSC đồng loài
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu can thiệp đối chứng ngẫu nhiên
- Nghiên cứu này sử dụng chuột nhắt trắng chuột thiếu máu chi cấp tính
do cắt và cắt mạch máu đùi
- Nguồn tế bào cho điều trị: tế bào ghép đồng loài được sử dụng là MSC và BM-MSC
Trang 5AD-CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bệnh tắc nghẽn mạch máu chi
Tắc nghẽn mạch máu chi thuộc nhóm bệnh lý động mạch ngoại biên (BĐMNB) BĐMNB có thể xảy ra tại bất cứ mạch máu nào trong cơ thể, trong đó đại đa số xảy ra ở chi dưới Thiếu máu cục bộ chi cấp tính là kết quả của sự tiến triển dày lên của thành động mạch do sự tích tụ của các mảng bám Sự tích tụ mảng bám này còn được gọi là xơ vưa động mạch, làm hẹp và gây tắc dòng máu Bệnh làm giảm đáng kể lưu lượng máu tới các chi như tay, chân, bàn chân, cuối cùng tiến triển tới mức đau nặng ngay
cả khi nghỉ ngơi và thậm chí gây loét da, loét hoặc hoại tử chân và bàn chân
Thiếu máu cục bộ cấp tính chi được xác định trong 12% dân số trưởng thành ở Mỹ Một năm sau khi được chẩn đoán, 25% bệnh nhân sẽ tử vong, 30% phải cắt cụt chi, và chỉ 45% còn lại sống mà còn giữ được 2 chi Năm năm sau đó, hơn 60% bệnh nhân sẽ tử vong do thiếu máu cục bộ cấp tính chi
Tại Việt Nam, cùng với các bệnh động mạch do xơ vữa như nhồi máu
cơ tim, đột quỵ… tỷ lệ bệnh nhân nhập viện vì BĐMCD cũng ngày một gia tăng Thống kê tại Viện Tim mạch Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh nhân BĐMCD điều trị nội trú tại Viện tăng từ 1,7% (2003) lên tới 2,5% (2006)
và 3,4% (2007) Theo báo cáo từ tác giả Đoàn Quốc Hưng và cs, trong thời gian từ 3/1999 đến 5/2005, nghiên cứu trên 113 bệnh nhân tắc nghẽn mạch máu chi dưới mạn tính do xơ vữa động mạch được điều trị phẫu thuật cho thấy tỷ lệ tử vong chung sau 5 năm là 15,1%
Các nghiên cứu gần đây cho thấy tế bào gốc trung mô tuỷ xương (BM-MSC) có thể cảm ứng tạo mạch máu mới trên mô hình chuột thiếu máu chi cấp tính cũng như trên người trưởng thành Ngoài BM-MSC, tế bào gốc trung mô có nguồn gốc từ mô mỡ (AD-MSC) có đặc tính tương tự với tế bào BM-MSC AD-MSC có thể biệt hoá thành các tế bào nội mô
Trang 64
hoặc các tế bào có nguồn gốc trung mô khác như mô cơ Ghép AD-MSC đã được nhiều báo cáo cho thấy tính hiệu quả của chúng trong việc tái tạo mô tổn thương và giúp tái tạo mạch máu mới
Tế bào gốc trung mô
MSC là một trong những nguồn TBG được nghiên cứu từ lâu và sở hữu nhiều đặc tính ưu việt Uỷ ban MSC của Hiệp hội quốc tế về liệu pháp
tế bào (International Society of Cellular Therapy-ISCT) đã đề xuất một bộ tiêu chuẩn tối thiểu để xác định đặc tính miễn dịch của MSC người cho các các nhà khoa học nghiên cứu cơ bản phòng thí nghiệm lẫn các nhà nghiên cứu tiền lâm sàng vào năm 2006 và được cập nhật mới năm 2013 Đầu tiên, MSC phải có tính bám dính khi được duy trì trong điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn sử dụng bình nuôi cấy mô Thứ hai, tế bào phải biểu hiện dương tính với các phân tử protein bề mặt (marker) CD105, CD73, CD90 và không biểu hiện marker CD45, CD34, CD14 hoặc CD11b, CD79a hoặc CD19 và HLA-DR Thứ ba, các tế bào phải có khả năng biệt hoá thành nguyên bào tạo xương, tế bào mỡ và nguyên bào sụn dưới điều kiện nuôi cấy biệt hoá in vitro tiêu chuẩn
Cơ chế sửa chữa tổn thương của tế bào gốc trung mô
MSC tham gia tích cực vào việc sửa chữa và tái tạo mô Đầu tiên MSC được phân phối vào vùng tổn thương hoặc mô bệnh có thể tiết cytokine và nhân tố tăng trưởng để kích thích tái tạo theo hướng cận tiết MSC có thể điều chỉnh ổ tế bào gốc trong cơ thể chủ bằng cách kích thích
sự huy động tế bào nội sinh tới vùng tổn thương và định hướng biệt hoá theo dòng tế bào cần thiết Một cách có liên quan, MSC có thể cung cấp chất chống oxy hoá, dọn dẹp các gốc tự do và các protein sốc nhiệt/chaperone ở vùng thiếu máu Kết quả là các chất độc hại phóng thích vào môi trường có thể được loại bỏ, do đó thúc đẩy sự phục hồi của các tế bào còn sống sót MSC được cấy ghép có thể cung cấp ty thể mới cho tế bào hư hại, do đó phục hồi lại quá trình thoái hoá yếm khí Thứ hai, MSC
Trang 7có thể biệt hóa trực tiếp thành các tế bào có chức năng, thay thế cho tế bào
đã hư hại
Tế bào gốc trong tái tạo mạch máu mới
Một đặc tính sinh học quan trọng của TBG là tác động cận tiết trong quá trình tân tạo mạch Đồng thời, TBG cũng tham gia biệt hoá trự tiếp thành các tế bào thành phần của mạch máu như tế bào nội mô, tế bào cơ trơn thành mạch Sự tạo mạch máu mới giúp cung cấp oxy và chất dinh dưỡng là thiết yếu cho sự sống sót và tăng trưởng của các mô trong cơ thể
Sự tân tạo được hình thành theo 2 cơ chế: sự tạo mạch máu mới hoàn toàn (vasculorgenesis) và sự tạo mạch bằng cách phân nhánh và kéo dài từ các mạch tồn tại sẵn có (angiogenesis)
Tế bào gốc trung mô trong việc sửa chữa và tái tạo mô cơ
MSC có thể biệt hoá thành các sợi cơ vân và tham gia vào phục hồi ổ
tế bào vệ tinh cả in vitro và in vivo Do đó, MSC cũng được xem là một ứng
viên cho điều trị các bệnh về cơ Trong một số nghiên cứu, MSC khi cấy ghép vào chuột đột biến thiếu gen dystrophin hoặc bệnh nhân teo cơ Duchenne đã cho thấy dấu hiệu cải thiện đáng kể chức năng cơ Goudenege
và cs (2009) cũng đã chứng minh rằng biểu hiện của MyoD ảnh hưởng bởi AD-MSC người Kết quả của thí nghiệm của ông cho thấy tiềm năng tạo tế
bào cơ của AD-MSC người tăng cả ở in vitro và in vivo
CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
• Chuột nhắt trắng dòng Swiss trên 3 tháng tuổi được sử dụng cho thí nghiệm
• Tế bào gốc trung mô được thu nhận từ mô mỡ (AD-MSC) và tuỷ xương (BM-MSC) của chuột đồng loại
• Loại bệnh nghiên cứu: bệnh thiếu máu chi cấp tính do bị thắt và cắt mạch máu
Trang 86
Sơ đồ bố trí thí nghiệm Phương pháp nghiên cứu:
• Phương pháp thu nhận và nuôi cấy tế bào ứng viên tế bào gốc trung
mô từ mô mỡ và tuỷ xương
• Phương pháp đánh giá một số đặc tính an toàn của tế bào: tính vô khuẩn của tế bào, khả năng tạo khối u của tế bào và khả năng gây chết của
tế bào trên động vật
• Phương pháp tạo mô hình chuột thiếu máu chi cấp tính với các kĩ thuật đánh giá sự lưu thông mạch máu chi, SPO2, sự phù nề chi, khả năng vận động, sự biến đổi cấu trúc mô bằng nhuộm mô học, sự hình thành mạch máu mới
• Phương pháp ghép tế bào gốc trên chuột tắc nghẽn mạch máu chi
• Phương pháp chuyển gen phát huỳnh quang vào tế bào gốc
• Phương pháp đánh giá sự tồn tại của tế bào dựa trên tế bào đánh dấu huỳnh quang và các kĩ thuật chụp hình dưới kính hiển vi huỳnh quang
và kĩ thuật phân tích dòng chảy (flow cytometry)
Trang 9• Phương pháp đánh giá sự thay đổi của các gen liên quan đến khả năng tạo mạch máu mới của tế bào ghép bằng kĩ thuật realtime RT-PCR
• Phương pháp xử lý số liệu: các số liệu được sử lý bằng phần mềm
xử lý thống kê prism 6.0, Tukey's multiple comparisons test với độ tin cậy
trên 95%
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
1 Kết quả phân lập và định danh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ
và tuỷ xương
1.1 Hình thái và khả năng tăng sinh của tế bào gốc ứng viên 1.1.1 Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ
Hình 1 Hình dạng tế bào AD-MSC ứng viên nuôi cấy in vitro
Phân đoạn tế bào SVF bám trải sau khi nuôi cấy hai ngày, tế bào có dạng hình thoi, thuôn dài về hai đầu, hình que hoặc dạng đa giác (Hình 1A) Sau năm ngày nuôi cấy, mật độ tế bào bao phủ khoảng 70-80% bề mặt đĩa nuôi Tế bào có dạng hình thoi, thuôn dài về hai đầu và hình que chiếm đa
số (Hình 1B) Qua các lần cấy chuyền thứ ba (Hình 1C), thứ năm (Hình 1D), thứ mười (Hình 1E), hình dạng tế bào trở nên đồng nhất hơn với hình dạng chủ yếu thuôn dài ở hai đầu Hình dạng này giống với các tế bào nguyên bào sợi (Hình 1F)
1.1.2 Tế bào gốc trung mô từ tuỷ xương
Trang 108
Đối với tế bào đơn nhân thu nhận từ tuỷ xương chuột, tế bào bám dính sau 24 giờ nuôi cấy và tăng sinh sau 48 giờ (Hình 2A) Tế bào bao phủ 70-80% bề mặt đĩa nuôi sau 5-6 ngày (Hình 2B) Tế bào có dạng hình thoi, thuộn dài về hai đầu, ít tế bào phân nhánh hơn so với tế bào thu nhận từ mô
mỡ
Hình 2 Hình dạng tế bào BM-MSC ứng viên nuôi cấy in vitro
Sau 3 lần cấy chuyền, hình dạng tế bào đồng nhất hơn với dạng hình thoi chiếm đa số (Hình 2C) Ở lần cấy chuyền thứ 5 đến 10, hình dạng
tế bào đồng nhất (Hình 2D,E), tế bào tăng sinh với tốc độ ổn định, sau mỗi
2 -3 ngày, mật độ tế bào bao phủ 70-80% bề mặt đĩa nuôi (Hình 2)
1.2 Khả năng biệt hoá thành tế bào mỡ, xương và sụn
Sau khi nuôi trong môi trường cảm ứng biệt hoá tạo mỡ, xương và sụn, tế bào AD-MSC và BM-MSC lần lượt bắt màu với thuốc nhuộm oil red O, alizarin red S và safranin O cho thấy đã có sự hình thành và tích tụ các giọt lipid, tích tụ ion canxi và sự hình thành proteoglycan trong tế bào Như vậy, AD-MSC và BM-MSC có khả năng biệt hoá thành tế bào mỡ, xương và sụn (Hình 3)
Trang 11Hình 3 Khả năng biệt hoá thành tế bào mỡ, xương, sụn của BM-MSC
và AD-MSC in vitro
1.3 Sự biểu hiện các dấu ấn protein bề mặt tế bào
Hình 4 Sự biểu hiên kiểu hình miễn dịch của AD-MSC và BM-MSC
Ở lần cấy chuyền thứ 3 và thứ 4, AD-MSC và BM-MSC biểu hiện kiểu hình miễn dịch không đồng nhất Từ lần cấy chuyền thứ 5 và 10, tế bào đồng nhất về kiểu hình miễn dịch với trên 99% quần thể tế bào dương tính với CD44, CD90, CD106 và và dưới 5% âm tính với CD14, CD34, CD45, CD105 (Hình 4)
1.4 Thời gian nhân đôi của tế bào
Ở lần cấy chuyền thứ 5 đến lần 10, thời gian nhân đôi của tế bào AD-MSC là 46,64 ± 2,3 h giờ và tế bào BM-MSC là 59,03 ± 2,9 h
2 Kết quả đánh một số đặc tính an toàn của tế bào ghép
2.1 Độ vô khuẩn của tế bào
Trang 1210
Sau 14 ngày, màu sắc và trạng thái môi trường nuôi AD-MSC và BM-MSC tương đồng với mẫu đối chứng âm, dung dịch trong suốt cho thấy mẫu tế bào không bị nhiễm vi khuẩn (Hình 5A) và vi nấm (Hình 5B) Điều này khác với ống đối chứng dương, vi nấm và vi khuẩn phát triển mạnh dẫn đến màu môi trường đục
Hình 5 Độ vô khuẩn của tế bào AD-MSC và BM-MSC
2.2 Khả năng gây khối u và gây chết của tế bào trên động vật
Sau 7 ngày, khối u hiện diện rõ ở tất cả các vị trí ghép tế bào ung thư vú 4T1 (3 nồng độ 105, 106 và 107 tế bào) Sau 14 ngày (Hình 6), khối u tạo dạng cầu và xuất hiện các vùng da bị hoại tử tại vị trí khối u phát triển Sau 28 ngày, diện tích vùng hoại tử trên da chuột tăng Kích thước khối u tăng nhanh và 100% chuột được ghép 4T1 đều tử vong Đồng thời, với liều
tế bào 4T1 ghép càng cao, sự phát triển của khối u càng nhanh Trong khi
đó, tại vị trí ghép AD-MSC (Hình 6A) và BM-MSC (Hình 6B), với tất cả các liều ghép, vào tất cả các thời điểm đánh giá đều không có sự xuất hiện của bất cứ khối u nào
Trang 13Hình 6 Khả năng gây khối u của tế bào trên động vật
Để đánh giá tác động riêng lẻ của tế bào AD-MSC và BM-MSC lên
sự sống sót của chuột, chúng tôi tiến hành ghép chỉ AD-MSC hoặc MSC lên chuột tại 2 vị trí cơ đùi và vú Kết quả cho thấy, 100% chuột được ghép AD-MSC (n=15) hoặc BM-MSC (n=15) không có sự hình thành khối
BM-u và tất cả các con chBM-uột được ghép tế bào sống khoẻ mạnh saBM-u 6 tháng ghép tế bào
3 Kết quả xây dựng mô hình chuột thiếu máu chi cấp tính
3.1 Khả năng lưu thông máu sau tổn thương
Một đến hai phút ngay sau khi tiêm trypan blue, ở cả 2 lô chuột dưới 6 tháng tuổi và chuột trên 6 tháng tuổi, chi không cắt mạch bắt màu xanh của thuốc nhuộm Trong khi đó, chi cắt mạch không bắt màu (Hình 7A) Hiên tượng này xảy ra tương tự cho đến ngày thứ 6 sau khi cắt mạch (Hình 7B) Điều này chứng tỏ lượng máu lưu thông đến phía sau vùng bị gây tắc nghẽn mạch đã bị gián đoạn Điều này cho thấy việc gây tắc nghẽn mạch máu chi đã thành công trên 100% chuột thí nghiệm ở cả 2 lô
Hình 7 Khả năng lưu thông máu sau tổn thương
Sau 6 ngày, những chuột còn giữ được đến bàn chân ở cả hai lô, sự bắt màu thuốc nhuộm quan sát được ở chi bị cắt mạch và chi bình thường (Hình 7C) Tuy nhiên, ở chi bị cắt mạch, sự bắt màu xanh hiện diện ở ít vị trí hơn so với chi bình thường Điều này cho thấy, mặc dù sự tổn thương sau khi gây tắc nghẽn mạch bị hạn chế, nhưng sự lưu thông mạch máu kém hơn so với chi bình thường