Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cây hẹ ( Allium tuberosum Rotller ex Spreng) trồng tại xã Cẩm Lý, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang đối với 4 chủng vi khuẩn: Stapylococus aurenus, Serratia marcescens, Bacilus subtilis, Pseudomonas aeruginosa. Kết quả cho thấy, dịch chiết từ các bộ phận của cây hẹ (rễ, thân, lá) có khả năng ức chế cả 4 loài vi khuẩn nghiên cứu. Trong đó, dịch chiết từ thân, lá và rễ có khả năng kháng S. aurenus, B. subtilis cao hơn so với S. marcescens và P. aeruginosa.
Trang 1SỞ GD & ĐT BẮC GIANG TRƯỜNG THPT CẨM LÝ
ĐỖ THỊ YẾN LINH
XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT
TỪ CÂY HẸ (Allium tuberosum Rotller ex Spreng) TRỒNG TẠI
XÃ CẨM LÝ - HUYỆN LỤC NAM - TỈNH BẮC GIANG
Người hướng dẫn:
TS Nguyễn Hữu Quân - GV ĐH SP Thái Nguyên
Th Sỹ Nguyễn Thị Hồng Liên - THPT Cẩm Lý
CẨM LÝ, NĂM 2016
Trang 2XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT CÂY HẸ ( Allium tuberosum Rotller ex Spreng) TRỒNG TẠI XÃ CẨM LÝ, HUYỆN
LỤC NAM, TỈNH BẮC GIANG
Nguyễn Hữu Quân, Nguyễn Thị Hồng Liên, Đỗ Thị Yến Linh
TÓM TẮT
Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cây hẹ ( Allium tuberosum Rotller ex Spreng) trồng tại xã Cẩm Lý, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang đối với 4 chủng vi khuẩn: Stapylococus aurenus, Serratia marcescens, Bacilus subtilis, Pseudomonas aeruginosa Kết quả cho thấy, dịch chiết từ các bộ phận của cây hẹ (rễ, thân, lá) có khả năng ức chế cả 4 loài vi khuẩn nghiên cứu Trong đó,
dịch chiết từ thân, lá và rễ có khả năng kháng S aurenus, B subtilis cao hơn so với S
marcescens và P aeruginosa.
Trang 31 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Hiện nay, việc sử dụng kháng sinh trong điều trị các bệnh do vi khuẩn gây nên ngày càng phổ biến ở Việt Nam, cũng như trên thế giới Một trong những hạn chế gặp phải là tình trạng nhờn thuốc kháng sinh trong điều trị Theo nghiên cứu của Lê Văn
Tạo (2006) cho thấy, vi khuẩn Escherichia coli đã kháng một lúc với nhiều loại
kháng sinh, trong đó có 12% số chủng đa kháng với 7 loại kháng sinh, 32% đa kháng với 6 loại kháng sinh, 40% đa kháng với 5 loại kháng sinh, 10% đa kháng với 4 loại kháng sinh So với kháng sinh tân dược, các cây thuốc có chứa kháng sinh tự nhiên tuy không mạnh bằng nhưng cũng đủ để chữa khỏi nhiều bệnh nhiễm khuẩn Kháng sinh thực vật có nhiều ưu điểm mà thuốc kháng sinh tân dược không có Ưu điểm nổi bật của kháng sinh thực vật là rất ít độc, do đó không gây ra những tai biến nguy hiểm Vì vậy, gần đây, người ta nhắc nhiều đến kháng sinh thực vật và có xu hướng trở lại với các cây thuốc, sử dụng các kháng sinh tự nhiên của cây cỏ
Cây hẹ (Allium tuberosum Rotller ex Spreng) được trồng khá phổ biến tại các vùng nông thôn nước ta Theo kinh nghiệm dân gian, hẹ có thể được dùng để chữa ho cho trẻ em, hẹ đồng thời cũng là gia vị cho một số món ăn Thành phần của hẹ có chứa một số kháng sinh thực vật mạnh như allcin, orodin, sunfit Nhờ vậy chúng có thể chữa được một số bệnh như ghẻ, chín mé, nhiễm trùng da bằng cách đắp lá giã nhỏ lên vết thương, tiện lợi cho việc điều trị giun kim ở trẻ nhỏ mà không sợ tác dụng phụ của thuốc tân dược
Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài nghiên cứu: Xác định
hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Hẹ (Allium tuberosum Rotller ex
Spreng) được trồng tại xã Cẩm Lý, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang
2 PHÁT BIỂU GIẢ THUYẾT KHOA HỌC, CÂU HỎI NGHIÊN CỨU, MỤC TIÊU KĨ THUẬT, KẾT QUẢ MONG ĐỢI
- Giả thuyết khoa học: Trong cây Hẹ có chứa một số kháng sinh thực vật như orodin, sunfua, alicin nên dịch chiết từ cây Hẹ có khả năng kháng khuẩn
Trang 4- Câu hỏi nghiên cứu: Dịch chiết từ cây Hẹ (Allium tuberosum Rotller ex
Spreng) trồng tại xã Cẩm Lý, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang có khả năng kháng khuẩn không?
- Mục tiêu kĩ thuật: Xác định được hoạt tính kháng một số loài vi khuẩn của dịch chiết từ cây Hẹ thông qua một số kĩ thuật sinh học phổ thông
- Kết quả mong đợi: Xác định được hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết cây Hẹ trồng tại xã Cẩm Lý, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang
3 KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Kế hoạch nghiên cứu
Bảng 1 Kế hoạch nghiên cứu
STT Các nội dung, công việc chủ yêu
1
Nghiên cứu tài liệu, tìm hiểu về tình
hình sử dụng thuốc kháng sinh hiện
nay, tìm hiểu về cây Hẹ, các kháng
sinh thực vật có trong cây hẹ
Báo cáo tổng quan về các loại kháng sinh thực vật có trong cây Hẹ
2 Lấy mẫu cây hẹ tại một số địa điểm
3 Tìm hiểu các phương pháp xác định
hoạt tính kháng khuẩn
Tìm ra phương pháp phù hợp để xác định hoạt tính kháng khuẩn của Hẹ
4
Xác định tính kháng khuẩn từ dịch
chiết của cây Hẹ bằng một số
phương pháp truyền thống
Báo cáo về kết quả kháng khuẩn của dịch chiết từ cây
Hẹ
khoa học nhà trường
Trang 53.2 Vật liệu
Cây Hẹ được trồng tại xã Cẩm Lý, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang Nguyên liệu được thu trong điều kiện khô ráo, không bị sâu bệnh vào thời gian 12/9/2016
Các chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu gồm: Staphylococus aurenus,
Bacillus subtilis, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa do Khoa Sinh học,
trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên cung cấp
- Môi trường nghiên cứu: Môi trường LB có thành phần gồm cao nấm men 0,5%, NaCl 1,0%, pepton 1,0% Môi trường LB đặc bổ sung 2% thạch agar
- Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh học – THPT Cẩm Lý, phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào và phòng Vi sinh – Đại học Sư phạm Thái Nguyên
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Xác định tính kháng khuẩn từ dịch chiết của cây Hẹ
- Chuẩn bị dịch chiết: Các phần của cây Hẹ (rễ, thân và lá) có khối lượng lần lượt là 2,5g; 5g; 7,5g và 10g được nghiền lát trong cối sứ, sau đó bổ sung 5ml nước cất, hòa đều và lọc bỏ cặn để thu dịch chiết
- Nuôi vi khuẩn thử nghiệm: các loài vi khuẩn trong ống thạch nghiêng được ria trên đĩa môi trường LB đặc nuôi ở 30°C, qua đêm Lấy 1 khuẩn lạc nuôi trong lọ chứa 3ml môi trường LB lỏng nuôi qua đêm để thử nghiệm
- Tiến hành thử nghiệm dịch chiết từ cây Hẹ đối với vi khuẩn:
+ Chuẩn bị môi trường LB đặc, khử trùng, đổ ra các đĩa petri
+ Hút 30µl dịch nuôi vi khuẩn mỗi loại nhỏ vào đĩa môi trường, dùng que chang trải đều trên mặt thạch cho đến khi khô
+ Dùng khoan nút chai vô trùng có đường kính 1mm đục 4 lỗ trên đĩa thạch và nhỏ 100 µl dịch chiết từ rễ, thân và lá vào 3 giếng (giếng đối chứng bổ sung 100 µl nước)
Trang 6+ Đặt các đĩa petri đã bổ sung dịch vào tủ lạnh 4°C khoảng 1-2h cho dịch chiết khuếch tán đều ra môi trường Sau đó, đặt vào tủ ấm nuôi ở 28°C, từ 18-24h Đo đường kính vòng vô khuẩn, chụp hình và ghi lại kết quả Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần Đường kính vòng kháng khuẩn được xác định theo công thức:
H = D – d (mm) trong đó: D là đường kính vòng vô khuẩn tính từ tâm đục lỗ (mm)
d là đường kính đục lỗ thạch (mm)
3.3.2 Xử lý số liệu
Số liệu thí nghiệm thu được xử lý thống kê bằng phần mềm Excel 2007 Phân tích phương sai và so sánh các trung bình ở mức ý nghĩa α = 0,05 bằng phần mềm SAS 9.1
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Khả năng kháng vi khuẩn Staphylococus aurenus từ dịch chiết cây Hẹ
Vi khuẩn S aurenus được xem là một trong ba tác nhân chính gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm chỉ sau Samolena và Clostridium pefrigen Vi khuẩn S aurenus là loài
vi khuẩn có khả năng kháng thuốc mạnh nhất Khảo sát tính kháng kháng sinh của S
aurenus ở thành phố Hồ Chí Minh năm 2005 cho thấy các chủng S aurenus có đến
91,4% chủng kháng với penicilin; 52,9% kháng với ciprofloxacin; 12,5% kháng gentamicin (Nguyễn Thị Kê và cs, 2006)
Kết quả xác định hoạt tính kháng vi khuẩn S aurenus của dịch chiết từ cây Hẹ
được trình bày ở bảng 2 và hình 1 Kết quả ở bảng 1 cho thấy, dịch chiết từ cây Hẹ có
khả năng ức chế vi khuẩn S aurenus phát triển Dịch chiết từ rễ, thân và lá của cây Hẹ
ức chế vi khuẩn S aurenus phát triển tăng dần theo nồng đồ và có sự khác nhau Dịch
chiết từ rễ, hoạt tính ức chế tăng từ 14,01 mm ở nồng độ 0,5 đến 17,19 mm ở nồng độ 2g/ml
Đối với dịch chiết từ lá, hoạt tính ức chế tăng từ 18,25mm ở nồng độ 0,5 g/ml đến 32,23 mm ở nồng độ 2g/ml Hoạt tính ức chế vi khuẩn cũng tăng từ 16,35mm ở nồng độ 0,5 g/ml đến 20,11 mm ở nồng độ 2g/ml đối với dịch chiết từ thân Như vậy,
Trang 7ở cùng nồng độ khảo sát hoạt tính ức chế vi khuẩn S aureus mạnh nhất đối với dịch
chiết từ lá cây Hẹ, tiếp đến là dịch chiết từ thân cây Hẹ và thấp nhất là dịch chiết từ rễ cây Hẹ
Bảng 2 Đường kính vòng vô khuẩn của dịch chiết từ cây Hẹ đối với vi khuẩn
S aureus ở các nồng độ khảo sát (mm)
Nồng độ 0,5g/ml
Nồng độ 1g/ml
Nồng độ 1,5g/ml
Nồng độ 2g/ml
Hình 1 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ thân, lá, rễ cây Hẹ
đối với S aurenus
A Nồng độ 0.5g/ml B Nồng độ 1g/ml
C Nồng độ 1.5g/ml D Nồng độ 2g/ml
Trang 84.2 Khả năng kháng vi khuẩn Bacilus subtilis của dịch chiết từ cây Hẹ
Khảo sát khả năng kháng B subtilis của dịch chiết từ cây Hẹ cho thấy: dịch chiết
từ cây Hẹ có khả năng ức chế vi khuẩn B subtilis phát triển Sự ức chế khả năng phát triển của B subtilis khác nhau giữa thân, lá và rễ Kết quả được trình bày ở bảng 3 và
hình 2
Số liệu ở bảng 3 cho thấy, khi tăng nồng độ dịch chiết từ 0,5g/ml, 1g/ml, 1,5g/ml, 2g/ml thấy sự ức chế vi khuẩn tăng lên Ở nồng độ 2g/ml dịch chiết từ thân,
lá, rễ của cây Hẹ ức chế vi khuẩn B subtilis phát triển mạnh nhất Dịch chiết thu được
từ lá cây Hẹ có đường kính vòng kháng khuẩn cao nhất
Bảng 3 Đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Hẹ
đối với vi khuẩn B subtitis
0,5g/ml
Nồng độ 1g/ml
Nồng độ 1,5g/ml
Nồng độ 2g/ml
Hình 2 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ thân, lá, rễ cây Hẹ
đối với vi khuẩn B subtilis
A Nồng độ 0,5g/ml B Nồng độ 1g/ml
Trang 94.3 Khả năng kháng vi khuẩn Serratia marcescens của dịch chiết từ cây Hẹ
Vi khuẩn S marcescens có thể gây nên bệnh viêm phổi, nhiễm trùng huyết, viêm
màng não, nhiễm trùng đường tiết niệu, nhiễm trùng mắt Khảo sát khả năng kháng vi
khuẩn S marcescens của dịch chiết từ cây Hẹ cho thấy: dịch chiết từ cây Hẹ có khả năng ức chế vi khuẩn S marcescens phát triển Sự ức chế khả năng phát triển của vi khuẩn S marcescens khác nhau giữa thân, lá và rễ Kết quả được trình bày ở bảng 4
và hình 3
Kết quả ở bảng 4 cho thấy, khi tăng nồng độ dịch chiết từ 0,5g/ml, 1g/ml, 1,5g/ml, 2g/ml thấy sự ức chế vi khuẩn tăng lên Ở nồng độ 2g/ml, dịch chiết từ cây
Hẹ có khả năng ức chế vi khuẩn S marcescens phát triển mạnh nhất
Bảng 4 Đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Hẹ đối với vi
khuẩn S marcescens
0,5g/ml
Nồng độ 1g/ml
Nồng độ 1,5g/ml
Nồng độ 2g/ml
So sánh đường kính vòng kháng khuẩn của vi khuẩn S marcescens với đường kính vòng kháng khuẩn của vi khuẩn B subtilis và S aurenus nhận thấy đường kính vòng kháng khuẩn của vi khuẩn S marcescens nhỏ hơn, chứng tỏ khả năng ức chế vi khuẩn của dịch chiết cây Hẹ đối với vi khuẩn S marcescens là kém hơn
Hình 3 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ thân, lá, rễ cây Hẹ
Trang 10đối với vi khuẩn S marcescens ở nồng độ 1g/ml 4.4 Khả năng kháng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa của dịch chiết từ cây Hẹ
Vi khuẩn P aeruginosa (hay còn gọi là trực khuẩn mủ xanh) là một vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và con người Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn P
aeruginosa của dịch chiết từ cây Hẹ cho thấy: dịch chiết từ cây Hẹ có khả năng ức chế
vi khuẩn P aeruginosa phát triển Sự ức chế khả năng phát triển của vi khuẩn P
aeruginosa khác nhau giữa thân, lá và rễ Kết quả được trình bày ở bảng 5 và hình 4
Kết quả ở bảng 5 cho thấy, khi tăng nồng độ dịch chiết của thân, rễ và lá cây Hẹ
từ 0,5g/ml, 1g/ml, 1,5g/ml, 2g/ml thấy sự ức chế vi khuẩn tăng lên, tuy nhiên đường kính vòng kháng khuẩn tăng lên không lớn Ở nồng độ 2g/ml ức chế vi khuẩn phát triển mạnh nhất Dịch chiết thu được từ lá cây Hẹ có đường kính vòng kháng khuẩn là cao nhất đạt 16,19 mm
Bảng 5 Đường kính vòng kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Hẹ đối với vi
khuẩn P aeruginosa
0,5g/ml
Nồng độ 1g/ml
Nồng độ 1,5g/ml
Nồng độ 2g/ml
Hình 4 Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ thân, lá, rễ cây Hẹ
đối với vi khuẩn P aeruginosa ở nồng độ 1g/ml
Trang 11So sánh đường kính vòng kháng khuẩn của 4 loài vi khuẩn khảo sát cho thấy,
đường kính vòng kháng khuẩn của vi khuẩn S aurenus và B subtilis cao hơn so với
vi khuẩn S marcescens và P aeruginosa Như vậy có thể khẳng định rằng, dịch chiết
từ thân, lá và rễ của cây Hẹ có khả năng kháng vi khuẩn S aurenus, B subtilis cao hơn so với vi khuẩn S marcescens và P aeruginosa Kết quả bước đầu cho thấy, tác động của dịch chiết từ cây Hẹ lên vi khuẩn Gram dương (S aurenus, B subtilis) mạnh hơn vi khuẩn Gram âm (S marcescens, P aeruginosa) Điều này có thể được giải
thích bởi sự khác nhau của thành tế bào của hai loại vi khuẩn gram âm và gram dương
5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1.KẾT LUẬN
- Xác định được hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Hẹ đối với các vi
khuẩn S aureus, S marcescens, B subtilis, P aeruginosa bằng phương pháp vòng
kháng khuẩn
- Dịch chiết từ các bộ phận rễ, thân và lá của cây Hẹ có khả năng ức chế vi
khuẩn S aurenus và S marcescens cao hơn so với vi khuẩn P aeruginosa và
B subtilis Dịch chiết thu được từ thân và lá có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn
cao hơn so với dịch chiết thu được từ rễ
5.2 ĐỀ NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Hẹ và tinh sạch, xác định cấu trúc, cũng như tính chất của chất có trong dịch chiết từ cây Hẹ có khả năng kháng khuẩn để tìm ra nồng độ ức chế hoàn toàn một số loài vi khuẩn kiểm định
Trang 12TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Đỗ Tất Lợi (2003), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam Nhà xuất bản Khoa học
và Kĩ thuật, Hà Nội
2 Nguyễn Thị Hoàng Lan, Bùi Quang Thuật, Lê Danh Tuyên, Nguyễn Thị Ngọc Duyên (2015), Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá tía tô, Tạp chí Khoa học và phát triển, tập 13, số 2, tr 245 – 250
3 Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, 2003, Thí nghiệm Công nghệ sinh học, NXB ĐH Quốc gia, tp HCM, tập 2 – Thí nghiệm vi sinh vật
4 Nguyễn Thị Kê, Nguyễn Xuân Mai, Nguyễn Đỗ Phúc, Hoàng Hoài Thương, Bùi Thị Kiều Nương, Nguyễn Trần Chính, Cao Minh Nga, Cao Ngọc Nga (2006), Khảo sát tính kháng kháng sinh của một số chủng vi sinh vật lây qua đường tiêu hóa, Y học thành phố Hồ Chí Minh, số đặc biệt chuyên đề về y tế công cộng và y tế cộng đồng, phụ bản của tập 10, tr 406- 411
5 Trần Mỹ Linh, Vũ Hương Giang, Lê Quỳnh Liên, Nguyễn Tường Vân, Ninh Khắc Bản, Châu Văn Minh (2013), Đánh giá hoạt tính ức chế vi khuẩn kiểm định của một
số loài thực vật ngập mặn tại vườn quốc gia Giao Thủy, Nam Định, Tạp chí Sinh học, tập 35, tr 342 – 347