Nghiên cứu đặc điểm gây bệnh của nấm isaria javanica(friederichs bally) samson hywel jones ký sinh sâu khoang ở nghệ an

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Nguyễn Thị Thúy Tên luận án: Nghiên cứu đặc điểm gây bệnh của nấm Isaria javanica Friederichs & Bally Samson & Hywel-Jones ký sinh sâu khoang ở Nghệ An Phư

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ THÚY

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM GÂY BỆNH CỦA NẤM Isaria javanica (Friederichs & Bally) Samson & Hywel-Jones KÝ SINH SÂU KHOANG Ở NGHỆ AN

Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật

Người hướng dẫn khoa học

GS.TS Nguyễn Viết Tùng PGS.TS Trần Ngọc Lân

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng để bảo vệ ở bất

kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cảm

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Thúy

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Viết Tùng và PGS.TS Trần Ngọc Lân đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Côn trùng, Khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Trường Đại học Vinh

đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình công tác và thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận án

Nguyễn Thị Thúy

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình ix

Trích yếu luận án xi

Thesis abstract xiii

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 3

1.3 Phạm vi nghiên cứu 3

1.4 Những đóng góp mới của đề tài 4

1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4

Phần 2 Tổng quan tài liệu 5

2.1 Cơ sở khoa học của đề tài 5

2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 6

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm nấm ký sinh côn trùng chi Isaria 6

2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm vòng đời và chu kỳ phát triển của nấm ký sinh trên côn trùng 13

2.2.3 Nghiên cứu tuyển chọn nấm ký sinh côn trùng để phòng trừ sâu hại 18

2.2.4 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh của nấm trên côn trùng 20

2.2.5 Nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng để phòng trừ sâu khoang 23

2.3 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 24

2.3.1 Nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng chi Isaria 24

2.3.2 Nghiên cứu tuyển chọn nấm ký sinh côn trùng để phòng trừ sâu hại 27

2.3.3 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng xâm nhiễm và gây bệnh của nấm trên côn trùng 28

2.3.4 Nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng để phòng trừ sâu khoang 28

2.4 Những vấn đề còn tồn tại và những vấn đề đề tài tập trung nghiên cứu 29

2.4.1 Những vấn đề còn tồn tại 29

2.4.2 Những vấn đề đề tài tập trung nghiên cứu 29

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 30

3.1 Địa điểm nghiên cứu 30

3.2 Thời gian nghiên cứu 30

3.3 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 30

3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 30

3.3.2 Vật liệu nghiên cứu 30

3.3.3 Thiết bị và dụng cụ 30

3.4 Nội dung nghiên cứu 31

3.4.1 Thành phần loài nấm thuộc chi Isaria và vật chủ của chúng thu thập ở Vườn quốc gia Pù Mát, Nghệ An 31

3.4.2 Đặc điểm sinh vật học của loài nấm I javanica thu thập ở Vườn quốc gia Pù Mát, Nghệ An 31

3.4.3 Tuyển chọn các mẫu phân lập của loài nấm I javanica triển vọng để phòng trừ sâu khoang 31

3.4.4 Đánh giá ảnh hưởng một số yếu tố đến khả năng gây bệnh của nấm I javanica VN1487 trên sâu khoang trong phòng thí nghiệm 31

3.4.5 Đánh giá khả năng gây bệnh của nấm I javanica VN1487 trên sâu khoang ở ô lưới ngoài đồng ruộng 32

3.5 Phương pháp nghiên cứu 32

3.5.1 Nghiên cứu thành phần loài nấm thuộc chi Isaria và côn trùng vật chủ của chúng ở Vườn quốc gia Pù Mát, Nghệ An 32

3.5.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái của loài nấm Isaria javanica thu thập ở Vườn quốc gia Pù Mát, Nghệ An 34

3.5.3 Nghiên cứu tuyển chọn các mẫu phân lập của loài nấm Isaria javanica triển vọng để phòng trừ sâu khoang 39

3.5.4 Nghiên cứu ảnh hưởng một số yếu tố đến khả năng gây bệnh của nấm Isaria javanica VN1487 trên sâu khoang trong phòng thí nghiệm 41

3.5.5 Nghiên cứu khả năng gây bệnh của nấm Isaria javanica VN1487 trên sâu

khoang ở ô lưới ngoài đồng ruộng 47

3.5.6 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu 50

Phần 4 Kết quả và thảo luận 52

4.1 Kết quả nghiên cứu 52

4.1.1 Thành phần loài nấm thuộc chi Isaria và vật chủ của chúng thu thập ở Vườn quốc gia Pù Mát, Nghệ An 52

4.1.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái của loài nấm Isaria javanica thu thập ở Vườn quốc gia Pù Mát, Nghệ An 56

4.1.3 Tuyển chọn các mẫu phân lập của loài nấm Isaria javanica triển vọng để phòng trừ sâu khoang 76

4.1.4 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng gây bệnh của nấm Isaria javanica VN1487 trên sâu khoang trong phòng thí nghiệm 83

4.1.5 Khả năng gây bệnh của nấm Isaria javanica VN1487 trên sâu khoang S litura ở ô lưới ngoài đồng ruộng 105

4.2 Thảo luận 112

4.2.1 Phân tích, đánh giá các kết quả đạt được của luận án 112

4.2.2 Một số điểm chưa có điều kiện nghiên cứu của luận án 128

Phần 5 Kết luận và đề nghị 129

5.1 Kết luận 129

5.2 Đề nghị 130

Danh mục các công trình công bố 131

Tài liệu tham khảo 132

Phụ lục 144

DANH MỤC BẢNG

2.1 Lịch sử các tên gọi của loài Isaria javanica 8

từ năm 2011 đến 2013 52

quốc gia Pù Mát từ năm 2011 đến 2013 55

Vườn quốc gia Pù Mát từ năm 2011 đến 2013 56

thuật DNA (tại BIOTEC, Thái Lan, 2012) 57

I javanica thu thập ở Vườn quốc gia Pù Mát từ năm 2011 đến 2013 59

trong điều kiện tự nhiên 64

sâu khoang S litura 77

khoang S litura 81

của nấm I javanica trên sâu khoang S litura 83

I javanica VN1487 84

I javanica VN1487 85

dung dịch bào tử nấm I javanica VN1487 86

4.17 Tỷ lệ sâu khoang S litura chết ở các tương quan mật độ giữa sâu nhiễm

nấm I javanica VN1487 và sâu khỏe 87

4.18 Tỷ lệ sâu khoang S litura mọc nấm ở các tương quan mật độ giữa sâu nhiễm nấm I javanica VN1487 và sâu khỏe 88

4.19 Thời gian phát triển của nấm trên sâu khoang S litura ở các tương quan mật độ giữa sâu nhiễm nấm I javanica VN1487 và sâu khỏe 89

4.20 Khả năng gây bệnh của nấm I javanica VN1487 cho một số loài vật chủ 90

4.21 Tỷ lệ sâu chết ở các mức mật độ sâu khoang S litura 92

4.22 Tỷ lệ sâu mọc nấm I javanica VN1487 ở các mật độ sâu khoang S litura 93

4.23 Thời gian phát triển của nấm I javanica VN1487 ở các mật độ sâu khoang S litura 94

4.24 Tỷ lệ sâu chết ở các tuổi sâu khoang S litura 94

4.25 Tỷ lệ sâu mọc nấm I javanica VN1487 ở các tuổi sâu khoang S litura 95

4.26 Thời gian phát triển của nấm I javanica VN1487 ở các tuổi sâu khoang S litura 97

4.27 Tỷ lệ sâu khoang S litura chết ở các nhiệt độ khác nhau 99

4.28 Tỷ lệ sâu khoang S litura mọc nấm I javanica VN1487 ở các nhiệt độ khác nhau 100

4.29 Thời gian phát triển của nấm I javanica VN1487 trên sâu khoang S litura ở các nhiệt độ khác nhau 101

4.30 Tỷ lệ sâu khoang S litura chết ở các độ ẩm khác nhau 102

4.31 Tỷ lệ sâu khoang S litura mọc nấm ở các độ ẩm khác nhau 103

4.32 Thời gian phát triển của nấm I javanica VN1487 trên sâu khoang S litura ở các độ ẩm khác nhau 104

4.33 Hiệu lực gây bệnh trên sâu khoang S litura sau khi phun nấm I javanica VN1487 ở ô lưới ngoài đồng ruộng 105

4.34 Hiệu lực gây bệnh khi thả sâu khoang S litura nhiễm nấm I javanica VN1487 trên ô lưới ngoài đồng ruộng 108

4.35 Tỷ lệ sâu khoang S litura mọc nấm I javanica VN1487 trên ô lưới ngoài đồng ruộng ở các mùa vụ năm 2014 109

4.36 Mật độ bào tử nấm I javanica VN1487 lưu tồn trong đất qua các mùa vụ năm 2014 110

DANH MỤC HÌNH

1.1 Chu kỳ xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 14

1.2 Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng 14

4.1 Mẫu vật các loài nấm thuộc chi Isaria thu thập ở Vườn quốc gia Pù Mát từ năm 2011 đến 2013 53

4.2 Tỷ lệ thành phần vật chủ và vị trí phân bố của loài nấm I javanica thu thập ở Vườn quốc gia Pù Mát từ năm 2011 đến 2013 58

4.3 Mẫu vật loài nấm I javanica thu thập ở Vườn quốc gia Pù Mát từ năm 2011 đến 2013 60

4.4 Hình thái của loài nấm I javanica 61

4.5 Mẫu vật và tản nấm của 3 loài nấm sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA 65

4.6 Thời gian phát triển của nấm I javanica VN1487 trên 3 loài vật chủ 67

4.7 Vòng đời và chu kỳ phát triển của nấm I javanica VN1487 trên sâu khoang S litura 68

4.8 Vòng đời và chu kỳ phát của nấm I javanica VN1487 trên rệp B brassicae 68

4.9 Vòng đời và chu kỳ phát triển của nấm I javanica VN1487 trên mọt ngô S zeamais 69

4.10 Các giai đoạn phát triển xen gối của nấm I javanica VN1487 trên sâu khoang S litura 70

4.11 Các vị trí nấm I javanica phát triển trên cơ thể sâu khoang S litura 75

4.12 Tỷ lệ sâu khoang S litura chết và mọc nấm ở các nồng độ dung dịch bào tử nấm I javanica VN1487 85

4.13 Tỷ lệ sâu khoang S litura chết và mọc nấm ở các tương quan mật độ giữa sâu nhiễm nấm I javanica VN1487 và sâu khỏe 88

4.14 Nấm I javanica VN1487 ký sinh trên một số loài vật chủ 91

4.15 Tỷ lệ sâu chết và mọc nấm I javanica VN1487 ở các mật độ sâu khoang S litura 93

4.16 Tỷ lệ sâu chết và mọc nấm I javanica VN1487 theo các tuổi sâu khoang S litura 96

4.17 Nấm I javanica VN1487 ký sinh ở các tuổi sâu khoang S litura 98

4.18 Tỷ lệ sâu khoang S litura chết và mọc nấm I javanica VN1487 ở các

nhiệt độ khác nhau 101

ẩm khác nhau 103

phun nấm I javanica VN1487 ở ô lưới ngoài đồng ruộng 106

phun nấm I javanica VN1487 ở trong phòng thí nghiệm 106

thả sâu nhiễm nấm I javanica VN1487 ở ô lưới ngoài đồng ruộng 108

đồng ruộng 111

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên tác giả: Nguyễn Thị Thúy

Tên luận án: Nghiên cứu đặc điểm gây bệnh của nấm Isaria javanica (Friederichs & Bally) Samson & Hywel-Jones ký sinh sâu khoang ở Nghệ An

Phương pháp nghiên cứu

* Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu thành phần loài nấm thuộc chi Isaria và vật chủ của chúng thu thập ở Vườn quốc gia Pù Mát, Nghệ An;

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái của loài nấm Isaria javanica thu thập ở Vườn quốc gia Pù Mát, Nghệ An;

- Tuyển chọn các mẫu phân lập của loài nấm Isaria javanica triển vọng để phòng trừ sâu khoang;

- Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng gây bệnh của nấm Isaria javanica VN1487 trên sâu khoang ở phòng thí nghiệm;

- Đánh giá khả năng gây bệnh của nấm Isaria javanica VN1487 trên sâu khoang ở

ô lưới ngoài đồng ruộng

* Vật liệu nghiên cứu

- Chi Isaria, loài Isaria javanica (Friederichs & Bally) Samson & Hywel-Jones (Hypocreales: Cordycipitaceae) thu thập tại Vườn quốc gia Pù Mát, Nghệ An

- Vật chủ sâu non sâu khoang Spodoptera litura Fabricius (Lepidoptera: Noctuidae) thu bắt trên các ruộng lạc tại huyện Nghi Lộc, Nghệ An

* Phương pháp nghiên cứu

- Thu thập, phân lập, định loại, nhân nuôi nấm thuộc chi Isaria

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái của loài nấm Isaria javanica thu thập ở Vườn quốc gia Pù Mát, Nghệ An;

- Tuyển chọn các mẫu phân lập triển vọng của loài nấm Isaria javanica để phòng

- Chu kỳ phát triển của nấm Isaria javanica VN1487 trên sâu khoang gồm pha gây bệnh và pha hoại sinh với 5 giai đoạn Thời gian mỗi giai đoạn (1) Lây nhiễm nấm đến sâu khoang chết 2,08±0,09 ngày, (2) Sâu khoang chết đến sợi nấm mọc ra ngoài cơ thể 2,92±0,19 ngày, (3) Sợi nấm mọc ra ngoài đến hình thành bào tử 2,82±0,15 ngày, (4) Bào tử hình thành đến nấm bao phủ cơ thể sâu khoang 2,63±0,14 ngày, (5) Nấm bao phủ cơ thể sâu khoang đến bào tử phát tán từ xác chết sâu khoang; Vòng đời phát triển của nấm trên sâu khoang 7,82±0,23 ngày; Chu kỳ phát triển của nấm trên sâu khoang 12,79±0,36 ngày

- Đã tuyển chọn được 4 trong 18 mẫu phân lập của loài nấm Isaria javanica có triển vọng để phòng trừ sâu khoang gồm VN1472, VN1487, VN1801 và VN1802

- Trong phòng thí nghiệm, điều kiện thích hợp cho nấm Isaria javanica VN1487

tử/ml hoặc thả 4 - 5 sâu nhiễm nấm cùng với 10 sâu khỏe; mật độ sâu khoang 20

80% RH

- Ngoài đồng ruộng, điều kiện thích hợp cho nấm Isaria javanica VN1487 gây

tháng trong đất ở Nghi Lộc, Nghệ An, tuy tỷ lệ sâu nhiễm nấm còn thấp 8,05%

THESIS ABSTRACT

PhD candidate: Nguyen Thi Thuy

Thesis title: Research of pathogenic characteristics of Isaria javanica (Friederichs & Bally) Samson & Hywel-Jones against Spodoptera litura (Fabr.) in Nghe An province

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)

Research Objectives:

Based on these studies of inoculation and pathogenesis ability of Isaria javanica

on Spodoptera litura in the relevant factors related, which evaluate, choose the potential specimen as well as proposals the impact of measures to improve the efficiency of application of biological products from fungal entomopathogens in plant protection Materials and Methods

* Research contents

- Research of species composition of Isaria genus and hosts collected at Pu Mat National Park, Nghe An province;

- Research of biological and ecological characteristics of Isaria javanica collected

in Pu Mat National Park, Nghe An province;

- Selection of potential isolates of Isaria javanica to biocontrol agents Spodoptera litura;

- Evaluation of several factors affect on the inoculation and pathogenesis ability of Isaria javanica on Spodoptera litura in laboratory

- Evaluation of inoculation and pathogenesis ability Isaria javanica VN1487 on Spodoptera litura in the field

* Materials

- Isaria genus, Isaria javanica (Friederichs & Bally) Samson & Hywel-Jones (Hypocreales: Cordycipitaceae) species collected in Pu Mat National Park, Nghe An province

- Spodoptera litura Fabricius larvae (Lepidoptera: Noctuidae) collecting in the field in Nghi Loc district, Nghe An province

* Methods

- Collection, isolation, identification and cultivation Isaria genus;

- Research of biological and ecological characteristics of Isaria javanica collected

in Pu Mat National Park, Nghe An province;

- Evaluation and selection of potential specimen of Isaria javanica to biocontrol

agents Spodoptera litura;

- Research of several factors affect on the inoculation and pathogenesis ability of Isaria javanica on Spodoptera litura in laboratory;

- Research of inoculation and pathogenesis ability Isaria javanica VN1487 on Spodoptera litura in the field

Main findings and conclusions

- Field surveys of entomopathogenic fungi were carried out in Pu Mat National Park from 2011 to 2013 A total of 146 specimens of 10 species of Isaria genus were collected, isolated and identified, popular Isaria tenuipes (89 specimens) and Isaria javanica (18 specimens)

- Development cycle of Isaria javanica VN1487 isolates on Spodoptera litura larvae includes pathogenesis phase and saprogenesis phase with 5 stages Duration of each stage was (1) Inoculation to the host died 2.08±0.09 days; (2) Host died to start mycelium 2.92±0.19 days; (3) Start mycelium to spore formation 2.82±0.15 days; (4) Spore formation to totally covered with mycelium 2.63±0.14 days; (5) Mycelium covering to spore discharge 2.34±0.15 days Life cycle of the fungus was 7.82±0.23 days, development cycle was 12.79±0.36 days

- Based on these parameters only 4/18 isolates of Isaria javanica merited further study, includes VN1472, VN1487, VN1801 and VN1802

- In the laboratory, the suitable conditions for inoculation and pathogenesis of Isaria javanica VN1487 on Spodoptera litura including spraying concentration of

- In the field, the suitable conditions for discharge, inoculation and pathogenesis

surface of soil 3 - 4 months in Nghi Loc, Nghe An in 2014, but mortality rate low 8.05%

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh nấm gây chết côn trùng là một hiện tượng phổ biến trong tự nhiên Cùng với các nhóm thiên địch khác, nấm ký sinh gây bệnh cho côn trùng có vai trò quan trọng trong việc điều hoà số lượng côn trùng trong tự nhiên ở khắp mọi nơi Do đó, việc khai thác sử dụng nấm ký sinh gây bệnh cho côn trùng được xem là hướng đi triển vọng, thu hút sự chú ý của các nhà khoa học côn trùng học

và bảo vệ thực vật Chế phẩm sinh học trừ sâu hại từ nấm ký sinh côn trùng là một giải pháp quan trọng trong biện pháp sinh học Tuy nhiên, hạn chế hiện nay đối với việc ứng dụng thuốc trừ sâu sinh học từ nấm ký sinh côn trùng là hiệu quả gây bệnh cũng như khả năng duy trì hiệu lực với sâu hại còn kém ổn định

Để khai thác tốt tiềm năng của giải pháp hữu ích này, cần có những kiến thức cơ bản và toàn diện về nấm gây bệnh trên côn trùng Trong đó, những hiểu biết về đặc điểm gây bệnh của nấm trên côn trùng vật chủ liên quan đến cơ chế gây bệnh

và mối liên quan với các yếu tố sinh thái là chìa khoá để nâng cao hiệu quả của thuốc trừ sâu sinh học từ nấm ký sinh côn trùng trong bảo vệ thực vật

Hiệu lực nấm gây bệnh cho côn trùng phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó quan trọng nhất là khả năng gây bệnh của mầm bệnh, đặc điểm của côn trùng vật chủ và điều kiện ngoại cảnh Trong đó, cơ chế gây bệnh là yếu tố quyết định đến hiệu quả gây bệnh của nấm đối với côn trùng Vận dụng các hiểu biết về cơ chế gây bệnh là để giải đáp các vấn đề liên quan đến sinh thái của quá trình gây bệnh làm cơ sở để lựa chọn các mẫu phân lập triển vọng và phương pháp sử dụng hợp

lý Quá trình gây bệnh của nấm ký sinh côn trùng bao gồm con đường lây nhiễm, quá trình tiếp xúc, xâm nhiễm, làm chết vật chủ đến khi nấm phát tán bào tử ra bên ngoài hoàn thành chu kỳ phát triển; cùng với đó là sự biến đổi về hình thái, sinh lý, sinh hóa của vật chủ trong quá trình nhiễm bệnh nấm (Alcides et al., 2002; Posada and Vega, 2005; Tian Zhi-lai, 2008; Vega et al., 2008)

Trên thế giới, nghiên cứu về nấm gây bệnh côn trùng đã đạt được những thành tựu đáng kể Các loài nấm ký sinh côn trùng đã được ứng dụng phòng trừ sâu hại như Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Hirsutela lecaniicola, Isaria fumosoroseus, Isaria javanica, Nomuraea rileyi (Lin et al., 2007; Thomas and Read, 2007; Toledo et al., 2010) Một số tác giả đã nghiên cứu về sự gây

bệnh, cơ chế tác động của các loài nấm ký sinh trên côn trùng (Posada and Vega, 2005; Tian, 2008; Vega et al., 2008) Ở Việt Nam cho đến nay chủ yếu là các nghiên cứu ứng dụng phòng trừ sâu hại của 2 loài nấm truyền thống là B

Thuỳ và cs., 2004, 2005); các nghiên cứu cơ bản về sự gây bệnh của nấm trên côn trùng còn ít được quan tâm

Nghiên cứu ứng dụng nấm gây bệnh cho côn trùng chưa đạt được kết quả như mong muốn, hiệu quả gây bệnh còn thấp và kém ổn định Có nhiều nguyên nhân dẫn đến thực trạng này, trong đó vấn đề dễ nhận thấy là việc nghiên cứu nấm gây bệnh cho côn trùng thường mới chỉ chú ý nhiều đến khâu sản xuất ứng dụng chế phẩm mà chưa quan tâm thích đáng đến các nghiên cứu cơ bản, như cơ chế gây bệnh của các loài nấm ký sinh trên côn trùng, mối quan hệ giữa nấm ký sinh và côn trùng vật chủ trong mối quan hệ với các yếu tố liên quan Đây là những hiểu biết không thể thiếu, làm cơ sở khoa học cho việc đánh giá, lựa chọn các mầm bệnh tiềm năng cũng như đề xuất các biện pháp tác động nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng nấm gây bệnh cho côn trùng

Trên đồng ruộng, sâu khoang (Spodoptera litura Fabr.) là loài đa thực gây hại nghiêm trọng trên rất nhiều cây trồng với 290 loài thuộc 99 họ thực vật, nhất

là các cây rau, lạc, đậu, cây công nghiệp, cây lương thực Ở Việt Nam, đây là đối tượng gây hại mạnh nhất trên cây lạc, có thể gây hại 70 - 81% diện tích lá, làm giảm tới 18% năng suất lạc và đã phát triển thành dịch ở nhiều nơi (Đặng Trần Phú và cs., 1997; Lê Văn Thuyết và cs., 1993; Phạm Thị Vượng, 1996) Đã có nhiều biện pháp phòng trừ sâu khoang được đưa ra như biện pháp hóa học, sinh học (chi nấm Beauveria, Nomuraea, Isaria; vi khuẩn; vi rút NPV), canh tác,… Hiện nay, phòng trừ sâu khoang chủ yếu bằng thuốc hoá học đã không đem lại hiệu quả và hướng sử dụng thuốc trừ sâu sinh học từ nấm ký sinh côn trùng là giải pháp hữu ích ngày càng được quan tâm (Lin et al., 2007; Vijayavani et al., 2009; Vimala et al., 2003)

Loài Isaria javanica có tiềm năng trong phòng trừ sâu hại, trước đây gọi là Paecilomyces javanicus (1957) và ban đầu được mô tả bởi Friederichs and Bally (1923) gọi là Spicaria javanica, đến năm 2005 sử dụng tên gọi chính thức là Isaria javanica Trong những năm gần đây, một số tác giả đã phát hiện một hiện tượng khá thú vị và hữu ích là ở một số chi nấm, bên cạnh khai thác làm dược liệu, chúng còn được sử dụng như một tác nhân phòng trừ sinh học, như chi nấm Isaria mà

điển hình là loài I javanica Loài nấm này chỉ mới được quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây và các dẫn liệu nghiên cứu còn hạn chế, nhưng đánh giá bước đầu đều cho thấy nhiều mẫu phân lập có triển vọng trong phòng trừ sinh học (Scorsetti et al., 2008; Shimazu and Takatsuka, 2010)

Ở Việt Nam, Vườn quốc gia Pù Mát được đánh giá là một trong những trung tâm có tính đa dạng sinh học cao, chứa đựng nguồn lợi lớn về nấm ký sinh côn trùng Các nghiên cứu bước đầu phát hiện một số loài nấm hữu ích trong phòng trừ sinh học và dược liệu, trong đó có loài I javanica (Trần Ngọc Lân, 2008; Trần Ngọc Lân và cs., 2008a, 2011a; Nguyễn Thị Thanh và cs., 2011a, 2011b; Phạm Quang Thu và cs., 2011)

Các vấn đề đặt ra khi nghiên cứu ứng dụng loài nấm I javanica trong phòng trừ sâu khoang như: Đặc điểm sinh vật học? Phương pháp đánh giá tuyển chọn những mẫu phân lập có tiềm năng trong phòng trừ sinh học sâu khoang? Khả năng gây bệnh của nấm trên sâu khoang như thế nào? Mối liên quan giữa nấm và sâu khoang trong với các yếu tố sinh thái ra sao? Các mẫu phân lập I javanica nghiên cứu được thu thập ở hệ sinh thái rừng của VQG Pù Mát liệu có thích ứng với điều kiện hệ sinh thái nông nghiệp? Đây là những nghiên cứu cơ bản cần thiết để làm cơ sở khoa học cho việc ứng dụng có hiệu quả nấm gây bệnh côn trùng Ở Việt Nam, các nghiên cứu về đặc điểm gây bệnh của nấm ký sinh trên côn trùng vật chủ còn ít được quan tâm, nên hy vọng kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ có những đóng góp cho vấn đề này ở Việt Nam

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Trên cơ sở nghiên cứu về khả năng gây bệnh của nấm Isaria javanica trên vật chủ sâu khoang trong mối quan hệ với các yếu tố liên quan, từ đó đánh giá, lựa chọn các mẫu phân lập triển vọng cũng như đề xuất các biện pháp tác động nhằm nâng cao hiệu quả ứng dụng chế phẩm sinh học từ nấm ký sinh côn trùng trong bảo vệ thực vật

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

- Bổ sung dẫn liệu về thành phần loài nấm thuộc chi Isaria gồm 10 loài và vật chủ của chúng; các đặc điểm sinh học, sinh thái của loài I javanica thu thập tại VQG Pù Mát, Nghệ An

- Đã mô tả được đặc điểm về chu kỳ xâm nhiễm, gây bệnh và phát triển bên ngoài của nấm I javanica trên sâu khoang, gồm 5 giai đoạn chính và mỗi giai đoạn thể hiện những triệu chứng đặc trưng cho loài

- Đã tuyển chọn được 4 trong 18 mẫu phân lập của loài nấm I javanica có triển vọng trong phòng trừ sâu khoang gồm VN1472, VN1487, VN1801 và VN1802 Nấm I javanica VN1487 có khả năng tồn tại và thích ứng được trong hệ sinh thái tại khu vực thử nghiệm

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Ý nghĩa khoa học

- Bổ sung các dẫn liệu về thành phần loài, đặc điểm sinh học, sinh thái của các loài nấm thuộc chi Isaria làm cơ sở cho việc đánh giá tiềm năng và ứng dụng trong phòng trừ sinh học sâu hại cây trồng

- Cung cấp một số dẫn liệu khoa học cho nghiên cứu cơ bản về khả năng gây bệnh của nấm I javanica trên sâu khoang ở Việt Nam (giai đoạn, thời gian, triệu chứng bệnh, )

1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Đề xuất các tiêu chí để áp dụng trong quá trình đánh giá, tuyển chọn các mẫu phân lập mục tiêu Kết quả của đề tài cũng đã xác định được 4 mẫu phân lập của loài I javanica có triển vọng trong phòng trừ sâu khoang

- Đề xuất một số biện pháp tác động nhằm nâng cao hiệu quả ứng dụng nấm I javanica trong phòng trừ sâu khoang

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

Khái niệm “Nấm ký sinh côn trùng - Entomopathogenic fungi (EPF)” hay

“nấm côn trùng - Insect fungi” được các nhà khoa học sử dụng như là thuật ngữ đồng nghĩa, đề cập về nhóm nấm ký sinh gây bệnh cho côn trùng Nấm ký sinh côn trùng dùng để mô tả hiện tượng nấm ký sinh trên hoặc trong cơ thể côn trùng Nấm ký sinh nguyên phát thường nhiễm vào ký chủ côn trùng khỏe mạnh gây bệnh và sau đó giết chết côn trùng Trong khi đó, nấm ký sinh thứ phát chỉ có thể

ký sinh trên côn trùng đã bị suy yếu bởi một loại bệnh nào đó hoặc côn trùng bị thương (Samson et al., 1988; Tzean et al., 1997)

Các loài nấm ký sinh côn trùng thường phân bố trong các khu rừng nhiệt đới, một số loài có ở cả hệ sinh thái nông nghiệp Đây là nguồn tài nguyên phong phú và có giá trị trong phòng trừ sinh học sâu hại và làm dược liệu Nấm là nhóm

vi sinh vật đầu tiên được chứng minh về khả năng lây nhiễm từ vật chủ này sang vật chủ khác Những phát hiện về nấm gây bệnh trên côn trùng ra đời cùng với sự xuất hiện ngành khoa học nghiên cứu về bệnh côn trùng Từ đây đã hình thành 2 hướng nghiên cứu chính về nấm ký sinh côn trùng là làm dược liệu và ứng dụng phòng trừ sinh học Trong những năm gần đây, một số chi nấm được đánh giá có thể làm dược liệu đồng thời cũng là một tác nhân phòng trừ sinh học, điển hình là chi Isaria (Marcos and Stephen, 2007; Scorsetti et al., 2008)

Khoa học nghiên cứu bệnh côn trùng gọi là bệnh lý học côn trùng Bệnh lý học côn trùng không chỉ đơn thuần mô tả những biến đổi bệnh lý trong cơ thể côn trùng và nghiên cứu các tác nhân gây bệnh, dịch bệnh, cũng như nghiên cứu các đặc điểm cơ bản và những diễn biến của nấm ở bên trong và bên ngoài cơ thể vật chủ (dẫn theo Tạ Kim Chỉnh, 2009) Trong các tác nhân gây bệnh, nấm ký sinh côn trùng thường có vai trò quan trọng nhất

Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua con đường tiêu hóa (miệng côn trùng), hô hấp (lỗ thở), qua cơ quan sinh dục, nhưng phần lớn là qua lớp vỏ, tức là phải có khả năng tiếp xúc, bám dính của bào tử nấm trên bề mặt vỏ cơ thể côn trùng; sự xâm nhập qua lớp vỏ cơ thể của côn trùng gồm giai đoạn bám dính, hình thành cấu trúc xâm nhập và sản sinh các

enzyme Bào tử nấm xâm nhập qua lớp vỏ cơ thể là sự tổ hợp của sức ép cơ học và

sự tác động của enzyme phân giải tầng cuticun Sau đó là quá trình sinh trưởng bên trong xoang cơ thể vật chủ và sự sinh sản của bào tử đính làm vật chủ bị chết Các loài côn trùng có thể phản ứng lại sự xâm nhiễm này của nấm bằng cả hai phương thức là tế bào và thể dịch Các loài nấm nói chung đều có hai phương thức để chiến thắng các phản ứng tự vệ của vật chủ: Sự phát triển của các dạng sinh trưởng giai đoạn tiềm ẩn là sự ngụy trang hữu hiệu từ các phản ứng tự vệ của côn trùng và sự sản xuất ra các chất miễn dịch phân hóa thuận nghịch của bộ phận

ức chế hệ thống bảo vệ

Trên bề mặt vỏ cơ thể sâu hại bị nhiễm nấm thường xuất hiện các vệt chấm đen Đây có thể là vị trí mà bào tử nấm tiếp xúc, mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể vật chủ Cơ thể sâu bị bệnh ngày càng trở nên hóa cứng Cơ thể côn trùng bị chết do nấm côn trùng không bị nát mà thường giữ nguyên hình dạng như khi còn sống Toàn bộ bên trong cơ thể côn trùng chứa đầy sợi nấm Sau đó, các sợi nấm này mọc ra ngoài qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể Đây là đặc điểm rất đặc trưng để phân biệt sâu chết bệnh do nấm côn trùng với các bệnh khác (Phạm Văn Lầm, 2000)

Chi nấm Isaria mặc dù phát hiện khá lâu nhưng chủ yếu khai thác làm dược liệu mà chưa chú ý nhiều đến hướng phòng trừ sinh học Loài nấm I javanica mới được quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây và các dẫn liệu còn hạn chế Do đó, trong đề tài này sẽ dựa trên cơ sở khoa học các nghiên cứu về đặc điểm gây bệnh của chi nấm Isaria và các loài nấm truyền thống như B bassiana,

M anisopliae, N rileyi

2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm nấm ký sinh côn trùng chi Isaria

2.2.1.1 Nghiên cứu thành phần loài nấm chi Isaria và vật chủ của chúng Cho đến nay, trên thế giới đã phát hiện có khoảng 1,5 triệu loài nấm, với khoảng 2000 loài nấm ký sinh côn trùng Trong đó, đa dạng nhất là chi Cordyceps với 500 loài, tiếp theo là chi Verticilium với 261 loài, chi Entomophthora với 152 loài, chi Hypocrella 112 loài, chi Torrubiella 83 loài, chi Aschersonia 79 loài, chi Isaria 42 loài,… (Aung et al., 2008; Luangsa-ard et al., 2006; Sung et al., 2007a)

Ở Thái Lan, nấm ký sinh côn trùng mới được nghiên cứu trong những năm

gần đây Sau 15 năm nghiên cứu, các nhà khoa học BIOTEC đã phát hiện hơn

400 loài nấm ký sinh côn trùng thuộc 15 giống được phát hiện ở Thái Lan, trong

đó có hơn 120 loài chi Cordyceps, 24 loài chi Isaria, (Morakot, 2003) Các nghiên cứu vẫn tiếp tục từ 2005 - 2006 tại Chiang Mai, Thái Lan đã thu thập được

301 mẫu vật gồm 34 loài thuộc 15 chi nấm ký sinh côn trùng, ký sinh trên 10 bộ côn trùng và nhện Các loài phổ biến là Ophiocordyceps myrmecophila chiếm 2,61%, O unilateralis chiếm 13,78%, I fumosoroseus chiếm 13,07%, Paecilomyces marquandii chiếm 7,42% và I tenuipes chiếm 5,3% Côn trùng bị nấm ký sinh nhiều nhất thuộc là bộ Cánh màng, bộ Cánh nửa và bộ Cánh vảy (Aung et al., 2008) Trung tâm BIOTEC đã có nhiều thành công trong nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng tạo chế phẩm sinh học trừ sâu hại cây trồng và làm dược liệu từ các chi nấm Beauveria, Metarhizium, Cordyceps, Ophiocordyceps, Isaria (Luangsa-ard et al., 2006); các kết quả phân loại nấm ký sinh côn trùng về hình thái, sinh học phân tử DNA (Luangsa-ard et al., 2006, 2007; Sung et al., 2007b)

Ở Nam Mỹ phát hiện đầu tiên về 2 loài nấm I fumosorosea và I javanica gây bệnh trên trưởng thành bọ phấn Bemisia tabaci (Gennadius) và Trialeurodes vaporariorum (Westwood) (Hemiptera: Aleyrodidae) trên sâu hại cây trồng nông nghiệp (Scorsetti et al., 2008) Loài nấm I javanica cũng là ghi nhận đầu tiên ký sinh trên sâu non sâu róm Lonomia obliqua Walker ở Brazil Sau khi phân lập, nuôi cấy và lây nhiễm lại trên loài L obliqua và phân tích về hình thái và phân tử không có khác biệt so với mẫu gốc ban đầu (Alexandre et al., 2009)

Shimazu and Takatsuka (2010) lần đầu tiên phát hiện và phân lập được loài

I javanica ký sinh trên sâu non sâu róm Lymantria dispar ở miền Bắc, Nhật Bản vào mùa hè năm 2008 Nấm phát triển trên môi trường SDAY với nhiệt độ 10 -

giải pháp triển vọng để phòng trừ loài sâu nguy hiểm này ở Nhật Bản

Wazeer et al (2012) đã tiến hành khảo sát các loài nấm trong đất nông nghiệp và rừng tự nhiên, ở những nơi có côn trùng qua đông tại Kurdistan, Iraq, trong tháng 10 - 12 năm 2009 Kết quả đã phân lập và xác định được 2 loài nấm

ký sinh côn trùng là I javanica và B bassiana chiếm 38,46% Tỷ lệ chết của loài I javanica trên hai loài rệp Hyalopterus pruni Geoff và Aphis pomi De Geer đạt khá cao 66,67% và 75,59% sau 6 ngày lây nhiễm nấm Đây là ghi nhận đầu tiên về loài I javanica tại Iraq Nghiên cứu cũng cho thấy một số loài nấm

ký sinh côn trùng có thể lưu tồn một thời gian nhất định trong đất

Trước đây chi Isaria và chi Peacilomyces không có sự tách biệt, loài I javanica được xem là loài Peacilomyces javanicus Vấn đề này đã gây ra nhiều tranh luận cho các nhà khoa học và đến nay đã tách biệt thành 2 chi thuộc 3 họ riêng biệt, trong đó chi Isaria thuộc họ Cordycipitaceae, chi Peacilomyces thuộc 2

họ là Clavicipitaceae và Ophiocordycipitaceae, bộ Hypocreales Kết quả phân tích phát sinh loài dựa trên trình tự RNAs riboxom, β-tubulin cho thấy chi Isaria cùng nhóm với chi Cordyceps Các loài nấm thuộc chi Isaria có sinh sản dạng vô tính (Anamorph), còn sinh sản dạng hữu tính (Telemorph) không có hoặc chưa được biết (Luangsa-ard et al., 2009; Sung et al., 2007a; Petch, 2009)

Bảng 2.1 Lịch sử các tên gọi của loài Isaria javanica

Trichocomaceae, Eurotiales

Friedrichs and Bally (1923)

Paecilomyces javanicus (Friedrichs

& Bally) A.H.S Br & G Sm

Peacilomyces, Trichocomaceae, Eurotiales

Brown and Smith (1957)

Paecilomyces javanicus (Friederichs

& Bally) Brown & Smith

Peacilomyces, Trichocomaceae, Eurotiales

Samson (1974)

Isaria javanica (Friederichs & Bally)

Samson & Hywel-Jones

Isaria, Cordycipitaceae, Hypocreales

Luangsa-ard et al (2005)

Nhìn chung các nghiên cứu về đa dạng sinh học hay nguồn lợi tự nhiên của chi nấm Isaria còn ít Một số kết quả bước đầu cho thấy, các loài nấm Isaria phân bố khá rộng ở nhiều nước trên thế giới nhưng không phổ biến Chi nấm này chủ yếu thu thập được ở hệ sinh thái rừng nhiệt đới, với phổ vật chủ ký sinh khá

đa dạng thuộc bộ Cánh màng, bộ Cánh vảy, bộ Cánh nửa, bộ Nhện lớn, ở pha sâu non, nhộng và trưởng thành Ngoài ra, một số loài như I fumosorosea và

I javanica cũng mới phát hiện có phân bố ở cả rừng trồng và hệ sinh thái nông nghiệp nhưng không phổ biến

2.2.1.2 Nghiên cứu nhân nuôi các loài nấm thuộc chi Isaria

Theo Chun-Ping et al (2003) khi nhân sinh khối nấm Isaria tenuipes ở các điều kiện nuôi thay đổi về nguồn dinh dưỡng cacbon, khoáng, ni tơ và độ pH đã

ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển của nấm Nguồn dinh dưỡng tối ưu cho

Nghiên cứu của Ali et al (2009) đã cải tiến thành phần môi trường lỏng nuôi cấy nấm I fumosorosea để tạo ra sinh khối chủ yếu là các bào tử đính dạng chìm Với các môi trường nuôi cấy bình thường sinh khối thu được có màu trắng

và chủ yếu là sợi nấm (80-97%) Với môi trường có chứa 20-30 mg/lít

25 ml/lít Polyethylene glycol (200MW) làm giảm sự hình thành sợi nấm sinh

cấy Sinh khối thu được chủ yếu là bào tử đính chiếm hơn 60%

Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm đến khả năng nảy mầm của bào

tử nấm I fumosorosea cho thấy, sự nảy mầm yếu trong điều kiện có ánh sáng

RH trong 160 giờ (Bouamama et al., 2010)

Kết quả nghiên cứu của Gabriel et al (2010) đã lựa chọn được môi trường nhân sinh khối nấm I fumosorosea và I farinosa: Giai đoạn 1, môi trường lỏng

là mật mía (30 g/l) + nước gạo ninh nhừ (200 g/l); nước gạo ninh nhừ (200 g/l) + nấm men (5 g/l) và mật mía (30 g/l) + nước gạo ninh nhừ (200 g/l) + nấm men (5 g/l); Giai đoạn 2: nhân nuôi trên môi trường rắn, nấm I farinosa phát triển tốt nhất với bột đậu nành + ngô vỡ (ngâm nước 60 phút) và gạo nguyên kích thước dài 7mm x dày 2mm (ninh 8-10 phút với nước) Đối với nấm I fumosorosea môi trường gạo vỡ 3mm dài x 2mm dày (ngâm nước 40 phút) và gạo nguyên (ninh 8-

10 phút với nước) đều cho kết quả tốt về khả năng phát sinh bào tử

Nghiên cứu của Jae et al (2014) cho thấy bảo quản bào tử bột của nấm

I fumosorosea trên môi trường rắn từ gạo để duy trì các bào tử chịu nhiệt tốt với

2.2.1.3 Nghiên cứu hoạt chất sinh học của các loài nấm thuộc chi Isaria

Các nghiên cứu gần đây cho thấy có nhiều loài nấm thuộc chi Isaria, bên cạnh khai thác làm dược liệu, còn được sử dụng như một tác nhân phòng trừ sinh học Trong những nấm gần đây, các hoạt chất sinh học có trong một số loài nấm

chi Isaria đã được nghiên cứu chiết xuất ứng dụng làm dược liệu

Yan Shen et al (2007) xác định hợp chất FTY720 trong nấm Isaria sinclairii có khả năng ức chế các tế bào ung thư tuyến tụy

Theo Ichiro et al (2001) khi tách chiết từ hệ sợi nấm I japonica trên môi trường lỏng đã tìm thấy 2 enzym Chitinaese bằng phương pháp sắc ký DEAE Bio-Gel Pae et al (2003) tách chiết từ quả thể nấm chất Trichothecene mycotoxin 4-acetyl-12,13-epoxyl-9-trichothecene-3,15-diol (AETD) có tác dụng chữa trị bệnh bạch cầu Theo Kikuchi et al (2004) phân tích trong sinh khối nấm

I tenuipes chứa chất Paecilomycine A, B và C có hoạt tính sinh học cao Nghiên cứu tiếp sau đó của Akira et al (2005, 2009) đã phát hiện hợp chất mới chống oxy hóa và tiền chất của nó được chiết xuất từ nấm I japonica

Từ nấm I farinosa B05 chiết xuất được loại Polysaccharides có khả năng kháng u và chống oxy hóa, có chứa 90,3% carbohydrate, 8% axit uronic, 7,15% protein và 3 loại monosacarit bao gồm mannose, galactose và glucose với tỷ lệ 8.0:4.8:1.0 Chất ngoại polysaccharides hòa tan chứa 93,4% carbohydrate, 8,06% axit uronic, 4,40% protein và ba loại monosaccharides gồm mannose, galactose

và glucose với tỷ lệ 21.6:4.7:1.0 (Yan et al., 2008)

Beauvericin là cyclohexadepsipeptide tự nhiên có trong nấm B bassiana, một số loài nấm chi Fusarium và chi Isaria Theo Luangsa-ard et al (2009) nhiều loài nấm chi Isaria có chứa chất Beauvericin (một cyclohexadepsipeptide

tự nhiên) như Isaria cicadae, I fumosorosea, I japonica, I tenuipes, Cordyceps

cf takaomontana và Cordyceps dạng hữa tính của I cicadae Chất này không phát hiện được ở một số loài như I amoenerosea, I cateniannulata và

I cateniobliqua, N atypicola, P sensulato

2.2.1.4 Nghiên cứu ứng dụng chi Isaria trong phòng trừ sinh học

Cho đến nay, đi tiên phong trong phòng trừ sinh học của nấm ký sinh côn trùng chủ yếu 2 loài B bassiana và M anisopliae Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy các loài nấm chi Isaria cũng có nhiều triển vọng để phòng trừ sâu hại nông nghiệp Hiện nay, một số loài nấm chi Isaria được sử dụng phòng trừ sâu hại cây trồng như I javanica, I fariosa, I fumosorosea Các loài nấm này đã được nghiên cứu và ứng dụng vào phòng trừ một số đối tượng sâu hại thuộc bộ Lepidoptera, Hemiptera, Diptera, Coleoptera, Hymenoptera,… ở một số nước trên thế giới như Trung Quốc, Hoa Kỳ, Brazil, Thái Lan và cho kết quả tốt

Các nghiên cứu của Nigel and Hywel-Jones(2005) cho thấy, chi Isaria có triển vọng trong phòng trừ sâu hại cây trồng điển hình như loài I fumosorosea,

I javanica, I tenuipes Năm 2008 ở Argentina đã sử dụng nấm Isaria phòng trừ

sau lây nhiễm Mặt khác, các loài nấm chi Isaria thường dễ phân lập, phát triển nhanh, có số lượng bào tử nhiều nên có lợi thế nhân nuôi và ứng dụng phòng trừ Loài I fumosorosea và P fumosoroseus là tác nhân quan trọng phòng trừ rầy chổng cánh Diaphorina citri Cho trưởng thành rầy chổng cánh tiếp xúc với

chết ở công thức đối chứng Rầy bị bệnh nấm co giật chân và râu, sau 2-3 ngày xuất hiện sợi nấm mọc ở chân, sau một tuần sợi nấm bao phủ khắp cơ thể, rồi xuất hiện bào tử dạng bột khô màu xám (Jason et al., 2009) Trong phòng thí nghiệm dùng lá sạch hoặc tấm dính vàng chứa môi trường nhân tạo phun nấm I

khi tiếp xúc từ 4,9±0,21 đến 6,1±0,37 ngày (Pasco et al., 2009) Cho trưởng thành rầy chổng cánh tiếp xúc với tấm dính vàng đã phun bào tử chồi nấm I fumosorosea, trong phòng thí nghiệm ở 27°C tỷ lệ chết đạt 70%; trong nhà kính ở 25-37°C tỷ lệ chết thấp < 40% sau 1 tuần (Patrick et al., 2011) Phun dịch nấm I fumosorosea lên trưởng thành rầy chổng cánh ở phòng thí nghiệm, tỷ lệ chết đạt

Một số kết quả ghi nhận bước đầu về việc sử dụng nhiều loài nấm Isaria để phòng trừ bọ phấn trắng Bemisia tabaci Theo Scorsetti et al (2008) khi thử nghiệm 2 loài nấm I fumosorosea và I javanica trên 2 loài là bọ phấn trắng và

76,6% sau 7 ngày lây nhiễm Enrique and Walker (2009) đánh giá khả năng gây bệnh của loài Isaria sp trên bọ phấn (biotype B) hại khoai lang, trong điều kiện

trên bọ phấn trưởng thành chậm hơn và tỷ lệ chết thấp hơn so với sâu non Theo Rahim et al (2013) ở trong phòng thí nghiệm, hiệu lực của nấm

phấn tuổi 2, 3 và tuổi 4, tương ứng là 91, 90, 86 và 89% Nghiên cứu của Hong Z

et al (2013), nấm I javanica có khả năng gây bệnh cho loài bọ phấn hại khoai

ở độ ẩm tương đối thấp và không đổi, nhưng khi giữ độ ẩm cao trong 24 giờ đầu rồi chuyển sang độ ẩm thấp các mẫu phân lập có thể xâm nhiễm gây bệnh ở tất cả các giai đoạn phát triển từ trứng đến nhộng Những kết quả này cho thấy loài

I javanica có tác dụng phòng trừ tốt loài bọ phấn ở các điều kiện môi trường khác nhau, có triển vọng để phát triển thành một loại thuốc trừ sâu vi sinh vật để kiểm bọ phấn trắng hại khoai lang

Nghiên cứu ứng dụng phòng trừ một số loài sâu róm cho thấy, nấm

phòng thí nghiệm tại Thổ Nhĩ Kỳ (Manana et al., 2013) Tuy nhiên, loài nấm

I javanica lại có hiệu lực khá cao đối với ấu trùng sâu róm L dispar ở nồng độ

ra, nấm I javanica còn có tiềm năng ứng dụng để kiếm soát sâu tơ Plutella xylostella hại rau họ thập tự (Yin et al., 2010)

Theo Murat et al (2011) nấm I farinosa là tác nhân gây chết đối với bọ xít trưởng thành Aelia rostrata với tỷ lệ chết đạt 70% sau 12 ngày lây nhiễm ở điều

Bên cạch đó, đã có một số dẫn liệu đánh giá về khả năng kết hợp của nấm

I fumosoroseus và ong ký sinh trong phòng trừ sâu hại Theo Pasco et al (2008), kết hợp nấm với loài ong ký sinh Encarsia formosa phòng trừ bọ phấn Trialeurodes vaporariorum trên cây đậu cô ve Phaseolus vulgaris và cây Pelargonium domesticum Kết quả là trên cả hai cây khi cho bọ phấn tiếp xúc với ong ký sinh trong 2 ngày và 4 ngày, sau đó phun nấm thì tỷ lệ chết lần lượt đạt 99,5% và 75,5%; 94,6% và 59,4% Như vậy, trên cây đậu cô ve sự kết hợp giữa nấm và ong ký sinh mang lại hiệu quả rõ rệt, nhưng trên cây P domesticum việc kết hợp không mang lại hiệu quả so với tác động riêng biệt Còn theo nghiên cứu của David et al (2012), đã đánh giá khả năng kết hợp của nấm với ong ký sinh Lysiphlebus testaceipes phòng trừ rệp Toxoptera citricidus Kirkaldy hại cam quýt tại Florida, Mỹ Trong 2 tuần đầu tỷ lệ rệp chết không sai khác so với đối chứng, nhưng sau đó rệp có hiện tượng nhiễm bệnh nhiều Vì vậy, có thể kết hợp hai tác nhân này trong phòng trừ rệp hại cam quýt

Hiện nay nhiều nước trên thế giới đã và đang nghiên cứu, ứng dụng nấm ký sinh côn trùng trong phòng trừ sinh học sâu hại Bên cạnh các loài nấm truyền thống thuộc chi Beauveria và Metarhizium, thì chi nấm Isaria cũng đã bắt đầu được nghiên cứu và hứa hẹn có thể tạo ra chế phẩm hiệu quả Kết quả bước đầu cho thấy các loài nấm chi Isaria điển hình như I fumosorosea, I javanica,

I fariosa có nhiều triển vọng trong phòng trừ nhiều loài sâu hại cây trồng

2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm vòng đời và chu kỳ phát triển của nấm ký sinh trên côn trùng

Trong công trình nghiên cứu về sự gây bệnh của nấm ký sinh côn trùng, Charnley (1989) cho rằng, chu kỳ phát triển của nấm gây bệnh trên cơ thể côn trùng gồm 8 giai đoạn sau: (1) Bào tử phát tán và bám dính trên lớp vỏ cơ thể, (2) Bào tử nảy mầm và hình thành giác bám, (3) Xâm nhập qua lớp vỏ cơ thể và tăng sinh, (4) Xâm nhập biểu bì và nội bì, (5) Sợi nấm xâm nhập mô hoặc hình thành bào tử chồi trong xoang máu, (6) Côn trùng bị chết, (7) Sinh trưởng hoại sinh, (8) Bào tử nấm phát tán

Tuy nhiên, theo Clarkson and Charnley (1996), chu kỳ nấm gây bệnh côn trùng có thể chia thành 5 giai đoạn như sau: (1) Bào tử bám dính trên lớp vỏ cơ thể, (2) Bào tử nảy mầm và hình thành giác bám, (3) Hình thành ống mầm và sợi nấm xâm nhập qua lớp vỏ cơ thể, (4) Hình thành bào tử chồi tạo tản nấm trong xoang máu (haemolymph) của côn trùng vật chủ, (5) Sợi nấm mọc ra bên ngoài Cheah et al (2004), nghiên cứu phòng trừ sinh học sâu Adelges tsugae Annand (Homoptera: Adelgidae) gây hại cây Tsuga (thuộc nhóm cây thông) Nấm có thể xâm nhập qua lớp vỏ cơ thể để gây bệnh làm chết côn trùng Sau khi côn trùng bị chết, một số lượng lớn bào tử nấm được phát tán từ xác chết để tiếp tục chu trình lây nhiễm mới trong quần thể côn trùng Chu kỳ xâm nhiễm tổng quát của nấm ký sinh côn trùng gồm 6 giai đoạn: (1) Bào tử bám dính lên vỏ cơ thể vật chủ, (2) Bào tử nảy mầm, (3) Xâm nhập qua lớp vỏ cơ thể vật chủ, (4) Sợi nấm tăng sinh bên trong cơ thể vật chủ, (5) Hình thành bào tử bên ngoài xác chết vật chủ, (6) Bào tử phát tán và tiếp tục chu kỳ xâm nhiễm mới (hình 1.1)

Thomas and Read (2007) đưa ra chu kỳ phát triển in vivo của nấm gây bệnh côn trùng diễn ra 5 bước: (1) Bào tử bám dính trên lớp biểu bì, (2) Bào tử nảy mầm hình thành ống mầm và giác bám, (3) Xâm nhập vào lớp biểu bì bằng kết hợp của áp lực cơ học và hoạt tính của các enzyme làm mất lớp biểu bì, (4) Nấm tăng trưởng trong thể xoang vật chủ, (5) Hình thành bào tử bên ngoài và phát tán khi vật chủ bị chết (hình 1.2)

Hình 1.1 Chu kỳ xâm nhiễm của nấm

ký sinh côn trùng

Hình 1.2 Cơ chế xâm nhiễm của nấm

ký sinh côn trùng

Theo Vega et al (2008), chu kỳ xâm nhiễm của nấm B bassiana và Clonostachys rosea trên trưởng thành mọt đục quả cà phê Hypothenemus hampei gồm 5 giai đoạn: (1) Côn trùng chết, (2) Sợi nấm bắt đầu phát triển, (3) Sợi nấm bao phủ cơ thể côn trùng, (4) Hình thành bào tử và (5) Phát tán bào tử Còn theo Gao et al (2011), chu kỳ xâm nhiễm của nấm Metarhizium trên côn trùng vật chủ có 4 giai đoạn chính như sau: (A) Bào tử nảy mầm hình thành giác bám, (B) Sợi nấm tấn công tế bào máu sau khi xâm nhập qua lớp biểu bì, (C) Nấm nảy mầm sản sinh bào tử chồi để tạo điều kiện thuận lợi cho phát tán trong xoang cơ thể côn trùng, (D) Xác chết phủ đầy sợi nấm và hình thành bào tử

Khi bàn về sử dụng chế phẩm nấm phòng trừ côn trùng gây hại, Sandhu

et al (2012) cho rằng cơ chế xâm nhiễm của nấm gây bệnh côn trùng gồm 4 giai đoạn: (1) Bào tử bám dính vào vỏ cơ thể vật chủ, (2) Bào tử nảy mầm và hình thành cấu trúc xâm nhiễm, (3) Sự xâm nhập qua lớp vỏ cơ thể vật chủ, (4) Sản sinh độc tố

2.2.2.1 Nghiên cứu về sự xâm nhập của nấm qua lớp vỏ cơ thể của côn trùng Theo nghiên cứu của Sue (1979), bào tử nấm B bassiana có tốc độ nảy mầm nhanh (trong vòng 18 giờ) trên bề mặt của sâu non sâu xanh hại ngô (Heliothis zea) và ngay sau đó bắt đầu xâm nhập vào lớp biểu bì Enzyme được sản sinh bởi các sợi nấm xâm nhập làm suy giảm chức năng của lớp biểu bì kể từ

Dịch thể máu

Bào tử chồi Lớp nội bì

Vòi xâm nhập Biều bì trên Giác bám Bào tử

Biều bì dưới

khi lỗ hổng được hình thành tại thời điểm xâm nhập Bằng chứng trực tiếp cho thấy bào tử cũng có thể nảy mầm bên trong lỗ thở của sâu non và có thể xâm nhập vào cơ thể sâu non theo con đường lỗ thở vào bên trong xoang máu và sau

đó nấm phát triển nhanh lấp đầy nội quan trong xoang cơ thể

Bào tử nấm bám vào bề mặt vỏ cơ thể vật chủ, khi đủ điều kiện độ ẩm, bào

tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng Giai đoạn xâm nhập được tính từ khi bào tử nấm mọc mầm cho đến lúc hoàn thành xâm nhập vào trong xoang cơ thể côn trùng Bào tử nấm sau khi mọc mầm, sản sinh các enzyme ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp vỏ côn trùng để phân hủy như protease, chitinase, lipase, Các enzyme được tạo ra nhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài, các mẫu phân lập của một loài nấm Hai enzyme quan trọng nhất tham gia phân hủy lớp vỏ cơ thể côn trùng là protease và chitinase, liên quan trực tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng của nấm (Charley, 2003; Luangsa-ard et al., 2006)

Theo Vineet et al (1999) khả năng nảy mầm, xâm nhập của nấm

B bassiana trên lớp vỏ cơ thể tằm Bombyx mori, bào tử nảy mầm khoảng 8 giờ sau khi lây nhiễm, hình thành giác bám (appressorium) trong vòng 24 giờ và các sợi nấm gắn vào lớp biểu bì tạo thành một lỗ tròn rõ rệt Các sợi nấm xâm nhập vào trong xoang máu (haemolymph), sinh trưởng nhanh, tạo thành phức hợp sợi nấm, gây chết tằm trong khoảng 5 - 6 ngày

Các lớp biểu bì của vỏ cơ thể vật chủ là nơi đầu tiên chống lại sự xâm nhiễm của nấm Nếu nấm xâm nhập qua lớp biểu bì thì khả năng xâm nhiễm thành công phụ thuộc vào khả năng sau khi nấm bệnh chiến thắng được các phản ứng miễn dịch của côn trùng Côn trùng có thể phản ứng theo cách thức tế bào và thể dịch đối với khả năng xâm nhiễm của nấm, với hoạt động miễn dịch xảy ra sớm như suy thoái lớp biểu bì trong quá trình xâm nhập Nấm thường có 2 hình thức tác động là sinh trưởng và phát triển nhanh chống lại phản ứng tự vệ của côn trùng, hoặc sản sinh các chất ngăn chặn hệ thống bảo vệ của vật chủ (Gillespie et al., 2000; Roberto et al., 2001)

Như vậy, cơ chế xâm nhập của nấm qua lớp vỏ cơ thể của côn trùng hiện nay chưa rõ ràng Các nghiên cứu cho rằng bào tử nấm xâm nhập được qua lớp

vỏ do tác dụng chủ yếu và quyết định là của enzyme phân huỷ biểu bì côn trùng như protease, chitinase và lipase (Charley et al., 1989; Luangsa-ard et al., 2006;

Pornpoj et al., 2005); hoặc do tác dụng cơ học của ống mầm hoặc giác bám tạo lỗ đâm xuyên lớp vỏ cơ thể; hoặc kết hợp cả tác dụng cơ học và enzyme (Sue, 1979; Vineet et al., 1999; Wang et al., 2010;…) Mặt khác, các loài nấm và vật chủ khác nhau thì quá trình này khác nhau cả về cấu trúc và cách thức xâm nhập, khả năng sản sinh enzyme, vai trò tác động cơ học, thời gian, đặc điểm của vật chủ như cấu tạo lớp vỏ cơ thể, hàm lượng nước, khả năng tự vệ, điều kiện nhiệt

độ, độ ẩm, ánh sáng,… đều có ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh côn trùng của nấm Đây là những vấn đề cần được nghiên cứu vì khả năng xâm nhập qua lớp

vỏ cơ thể của vật chủ côn trùng là pha đầu tiên và quan trọng nhất có ý nghĩa quyết định đến khả năng xâm nhiễm gây bệnh của nấm với côn trùng vật chủ 2.2.2.2 Nghiên cứu giai đoạn phát triển bên trong và gây chết vật chủ côn trùng của nấm

Giai đoạn phát triển của nấm ký sinh trong cơ thể đến khi côn trùng chết là giai đoạn sống ký sinh của nấm và gây chết vật chủ Nấm ký sinh côn trùng thường sản sinh ra các chất chuyển hóa với bản chất là các độc tố làm cho vật chủ suy yếu Nấm Beauveria spp sản sinh một số chất chuyển hóa gồm bassianine, beauvericine, bassianolide, beauveriolide, bassiacridine, osporeine và tenelline (Quesada and Vey, 2004; Vining et al., 1962) (dẫn theo Vega et al., 2008) Các loài Isaria spp sản sinh chất độc isariine (Briggs et al., 1966); Hirsutella thompsonii sản sinh phomalactone (Krasnoff and Gupta, 1994) và hirsutellin A (Mazet et al., 1995), Metarhizium spp sản sinh destruxine và cytochalasine (Roberto, 1981); P tenuipes (= I tenuipes) sản sinh tenuipesine (Kikuchi et al., 2004) (dẫn theo Vega et al., 2008)

Trong xoang cơ thể côn trùng nấm tiếp tục phát triển, hình thành hàng loạt sợi nấm và bào tử chồi, chúng phân tán khắp xoang cơ thể theo dịch máu, phá hủy các tế bào máu và làm giảm tốc độ lưu thông máu Toàn bộ các nội quan bị xâm nhập Nấm thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp, hoạt động của côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kích thích bên ngoài, kết quả là vật chủ mất khả năng phòng trừ hoạt động sống và dẫn đến chết (Luangsa-ard et al., 2006)

Pornpoj et al (2005), khi nghiên cứu khả năng gây bệnh của nấm N rileyi trên sâu non sâu khoang cho biết khả năng xâm nhập qua bề mặt lớp biểu bì sau

48 giờ lây nhiễm Khả năng phân giải lớp biểu bì bên trong vỏ cơ thể sau 2,5 ngày lây nhiễm, diễn ra trước khi sợi nấm xâm nhập và xâm chiếm các lớp biểu

bì, cấu trúc xâm nhập của nấm sau đó chuyển thành các cấu trúc sinh trưởng trong xoang máu Các cơ quan trong cơ thể bị biến đổi và để sợi nấm xâm lấn sau

5 - 6 ngày lây nhiễm

Như vậy, sau khi xâm nhập qua lớp vỏ vào trong cơ thể vật chủ côn trùng thì nấm bắt đầu sinh trưởng nhanh chóng, xâm nhập vào xoang cơ thể và đi vào máu, hoặc xâm nhập bằng đường tiêu hoá qua thành ruột rồi cũng đi vào xoang máu Quá trình sinh trưởng trong xoang máu côn trùng hình thành blastospore và khả năng sản sinh của bào tử và nấm thường tiết ra độc tố ức chế khả năng miễn dịch của vật chủ và làm vật chủ bị chết (Luangsa-ard et al., 2006, 2009; Pornpoj

et al., 2005; Vega et al., 2008; Vineet et al., 1999;…)

2.2.2.3 Khả năng hình thành và phát tán bào tử pha hoại sinh

Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết là giai đoạn sống hoại sinh của nấm ký sinh Nấm ký sinh côn trùng có khả năng sản sinh ra các chất có hoạt tính như thuốc kháng sinh ức chế hoạt động của vi khuẩn và nấm hoại sinh khác nên chúng có thể cạnh tranh với các sinh vật này để tồn tại và phát triển, làm cho xác vật chủ không bị phân hủy Sau khi nấm ký sinh côn trùng đã sử dụng cạn kiệt nguồn dinh dưỡng bên trong cơ thể vật chủ, chúng chuyển sang giai đoạn hình thành bào tử Lúc này nấm đâm xuyên qua vỏ cơ thể mọc thành sợi ra bên ngoài cơ thể vật chủ thông qua tác động cơ học, sau đó các bào tử được hình thành trên lớp sợi nấm ở bề mặt cơ thể vật chủ Nói chung các loài vật chủ bị bao bọc toàn bộ bên ngoài bởi hệ sợi nấm và bào tử, vì vậy khó xác định loài côn trùng vật chủ (Luangsa-ard et al., 2006)

Nghiên cứu phương thức lây nhiễm N rileyi gây bệnh trên sâu non sâu khoang Pornpoj et al (2005) cho biết, vào cuối chu kỳ xâm nhiễm, sợi nấm mọc lên từ lớp biểu bì và hình thành cuống bào tử đính (condiophores) Sau 7 ngày lây nhiễm, cơ thể sâu được bao phủ hoàn toàn bởi sợi nấm màu trắng, 1-2 ngày tiếp theo chuyển sang màu xanh xanh lá cây và sản sinh bào tử Như vậy, chu kỳ phát triển của nấm N rileyi trên sâu non sâu khoang hoàn thành sau 8-9 ngày Vega et al (2008), nghiên cứu khả năng xâm nhiễm nấm B bassiana và nấm Clonostachys rosea trên trưởng thành mọt đục quả cà phê Hypothenemus hampei cho thấy, tỷ lệ nảy mầm của bào tử nấm B bassiana đạt 83% sau 48 giờ, nấm C rosea đạt 83% sau 24 giờ Tỷ lệ chết sau 21 ngày lây nhiễm đạt là 100% đối với B bassiana và 82,5% đối với C rosea Mật độ bào tử nấm B bassiana

Chu kỳ phát triển tính từ khi lây nhiễm đến khi phát tán bào tử từ xác chết của côn trùng của nấm B bassiana là 9,9±0,2 ngày, của C rosea là 16,4±1,1 ngày Chu kỳ phát triển của nấm ký sinh trên côn trùng hoàn thành khi chúng hình thành và phát tán bào tử vô tính trên xác vật chủ chết (và bắt dầu chu kỳ xâm nhiễm mới) Các sợi nấm bên ngoài tạo ra các bào tử vô tính, khi thành thục bào tử phát tán ra môi trường xung quanh kết thúc một chu trình nhiễm bệnh Khả năng hình thành và phát tán bào tử ảnh hưởng đến khả năng lây lan bệnh sang các cá thể khác Trong lúc đó, khả năng tồn tại của nấm sau khi xâm nhiễm phụ thuộc vào loài, mẫu phân lập, đối tượng vật chủ và điều kiện môi trường Như vậy, cho đến nay các công trình nghiên cứu đề cập về cơ chế gây bệnh hay quá trình xâm nhiễm của nấm gây bệnh côn trùng chưa đưa ra được mẫu hình thống nhất của chu kỳ phát triển của nấm trên côn trùng vật chủ Đó là (i) chu kỳ xâm nhiễm bao gồm các pha, các giai đoạn khác nhau có tính tuần tự nhưng phân chia thành các pha, các giai đoạn chưa thống nhất giữa các công trình nghiên cứu, như chu kỳ xâm nhiễm có 8 giai đoạn (Charnley, 1989), có 4 giai đoạn (Sandhu et al., 1993), có 6 giai đoạn (Clarkson and Charnley, 1996; Cheah et al., 2004), có 3 pha chính (Charnley, 2003), có 5 giai đoạn (Thomas and Read, 2007; Vega et al., 2008), 4 giai đoạn chính (Gao et al., 2011); (ii) hoặc

là chỉ tập trung vào khả năng xâm nhập qua lớp vỏ cơ thể (Sandhu et al., 2012; Thomas and Read, 2007), hoặc là chỉ tập trung vào khả năng phát triển của nấm (Gao et al., 2011), hoặc là chỉ tập trung vào pha hoại sinh bên ngoài (Posada and Vega, 2005; Vega and Posada, 2008) Trong đó, khả năng phát triển của nấm bệnh trong xoang cơ thể côn trùng vật chủ còn ít được nghiên cứu

2.2.3 Nghiên cứu tuyển chọn nấm ký sinh côn trùng để phòng trừ sâu hại

Có thể nói, nghiên cứu tuyển chọn được các chủng nấm triển vọng giữ vai trò rất quan trọng, là cơ sở để tạo ra được chế phẩm nấm có hiệu quả cao đối với sâu hại Nấm sau khi được phân lập từ các nguồn khác nhau tuyển chọn các chủng có hoạt tính diệt côn trùng cao, phục vụ cho mục đích tạo chế phẩm nấm

Có nhiều phương pháp đánh giá tuyển chọn chủng có hiệu lực cao và ổn định như nhân nuôi trên môi trường dinh dưỡng đặc biệt hoặc gây đột biến bằng hóa chất, chiếu tia tử ngoại, bằng sinh học phân tử Trong đó, phương pháp được sử dụng nhiều nhất là thử lây nhiễm bệnh trực tiếp lên sâu hại để đánh giá hiệu lực gây bệnh và phổ vật chủ ký sinh

côn trùng trong đất trồng mía ở Australia Trong số 95 chủng thử nghiệm trực tiếp, chỉ chọn được 2 chủng (F114 và F1153) là có khả năng diệt được loài sâu hại rễ mía Lepidota frenchi và L consobrina và chủng F114 diệt được loài

nấm/g đất Hanel (1982) đã chọn lọc từ 22 chủng thì chỉ có 1 chủng

M anisopliae là phù hợp để sử dụng trong phòng trừ loài mối Nasutiterm esexitiosus (Hill) (dẫn theo Phạm Văn Nhạ, 2013)

Đánh giá hiệu lực của 4 chủng nấm B bassiana phân lập ở Argentina (Bb 1,

10, 25, và 65) từ loài bọ xít Triatoma infestans căn cứ vào tỷ lệ chết ở các mức nhiệt độ khác nhau, Roberto et al (2001) đã xác định được chủng Bb10 đạt cao

Kết quả nghiên cứu của Posada and Vega (2005) đã phát triển một phương pháp mới nhằm lựa chọn các chủng có tiềm năng phòng trừ sinh học từ 50 chủng nấm B bassiana trên mọt đục quả cà phê Các phương pháp sàng lọc được dựa

phối, khả năng nảy mầm bào tử, chu kỳ phát triển nấm, nồng độ bào tử hình thành trên côn trùng Dựa trên các thông số đó, chỉ có 11 chủng có tiềm năng được tuyển chọn để tiếp tục nghiên cứu

Cũng dựa trên cơ sở phương pháp mới trên, Lopes et al (2011) đã đánh giá tuyển chọn từ 3 chủng nấm I javanica là URM4993, URM4994, URM4995 ký

bào tử hình thành trên xác chết Kết quả xác định được chủng I javanica

trùng không có sự khác biệt giữa các chủng nấm

Kết quả nghiên cứu của Wilberth et al (2013) cho thấy các chủng nấm

I fumosorosea (4 chủng bản địa: Pf-Tim, Pf-Tiz, Pf-Hal and Pf-Tic và 1 chủng nhập ngoại Pae-sin) đều gây chết trên thiếu trùng tuổi 2 của loài bọ phấn Bemisia

thấp nhất 3,7 ngày so với các chủng nội địa dao động 4,3-6,3 ngày

Có thể nói, nghiên cứu tuyển chọn các chủng nấm triển vọng đã có từ trước

đây, nhưng việc đánh giá chủ yếu dựa trên các tiêu chí về tỷ lệ chết, LC50, LT50khả năng phát triển trên môi trường nuôi cấy nên chưa đánh giá được đầy đủ tiềm năng của các chủng Hiện nay, bên cạnh dựa trên tiêu chí hiệu lực, việc tuyển chọn còn đánh giá thêm các tiêu chí phản ảnh về khả năng phát triển của nấm cả sau khi gây chết vật chủ như tỷ lệ mọc nấm, chu kỳ phát triển của nấm, nồng độ bào tử hình thành Việc đánh giá như trên sẽ giúp xác định được những chủng tốt nhất, tăng tính ổn định và khả năng lưu tồn của nấm trên đồng ruộng

2.2.4 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh của nấm trên côn trùng

Khả năng gây bệnh của nấm ký sinh trên vật chủ côn trùng chịu tác động của nhiều yếu tố khác nhau, bao gồm nguồn nấm, vật chủ, điều kiện ngoài cảnh (nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng) Mỗi yếu tố có những ảnh hưởng nhất định, đồng thời

có mối quan hệ tác động lẫn nhau

2.2.4.1 Nguồn nấm ký sinh

Nấm ký sinh côn trùng có phổ ký chủ rộng nhất trong các vi sinh vật gây bệnh cho các loài chân khớp Sự gây bệnh của nấm lên cơ thể côn trùng phụ thuộc vào khả năng sản sinh các enzyme và các độc tố, sức sống của loài/chủng; đồng thời cũng chịu ảnh hường bởi sinh lý của ký chủ (kháng thể) và điều kiện môi trường Yếu tố quan trọng trong việc lựa chọn loài/chủng là độc lực, đó là số lượng của bào tử có thể gây lên bệnh trong một nhóm của côn trùng Mật độ các bào tử phải đủ lớn đảm bảo tốt khả năng côn trùng tới sẽ tiếp xúc với số lượng

đủ, cho nên số lượng bào tử trong môi trường phải nhiều hơn ngưỡng gây nhiễm tối thiểu Khi một nấm có độc tố cao sẽ cần ít bào tử để gây bệnh, còn nấm yếu sẽ cần nhiều hơn Mật độ bào tử được xác định qua nồng độ, liều lượng bằng g (ml) Hiệu lực của nấm I javanica đối với loài mối Coptotermes gestroi đạt hiệu

phòng trừ loài mối này (Lopes et al., 2011)

Nấm Isaria sp là tác nhân gây bệnh loài bọ phấn trắng Bemisia tabaci

thời gian chiếu sáng 14L : 10D) thì mật độ gây chết trung bình đối với ấu trùng

2.2.4.2 Vật chủ côn trùng

Đặc điểm hình thái và sinh lý của côn trùng liên quan tới tính mẫn cảm đối với nấm ký sinh côn trùng Các yếu tố liên quan đến hiệu lực gây bệnh của nấm như mật độ phân bố, tập tính, giai đoạn phát triển, dinh dưỡng, hoạt chất, các yếu

tố môi trường, dinh dưỡng, vẫn chưa được hiểu rõ Thường những loài côn trùng hoạt động nhiều thì mẫn cảm hơn những loài ít hoạt động (Vago, 1963) Mật độ côn trùng là một trong những yếu tố đóng vai trò quyết định đến khả năng gây bệnh của nấm Khi mật độ côn trùng tăng, xác suất để chúng tiếp xúc với tác nhân gây bệnh như nấm (tác nhân gây bệnh trực tiếp hoặc lây nhiễm

từ cá thể bị bệnh khác) cũng tăng lên Mật độ còn ảnh hưởng gián tiếp đến khả năng hoạt động, tập tính, sức khỏe, khả năng cạnh tranh trong loài, từ đó ảnh hưởng đến trạng thái sinh lý và tính mẫn cảm của côn trùng Mật độ quá cao cũng đã được chỉ ra sự cạnh tranh trong loài, và sau đó làm ảnh hưởng tới sự nhiễm bệnh của côn trùng do các nhân tố không phải là nấm (Steinhaus, 1958) Tập tính của côn trùng cũng có thể ảnh hưởng tới sự phát triển của bệnh và

có thể làm ảnh hưởng tới sự lây lan của bệnh sang các côn trùng khỏe Ví dụ, tập tính sống quần tụ, vị trí và phương thức gây hại cây trồng, thời điểm hoạt động, khả năng di chuyển, Một số loài côn trùng bị nhiễm các bệnh do nấm thường

bò lên ngọn cây, khi chết bám vào cây (như châu chấu khi bị nhiễm nấm Entomophaga grylli) Đặc điểm này làm tăng khả năng phát tán và khả năng bắt gặp vật chủ Tuy nhiên, những vấn đề này cũng chưa được ghi nhận nhiều Các giai đoạn phát triển của côn trùng đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng gây bệnh của nấm Nghiên cứu cho thấy không phải tất cả các giai đoạn hay độ tuổi của côn trùng đều có tính mẫn cảm như nhau đối với sự gây bệnh bởi nấm Thường thì giai đoạn sâu non của côn trùng mẫn cảm hơn so với khi trưởng thành, như sâu non sâu đục thân ngô Ostrinia nubilalis ở tuổi nhỏ mẫn cảm hơn các tuổi lớn đối với nấm B bassiana (Feng et al., 1985); tốc độ gây bệnh của loài Isaria sp trên trưởng thành bọ phấn chậm hơn và tỷ lệ chết thấp hơn so với sâu non (Enrique and Walker, 2009) Nhưng cũng có một số loài thì ngược lại, như bọ trĩ Frankliniella occidentalis trưởng thành mẫn cảm hơn sâu non đối với nấm Verticillium ecanii (Vestergaard et al., 1995)

2.2.4.3 Điều kiện ngoại cảnh

Sự gây bệnh của nấm ký sinh trên côn trùng vật chủ có quan hệ chặt chẽ với điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng Nghiên cứu của Sandhu et al

(1993), nhiệt độ và độ ẩm tương đối ảnh hưởng đến khả năng tồn tại bào tử đính

và hoạt lực độc của nấm đối với sâu xanh (Helicoverpa armigera) Bào tử

khác nhau (0, 33, 53, 75, 85 và 98% RH) và được xác định trong một khoảng

tăng Bào tử vẫn gây độc nguy hiểm cho sâu non tuổi ba của H armigera trong điều kiện lưu giữ đảm bảo sau 24 tháng

Theo nghiên cứu của Steven and Matthew (2001), độ ẩm tương đối và nhiệt

độ ảnh hưởng đến hình thành bào tử nấm M anisopliae var acridum trên châu chấu (Schistocerca gregaria) trong phòng thí nghiệm Sau 10 ngày khả năng phát

Roberto et al (2001) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các mức nhiệt độ khác

gây chết của 4 chủng B bassiana phân lập từ Argentina (Bb 1, 10, 25, và 65) đối với loài bọ xít Triatoma infestans Kết quả, tỷ lệ chết đạt cao nhất là chủng Bb10,

ở các mức nhiệt độ thí nghiệm

Khi lây nhiễm bào tử nấm I fumosoroseus lên thiếu trùng tuổi 4 của bọ phấn Trialeurodes vaporariorum làm tỷ lệ lột xác sang trưởng thành điều kiện 16L: 8D thấp hơn so với 24L Tỷ lệ lột xác thành trưởng thành của thiếu trùng bọ phấn phụ thuộc vào tốc độ nhiễm nấm và chế độ chiếu sáng (Pasco et al., 2004)

hoặc kết hợp cả 2 loài nấm N rileyi và B bassiana đều cho kết quả tương tự nhau Như vậy, 2 loài nấm không có tác động hỗ trở để tăng hiệu quả gây bệnh Khi nhiệt độ tăng làm giảm tính độc của nấm, trong đó loài N rileyi mẫn cảm hơn loài B bassiana (Rao et al., 2006)

Như vậy, nấm ký sinh - vật chủ côn trùng - điều kiện ngoại cảnh là 3 nhóm yếu tố có quan hệ mật thiết với nhau, ảnh hưởng quyết định đến hiệu quả gây

bệnh của nấm ký sinh trên côn trùng Đồi với hầu hết các loài nấm thì yếu tố nhiệt độ và độ ẩm thường có ảnh hưởng lớn nhất tới sự gây bệnh trên côn trùng Mặc dù nấm ký sinh côn trùng đã được ứng dụng hơn 100 năm nay nhưng nghiên cứu về sự gây bệnh của nấm trong mối quan hệ với các yếu tố sinh thái còn rất ít được biết đến Hiện nay đã có một số nghiên cứu còn mang tính độc lập, chưa đủ

để khái quát thành mối quan hệ về sự gây bệnh của nấm ký sinh côn trùng với các yếu tố sinh thái (Jason et al., 2009; Sandhu et al., 1993; Vega et al., 2009) Cho nên, cần có các nghiên cứu để hiểu biết mối quan hệ này nhằm nâng cao hiệu quả ứng dụng chế phẩm nấm ký sinh côn trùng phòng trừ sâu hại

2.2.5 Nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng để phòng trừ sâu khoang Sâu khoang là đối tượng dịch hại nguy hiểm trên nhiều loài cây trồng, nhất

là cây lạc ở nhiều nước trên thế giới Các biện pháp phòng trừ sâu khoang bằng thuốc hóa học không đem lại hiệu quả Cho nên, việc nghiên cứu ứng dụng nấm

ký sinh côn trùng để phòng trừ sâu khoang là giải pháp triển vọng và đang được quan tâm nhưng cho đến nay mới có một số nghiên cứu bước đầu

Theo kết quả của Vimala et al (2003) khi đánh giá hiệu lực phòng trừ của

nhất đạt 77-80% sau 7 ngày

Đánh giá khả năng gây bệnh của 4 loài nấm trên sâu khoang thì 2 loài

B brongniartii và N rileyi có tác dụng gây bệnh cao nhất, với thời gian gây chết

100% và 95,2% Hai loài P fumosoroseus và B bassiana cũng có độc tính với

lệ chết tương ứng là 85,7% và 71,4% (Lin et al., 2007)

Các nghiên cứu khác cũng cho thấy loài B bassiana có nhiều triển vọng phòng trừ sâu khoang Vijayavani et al (2009) đã nghiên cứu khả năng gây bệnh trên sâu khoang của 2 chủng B bassiana (SBT 11 và SBT 16) trong điều kiện phòng thí nghiệm đều có tỷ lệ chết đạt 100% Chủng B bassiana SBT11 hiệu lực nhanh hơn so với chủng B bassiana SBT16 có thời gian gây chết trung bình

Baskar et al (2012) thì chủng B bassiana (Bb10) thu thập ở Tamil Nadu, Ấn Độ

68,06%, trọng lượng nhộng tối thiểu 183 mg, giảm tỷ lệ vũ hoá từ 22,91% đến 100%; trưởng thành bị dị tật phát triển không bình thường Chủng Bb10 được xem một giải pháp thay thế hữu ích thay thế dần thuốc trừ sâu hóa học

Nhìn chung, trên thế giới các nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng trong phòng trừ sâu khoang còn hạn chế, mới chỉ có một số nghiên cứu thời gian gần đây Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào các loài B bassiana và N rileyi, còn các loài nấm chi Isaria còn ít được quan tâm

2.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM

2.3.1 Nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng chi Isaria

2.3.1.1 Thành phần loài nấm chi Isaria và vật chủ của chúng

Ở Việt Nam có một số điều tra khảo sát về thành phần các loài nấm ký sinh côn trùng chi Isariai ở hệ sinh thái rừng và hệ sinh thái nông nghiệp

Vườn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An được đánh giá có tính đa dạng sinh học cao, chứa đựng nguồn lợi lớn về nấm ký sinh côn trùng Theo kết quả nghiên cứu của Trần Ngọc Lân và cs (2008a, b) đã thu thập và xác định được 71 loài nấm thuộc 17 chi ký sinh trên vật chủ thuộc 3 bộ côn trùng khác nhau, trong đó chi Isaria có 4 loài là I farinosa, I javanica, I tenuipes, Isaria sp Trần Ngọc Lân

và cs (2011a) đã xác định được 101 loài nấm thuộc 21 chi ký sinh trên 11 bộ côn trùng, 1 bộ nhện Chi Isaria có 10 loài, 134 mẫu, trong đó I tenuipes phổ biến nhất, tiếp theo là I javanica

Theo Trần Ngọc Lân và cs (2011a, b) loài nấm I tenuipes thu thập tại VQG Pù Mát, Nghệ An chỉ ký sinh trên nhộng sâu cánh vảy, quả thể có 4 dạng hình thái (hoa cúc trắng, lục bình trắng, bông tuyết, dạng vô tính kết hợp hữu tính), sinh trưởng nhanh trên PDA, bào tử dạng bột và có triển vọng trong phòng trừ sâu hại cây trồng

Theo Nguyễn Thị Thúy và cs (2012b) đã phát hiện dạng sinh sản hữu tính của loài I tenuipes là Cordyceps takaomontana tại VQG Pù Mát Nấm

C takaomontana ký sinh trên nhộng côn trùng bộ Cách vảy, quả thể từ 2-4 cái; màu vàng nhạt đến da cam nhạt; hình trụ hoặc hình chuỳ; dài 3,90-11,20 mm

sau 12 ngày đạt 38,18±4,74 mm Đây là một trong ít loài nấm thuộc chi Isaria xác định được dạng hữu tính và thuộc chi Cordyceps

Tại Vườn Quốc gia Cát Tiên đã thu thập được 259 mẫu, định loại xác định