phương pháp xác định clenbuterol và salbutamol trong thức ăn chăn nuôi và dư lượng trong thịt

Do những bức xúc đó, nhóm em đã chọn tìm hiểu và trình bày đề tài “Phương pháp xác định Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn nuôi và dư lượng trong thịt” để từ đó có thể ngăn chặ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

TIỂU LUẬN MÔN HỌC

Kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm

Đề tài:

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI VÀ DƯ LƯỢNG TRONG THỊT

Hà Nội, tháng 3 năm 2017

Mục lục

LỜI MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, tình hình an toàn thực phẩm luôn là vấn đề nóng, được quan tâm hàng đầu không chỉ ở trong nước mà còn trên thế giới Có rất nhiều vụ gian lận thực phẩm xảy ra trên thế giới như: Thịt cừu giả thịt bò ở Anh, Thịt ngựa dán mác thịt bò, hay Thịt chuột đội lốt thịt cừu ở Trung Quốc… Nước ta cũng không ngoại lệ với những vụ đình đám như thịt lợn giả thịt bò hay dùng chất kích thích tăng trưởng, chất tạo nạc, Tất cả những vấn đề đó đã làm mất đi niềm tin của người tiêu dùng khi mua sản phẩm thực phẩm và hơn hết nó đã và đang ảnh hưởng đến sức khỏe và tính mạng của mỗi chúng ta

Clenbuterol và salbutamol là những chất thuộc nhóm Beta-Agonits có tác dụng làm giãn phế quản Đây là một dược phẩm sử dụng để điều trị hen suyễn trên người, các trường hợp viêm phổi dị ứng trên ngựa và viêm đường hô hấp trên bò Khi uống liều cao các chất Beta-Agonits có thể làm tăng khối lượng cơ thể và làm giảm mỡ Do vậy, thuốc được bổ sung vào thức ăn gia súc, gia cầm nhằm tăng thịt nạc và tăng trọng nhanh hơn Tuy nhiên, sự tồn dư của Clenbuterol và Salbutamol trong thịt và phủ tạng, đặc biệt là gan của những con vật được nuôi bằng thức ăn có chứa các chất này đã có ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ người tiêu dùng Hiện nay

Mỹ, Canađa, và các nước trong liên minh Châu Âu đã cấm sử dụng các chất thuộc nhóm BetaAgonits làm thức ăn chăn nuôi ở Việt Nam, Bộ Nông nghiệp và PTNT cũng đã ra quyết định số 54/2002/QĐ-BNN ngày 20 tháng 06 năm 2002: Cấm sử dụng các chất thuộc nhóm Beta- Agonist trong thức ăn chăn nuôi Tuy nhiên, việc

sử dụng bất hợp pháp các chất cấm như Clenbuterol và Salbutamol vẫn có trên thị trường thức ăn chăn nuôi nước ta

Do những bức xúc đó, nhóm em đã chọn tìm hiểu và trình bày đề tài “Phương pháp xác định Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn nuôi và dư lượng trong thịt” để từ đó có thể ngăn chặn gian lận thực phẩm, bảo vệ người tiêu dùng

Chương 1 Chất kích thích tăng trưởng họ β-agonists

1.1 Clenbuterol

− Công thức phân tử : C12H18Cl2ON2

− Khối lượng phân tử: 276,0796 đvC

− Công thức cấu tạo

− Tên gọi: 2–(tert–butylamino)–1–(4–amino–3,5–dichlorophenyl)ethanol Trong y học, clenbuterol có tác dụng làm dãn phế quản, dãn cơ trơn ở cuống phổi, clenbuterol còn là dược phẩm được chỉ gây tổn định để điều trị các chứng bệnh có liên quan đến phổi như: hen, suyễn, tuy nhiên có thể hại đến hệ thần kinh và tuần hoàn của con người

Trong thú y, clenbuterol được sử dụng để điều trị các căn bệnh dị ứng đường hô hấp ở ngựa (tên thương mại là ventipulmin), điều trị bệnh đường hô hấp ở trâu, bò, Thuốc có thể thải dần qua đường tiểu và qua phân nhưng với thời gian rất dài

Tên gọi: 2–(tert–Butylamino)–1-(3–hydroxyethyl–2–hydroxyphenyl)ethanol Salbutamol được ứng dụng trong y học để điều trị bệnh hen suyễn rất hiệu nghiệm Thuốc điều trị bệnh hen suyễn có chứa salbutamol có nhiều trên thị trường trong nước cũng như trên thế giới

1.3 Tác động tới động vật nuôi và người

Clenbuterol và salbutamol tích lũy trong thực phẩm thịt sẽ làm ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng thông qua dây chuyền thực phẩm, gây ra các triệu chứng rối loạn nhịp tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp, co thắt phế quản, phù nề, run cơ, liệt

cơ, choáng váng,…

Salbutamol và Clenbutarol đều được hấp thu dễ dàng qua đường tiêu hóa Vì vậy, chất này còn tồn dư trong thịt bao nhiêu thì người sử dụng sẽ hấp thụ bấy nhiêu Ăn thịt còn tồn dư chất tạo nạc Salbutamol lâu ngày có thể gây ra ảnh hưởng khôn lường cho sức khỏe

1.4 Tình hình nghiên cứu ở trong nước

Việc phân tích clenbuterol, salbutamol tại nhiều phòng thí nghiệm ở Việt Nam vào năm 2006 chủ yếu được thực hiện với phương pháp ELISA (dựa vào phản ứng

kháng nguyên - kháng thể) Tuy nhiên, phương pháp này chủ yếu có tính sàng lọc

và có thể cho kết quả dương tính giả Theo quyết định 2002/657/ EC của châu Âu, một phương pháp sàng lọc, dù đã được chứng minh có thể áp dụng được cho đối tượng kiểm nghiệm, vẫn phải được xác minh lại bằng một phương pháp có tính khẳng định hơn nếu nghi ngờ về kết quả

Năm 2007, Phạm Xuân Viết và cộng sự, Trường Đại Học Dược Hà Nội đã nghiên cứu phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, một tứ cực, để định lượng salbutamol trong huyết tương, hiệu suất chiết salbutamol ở các nồng độ 10, 75, 200ppb khoảng 80%

Năm 2008, Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích Thí nghiệm TPHCM đã nghiên cứu và xây dựng qui trình phân tích clenbuterol bằng sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) đạt hiệu suất thu hồi từ 65- 88%; giá trị LOD đối với TACN là 0,16 ppb (clen), 0,11 ppb (sal); giá trị LOD đối với thịt là 0,05 ppb (clen), 0,07 ppb (sal) báo cáo đề tài cấp thành phố năm 2008

Năm 2009, Bùi Quốc Anh (công ty Inotech – Thành phố Hồ chí Minh) nghiên cứu

đề tài bộ kit phát hiện nhanh chất clenbuterol trong thịt gia súc gia cầm trong thời gian 2 giờ Tuy nhiên, đây chỉ là phương pháp định tính dựa trên sự biến đổi màu của thuốc thử

Năm 2010, Nguyễn Thị Chân và cộng sự thuộc trung tâm phân tích và thí nghiệm TPHCM, đã nghiên cứu đề tài “Xác định clenbuterol trong thịt heo bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ triplequad (LC-MS/MS) ” giới hạn phát hiện LOD

= 0,03ppb Nhóm nghiên cứu không sử dụng nội chuẩn đồng vị và do đó không tận dụng được ưu thế của loại nội chuẩn này

Chương 2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

2.1 Tổng quan về phương pháp sắc ký

2.1.1 Nguyên tắc chung

Sắc ký là một kỹ thuật tách trong đó các cấu tử cần tách trong một hỗn hợp mẫu được vận chuyển bởi pha động đi qua pha tĩnh Mẫu đi vào tướng động được mang theo dọc hệ thống sắc kí có chưa pha tĩnh phân bố đều khắp Sự tương tác xảy ra giữa các cấu tử với pha tĩnh, nhờ đó các cấu tử sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh Sự khác nhau giữa ái lực của các cấu tử đối với pha tĩnh làm chúng di chuyển với các tốc độ khác nhau trong pha động của hệ thống sắc ký, kết quả là chúng được tách thành các dải trong pha động vào lúc cuối của quá trình, các cấu tử lần lượt hiện ra theo trật tự tương tác với pha tĩnh Nếu đặt một detecter có khả năng phát hiện các chất tan cuối cột tách và tín hiệu của nó được ghi lại theo thời gian (sắc ký đồ) thì vị trí của các pic theo thời gian được dùng để nhận biết định tính và diện tích của peak được dùng cho phép phân tích định lượng Ngoài ra, có thể định lượng chính xác hơn bằng phương pháp xây dựng đường chuẩn

2.1.2 Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

HPLC dùng để tách, định tính và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với hai pha luôn tiếp xúc nhưng không trộn lẫn nhau là pha tĩnh (được bao bên ngoài chất mang và nhồi trong cột) và pha động (dung môi rửa giải) Khi dung dịch của chất phân tách được đưa vào cột, chúng sẽ được hấp thụ hoặc liên kết với pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất cột và chất cần phân tách Khi chạy sắc ký, các quá trình hấp phụ và giải hấp phụ liên tục xảy ra từ lúc nạp mẫu vào đến khi chất ra khỏi cột các chất sau khi ra khỏi cột được nhận biết tùy theo bản chất trên các detecter thích hợp

Mô hình hệ thống sắc ký lỏng HPLC

2.1.3 Định tính và định lượng

− Phương pháp định tính

o So sánh thời gian lưu của chất phân tích với chất đối chiếu trong cùng mẫu phân tích

o So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích đã them chuẩn đối chiếu

− Phân tích định lượng

o Phương pháp tính theo diện tích peak

o Phương pháp ngoại chuẩn

o Phương pháp thêm chuẩn

o Phương pháp nội chuẩn

2.2 Quy trình kiểm định

2.2.1 Thiết bị và hóa chất

a) Thiết bị: Hệ thống máy LC-MS/MS Thermo Finnigan gồm:

− Hệ thống máy sắc ký lỏng: Bơm và hệ thống tiêm mẫu tự động

− Đầu dò khối phổ ba tứ cực TSQ Quantum Access với hai loại nguồn ion hóa ESI và APCI

− Cột sắc ký lỏng pha đảo Purospher Star C18, 150 mm x 4,6 mm, kích cỡ hạt 5 µm, cột bảo vệ pha đão C18 (hãng Merck)

− Phần mềm Xcalibur, điều khiển thiết bị và xử lý dữ liệu sắc ký

b) Hóa chất và dung dịch thử

− Nước cất 2 lần khử ion, CH3OH loại HPLC; H3PO4, p.a (pure analysis); HCOOH loại HPLC và K2HPO4, p.a (pure analysis); Dung dịch thử K2HPO4 0,1M

− Dung dịch pha động: MeOH (0,1% HCOOH) và H2O (0,1% HCOOH) (v/v)

c) Chất chuẩn và nội chuẩn

− Clenbuterol hydrochloride, Dr Ehrenstorfer, 95% (C12H18Cl2ON2,HCl)

− Clenbuterol–d9 (100 mg/L), Dr Ehrenstorfer (C12H 9D9 Cl2ON2)

− Salbutamol sulfate, Dr Ehrenstorfer, 99 % (C13H22O3N, ½ H2SO4)

− Salbutamol–d3 (100 mg/L), Dr Ehrenstorfer (C13H19D3O3N).

2.2.2 Các thông số tối ưu

− Nhiệt độ tối ưu của ống mao quản là là 350oC

− Chương trình dung môi: Khối phổ thực hiện theo chương trình gradient dung môi

 mũi sắc ký của clen và sal đối xứng và tách tốt, thời gian lưu tương đối không lớn lắm, (5- 8 phút), độ phân giải 5,97, các hệ số đối xứng của các pic sắc ký (của sal và clen) đều nằm trong khoảng cho phép, tạo thuận lợi cho phân tích chuỗi mẫu

− Khoảng tuyến tính của clen và sal trong xây dựng đường chuẩn

Với nồng độ clen từ 0,0495– 99,057μg/L, sal từ 0,0776– 155,525μg/L, mức độ phù hợp của phương trình hồi quy với thực nghiệm rất cao, bình phương hệ số tương quan R2 = 1 Do đó, có thể sử dụng đường chuẩn thiết lập như trên để phân tích clen, sal

− Đệm pH = 6,0 là tối ưu cho việc chiết tách đồng thời cả hai chất clen và sal

2.2.3 Quy trình chuẩn bị mẫu

2.3 Kết quả - tính toán

− Kết quả khảo sát độ lặp lại của tín hiệu đo của chuẩn clen và sal

Kết quả bảng 3.17 cho thấy với 6 lần phân tích mẫu, độ lêch chuẩn tương đối của thời gian lưu không sai lệch nhiều (không vượt quá 1%), sự lặp lại của cường độ tín hiệu của ion có m/z 151,15; m/z 204,01(ion định lượng của nội chuẩn sal-d3 và clen-d9) biến thiên trong khoảng nhỏ hơn 2%, có thể chấp nhận được Vì thế, có thể dùng thời gian lưu làm yếu tố định danh và yếu tố tín hiệu để định lượng clen

và sal

− Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu trong quá trình phân tích cho thấy các diện tích pic của mỗi ion lần lượt trong dung dịch chuẩn và dung dịch chuẩn thêm vào nền mẫu sau xử lý tương tự như nhau, điều này chứng tỏ không có hiệu ứng nền trong giai đoạn tạo ion ở đầu dò khối phổ

− Kết quả xây dựng đường chuẩn clen và sal trên nền thịt và TACN

− Hiệu suất thu hồi của phương pháp (HPP) đạt khoảng 100% như đã dự đoán và hiệu suất thu hồi thực (HT) trên các nền mẫu khảo sát đạt các kết quả như sau:

o Đối với clenbuterol : Mẫu có nồng độ 0,05-50μg/Kg, hiệu suất thu hồi đạt 68,5- 86,78%

o Đối với salbutamol : Mẫu có nồng độ 0,8-75μg/Kg, hiệu suất thu hồi đạt 70,91- 85,59%

 Các kết quả trên đáp ứng đúng yêu cầu của Châu Âu theo quyết định 2002/657/EC

− Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp (LOD, LOQ)

Kết quả cho thấy giá trị LOD của clen rất nhỏ đáp ứng được tiêu chuẩn của Châu Âu, Codex và phù hợp với quy định Việt Nam

Chương 3 Kỹ thuật miễn dịch enzym ELISA

3.1 Tổng quan về phương pháp ELISA

3.1.1 Nguyên tắc chung

Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay còn gọi là Kỹ thuật miễn dịch Enzym (Enzym Immuno Asay-EIA) dựa trên sự liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên (chất cần phân tích, Ag) và (các) kháng thể (Ab), trong đó có kháng thể đã được gắn enzyme (E)

Thông qua sản phẩm được tạo thành dưới tác dụng của phản ứng của enzym với

cơ chất thích hợp, ta xác định được sự có mặt và nồng độ chất cần phân tích Ở giai đoạn cuối này chính là sử dụng các “phương pháp enzyme” để xác định Có nhiều phương pháp có thể áp dụng ở đây Ví dụ: Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng

tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện

Từ đó xác định được sự có mặt và nồng độ chất cần phân tích

Một số dạng kỹ thuật ELISA thường dùng trong phân tích kiểm định nguồn gốc thực phẩm là:

1.1.1 ELISA trực tiếp (Direct Assay)

Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme)

1.1.2 ELISA gián tiếp ( Indirect ELISA)

Indirect ELISA: Phương pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không được gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể được gắn với enzyme)

Ưu điểm: Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa

Nhược điểm: Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau Điều này dẫn đến kết quả khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết thanh khác nhau để kết quả có thể tin tưởng được

3.1.2 ELISA bánh kẹp (Sandwich ELISA)

Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy Được gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm được đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies) Trong ELISA bánh kẹp, kháng nguyên cùng bám vào hai kháng thể khác nhau Đầu tiên kháng nguyên được cho phản ứng với một lượng dư kháng thể gắn trên pha rắn, sau đó ủ và rửa Kháng nguyên bám dính được xử lý với dư lượng kháng thể thứ hai Kháng thể thứ hai này

có thể đã được gắn với enzyme hoặc có thể có khả năng gắn vào kháng thể thứ ba dạng cộng gộp với enzyme (kỹ thuật ELISA “kẹp kép”- double sandwich ELISA)

3.2 Quy trình kiểm định

3.2.1 Các bước xử lý mẫu

3.2.2 Các bước tiến hành phân tích

3.3 Kết quả và tính toán

3.3.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn Clenbuterol và Salbutamol

Để định lượng được Clebuterol và Salbutamol cần có đường của các chất này Với mỗi nồng độ khác nhau của mỗi chất trong bộ Kit chuẩn của hãng BIOO SCIENTIFICMỹ đã dựng được hai đường chuẩn Clenbuterol và Salbutamol

Đường chuẩn Clenbuterol và Salbutamol trong bộ Kit chuẩn của hãng BIOO SCIENTIFIC

Xây dựng đường chuẩn của Clenbuterol hoặc Salbutamol dựa trên % hấp thụ tối

đa của chất chuẩn Clenbuterol hoặc Salbutamol và nồng độ tương ứng của chúng là một đường không tuyến tính Do vậy, các kết quả dương tính được đọc từ đường chuẩn chỉ có giá trị tương đối chính xác trong giới hạn của đường chuẩn

Chiều hướng của cả hai đồ thị đều có % độ hấp thụ giảm dần theo mức tăng của nồng độ chất chuẩn Điều này là phù hợp với nguyên lý của phương pháp ELISA

đã nêu trên Hai đồ thị này được dùng để xác định hàm lượng của Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn nuôi

3.3.2 Đánh giá hiệu quả của phương pháp

Hiệu suất thu hồi Clenbuterol và Salbutamol bổ sung vào mẫu trắng là 90,05-97,3% với độ lệch chuẩn là 2,25 - 3,89 %

 độ tin cậy và tính chính xác của phương pháp khá cao