Kiểm định dư lượng kháng sinh nhóm phenicol trong sản phẩm gà thịt

Nguyên nhân và hậu quả của việc sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi gà .... Thuốc kháng sinh được phép sử dụng Các loại thuốc kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi với liều lượng

Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Viện CNSH & CNTP - -

Báo cáo môn học

Kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm

Đề tài: Kiểm định dư lượng kháng sinh

nhóm phenicol trong sản phẩm gà thịt

Sinh viên thực hiện: Trần Thị Hợi 20131697

Giáo viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Thảo

Hà Nội, ngày 31 tháng 3 năm 2017

Kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page 1

Mục lục

1 Thực trạng sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi hiện nay 2

1.1 Thuốc kháng sinh được phép sử dụng 2

1.2 Hiện trạng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi 2

2 Nguyên nhân và hậu quả của việc sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi gà 3

2.1 Nguyên nhân sử dụng kháng sinh 3

2.2 Hậu quả sử dụng kháng sinh tràn lan 4

3 Kiểm định dư lượng kháng sinh nhóm phenicol trong gà thịt 4

3.1 Các phương pháp kiểm định 4

3.2 Phương pháp săc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS 5

3.3 Quy trình phân tích 6

4 Kết luận và kiến nghị 13

4.1 Kết luận 13

4.2 Kiến nghị 13

Tài liệu tham khảo 14

Kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page 2

1 Thực trạng sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi hiện nay

1.1 Thuốc kháng sinh được phép sử dụng Các loại thuốc kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi với liều lượng và thời gian cách ly cho phép theo QCVN 01 - 10: 2009/BNNPTNT

STT Tên kháng sinh,

hóa dược

Hàm luơng tối đa cho phép(mg/kg)

Thời gian ngừng sử dụng thức ăn có kháng sinh, hóa dược trước khi giết mổ(ngày)

Gà thịt Gà trứng

3 BMD(bacitracin methylence-disalicylate )

16 Sulfadimethoxin and

ormetoprim 5:3

Bảng 1: Các loại thuốc kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi

1.2 Hiện trạng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi

Trong năm 2015, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã triển khai dự án điều tra tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi tại 5 tỉnh: Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Dương, Thái Bình và Nam Định Kết quả triển khai cho

thấy 100% cơ sở chăn nuôi có sử dụng kháng sinh trong phòng và điều trị bệnh

cho động vật; 68% cơ sở có sử dụng thức ăn chăn nuôi chứa kháng sinh để

Kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page 3

phòng bệnh và kích thích tăng trưởng; 24,4% cơ sở tự trộn kháng sinh vào thức

ăn chăn nuôi để phòng bệnh và kích thích tăng trưởng, trong đó 1,23% số hộ trộn bằng kháng sinh dạng nguyên liệu

Theo báo cáo mới nhất của Bộ Y tế, trong chăn nuôi gà công nghiệp có hiện tượng lạm dụng quá nhiều các loại kháng sinh tổng hợp, số hộ sử dụng thuốc kháng sinh có từ 3 - 6 hoạt chất chiếm 10% trang trại nuôi gà, vịt Tuy nhiên, đến nay việc sử dụng kháng sinh trong trồng trọt, chăn nuôi gần như bỏ ngỏ; một phần từ sự quản lý lỏng lẻo của nhà quản lý, một phần cũng từ ý thức của người chăn nuôi

Thuốc kháng sinh được các cơ sở chăn nuôi sử dụng có 2 dạng: dạng bột hòa tan( pha với nước cho uống hoặc tiêm trực tiếp vào gà) và bột không hòa tan( trộn với thức ăn)

Các loại kháng sinh được sử dụng phổ biến và tồn dư gồm chloramphenicol (15,35%), tylosin (15,00%), colistin (13,24%), norfloxacin (10,00%), gentamycin (8,35%), nhóm tetracyclin (7,95%), ampicillin (7,24%) Mức tồn dư cao hơn so với qui định từ 2,5 lần đến 1.100 lần

Trong thương mại:

Có rất nhiều vụ bê bối về nhập gà kháng sinh, gà thải loại với giá rất rẻ (5000-6000đồng/1kg) rồi bán lại với giá cao (50000-60000 đồng/1kg) , vì vẫn thấp hơn giá gà nuôi nên nhiều người vẫn mua sử dụng mà không hề biết tác hại của nó

Gà thải loại chỉ để đẻ trứng, vòng đời con gà đẻ loại thải thường phải tiêm chích nhiều kháng sinh mới có đủ sức đề kháng, gà đẻ loại thải tính từ con giống phải chích năm loại vắcxin Thời gian để vắcxin hết hiệu lực trong cơ thể con gà đẻ trong vòng một tuần Nếu sớm hơn thì nguy cơ tồn dư kháng sinh là rất lớn Khi

ăn phải sẽ gây tác hại hớn đến sức khỏe người tiêu dùng

2 Nguyên nhân và hậu quả của việc sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi gà

2.1 Nguyên nhân sử dụng kháng sinh

Do hiệu quả của việc sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi đem lại:

- Điều trị bệnh;

- Phòng bệnh mãn tính và ngăn chặn xảy ra những dịch bệnh do vi trùng;

- Dùng như chất kích thích sinh trưởng do tăng khả năng hấp thụ thức ăn và kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật đường ruột;

- Nâng cao chất lượng sản phẩm như tăng tỷ lệ lạc, giảm mỡ, thịt nở, mềm hơn,…

Kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page 4

2.2 Hậu quả sử dụng kháng sinh tràn lan

- Sử dụng kháng sinh thường xuyên, sức khỏe vật nuôi giảm dần và càng phụ thuộc nhiều hơn, các loại vi khuẩn gây bệnh cho vật nuôi sẽ chống chọi lại thuốc làm thuốc mất tác dụng

- Ngày càng tăng số lượng vi khuẩn , siêu vi khuẩn có khả năng kháng kháng sinh, có thể gây bệnh, phát sinh dịch bệnh.( phổ biến nhất là nhóm vi khuẩn gram âm đường ruột E.Coli)

- Nếu thuốc kháng sinh dùng cho vật nuôi chưa đủ thời gian cách ly, hoặc dùng quá nhiều được đưa vào sử dụng sẽ có hiện tượng tồn dư trong nguyên liệu thịt, khi đi vào cơ thể người tiêu dùng dẫn đến nguy cơ kháng thuốc kháng sinh ở người, làm giảm hiệu quả, tang thời gian điều trị bênh ở người

3 Kiểm định dư lượng kháng sinh nhóm phenicol trong gà thịt

3.1 Các phương pháp kiểm định Trong chăn nuôi hiện nay người nuôi sử dụng khá nhiều loại thuốc kháng sinh

để tăng sức khỏe cũng như chất lượng cảm quan của gà Do có phổ kháng khuẩn rộng và khả năng phân bố tốt vào các mô trong cơ thể nên nhóm phenicol được dùng phổ biến Tuy nhiên, từ khi phát hiện những độc tính của chloramphenicol (CAP) lên cơ quan tạo máu (có thể gây thiếu máu không tái tạo, không phục hồi

do suy tủy, gây tử vong) nên từ năm 1990 Ủy ban Châu Âu đã cấm sử dụng CAP trong thú y (EU, 1990; Bộ NN&PTNT, 2009a).

Có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện dư lượng các chất kháng sinh trong vật nuôi như:

- Phương pháp miễn dịch enzyme (ELISA)

- Phương pháp vi sinh vật,

- Phương pháp sắc lý lỏng cao áp HPLC

- Phương pháp sắc ký khối phổ

- Phương pháp sắc ký miễn dịch,…

Phương pháp ELISA, vi sinh vật thích hợp để sàng lọc Do ưu điểm là kiểm tra tương đối nhạy và nhanh, đơn giản, phổ phát hiện rộng(pp vi sinh vật), tuy nhiên phương pháp elisa có tính đặc hiệu cao với từng nhóm kháng sinh nên nhiều khi gây bất lợi, không phát hiện được chất cấm, còn phương pháp vi sinh vật thì đơn giản, rẻ nhưng tiến hành trong thời gian dài, phụ thuộc vào chủng vi sinh vật sử dụng, một số chất không phát hiện được

Các phương pháp lý hóa phù hợp để nhận diện rõ ràng, định lượng, thích hợp cho khẳng định vì ưu điểm là khả năng phát hiện các chất có dư lượng nhỏ, rất

Kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page 5

nhạy nhưng phức tạp, thiết bị đắt tiền, kỹ thuật viên chuyên nghiệp cao Phương pháp này có độ nhạy với một giới hạn phát hiện thấp của chất cấm, có độ tin cậy cao, không có kết quả dương tính giả và âm tính giả

Phương pháp được chú ý nghiên cứu sử dụng nhiều nhất là phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS do có khả năng phân biệt, nhận diện các chất cao, thiết bị hiện đại nên giảm các nguy cơ sai sót tiềm tàng

3.2 Phương pháp săc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS

Sắc ký lỏng ghép khối phổ là kỹ thuật phân tích kết hợp giữa sắc ký và khối phổ Sau khi các chất tách ra khỏi nhau nhờ sắc ký lỏng sẽ được phân tích khối phổ

để có thêm thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất

Cơ sở lý thuyết của phương pháp:

Hình 1: Mô hình hệ thống LC-MS/MS Sắc ký là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động

là chất lỏng Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa, Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và phát hiện

Kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page 6

Sơ đồ cấu trúc máy khối phổ MS

Hình 2: Sơ đồ cấu trúc bộ phân tích khối

- Nguồn ion: Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion

để chuyển thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử;

- Bộ phận phân tích khối: Có nhiệm vụ phân tách các ion có trị số m/z khác

nhau thành từng phần riệng biệt;

- Bộ phận phát hiện: Sau khi đi ra khỏi thiết bị phân tích khối lượng, các ion được đưa

tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion, tạo ra một tín hiệu của các ion tương ứng từ các electron thứ cấp đã được khuếch đại hoặc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển

Hệ thống sẽ thu nhận tín hiệu và đưa ra kết quả phân tích(nhờ dòng electoron hoặc dòng photon tạo ra)

3.3 Quy trình phân tích

Quy trình phân tích:

Chọn các điều kiện thực nghiệm: cần tìm ra các điều kiện thực nghiệm cho

xử lý, phân tích mẫu phù hợp mới có thể tiến hành quy trình phân tích

- Điều kiện phân tích CAP, FF, TAP trên máy LC-MS/MS Khảo sát tìm được ion mẹ, ion con định tính và định lượng của từng chất; tìm các điều kiện tối ưu của MS:

+) Lựa chọn kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chế độ bắn phá ion âm(dựa theo nghiên cứu khác (Nguyễn Minh Đức, 2006; Nguyễn Văn Ri, 2009; Zhao and Carol, 2004) về các chất có khối lượng phân tử trung bình),

khối

Detector

Xử lý và lưu dữ liệu Phổ khối

Tránh ion phân tích va chạm với ion trong không khí

Kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page 7

+) Dùng xilanh 500µl bơm từng chuẩn CAP, FF, TAP 10ng/ml vào detector để khảo sát

+) Chọn chế độ khảo sát tự động đới với từng chất, tối ưu hóa từng ion mẹ

 Kết quả: Điều kiện chạy nguồn ESI tối ưu nhất để chạy khối phổ:

Chú thích: DP: thế phân nhóm, CE: năng lượng va chạm, CXP: điện thế sau va chạm

Các thông số tối ưu:

Kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page 8

- Điều kiện xử lý mẫu:

Căn cứ vào độ phân cực và một số đặc điểm hóa học của nhóm phenicol, 3 hợp chất được lựa chọn làm dung môi chiết ban đầu là etylaxetat, axeton, và axetonitril

 Kết quả:

Etylaxetat tách chiết hiệu quả và cho độ thu hồi cao nhất( do có độ phân cực trung bình, có độ chọn lọc với dung môi hòa tan ở trong nó cao hơn axeton và axetonitril) Tuy nhiên nó chiết cả các chất có độ phân cực tương đượng như chất màu, lipit,… nên tiếp tục tiến hành hòa tan cặn bằng CH3COONH4 4% và loại bỏ chất béo bằng n-hexan

Tách và làm giàu chất cần phân tích: chọn khảo sát 2 loại cột chiết là cột C18(không phân cực) và cột floresil(độ phân cực thấp)

 Kết quả: Cột C18 làm tinh khiết và làm sạch chất cần phân tích vượt trội hơn, thể tích methanol dung cho bước rửa giải tối ưu là 3ml

- Điều kiện sắc ký:

Các chất nhóm phenicol có độ phân cực trung bình, hệ pha động sử dụng an toàn với thiết bị là các dung môi phân cực và phân cực vừa như methanol, axetolnitril, nước, axit formic, amoniaxetat, … cho nên lựa chọn cột phân tách

Kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page 9

pha đảo Sử dụng cột Symestry Shield C18 của Water (150mm x 4,6mm x 5mm)

và tiền cột Symestry C18 của Water (20mm x 3,9mm x 5mm)

Thực hiện khảo sát điều kiện tối ưu:

Pha động: Hệ pha động kênh A lần lượt là axit axetic 0,1%, CH3COONH4 0,1% trong nước, nước; kênh B lần lượt là methanol và axetonitril

Tỉ lệ pha động khảo sát theo hai chế độ: cố định tỉ lệ hai kênh của pha động và chế độ gradient quét từ 10% đến 100% kênh A về thể tích theo thời gian

 Kết quả: Hình ảnh các pic trên sắc đồ ổn định, tách nhau rõ ràng, pic nhọn

và cho tín hiệu tốt nhất với hệ pha động kênh A là CH3COOH 0.1%, kênh B là methanol

Chương trình gradient tối ưu:

Kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page 10

QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

(1) Lấy mẫu:

- Đối tượng mẫu: mẫu gà thịt muốn phân tích

- Phương pháp lấy mẫu: ngẫu nhiên

- Khối lượng mẫu lấy: 100 – 500 g/mẫu

- Bảo quản: nhiệt độ thường

- Mẫu đảm bảo độ đồng nhất theo yêu cầu: Dùng máy đồng nhất mẫu để đồng nhất khoảng 500g mẫu tới cỡ hạt khoảng 1-2 mm

(2), (3) Xử lý và phân tích mẫu:

Sau khi mẫu đã được đồng nhất và lựa chọn các dung môi khảo sát, tiến hành cân 10g mẫu cho vào ống ly tâm 50ml, chất chuẩn, sau đó thêm 20ml dung môi, vortex và lắc trong khoảng 5 phút Tiếp theo đem ly tâm ở 6.000v/phút trong 5 phút, gạn thu dịch chiết sang một ống ly tâm khác Chiết lặp lại một lần nữa với 10ml dung môi Gộp dịch chiết hai lần cho vào bình cô quay 100ml, cô quay tới cạn ở 40°C

Do các đối tượng mẫu khảo sát thường có hàm lượng chất màu, lipit sau bước làm giàu sơ bộ khá cao nên trước khi nạp mẫu qua cột chiết pha rắn ta tiến hành hòa tan cặn còn lại bằng dung dịch CH3COONH4 4%, chất béo chiết bằng 10ml n-hexan, lặp lại hai lần với dung dịch thu được ở trên Quá trình chiết pha rắn tiến hành trên cột chiết C18 với dung môi hoạt hóa và rửa giải là H2O và methanol

Sau đó mẫu được đưa vào phân tích trong hệ thống LC-MS/MS để máy tự động phân tích và ghi nhận kết quả từ đồ thị thu được sau khi máy phân tích

Kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page 11

(4)Kết quả: kết quả thu được tại bộ ghi tín hiệu của hệ thống LC-MS/MS dưới

dạng đồ thị khối phổ

Dựa vào sắc ký đồ ta sẽ định tính và định lượng được hàm lượng của kháng sinh trong mẫu Định tính các chất bằng sự xuất hiện các pic trên đồ thị, hàm lượng các chất được đo bằng diện tích của pic đó

Kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page 12

*Nhận xét hiệu quả của phương pháp LC-MS/MS:

- Khoảng tuyến tính và khả năng phát hiện của phương pháp:

Khoảng tuyến tính 0.5-3 ng/g 5-300 ng/g 2-200ng/g

Giới hạn phát hiện 0.009ng/g 0.003ng/g 0.2ng/g

=> Khoảng tuyến tính rõ rệt và giới hạn phát hiện thấp

- Độ lặp lại và hiệu suất thu hồi của phương pháp:

Hiệu suất thu hồi >83%

Độ lệch chuẩn <5%

- Tính đặc hiệu / chọn lọc: phương pháp nghiên cứu có tính đặc hiệu/ chọn lọc cao

- Độ chính xác: phương pháp nghiên cứu có độ chính xác cao, có thể đem áp dụng để phân tích đồng thời Chloramphenicol(CAP), flophenicol(FF), thiamphenicol (TAP)

Kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm Page 13

4 Kết luận và kiến nghị

4.1 Kết luận

- Hiện nay việc sử dụng kháng sinh một cách tràn lan của con người trong chăn nuôi đang hình thành ngày càng nhiều vi khuẩn, siêu vi khuẩn kháng kháng sinh mang lại những hậu quả nghiêm trọng cho hệ sinh thái và với cả con người

- Hệ thống phân tích sắc ký LC-MS/MS được chú ý sử dụng để phân tích dư lượng kháng sinh trong chăn nuôi vì có khả năng định tính, định lượng được thành phần mẫu và có độ chính xác cao

4.2 Kiến nghị

- Cần có các biện pháp giám sát tốt hơn quy trình chăn nuôi tại các cơ sở chăn nuôi, có biện pháp xử lý khi cần thiết đối với các cơ sở sử dụng kháng sinh bừa bãi

- Tuân thủ hướng dẫn sử dụng thuốc kháng sinh, sản phẩm xử lý và cải tạo môi trường trong chăn nuôi, 5 vấn đề quan trọng mà người nuôi cần quan tâm trong việc sử dụng kháng sinh:

 Chỉ sử dụng kháng sinh để chữa bệnh khi xác định rõ chúng bị bệnh do vi khuẩn

 Hạn chế sử dụng lặp lại cùng một loại kháng sinh để tránh làm tăng độ kháng thuốc

 Đối với một số loại kháng sinh, cần ngừng sử dụng trong một thời gian nhất định trước khi thu hoạch để tránh dư lượng kháng sinh trong nguyên liệu(thời gian ngừng thuốc thực hiện theo hướng dẫn trên bao bì và theo quy định của cơ quan quản lý – trường hợp có quy định khác nhau thì phải theo quy định có thời gian ngừng lâu hơn)

 Trong điều kiện có thể, nên cho giám sát việc sử dụng kháng sinh

 Nắm chắc các nguyên tắc sử dụng thuốc kháng sinh và áp dụng đúng các phương pháp sử dụng thuốc kháng sinh trong phòng trị bệnh