gian lận thương mại thịt lợn giả bò và các phương pháp kiểm định

Cácchất dinh dưỡng lẫn mùi vị thơm ngon đặc trưng của thịt bò khiến cho nó trở thànhsản phẩm thực phẩm không thể thiếu được trong chế độ dinh dưỡng của chúng ta.Vì thực tế đó nên không í

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

TIỂU LUẬN MÔN HỌC

Kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm

Đề tài:

GIAN LẬN THƯƠNG MẠI THỊT LỢN GIẢ BÒ

VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM ĐỊNH

Hà Nội, tháng 3 năm 2017

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 3

Chương 1 Gian lận thịt lợn giả bò và chiêu thức đánh lừa người tiêu dùng của các gian thương 4

1.1 Tình trạng thịt lợn giả bò bán tràn lan trên thị trường 4

1.2 Chiêu thức đánh lừa người tiêu dùng của gian thương 5

1.3 Tác động tới người tiêu dùng 6

Chương 2 Các phương pháp kiểm định 8

2.1 Các phương pháp kiểm định đã được nghiên cứu hiện nay 8

2.2 Phương pháp cảm quan 9

2.3 Phương pháp phân tích DNA bằng kỹ thuật PCR 11

2.3.1 Cơ sở phương pháp 11

2.3.2 Nguyên tắc của phản ứng PCR 11

2.3.3 Vật liệu sử dụng trong phản ứng PCR 12

2.3.4 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ cần thiết 15

2.3.5 Cách tiến hành 16

2.3.6 Tính toán kết quả và kết luận 20

2.3.7 Ưu nhược điểm của phương pháp phân biệt loài bằng kỹ thuật PCR 21 KẾT LUẬN 22

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 23

Thịt bò là một trong những loại thịt đỏ giàu chất dinh dưỡng, hàm lượngprotein cũng như các axit amin trong thịt bò rất cân đối và có lợi cho sức khỏe Cácchất dinh dưỡng lẫn mùi vị thơm ngon đặc trưng của thịt bò khiến cho nó trở thànhsản phẩm thực phẩm không thể thiếu được trong chế độ dinh dưỡng của chúng ta.

Vì thực tế đó nên không ít các gian thương đã dùng mọi thủ đoạn, chiêu trò để cóthể có lợi nhuận cao hơn bằng cách dùng mánh khóe biến thịt lợn thành miếng thịt

đỏ trông giống thịt bò để bán với giá cao gấp 3 lần giá trị thực của nó

Do những bức xúc đó, nhóm em đã chọn tìm hiểu và trình bày đề tài “Gianlận thương mại thịt lợn giả bò và phương pháp kiểm định” để từ đó có thể ngănchặn gian lận thực phẩm này, và bảo vệ người tiêu dùng

Chương 1 Gian lận thịt lợn giả bò và chiêu thức đánh lừa người tiêu dùng của các gian thương

1.1 Tình trạng thịt lợn giả bò bán tràn lan trên thị trường

Theo chân một số người tiêu dùng đến chợ tại Cổ Nhuế, chợ đầu mối MinhKhai, chợ Gạch (Phúc Thọ), phóng viên VTV24 đã ghi nhận hiện tượng thịt lợnlàm giả thành thịt bò được bày bán ở nhiều gian hàng tại đây Những miếng thịt đỏtươi, được để cùng với da bò, gân bò khiến người tiêu dùng không có sự nghi ngờnào về sản phẩm mình mua

Tuy nhiên, khi rửa sạch để chế biến, người sử dụng sẽ dễ dàng nhận ra nướcrửa miếng thịt đổi màu bất thường Miếng thịt được chủ hàng khẳng định là thịt bò

đã nhanh chóng chuyển màu trắng nhạt, mùi hôi đặc trưng của thịt bò cũng biếnmất

Theo kết quả kiểm tra của Chi cục thú y Hà Nội, đại diện đơn vị này đãkhẳng định những miếng thịt được kiểm nghiệm là thịt lợn

"Đây là những miếng thịt lợn vì mỡ của thịt lợn có màu trắng sáng, thớ thịt

to, ngắn, trong khi thịt bò có mùi tanh", anh Công Xuân Chiến – Chuyên viênphòng kiểm định, Chi cục Thú y Hà Nội cho biết

Cách đây không lâu, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia

đã lấy nhiều mẫu thịt bò tươi tại các quán phở trên địa bàn Hà Nội để kiểm nghiệm

Kết quả, trong 12 mẫu nạm bò, chỉ có 2 mẫu là thịt bò thật Với 10 mẫu thịt bò tái,

có 2 cửa hàng bán thịt lợn

1.2 Chiêu thức đánh lừa người tiêu dùng của gian thương

Như chương trình “Nói không với thực phẩm bẩn” phát sóng ngày05/10/2016 đã đưa tin, hiện nay, thịt lợn giả thịt bò đang được bày bán tràn lan ởnhiều khu chợ đầu mối nổi tiếng như Cổ Nhuế, chợ đầu mối Minh Khai, chợ Gạch(Phúc Thọ) Những miếng thịt đỏ tươi, được để cùng với da bò, gân bò khiến ngườitiêu dùng không có sự nghi ngờ nào về sản phẩm mình mua

Trong vai người lái buôn, các phóng viên VTV24 đã được một số tiểuthương chia sẻ về bí quyết làm giả thịt bò "Bỏ hết phần thủ, bì da, xương, chỉ lấyphần thịt nạc và gân Tất cả đều làm giả được hết", một tiểu thương tiết lộ Ngoài

ra, tiểu thương này cũng chia sẻ mối lấy hàng của anh ở quanh các thành phố lớnnhư Hà Nội, Hải Phòng, Bắc Giang Trong đó, chợ Nhổn cung cấp nguồn hàng dồidào nhất cho tiểu thương này

Tìm đến một địa điểm cách chợ Gạch, Phúc Thọ không xa,các phóng viêncũng phát hiện một khu nhà tập kết các loại thịt bò giả Trong những chiếc tủ đônglạnh là hàng trăm kg thịt đang được bảo quản chờ xuất bán Cơ sở này chuyên bánbuôn cho các khu chợ tại địa phương cũng như cung cấp cho các nhà hàng, bếp ăntập thể Những bí quyết tạo mùi cho thịt bò giả cũng được chính chủ cơ sở trên tiếtlộ

"Chỉ cần lấy nhiều mỡ bò bôi vào là miếng thịt hơi gây mùi Với phần thịt cổ heonái, khi thái ra để xào thì thấy gân như hoa thị, giống gân, giống bắp bò", người nàynói thêm Những miếng thịt giả nói trên tinh vi đến nỗi nhiều người bán hàngkhẳng định không có cách gì để phân biệt.

Không những vậy, nhiều gian thương còn sử dụng những phẩm màu không rõnguồn gốc để tạo màu đỏ cho thịt lợn nhằm đánh lừa người tiêu dùng

1.3 Tác động tới người tiêu dùng

Hiện nay với giá bán trung bình của thịt bò là khoảng 250000 - 280000 đồng/

kg, trong khi thịt lợn chỉ có giá khoảng 70000 – 80000 đồng/kg thì việc làm giả thịt

bò từ thịt lợn của thương lái thu lợi gấp 3 lần giá trị thực của nó Điều này đã khiếncác thương lái không ngần ngại việc làm giả thịt và bán nhằm thu lợi và không cầnquan tâm đến những ảnh hưởng của việc ăn thịt bò giả này ảnh hưởng như thế nàotới sức khỏe và lòng tin của người tiêu dùng

Theo PGS.TS Nguyễn Duy Thịnh, nguyên giảng viên Viện Công nghệ vàThực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội, nhận định “hô biến thịt lợn thành thịt bò làhành vi gian lận thương mại” Hơn nữa, nếu sử dụng hóa chất để tẩm ướp, biến thịtlợn thành thịt bò cũng là một hành động coi thường sức khỏe của người tiêu dùng

Nếu hóa chất tẩm ướp có nguồn gốc tự nhiên thì không gây hại cho sức khỏenhưng nếu sử dụng hóa chất có nguồn gốc công nghiệp, dạng bột thì sẽ gây ảnhhưởng không nhỏ cho sức khỏe người tiêu dùng

Ăn thịt bò giả làm từ thịt lợn gây ảnh hưởng tới đường hô hấp:

Hóa chất Metabisulfite được dùng trong việc tẩy uế, chống oxy hóa và chất bảoquản, được cho phép dùng trong xử lý, chế biến các loại nước uống hoặc bia rượuvới liều lượng nhất định Metabisulfite nếu được dùng trong việc chế biến thịt lợnnái thành thịt bò giả thì cực kỳ nguy hiểm bởi người ăn phải loại thịt ngâm hóa chấtnày sẽ bị ảnh hưởng đến đường hô hấp

Ăn thịt bò giả làm từ thịt lợn có thể gây bệnh suy giảm trí nhớ

Chương 2 Các phương pháp kiểm định

2.1 Các phương pháp kiểm định đã được nghiên cứu hiện nay

Hiện nay ta có rất nhiều phương pháp kiểm định đã được nghiên cứu cho phépphát hiện thịt lợn giả bò và thịt bò thật

Phương pháp quan sát dưới kính hiển vi quang học:

Để phân biệt các loài trong bột xương, thịt người ta lập ra một thư viện hình ảnh

về các mẫu xương Theo đó các mẫu thịt được quan sát dưới kính hiển vi và đốichiếu với thư viện hình ảnh này để xác định loài được mang đi xét nghiệm

Phương pháp này đòi hỏi người xét nghiệm phải có kinh nghiệm và tay nghề cao

Miễn dịch liên kết enzym (ELISA):

Nguyên tắc chung của kỹ thuật ELISA là nguyên tắc bánh kẹp, tạo liên kết đặc hiệugiữa kháng nguyên và kháng thể Sự liên kết đó cho phép định lượng sự hiện diệncủa kháng thể hoặc kháng nguyên Kháng thể hoặc kháng nguyên có thể được xácđịnh khi được nhận biết đặc hiệu bằng một kháng thể thứ hai cộng với hệ biotin –streptavidin – enzym sẽ tạo ra sản phẩm có màu khi tác dụng với cơ chất phù hợp.Đây là kĩ thuật khá nhạy và tương đối đơn giản, rẻ tiền, an toàn, độ chính xác cao.Tuy nhiên cũng có một số nhược điểm như: dễ bị nhiễm chéo từ chất tạo màu vàcần một lượng mẫu đủ lớn

Protein array:

Là phương pháp sử dụng một loại hạt hình cầu (hay slide) để xác định đồng thờinhiều phản ứng trong một ống nghiệm hay giếng nhỏ có chứa mẫu Phát hiện mẫunhờ các chất nhuộm huỳnh quang có trong hạt cầu được kích thích Độ nhạy của tínhiệu biểu thị cho lượng mẫu đích

Ưu điểm của phương pháp: Cho phép phát hiện cùng lúc nhiều chỉ tiêu trong cùngmột giếng mẫu, độ lặp lại cao, không cần lượng mẫu lớn, độ chuyên biệt cao.

Điện di 2 chiều:

Xây dựng từ hai kỹ thuật phân tách sản phẩm theo 2 thành phần cấu thành củabản thân sản phẩm (điểm đẳng điện và khối lượng phân tử) Phương pháp này có 2giai đoạn phân tách: giai đoạn đầu phân tách dựa vào điểm đẳng điện của phân tửprotein mẫu; giai đoạn hai, sản phẩm được phân tách theo khối lượng phân

Phương pháp này có tính ứng dụng cao, cho phép phát hiện nhiều polypeptit khácnhau với độ nhạy cao nhưng nhược điểm là yêu cầu kỹ thuật viên phải có tay nghề

Đ c đi m ặc điểm ểm Th t bò th t ịt bò thật ật Th t l n gi bò ịt bò thật ợn giả bò ả bò

1 Màu s c ắc Thịt bò thật màu đỏ au,

Muốn chắc chắn thì ta có thể rửa miếngthịt đó ngay tại nơi bán, sẽ thấy miếng'thịt bò' nhạt màu dần Hoặc có thể yêucầu người bán cắt đôi miếng thịt nghingờ, nếu ở trong màu nhạt hơn hẳn bênngoài thì đó là thịt bò giả

2 Th th t ớ thịt ịt bò thật Nhỏ và dài, bắp bò có

gân đặc trưng Mỡ và bìcủa thịt bò có màu vàngnhạt

Thớ thịt to và ngắn Mỡ có màu trắng

3 B m t ề mặt ặc điểm Khi ấn tay lên miếng

thịt sẽ thấy dẻo, khô, ítđàn hồi, thịt dính tay

Khi ấn tay thấy miếng thịt mềm, bở,không có cảm giác thịt dính vào tay

4 Mùi vịt bò thật Mùi hôi nồng đặc trưng

của thịt bò

Tạo mùi giả bằng cách bôi mỡ bò lên trênmiếng thịt Ta có thể kiểm tra bằng cáchcắt đôi miếng thịt, phần thịt phía trong sẽkhông có mùi hôi đặc trưng, thay vào đó

là mùi tanh của thịt lợn

5 Sau khi

ch bi n ế biến ế biến

Giữ nguyên được màuhồng đậm, vị ngọt vàmùi thơm đặc trưng

Sau khi nấu sẽ nhợt nhạt, thậm chí nếuthịt bò giả được làm từ thịt lợn đã chết thì

sẽ có mùi tanh khó chịu

2.3 Phương pháp phân tích DNA bằng kỹ thuật PCR

2.3.1 Cơ sở phương pháp

Cơ sở của phương pháp là dựa vào thành phần và trình tự các nucleotid khác nhautrên phân tử DNA của thịt bò và thịt lợn Từ đó ta nghiên cứu thực hiện phản ứngPCR trên cả mẫu thịt bò và thịt bò giả nghi ngờ (mẫu thịt lợn) rồi điện di sản phẩmtrên gel Agarose để phát hiện

2.3.2 Nguyên tắc của phản ứng PCR

Kỹ thuật PCR( Polymerase Chain Reaction- phản ứng chuỗi trùng hợp) là phươngpháp khuếch đai lượng lớn các đoạn DNA đặc thù từ phân tử DNA mạch khuôndựa trên sự hoạt động cuả DNA –polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung

Các bước thực hiện của phản ứng PCR

Nhiệt độ giảm xuống 37-68 ˚ C tùy nhiệt độ nóng chảy của cặp mồi

sử dụng để đoạn mồi bắt cặp với sợi DNA khuôn

Mồi cho mẫu DNA bò giả nghi ngờ( thịt lợn) 0,24Μm

3 Emzyme Taq polymerase 1,25UI

Đoạn mồi: Mồi là một chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc

trưng và có hiệu quả cao nhất Do đó cần chọn mồi theo các nguyên tắc sau:

 Chọn trình tự mồi xuôi và mồi ngược sao cho chúng không bắt cặp bổ sungvới nhau, kể cả cấu trúc kẹp tóc do các phần bắt cặp với nhau

 Mồi phải đặc hiệu với DNA cần khuếch đại và không trùng với các trìnhtực khác trên gen

 Trình tự nằm giữa mồi xuôi và mồi ngược không quá lớn, khoảng dưới 1kp

là tốt nhất và nếu trên 3 kp thì sẽ không cho kết quả tốt

 Độ dài mồi cần chọn khoảng 15-25 nucleotides

 Nhiệt độ bắt cặp của mồi xuôi và mồi ngược không được quá cách biệt,thông thường trong khoảng 4-5˚C Thành phần các nucleotide của các mồiphải cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần.

Công thức tính nhiệt độ bắt cặp của mồi trong trường hợp có khoảng 20nucleotide là:

Tm=4(G+C) +2(A+T)

Trong đó: A, T, G, C là thành phần các nucleotide của đoạn mồi

Năm 1998, Matsugana và các cộng sự đã xác định được trình tự bảo toàn trên genCytochrome b (mtDNA) của thịt, dựa vào trình tự này tác giả đã thiết kế mồi chungcho DNA thịt bò, thịt lợn, kí hiệu là FSIM:

5’-GACCTCCCAGCTCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3’

Tuy nhiên ở mỗi loài thú khác nhau thì trình tự trên gen mtDNA khác nhau Từ

đó tác giả cũng thiết kế mồi xuôi cho từng loại:

Mồi xuôi cho lợn, kí hiệu là RP:

5’-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCGTA- 3’

Mồi xuôi cho bò,kí hiệu là RB :

5’-CTAGAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG-3’

Enzyme Taq polymerase: Hiệu quả của phương pháp phụ thuộc vào khả năng

chịu nhiệt của enzyme polymerase (vì phản ứng PCR luôn phải thực hiện ở nhữngnhiệt độ khác nhau)

Enzyme taq polymerase có nguồn gốc từ vi khuẩn Thermus aquaticus phân lập từsuối nước nóng nên chịu được nhiệt độ cao Enzyme này không bị biến tính ở nhiệt

độ biến tính và xúc tác tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng tạo ra các sảnphẩm DNA tinh sạch.Điều này cho phép tự động hóa tất cả các bước của quá trình

nhân bản DNA.Từ đó máy luân nhiệt PCR ra đời điểu khiển cả về nhiệt độ lẫn thờigian.

Trong phản ứng PCR nếu DNA Taq polymerase quá dư thừa sẽ có hiện tượngphản ứng giả của mồi trên dây đơn Vì vậy người ta khuyến cáo nồng độ Taqpolymerase nên sử dụng là 0.5UI/25μl để kiểm soát tính chuyên biệt của phản ứng

Dung dịch đệm: Sử dụng môi trường đệm KCl với pH=8.3.

Dung dịch MgCl 2 : Một trong những ảnh hưởng có tính chất quyết định đến sự

chuyên biệt và hiệu quả của phản ứng PCR là nồng độ Mg2+ ¿¿ Môi trường có tínhchất ion cao sẽ làm cho dung dịch đệm trở nên năng động rất nhiều Nồng độ Mg2+¿¿

sẽ làm cho phân tử DNA mạch đôi ổn định hơn nhưng đồng thời ngăn cản sự biếntính hoàn toàn của sản phẩm trong mỗi chu kì và do đó làm giảm sản phẩm PCRtạo ra Ngoài ra lượng Mg2+ ¿¿ dư còn làm tăng hiện tượng bắt cặp giả tạo ra nhữngsản phẩm không mong muốn Ngược lại nếu nồng độ Mg2+¿¿ quá thấp (<0.5 μM) sẽảnh hưởng đến quá trình kéo dài vì Mg2+ ¿¿ đóng vai trò là co-factor của Taqpolymerase.Một vài ion Mg2+ ¿¿ sẽ được giữ kẹp bởi dNTP trong phản ứng.Vì vậycần phải có tỷ lệ thích hợp giữa Mg2+ ¿¿ và dNTP

Nucleotid: Cần phải có 4 loại nucleotide dạng triphophat: dATP, dTTP, dCTP,

dGTP Người ta khuyến cáo mỗi loại nulceotid được sử dụng là 200μM và phảigiữ cho nồng độ của tất cả các deoxynucleotide luôn bằng nhau, để tránh sự gắn kếtnhầm lẫn

2.3.4 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ cần thiết

o Máy đo quang OD

o Máy luân nhiệt

o Bộ điện di

o Máy chụp gel

o Micropipette, dầu tip, eppendorf,

o Kéo, chày, kẹp,…

2.3.5 Cách tiến hành

Bước 1: Lấy mẫu và xử lý mẫu

Lấy khoảng 20g mỗi loại thịt bò và thịt bò giả nghi ngờ ( thịt lợn) cho vào túinilong sạch, dán nhãn cho mỗi loại thịt, trữ trong thùng đá, đem về phòng thínghiệm

Sau đó rửa sạch  dùng chày nghiền mẫu trữ ở -70˚C

Bước 2: Tách chiết DNA

Sau khi rã đông mẫu ở nhiệt độ phòng ta tiến hành tách chiết DNA:

 Cho khoảng 0,1g mẫu vào eppendorf 1,5ml

 Cho vào 60μl dung dịch đệm tách chiết (50Mm tTris-HCl, 20mM NaCl,1mM EDTAvà 1% SDS, pH=8), và 3μl dung dịch protease K ủ hỗn hợp

Thực hiện phản ứng PCR

Điện di sản phẩmĐiện di sản phẩm

 Cho vào 375 μl nước cất khử ion vô trùng; vortex 14000 vòng/phút trong

30 giây

 Cho thêm 200μl dung dịch hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol;vortex 14000 vòng/phút trong 1 phút; ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút

ở 10˚C

 Lấy phần nước nổi bên trên chuyển vào eppendorf 1,5 ml mới đã có sẵn 1

ml dung dịch cồn tuyệt đối; trộn đều; ủ -20˚C trong 1 giờ

 Ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 10˚C, lấy cặn làm ráo

 Rửa cặn bằng 1 ml ethanol 70%, ly tâm 12000 vòng/ phút trong 2 phút ở10˚C , lấy cặn

 Làm khô cặn trong tủ ấm ở 55˚C

 Hòa tan cặn bằng 200μl dung dịch TE, ủ 55˚C trong 2 giờ

Sản phẩm DNA sau khi tách chiết được trữ ở -20˚C hoặc được sử dụng ngay.Kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng cách đo mật độ quang OD ở bước sóng 260nm

và 280nm bằng quang phổ kế (model HP 8453) Các mẫu DNA tách chiết có tỷ số

OD 260nm/OD 280nm> 1,6 được sử dụng cho PCR

Sau khi đo OD ta pha loãng mẫu đến nồng độ 100ng/μl

Kết quả OD được xử lý bằng phần mềm Statgraphics Version 7.0

Bước 3: Thực hiện phản ứng PCR

Sản phẩm DNA sau khi tách chiết được đưa vào máy luân nhiệt PCR để thực hiệnquá trình khuếch đại DNA theo quy trình của Matsugana và các cộng sự (1998)với chu trình nhiệt như sau:

Giai đoạn Diễn giải Nhiệt độ, thời gian

1 Tiền biến tính 94˚C trong 4 phút

2 Lặp lại 35 chu Biến tính 94˚C trong 30 giây