Ky sinh trung thuc hanh đt CNXN bo y Te(FILEminimizer)

Trong trường hợp sau khi lấy phân mà chưa xét nghiệm ngay hoặc lấy phân tại nhà ở xa, nên bảo quản phân bằng cách để phân trong các dung dịch định hình fixative để trứng giun, sán không

BỘ Y TẾ

GIÁO TRÌNH

KÝ SINH TRÙNG

THỰC HÀNH(DÙNG CHO ĐÀO TẠO CỬ NHÂN XÉT NGHIỆM)

MÃ SỐ: ĐK.01.Z.15

Chỉ đạo biên soạn:

VỤ KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO – BỘ Y TẾ

Chủ biên:

PGS TS LÊ THỊ XUÂN

Tham gia tổ chức bản thảo:

ThS PHÍ VĂN THÂM

TS NGUYỄN MẠNH PHA

Thực hiện một số điều của Luật Giáo dục, Bộ Giáo dục & Đào tạo và Bộ Y tế đã ban hành chương

trình khung đào tạo Cử nhân xét nghiệm Bộ Y tế tổ chức biên soạn tài liệu dạy – học các môn cơ sở và

chuyên môn theo chương trình trên nhằm từng bước xây dựng bộ sách đạt chuẩn chuyên môn trong công tác đào tạo nhân lực y tế

Giáo trình KÝ SINH TRÙNG THỰC HÀNH được biên soạn dựa vào chương trình giáo dục của Trường Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh trên cơ sở chương trình khung đã được phê duyệt Giáo trình được PGS.TS Lê Thị Xuân (Chủ biên), CN Võ Thị Mỹ Dung, CN Nguyễn Thị Hiện, CN Trịnh Tuyết Huệ, CN Nguyễn Hồ Phương Liên biên soạn theo phương châm: kiến thức cơ bản, hệ thống; nội dung chính xác, khoa học; cập nhật các tiến bộ khoa học, kỹ thuật hiện đại và thực tiễn Việt Nam

Giáo trình KÝ SINH TRÙNG THỰC HÀNH đã được Hội đồng chuyên môn thẩm định sách và tài liệu dạy – học chuyên ngành Cử nhân xét nghiệm của Bộ Y tế thẩm định năm 2008 Bộ Y tế quyết định ban hành tài liệu dạy – học đạt chuẩn chuyên môn của ngành trong giai đoạn hiện nay Trong thời gian từ

3 đến 5 năm, sách phải được chỉnh lý, bổ sung và cập nhật

Bộ Y tế chân thành cảm ơn các tác giả và Hội đồng chuyên môn thẩm định đã giúp hoàn thành cuốn sách; cảm ơn PGS.TS Vũ Đức Chính, PGS.TS Hoàng Tân Dần đã đọc và phản biện để cuốn sách sớm hoàn thành, kịp thời phục vụ cho công tác đào tạo nhân lực y tế

Lần đầu xuất bản, chúng tôi mong nhận được ý kiến đóng góp của đồng nghiệp, các bạn sinh viên và các độc giả để lần xuất bản sau sách được hoàn thiện hơn

VỤ KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO – BỘ Y TẾ

Giáo trình Ký sinh trùng thực hành được biên soạn cho sinh viên khoa Kỹ thuật Y học có mục

đích hướng dẫn cho những sinh viên học môn Ký sinh trùng nhằm hoàn thiện khả năng chẩn đoán dựa trên một số thông tin lâm sàng cơ bản và xét nghiệm bệnh phẩm bằng cách xem kính hiển vi, cấy Một số kỹ thuật miễn dịch cũng được đề cập đến

Nội dung các kỹ thuật trình bày trong giáo trình này có thể không được đầy đủ, nhưng nó cũng chứa đựng các phương pháp phổ biến nhất và đủ dùng cho các phòng xét nghiệm lâm sàng ở nước ta Trong cuốn giáo trình này, chúng tôi đã cố gắng trình bày những điểm đặc trưng về hình thể để phân biệt ký sinh trùng và giải thích làm thế nào để xác định chúng

Phần ba: Phụ lục, giới thiệu các hóa chất thường dùng trong xét nghiệm ký sinh trùng đường ruột; các

hóa chất, thuốc nhuộm và môi trường trong xét nghiệm nấm

Những hình ảnh minh họa, mặc dù không hoàn chỉnh nhưng cũng khá đầy đủ về số lượng và chất lượng, cung cấp một cách khái quát về hình thái của ký sinh trùng và vi nấm cũng như các kỹ thuật phát hiện chúng

Các tác giả là những người làm việc ở phòng thí nghiệm trong nhiều năm qua và có kinh nghiệm giảng dạy về môn Ký sinh trùng, hy vọng rằng cuốn sách này sẽ cung cấp những thông tin có giá trị cho sinh viên nhằm giúp họ có kiến thức về thực tiễn chẩn đoán ký sinh trùng, giúp cho việc phòng, chữa bệnh đạt hiệu quả

Do trình độ và thời gian có hạn, chúng tôi không tránh khỏi những thiếu sót về chuyên môn cũng như in ấn, rất mong nhận được sự góp ý của các sinh viên và đồng nghiệp để lần xuất bản sau giáo trình được hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn

CÁC TÁC GIẢ

Đa số ký sinh trùng (KST) không thể nhận thấy bằng mắt thường mà cần có những dụng cụ quang học để phóng đại chúng lên như kính lúp, kính hiển vi Tùy theo yêu cầu của kỹ thuật, kính hiển vi còn cần có những phụ tùng để đo kích thước KST, tụ quang nền đen,…

1 NHẮC LẠI CẤU TRÚC CỦA KÍNH HIỂN VI

Kính hiển vi là một công cụ thường dùng và quan trọng nhất của một phòng xét nghiệm KST Kính hiển vi có thể có những hình dạng khác nhau tùy theo mẫu sản xuất, nhưng cấu tạo cơ bản

 Kính tụ quang: tập trung ánh sáng

 Màng chắn ánh sáng: để cho ánh sáng qua nhiều hay ít để vào vật kính

 Gương tròn dùng để lấy ánh sáng, thường có 2 mặt:

– Mặt lõm: khi sử dụng vật kính x10, x40

– Mặt phẳng: khi sử dụng vật kính x100

Những loại kính dùng ánh sáng của bóng đèn gắn trong thân máy không có gương

 Tiểu xa: dùng để giữ tiêu bản được gắn với một trục có một ốc dùng để di chuyển sang trái, sang phải và một ốc dùng để di chuyển phía trước, về sau

 Thân kính mang ống kính, bàn mang mẫu vật, kính tụ quang, ốc vi cấp, ốc thứ cấp và gương

 Chân: có chức năng giữ cho kính được vững và ổn định

Cấu tạo kính hiển vi quang học

2 CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI

 Đặt tiêu bản lên bàn mang tiêu bản

 Điều chỉnh ánh sáng với gương tròn, kính tụ quang và màn chắn sáng

 Xoay trục mang vật kính x10 vào đúng vị trí

 Vặn ốc thứ cấp để thấy rõ vật

 Nếu cần quan sát với độ phóng đại lớn thì đổi qua vật kính lớn hơn x40, dùng ốc vi cấp để điều chỉnh đến khi thấy rõ vật Khi sử dụng vật kính x100, ta phải dùng dầu soi kính Nhỏ 1 giọt dầu lên tiêu bản rồi đổi qua vật kính x100

3 CÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI

 Đặt kính hiển vi đúng chỗ, xa hơi nóng và chỗ ẩm ướt

 Cầm kính hiển vi bằng thân kính, tay kia đỡ chân của kính Phải để đứng kính hiển vi, không được để kính nghiêng

 Cẩn thận không làm rơi chất ăn mòn hay bất cứ một dung dịch nào lên bàn kính

 Không được để tay ướt hay bẩn lên kính hiển vi

 Lau thị kính và vật kính bằng giấy lau kính trước và sau khi dùng Khi soi với vật kính dầu, thấm giấy lau kính với một giọt xylen để lau vật kính Sau khi lau với xylen, phải lau khô ngay bằng giấy lau kính, nếu không xylen có thể làm bong những thấu kính gắn trong vật kính

 Trước khi cất kính hiển vi, để vật kính nhỏ ở vị trí quan sát và hạ thấp ống kính bằng ốc lớn Vặn nhẹ nhàng, đừng ấn mạnh ống kính Nếu cẩn thận hơn, hạ tụ quang kính xuống Nếu tụ quang kính bẩn, lau bằng giấy lau kính khô

 Để gương nghiêng, mặt phẳng ra phía ngoài để tránh bụi

 Che kính hiển vi bằng bao của kính Cất kính vào đúng chỗ của kính, để lui vào phía trong, đừng để mấp mé phía ngoài

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Trình bày cách sử dụng kính hiển vi để quan sát một mẫu phân tươi

2 Khi sử dụng kính hiển vi để soi lam máu, anh (chị) cần chú ý đến yếu tố nào để có thể nhìn thấy

rõ KST sốt rét (KST SR) trên phết máu nhuộm?

3 Sau khi soi lam máu tìm KST SR, anh (chị) bảo quản kính hiển vi như thế nào trước khi cất vào

tủ kính?

Bài 2 CÁCH CHUẨN ĐỘ KÍNH HIỂN VI

Xác định loài KST cần dựa vào nhiều tiêu chuẩn, trong đó có tiêu chuẩn kích thước của KST Ta

có thể ước lượng kích thước KST bằng cách so sánh với một vật đã biết kích thước trước như hồng cầu, nhưng cách này không cho ta kết quả chính xác Để đo được chính xác kích thước KST, ta dùng

– Thước trắc vi thị kính (chia thành 50 đơn vị)

– Thước trắc vi nền với 2 độ chia 0,1 và 0,01mm

 Đặt thước trắc vi nền lên bàn kính hiển vi

 Di chuyển bàn kính sao cho 2 thước nằm chồng lên nhau, vạch 0 trên thước trắc vi thị kính trùng với vạch 0 trên thước trắc vi nền

 Nhìn phía bên phải vạch 0 của thước trắc vi nền để tìm điểm mà 1 vạch của thước trắc vi thị kính trùng với 1 vạch của thước trắc vi nền, điểm trùng này gọi là điểm Y Khoảng cách sẽ thay đổi tùy theo các vật kính sử dụng (x10, x40, x100)

 Đếm số vạch chia trên thước trắc vi thị kính, từ số 0 đến vạch trùng lắp (Y) Đếm số vạch chia (0,1mm) trên thước trắc vi nền từ vạch 0 đến vạch trùng lắp (Y), Tính đoạn đếm được trên thước trắc vi thị kính theo công thức sau:

N = Số vạch đếm được trên thước trắc vi nền (mm)

n = Số vạch đếm được trên thước trắc vi thị kính (mm)

Ví dụ: Ở vật kính x10, ta có N = 0,3mm, n = 40

Ví dụ: Đo chiều dài của trứng giun kim

Đặt tiêu bản lên bàn kính, quan sát trứng với vật kính 10, chiều dài của trứng giun kim tương ứng với 8 khoảng chia của thước trắc vi thị kính

Ta đã có đơn vị thị kính ở vật kính x10 là 7,5mm, chiều dài của trứng giun kim sẽ là 7,5mm x 8

= 60mm

Lưu ý:

– Mỗi độ phóng đại của vật kính (x10, x40 và x100) có đơn vị thị kính khác nhau, vì mỗi vạch của thước trắc vi nền sẽ thay đổi kích thước trong khi vạch của thước trắc vi thị kính vẫn duy trì kích thước cũ Vì vậy, cần phải chuẩn độ cho từng loại vật kính và ghi lại các đơn vị này lên kính hoặc tờ giấy dán gần kính để dễ tra cứu

– Khi muốn có số đo của KST thì chỉ cần nhân số vạch đo được với đơn vị thị kính để có kích thước thật

– Sau khi mỗi vật kính đã được chuẩn độ, ta không trao đổi thị kính chứa thước trắc vi và những vật kính của kính hiển vi này với thị kính hoặc vật kính của kính hiển vi khác Phải sử dụng vật kính

và thị kính đã được chuẩn độ

– Nên chuẩn độ định kỳ để bảo đảm tính chính xác

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Tạo sao cần phải biết kích thước của KST?

1.1 Chuẩn bị bệnh nhân trước khi lấy phân

Nhiều kết quả xét nghiệm phân là âm giả tạo do bệnh nhân không được hướng dẫn đầy đủ hay hướng dẫn không đúng cách Phải hướng dẫn bệnh nhân một cách cẩn thận; tốt nhất là phòng thí nghiệm đưa cho bác sĩ điều trị những bản in sẵn những chi tiết cần thiết để phát cho bệnh nhân được chỉ định xét nghiệm phân

Dặn bệnh nhân trong 3 ngày trước khi lấy bệnh phẩm, tránh dùng những loại thuốc và thực phẩm

có thể làm cho việc nhận dạng KST khó khăn như:

– Thuốc: Bismuth, Magnesium, Kaolin, Baryte, thuốc đặt vào hậu môn có dầu, mỡ

– Thực phẩm nhiều cặn bã: ngũ cốc, bắp cải, salad, quả có nhiều hạt nhỏ, nhiều chất béo, dầu,

làm biến dạng đơn bào

+ Nếu cho bệnh nhân uống thuốc xổ, chỉ nên cho uống sulfat natri và sẽ lấy phân khi bệnh nhân

đi ngoài lần thứ hai hay thứ ba sau khi uống thuốc

– Lượng phân cần lấy:

+ Thay đổi tùy theo mục đích và kỹ thuật xét nghiệm, thường chỉ cần khoảng 5 – 10 gam phân (khoảng bằng hạt lạc) để có thể đủ làm nhiều phương pháp

+ Trong một số trường hợp như tìm giun, đốt sán, các bệnh về bộ tiêu hoá phải lấy toàn bộ số lượng phân được thải ra để có thể thấy được KST và màng nhày hay mô bì bị tróc ra cùng với phân

1.2.2 Ngoài phòng xét nghiệm

Lấy phân ở ngoài phòng xét nghiệm là điều bất đắc dĩ, cần tôn trọng những nguyên tắc sau: – Phải gửi đến phòng xét nghiệm trong thời gian ngắn nhất, đặc biệt là đơn bào, phân phải luôn được giữ ấm

– Không được giữ ở nhiệt độ lạnh quá

– Nếu ở xa: giữ hộp phân trong nước ấm 37oC và đồng thời lấy một chút phân cho vào một trong những dung dịch cố định:

+ MIF: Merthiolate Iod Formol

PVA: Polyvinyl Alcohol

F2AM: Formol + Phenol + Alcool + Xanh Methylene

Sau khi thu hồi bệnh phẩm cần xét nghiệm ngay, càng sớm càng tốt Thời gian từ khi lấy mẫu đến khi khảo sát:

– Phân bình thường cần xét nghiệm trong vòng 12 – 24 giờ hoặc có thể để 1 – 2 ngày trong tủ lạnh – Phân mềm, nhão, lỏng hay có màng nhày và máu cần phải xem ngay trong vòng 30 phút sau khi lấy

Trong trường hợp sau khi lấy phân mà chưa xét nghiệm ngay hoặc lấy phân tại nhà ở xa, nên bảo quản phân bằng cách để phân trong các dung dịch định hình (fixative) để trứng giun, sán không phát triển, đơn bào không bị thoái hóa

2 HÓA CHẤT BẢO QUẢN PHÂN

– Để bảo quản hình thể và ngăn sự phát triển tiếp tục của trứng và ấu trùng giun, sán, phân được đựng trong chất bảo quản ngay lập tức sau khi lấy (bệnh nhân lấy) hoặc khi phòng xét nghiệm nhận bệnh phẩm

– Một số chất cố định được ưa dùng là: formol, sodium acetat–acetic acid–formol (SAF), dung dịch Schaudinn, polyvinyl alcohol (PVA)

– Khi chọn phương pháp cố định, phải đảm bảo chất cố định được chọn phù hợp với kỹ thuật xét nghiệm sẽ làm Vì mỗi chất cố định có tính chất riêng, không thể dùng cho tất cả các loại kỹ thuật xét nghiệm

100%

Bào nang đơn bào, trứng nang của trùng bào tử, trứng giun, sán và ấu trùng được bảo quản lâu dài trong formol 10% Formol nóng (60OC) có thể dùng đối với bệnh phẩm có trứng giun, sán (vì trong formol lạnh, một vài loại trứng dày sẽ tiếp tục phát triển, gây nhiễm và sống trong một thời gian dài)

Lấy vài gram phân trộn kỹ trong dung dịch formol 5 – 10%

– Không bảo quản thể hoạt động

– Hình dạng KST không đẹp trên phết nhuộm cố định

2.2 Sodium acetat – acetic acid formol (SAF)

SAF được dùng để bảo quản trứng và ấu trùng giun, sán, bào nang và thể hoạt động đơn bào,

trứng nang trùng bào tử và bào tử Microsporidia

Bệnh phẩm cố định trong SAF đều dùng được với phương pháp tập trung phân và làm phết nhuộm cố định Khi làm phết phân để nhuộm, nên trộn thêm albumin vào phân để tăng độ dính của bệnh phẩm vào lam kính

SAF được coi là chất cố định mềm hơn thủy ngân clorua Hình dạng KST sẽ không sắc nét bằng khi cố định trong dung dịch có thủy ngân clorua Kết hợp cố định SAF với nhuộm hematoxylin sắt cho hình dạng tốt hơn nhuộm Trichrome

– Thành phần:

Pha chế Albumin Mayer: trộn một thể tích lòng trắng trứng với một thể tích glycerin Cho một

giọt hỗn hợp này lên lam kính, cho thêm một giọt cặn lắng phân SAF, trộn đều, để khô ở nhiệt độ phòng 30 phút rồi nhuộm

Ưu điểm:

– Dùng cho tiêu bản tập trung và cố định

– Không có hợp chất thủy ngân

– Dễ pha chế, bảo quản lâu

– Cặn lắng có thể làm kỹ thuật miễn dịch men

– Cố định tiêu bản từ mẫu phân tươi hoặc niêm mạc ruột

– Bảo quản tốt thể hoạt động và bào nang đơn bào

Nhược điểm:

– Không khuyến cáo dùng trong phương pháp tập trung

– Dung dịch có chứa thủy ngân clorua, nên đặt ra vấn đề xử lý nước thải

– Ít dính với bệnh phẩm lỏng hoặc nhày

2.4 Polyvinyl alcohol (PVA)

PVA là một nhựa dẻo phối hợp với dung dịch cố định Schaudinn Bột PVA được dùng như chất dính cho bệnh phẩm phân khi hỗn hợp phân – PVA được trải trên lam kính, còn việc cố định vẫn là dung dịch Schaudinn

Dung dịch cố định PVA được dùng để bảo quản tất cả các thể của KST đường ruột, nhất là bào nang

và thể hoạt động đơn bào cho những kỹ thuật chuyên sâu

PVA cũng được dùng để cố định bệnh phẩm cần gửi qua bưu điện đến những phòng thí nghiệm chuyên sâu, rất tốt với bệnh phẩm lỏng và pha theo tỷ lệ 3 phần PVA với 1 phần phân

Cách pha chế:

Trộn các dịch lỏng vào cốc 500ml, thêm bột PVA vào (không khuấy) Đậy cốc bằng đĩa Petri lớn, giấy sáp hoặc lá kim loại, để qua đêm Đun từ từ đến 75oC, lấy cốc ra và khuấy trong khoảng 30 phút đến khi có dung dịch đồng nhất như sữa

Ưu điểm:

– Có thể làm tiêu bản cố định và phương pháp tập trung

– Bảo quản tốt bào nang và thể hoạt động đơn bào

– Bảo quản lâu (hàng năm) trong lọ kín ở nhiệt độ phòng

– Bệnh phẩm có thể gửi bằng bưu điện đến phòng thí nghiệm chuyên sâu

– Trứng Trichuris trichura và bào nang Giardia lambia trong phương pháp tập trung dễ nhận ra

như trong phương pháp formol–ether

Nhược điểm:

– Hình dạng ấu trùng Strongyloides stercoralis không đẹp như cố định bằng formol Trứng nang

Isospora belli có thể không quan sát được (formol tốt hơn)

– Dung dịch có chứa thủy ngân, nên đặt ra vấn đề xử lý nước thải

– Có thể trở nên trắng và sệt do mất nước hay do làm lạnh

– Khó pha chế trong phòng thí nghiệm

– Không thể dùng tiêu bản để làm kỹ thuật miễn dịch men

2.5 PVA cải tiến

PVA được cải tiến không chứa thủy ngân, mà thay vào đó người ta dùng sulfat đồng hoặc sulfat

kẽm Sulfat đồng không cho kết quả tốt như thủy ngân clorua Sulfat kẽm được dùng trong nhuộm Trichrome

Ưu điểm:

– Dùng được cho phết nhuộm cố định và phương pháp tập trung

– Không chứa thủy ngân

– Cố định bằng sulfat kẽm cho kết quả tốt hơn vì thế nhiều người thích dùng PVA có chứa sulfat kẽm hơn sulfat đồng

3 KỸ THUẬT LƯU GIỮ KÝ SINH TRÙNG TRONG BỆNH PHẨM

Giữ bệnh phẩm ở 40oC, có thể giữ được trứng giun, sán và bào nang đơn bào nhiều ngày, nhiều tuần mà vẫn có thể định danh được dễ dàng Muốn giữ lâu phải dùng dung dịch định hình

3.1 Trứng, ấu trùng giun, sán và bào nang đơn bào

a) Lưu giữ trên tiêu bản làm từ phân ướt

– Để tránh loang phải dùng lam kính sạch, rửa sạch mỡ trong dung dịch đồng thể tích cồn –ether

– Để tránh khô do tiếp xúc với không khí, không bay hơi, người ta hàn tiêu bản bằng:

+ Vaselin: mẫu không giữ lâu hơn vài giờ, dùng để quan sát KST sống

+ Paraffine:

Loại paraffine dùng cho mô học, hơ nóng chảy hay để ở tủ ấm 56oC Phương pháp này dễ thực hiện nhưng tiêu bản dễ bị vỡ khi va chạm

+ Thuốc sơn móng tay:

* Phải để tiêu bản bốc hơi, khô bớt ở viền hàn, ấn xem còn hở không Sau đó hàn lần thứ 2 và để khô Phương pháp này giản dị không cần dụng cụ đặc biệt

* Nếu hàn kín, mẫu lưu giữ tốt, trứng giun, sán còn nguyên vẹn; ngược lại bào nang và dạng hoạt động lưu giữ không tốt

b) Lưu giữ KST lâu dài

Dùng dung dịch formol mà nồng độ tùy thuộc vào độ cứng của phân (phân rắn dùng formol 5%; phân sệt: formol 10%), phân có trứng giun có sức chịu đựng cao (20%, F2AM)

– Quy trình thực hiện:

 Cho phân vào dung dịch cố định theo thể tích:

1 thể tích phân + 3 thể tích dung dịch bảo quản

 Nghiền đều, lược qua lưới kim loại để loại những cặn bã lớn

 Để 1 phút ở bình thủy tinh có chân để loại trừ những phần tử nặng

 Đổ phần trên vào chai có nút và có nhãn

 Ghi KST có trong mẫu, ngày lấy mẫu, nồng độ dung dịch cố định

+ KST được giữ tốt ở cặn lắng trong chai

+ Để làm giảm sự bốc hơi của formol, thêm vào dung dịch bảo quản 10% glycerine

Đối với dạng hoạt động của amíp

+ Dùng dung dịch cố định và lưu giữ kể trên, dung dịch formol 10% chỉ giữ được amíp vài tuần, sau đó amíp sẽ bị ly giải

+ Dung dịch MIF: dung dịch này đắt tiền nhưng giữ được dạng hoạt động của amíp nhiều năm + Dung dịch PVA: giữ được dạng hoạt động của amíp và có thể làm phết nhuộm Hematoxyline sắt

Đối với dạng hoạt động của trùng roi đường ruột:

Những cách kể trên đều dùng được nhưng không tốt vì những dạng hoạt động thường thu tròn lại, không thấy được như khi quan sát trực tiếp Dung dịch tương đối tốt là MIF, F2AM

3.2 Giun, sán trưởng thành

a) Giun, sán tìm thấy đã chết trong phân

– Ít có giá trị vì chúng thường đã bị hủy hoại

– Hóa chất thường dùng là formol 5% hoặc cồn ethylic 700

b) Giun, sán còn sống trong phân

– Rửa bằng nước muối sinh lý

– Phương thức cố định thay đổi tùy theo loại giun, sán:

+ Giun:

* Lấy giun ra khỏi nước rửa để trong hộp Petri hay bát sứ

* Đổ ngay cồn ethylic 700 sôi (đun sôi cồn trong bình Erlenmeyer có khuấy từ) Cách cố định này làm giãn giun ngay lập tức

* Giữ trong bình thủy tinh có nút mài Không đậy bằng nút bấc hay cao su vì sẽ làm hư mẫu mau chóng

Lưu ý:

* Không cố định bằng cồn lạnh

* Không làm chết giun trong NaCl 0,85%

* Không dùng dung dịch formol

* Lưu mẫu trong cồn 700, trong chai thủy tinh nút mài hoặc nút cao su

c) Loại giun có kích thước nhỏ

– Để từng lô giun trong ống nghiệm chứa cồn ethylic 700, đậy nút bông gòn không thấm nước, bao miệng

– Phải dán nhãn, viết ngày bằng bút mực tàu, bút mỡ

– Để cả lô vào bình có nắp, dưới lót bông thấm nước, đổ đầy cồn ethylic 700, đậy nắp Tránh cồn bay hơi (nắp phải có vòng cao su)

3.3 Những điều cần biết khi lưu giữ KST lâu dài

– Giun mất độ trong và màu tự nhiên: khi bị cố định trở nên đục và hơi trắng nhưng giữ được rất lâu trong cồn

– Trứng giun, sán thì dễ nhận nhưng không giống hệt như trong phân tươi Vài loại trứng nhưtrứng giun đũa, trứng giun móc sẽ bị phân bào nếu dung dịch cố định không đủ nồng độ (dạng phân bào không bao giờ gặp trong phân tươi)

– Bào nang đơn bào ở dạng tươi thì nhân có màu kém Sau một thời gian lưu, những nhân này không nhuộm màu nhưng lại rõ hơn là ở trạng thái tươi

– Dạng hoạt động của amíp mất nhanh chóng độ chiết quang trong dung dịch formol

– Trong MIF, amíp không bị ly giải, nhận ra dễ Ngược lại, sau khi để trên lam kính và đậy bằng

lá kính, màu của chúng biến mất, không thể dùng làm mẫu để lâu dài trên lam kính và lá kính

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Thế nào là thu thập phân đúng quy cách?

2 Đối với anh (chị), điều gì quan trọng trong khâu thu thập phân?

3 Theo anh (chị) hiện nay, các phòng xét nghiệm trong nước ta có chú trọng đến việc lấy bệnh

phẩm? và kết quả của việc có/không chú trọng đến việc lấy bệnh phẩm là gì?

4 Bảo quản bệnh phẩm có ích lợi gì?

5 Nêu tên những hóa chất bảo quản phân thường được dùng, cho biết ưu và nhược điểm của từng

hóa chất bảo quản được nêu

6 Cách bảo quản đơn bào khác với cách bảo quản giun, sán như thế nào?

7 Hóa chất bảo quản có ảnh hưởng gì đến KST khi KST được ngâm trong thời gian lâu dài?

Không nên để phân ngoài trời, không có nắp đậy; không nên để lọ phân trên phiếu xét nghiệm hoặc để dồn mẫu vào cuối buổi mới xét nghiệm

Đối với phân được bảo quản trong dung dịch cố định thì quan sát đại thể không thực hiện được

Để phát hiện được KST chúng ta cần phải dùng kính hiển vi để quan sát (vi thể)

1 QUAN SÁT ĐẠI THỂ

Quan sát đại thể (bằng mắt hoặc kính lúp) để ghi nhận trạng thái, màu sắc, các chất lạ, tìm kiếm

và xác định các loại giun, sán được thải ra theo phân

– Mô liên kết: màu trắng như xà cừ Xem dưới kính hiển vi sau khi làm trong với acid acetic sẽ

thấy những sợi dài

– Máu: chỉ cần ghi nhận sự hiện diện máu tươi hoặc đã được tiêu hóa làm phân có màu đen đều – Mủ: gồm có nhiều bạch cầu đã biến dạng

– Các cặn bã thực vật chưa tiêu hóa, thường dưới hình thức sợi

2 QUAN SÁT VI THỂ

Quan sát vi thể có thể được thực hiện với kỹ thuật xét nghiệm phân trực tiếp, tập trung KST trong phân, kỹ thuật chuyên biệt, cấy và nhuộm cố định

II KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PHÂN TRỰC TIẾP

Kỹ thuật xét nghiệm phân trực tiếp sử dụng phân hòa tan trong nước muối cho phép phát hiện sự

di động của thể hoạt động đơn bào, trứng giun, sán, ấu trùng giun và các vật thể bất thường trong phân (hồng cầu, bạch cầu,…)

3 QUY TRÌNH LÀM TIÊU BẢN PHÂN

 Lấy một tấm lam kính sạch, khô Dùng viết chì sáp chia lam kính ra làm 3 phần Ghi tên bệnh nhân vào ô nhỏ ở đầu lam kính

 Nhỏ lên lam kính 1 giọt NaCl 0,85% vào ô giữa, 1 giọt Lugol ở ô cuối

 Dùng que gỗ lấy một ít phân bằng đầu que diêm, hòa tan phân vào giọt NaCl 0,85%

 Lấy phân lần thứ hai rồi hòa tan phân vào giọt Lugol

 Bỏ que gỗ vào dung dịch sát trùng

 Đậy lá kính lên 2 giọt phân

 Khảo sát tiêu bản dưới kính hiển

4 TIÊU CHUẨN CỦA MỘT TIÊU BẢN TỐT

– Không quá dày: phân nhiều sẽ làm tiêu bản đục tối, che lấp KST, khó phát hiện

– Không quá mỏng: ít phân quá sẽ không tìm thấy KST, trừ khi chúng

quá nhiều

– Tiêu bản có độ dày vừa phải khi thấy được chữ in trên tờ báo đặt dưới tiêu bản

– Tiêu bản không có bọt khí, dung dịch phân không tràn ra quanh lá kính

5 KHẢO SÁT TIÊU BẢN DƯỚI KÍNH HIỂN VI

– Khảo sát tiêu bản phân bằng vật kính x10, khi muốn nhìn rõ chi tiết thì chuyển sang vật kínhx40

– Khảo sát mẫu phân theo hình chữ chi (zic zac) để không bỏ sót vi trường nào

Lưu ý:

– Nên để ánh sáng vừa phải

– Mẫu phân được xét nghiệm càng sớm càng tốt, để lâu KST sẽ chết hoặc thay đổi hình dạng, khó xác định

– Mẫu phân tìm trứng giun, sán: không để quá 10 giờ

– Mẫu phân tìm đơn bào: không để quá 2 giờ

6 NHỮNG SAI LẦM NÊN TRÁNH

– Phết phân không đều, chỗ dày, chỗ mỏng

– Nếu phết phân loãng quá hoặc đặc quá, nên bỏ đi, làm lại phết phân khác

– Đậy lá kính làm tiêu bản có bọt khí

– Dung dịch phân tràn ra xung quanh lá kính

– Quên không đặt lá kính lên phết phân thì phết phân sẽ chóng khô, vật kính bị bẩn và màu nhuộm sẽ nhạt rất nhanh

– Dùng nước thường để hòa tan phân thay vì dùng dung dịch NaCl 0,85%, nước thường sẽ làm biến dạng hay hủy hoại thể hoạt động của đơn bào

– Dùng nhiều ánh sáng quá Nên để tụ kính gần với bàn kính Giảm ánh sáng bằng cách đóng bớt màng chắn sáng hay dùng kính lọc màu xanh da trời lấy ánh sáng

7 CÁCH TRẢ LỜI KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM PHÂN

Trên phiếu trả lời kết quả xét nghiệm phân, phải ghi các nội dung sau:

– Đặc tính của phân: phân cứng, mềm, nhão, có khuôn, lỏng,…

– Màu sắc của phân: vàng, xanh, nâu, đen,…

– Các yếu tố bất thường thấy được bằng mắt: chất nhày, máu, đốt sán,…

– Kỹ thuật sử dụng: soi trực tiếp, kỹ thuật tập trung Willis,…

– Kết quả:

+ Âm tính: tìm không thấy trứng và bào nang của KST đường ruột

+ Dương tính, viết ra các chi tiết sau:

* Tên tiếng Việt và tên khoa học của KST

* Trứng, thể hoạt động, bào nang, ấu trùng

* Mật độ nhiễm trên tiêu bản:

– Lá kính: rửa tương tự như lam kính nhưng chỉ sấy khô ở 600C

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Mô tả kỹ thuật làm tiêu bản phân để soi trực tiếp tìm KST

2 Nêu những sai lầm có thể gặp khi làm tiêu bản phân soi trực tiếp

3 Trình bày cách ghi phiếu trả lời kết quả xét nghiệm phân

Kỹ thuật làm tiêu bản phân

2 Ghi tên bệnh nhân lên lam kính. Ghi rõ tên hoặc ký hiệu, đối chiếu với tên

trên phiếu xét nghiệm.

3 Nhỏ lên lam kính 1 giọt NaCl 0,85% và

5 Cho phân vào giọt Lugol và khuấy. Lượng phân vừa đủ, khuấy tan đều, tiêu

bản không quá dày, không quá mỏng.

phân không tràn ra mép lá kính.

7 Đặt tiêu bản lên bàn kính hiển vi Tìm

1.1 Kỹ thuật dùng nước muối bão hòa (Phương pháp Willis)

– Phương pháp này được dùng để tìm trứng các loại giun, sán trong phân: trứng giun móc (rất

tốt), giun đũa, giun tóc, trứng sán dải (dây) và sán dải (dây) Hymenolepis sp

– Không dùng để tìm trứng sán lá, sán máng, ấu trùng giun lươn, bào nang và thể hoạt động của đơn bào

a) Nguyên tắc

Phân được hòa tan trong nước muối bão hòa Trứng giun, sán có tỷ trọng nhẹ hơn tỷ trọng của nước muối bão hòa nên nổi trên mặt nước, dính vào thủy tinh (lá kính) và được lấy ra để quan sát dưới kính hiển vi

* Rửa lá kính sạch dầu, mỡ bằng cồn – ether :

 Đổ dung dịch cồn – ether vào hộp Petri

 Cho lá kính từng chiếc vào hộp Petri, ngâm trong 10 phút

 Lấy ra lau khô từng chiếc và cất trong hộp Petri để dùng dần

d) Quy trình kỹ thuật

 Cho khoảng 5g phân vào lọ penicilin hoặc ống nghiệm

 Đổ vào lọ một ít nước muối bão hòa, khoảng 1/3 lọ

 Dùng que khuấy tan phân trong nước muối

 Cho thêm nước muối bão hòa vào đến khi mực nước ngang miệng lọ

 Vớt bỏ các cặn bã nổi lên mặt nước

 Nhỏ thêm vài giọt nước muối bão hòa vào lọ cho đến khi mặt nước cong vồng lên (không để nước muối tràn miệng lọ)

 Đậy lá kính lên miệng lọ, tránh có bọt khí giữa lá kính và mặt nước

 Để yên trong khoảng 10 phút

 Nhấc thẳng lá kính lên (lá kính mang theo giọt nước muối ở mặt dưới) và đặt lên lam kính

 Khảo sát tiêu bản dưới kính hiển vi

Lưu ý:

– Nếu thời gian để ngắn quá trứng sẽ chưa nổi lên

– Nếu để lâu quá trứng sẽ ngấm nước muối và chìm xuống đáy

– Thời gian dài hay ngắn tùy theo độ cao của ống nghiệm hoặc chai lọ khi sử dụng Tốt nhất nên thử thời gian trứng nổi với ống nghiệm và chai lọ khác nhau

1.2 Kỹ thuật dùng dung dịch Sulfat kẽm

– Phương pháp này dùng để tìm trứng các loại giun và bào nang đơn bào trong phân

– Không dùng để tìm trứng sán dây, sán lá, sán máng, ấu trùng giun lươn Không dùng với phân

 Hòa tan 5g phân với 2 – 3ml nước trong ống nghiệm

 Thêm nước cho đủ 10ml

 Lọc dung dịch trên qua tấm gạc vào ống ly tâm

 Ly tâm 2000 vòng/phút trong 2 phút, đổ bỏ phần nước trong bên trên

 Cho vào ống ly tâm một ít dung dịch Sulfat kẽm, khuấy đều, tiếp tục cho thêm dung dịch Sulfat kẽm vào ống cho đến cách miệng ống nghiệm khoảng 2 – 3cm

 Khuấy đều phân trong ly có chân

 Để lắng khoảng 1 giờ

 Đổ bỏ phần nước nổi bên trên

 Thêm nước, khuấy đều, để lắng 1 giờ, gạn bỏ phần nước nổi

 Lập lại nhiều lần cho đến khi nước bên trên trong hẳn

 Gạn bỏ phần nước nổi

 Khuấy đều phần cặn, lấy 1 hoặc 2 giọt cặn khảo sát dưới kính hiển vi

a) Nguyên tắc

Mẫu phân được xử lý với formol để bảo quản KST có trong phân Chất bã được lược bỏ, dầu,

mỡ trong phân sẽ được tách ra bởi ether Sau khi ly tâm, cặn lắng xuống đáy và chứa tất cả KST có trong phân

 Dùng que gỗ lấy khoảng 5g phân cho vào trong ống ly tâm

 Cho 7ml dung dịch formol 10% vào ống ly tâm

 Hòa tan phân và lọc phân qua lưới lọc vào ống ly tâm khác hoặc vào cốc có mỏ

 Ly tâm 2000 vòng/phút trong 1 – 2 phút Hút bỏ phần nước nổi Có thể lặp lại nhiều lần cho đến khi phần nước nổi trong

 Cho 10ml dung dịch formol 10% và 3ml ether vào trong ống ly tâm

 Đậy ống nghiệm bằng nút cao su, trộn đều bằng cách lắc mạnh trong vòng 10 giây

 Mở nắp cao su, cho ống nghiệm vào máy ly tâm, quay 2000 vòng/phút trong 1 – 2 phút

 Lấy ống nghiệm ra khỏi máy ly tâm, chất dịch trong ống nghiệm được chia thành 4 lớp:

 Đổ bỏ 3 lớp dung dịch trên cùng bằng một động tác nhanh gọn, dốc ngược ống ly tâm

 Dùng ống hút Pasteur lấy 1 giọt cặn nhỏ lên lam kính và khảo sát dưới kính hiển vi (có thể khảo sát cặn với dung dịch Lugol)

Lưu ý:

Ether, ethyl acetat hoặc xăng là dung môi rất dễ bay hơi và dễ cháy nên để xa nguồn điện, nguồn lửa Bảo quản các chất này trong bình hoặc chai lọ rộng, để nơi thoáng mát Không đặt các bình chứa Ether vào tủ lạnh, hơi Ether sẽ thoát ra và gây nổ

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Mục đích của phương pháp tập trung KST trong phân là gì?

2 Có bao nhiêu phương pháp làm tập trung KST trong phân?

3 Nêu ưu và nhược điểm của kỹ thuật Willis và kỹ thuật dùng formol–ether

4 Anh (chị) sẽ chọn kỹ thuật nào để làm tập trung phân? Cho biết lý do của sự chọn lựa này Xét nghiệm phân theo phương pháp tập trung Wills

1 Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để làm

tiêu bản phân.

Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để làm tiêu bản phân

2 Cho phân vào lọ xét nghiệm Lượng phân đúng quy định 5 gram

3 Đổ nước muối bão hòa vào lọ xét

5 Đậy lá kính miệng lọ xét nghiệm.

Không có bọt khí, bọt nước Dung dịch phân tiếp xúc với lá kính ở vị trí cân đối trong thời gian 15 phút.

Xét nghiệm phân theo phương pháp tập trung formol–ether

ĐỂ PHÁT HIỆN KÝ SINH TRÙNG ĐƯỜNG RUỘT

6 Nhấc lá kính lên và đặt tiêu bản lên lam

kính.

Không có bọt khí, bọt nước.

Soi kính hiển vi tìm ký sinh trùng Soi đúng theo quy trình và quy định.

1 Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để làm

tiêu bản phân.

Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để làm tiêu bản phân

2 Cho phân vào lọ xét nghiệm Lấy nhiều nơi trên khối phân.

3 Đổ dung dịch formol 10% vào lọ xét

4 Dùng que gỗ quấy phân Lọc dung dịch

5 Quay ly tâm 2000 vòng/phút trong 1-2

phút, hút bỏ nước nổi. Hút bỏ nước nổi không làm xáo trộn cặn.

Lặp lại giai đoạn (5) nhiều lần Phần nước nổi phải trong.

6 Đổ dung dịch formol 10% vào lọ xét

nghiệm Cho thêm ether Lấy đúng 10ml formol và 3ml ether

7 Đậy nắp ống nghiệm và trộn đều phân

với formol và ether.

Nắp phải đậy kín và lắc mạnh ống nghiệm trong 10 giây.

8

Quay ly tâm 2000 vòng/phút trong 1-2

phút Lấy ống nghiệm ra khỏi máy ly

nhanh ống nghiệm xuống.

Sau khi đổ bỏ phần nước nổi, cặn không

bị xáo trộn.

11 Soi kính hiển vi tìm ký sinh trùng Soi đúng theo quy trình và quy định.

Trong một số trường hợp, do đặc điểm sinh học riêng biệt của một số loại giun, sán, đơn bào mà các phương pháp xét nghiệm thông thường không thể hoặc thỉnh thoảng mới phát hiện mầm bệnh trong phân

Để khắc phục tình trạng này, người ta đã nghiên cứu đưa ra các phương pháp xét nghiệm đặc thù phù hợp với những đặc điểm sinh học của từng loại KST

1 XÉT NGHIỆM TÌM TRỨNG GIUN KIM

1.1 Phương pháp GRAHAM (Phương pháp băng dính trong)

a) Nguyên tắc

Trứng giun kim thường được tìm thấy ở các nếp nhăn hậu môn, rất hiếm khi tìm thấy trong phân Vì vậy, phết hậu môn bằng keo dính được dùng để thu thập trứng giun kim Kỹ thuật này phải được thực hiện buổi sáng sớm trước khi trẻ làm vệ sinh hậu môn

– Băng keo trong

– Cây đè lưỡi hoặc muỗng dài 10cm

 Đặt miếng lam kính đã dán băng keo lên cây đè lưỡi sao cho cạnh nhỏ của tấm lam kính cách

bờ cây đè lưỡi bằng 1/3 chiều dài của tấm lam kính

 Gỡ băng dính ra khỏi lam kính và cuộn vòng qua đầu cây đè lưỡi, mặt dính để ra ngoài

 Giữ chặt tất cả bằng bàn tay phải

 Tay trái vạch hậu môn của trẻ, tay phải cầm cây đè lưỡi có dán băng keo ấn nhẹ, lật qua lật lại cây đè lưỡi chung quanh rìa hậu môn

 Dán miếng băng keo lên mặt lam kính, dùng bông khô và sạch chà nhẹ miết chặt miếng băng keo xuống mặt lam kính

 Khảo sát tiêu bản dưới kính hiển vi

Chú ý: Phải luôn mang găng tay trong suốt quá trình thao tác, tránh bị nhiễm KST

– Que tăm bông

– Nước muối NaCl 0,85%

– Găng tay

b) Quy trình kỹ thuật

 Dùng que tăm bông xoay chung quanh nếp nhăn hậu môn

 Cho que tăm bông vào trong ống nghiệm có chứa 0,5ml NaCl 0,85%, rửa kỹ que tăm bông vào trong dung dịch nước muối

 Dùng ống hút Pasteur hút nước muối ra lam kính, đậy lá kính và khảo sát dưới kính hiển vi

Chú ý: Phải luôn mang găng tay trong suốt quá trình thao tác, tránh bị nhiễm KST

2 TÌM ẤU TRÙNG GIUN LƯƠN (PHƯƠNG PHÁP BAERMANN)

2.1 Nguyên tắc

Ấu trùng giun lươn có ái tính với nhiệt độ và ẩm độ cao và bị thu hút về nơi có nước ấm

2.3 Quy trình kỹ thuật

a) Lắp đặt hệ thống dụng cụ

 Đặt phễu thủy tinh hoặc plastic lên giá

 Đặt lưới kim loại lên phễu

 Lắp ống cao su vào phễu

 Kẹp chặt ống cao su lại

b) Thao tác

 Trên lưới kim loại đặt 2 miếng gạc

 Nếu phân lỏng, lót dưới miếng gạc 2 lớp giấy thấm

 Đổ khoảng 150g phân tươi lên miếng gạc trên phễu

 Đổ vào phễu nước ấm 45oC sao cho nước vừa sấp miệng phễu và ngập phân

 Dùng bóng đèn rọi vào phễu để giữ nhiệt độ của nước

 Để yên từ 1 – 3 giờ

 Mở kẹp khóa ống cao su hứng nước vào cốc thủy tinh

 Dùng ống hút Pasteur hút nước vào ống ly tâm

 Quay ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút

 Gạn bỏ phần nước nổi

Dùng ống hút Pasteur hút cặn

Khảo sát cặn dưới kính hiển vi tìm ấu trùng

Chú ý: Phải luôn mang găng tay trong suốt quá trình thao tác, tránh bị nhiễm KST

Mẫu phân cũ từ 24 – 48 giờ đôi khi thấy ấu trùng giun móc

3 PHÁT HIỆN ĐẦU SÁN DẢI (SÁN DÂY) TRONG PHÂN

– Thuốc điều trị sán dải hiện nay rất hiệu quả nên việc tìm đầu sán dải trong phân cũng không

cần thiết nữa Tuy nhiên, bệnh phẩm phân cũng nên được kiểm tra đầu sán và đốt sán mang trứng để định danh loài Khi thực hiện phải lấy cả bô phân để xét nghiệm

– Hòa phân với nước và cho qua hệ thống lọc với nhiều cỡ mắt lưới từ to đến nhỏ (sắp xếp mắt lưới từ to đến nhỏ)

– Ly tâm bỏ phần nước nổi, lấy cặn tìm đầu sán bằng kính lúp hoặc kính hiển vi

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Các phương pháp xét nghiệm phân trực tiếp có thể phát hiện được trứng giun kim, ấu trùng giun

lươn không? Tại sao?

2 Mô tả thao tác thu thập trứng giun kim

3 Kỹ thuật Baermann dùng để tìm ấu trùng giun lươn, có thể phát hiện được ấu trùng giun móc

không?

Kỹ thuật Baerman

Bài 7 CẤY PHÂN

– Cấy phân đặc biệt cần thiết để phát hiện nhiễm nhẹ giun móc, Strongyloides stercoralis và

Trichostrongylus spp và để định danh ký sinh trùng

– Ấu trùng thường gặp nhất trong phân là giun lươn

– Tùy thời gian vận chuyển trong lòng ruột và điều kiện của bệnh nhân, có thể tìm thấy ấu trùng

có thực quản phình (rhabditiform) và hiếm hơn là ấu trùng có thực quản hình ống (filariform) Cũng vậy, nếu vì một lý do nào đó mà phân bị chậm tống xuất, trứng phôi và cả ấu trùng giun móc cũng có thể tìm thấy trong phân

– Có nhiều kỹ thuật cấy: cấy qua giấy lọc Harada–Mori, cấy giấy lọc hộp thạch, cấy than

1 KỸ THUẬT HARADA – MORI

1 Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để làm

2 Lắp đặt hệ thống cấy phân Đúng theo quy trình.

3 Để 2 lớp gạc lên lưới Gạc phải phủ toàn bộ mặt lưới

4 Để phân lên lớp gạc Lượng phân lớn, nguyên bô phân.

5 Đổ nước ấm lên phân Nước ấm khoảng 45 o C, vừa ngập phân

6 Để yên từ 1 - 3 giờ. Luôn giữ nước ấm trong suốt thời gian quy

8 Dùng ống hút Pasteur hút nước vào

1.1 Nguyên tắc

Một thanh giấy thấm có phân được cho vào ống nghiệm có ít nước ở đáy Nước thấm dần ngược lên thanh giấy trong khi ấu trùng giun di chuyển xuống đáy ống nghiệm

1.3 Quy trình kỹ thuật

 Cho khoảng 3ml nước vào ống nghiệm

 Trải phân lên miếng giấy thấm, cách 2 đầu khoảng 2 – 3cm

 Đặt miếng giấy vào trong ống nghiệm sao cho nước chạm vào đầu dưới của miếng giấy nhưng không ngập đến phân

 Lấy giấy bọc đầu ống nghiệm lại, châm lỗ để cho không khí vào trong ống nghiệm

 Để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, theo dõi hằng ngày, từ ngày 2 – 4

 Hút nước ở đáy ống nghiệm, nhỏ 1 giọt lên lam kính

 Nhỏ thêm 1 giọt dung dịch Lugol, đậy lá kính, để 1 phút

 Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi với vật kính x10

Chú ý: Phải luôn mang găng tay trong suốt quá trình thao tác, tránh bị nhiễm KST

2 CẤY PHÂN TRONG HỘP PETRI

Kỹ thuật này giống như kỹ thuật Harada–Mori, chỉ khác là dùng hộp Petri thay vì ống nghiệm

2.2 Quy trình kỹ thuật

 Cắt giấy thấm thành hình chữ nhật 7 – 15cm

 Cuốn chặt giấy thấm quanh ở miếng lam kính

 Trải trên mặt giấy 1 gram phân

 Để tất cả vào đáy hộp Petri có 10ml nước cất vô trùng và luôn giữ cho đáy hộp có 1 lớp nước trong suốt thời gian cấy

 Để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, theo dõi hằng ngày, từ ngày 2 – 4

 Hút nước ở đáy hộp Petri, nhỏ 1 giọt lên lam kính

 Đậy lá kính và quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi

Chú ý: Phải luôn mang găng tay trong suốt quá trình thao tác, tránh bị nhiễm KST

3 KẾT QUẢ

Nếu kết quả cấy dương tính:

– Đầu giờ thứ 48 có thể thấy:

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

Về nguyên tắc, kỹ thuật cấy phân Harada–Mori có khác kỹ thuật Baermann không?

Kỹ thuật cấy phân Harada–Mori

1 Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để làm tiêu

bản phân.

Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để cấy phân.

2 Cho nước cất vào ống nghiệm Khoảng 3 - 5ml vào đáy ống nghiệm.

3 Trải phân lên thanh giấy, cách đầu giấy

Bọc giấy miệng ống nghiệm, châm lỗ để

không khí vào ống nghiệm.

Bọc giấy kín, châm những lỗ nhỏ để ruồi, kiến không chui vào được.

Để ống cấy ở nhiệt độ phòng trong 2 - 4

ngày.

Đủ thời gian quy định, không để nước ngập phân, không để nước cạn

6 Tháo bỏ giấy bọc miệng, hút 1 giọt nước

nhỏ lên lam kính Đậy lá kính.

Bỏ giấy vào dung dịch sát trùng.

Nước không tràn ra quanh lá kính.

7 Đặt tiêu bản lên bàn kính hiển vi Tìm KST Soi đúng theo quy trình và quy định.

Phương pháp soi tươi có giá trị rất lớn trong chẩn đoán các bệnh KST nói chung, nhưng không

đủ cho việc nhận dạng đơn bào Vì vậy, cần phải bổ sung thêm kỹ thuật nhuộm trong các kỹ thuật chẩn đoán bệnh KST, đặc biệt là đối với đơn bào Nhuộm cố định là kỹ thuật quan trọng nhất để xác định nhiễm đơn bào đường ruột, vì nó giúp cho việc phân biệt các bộ phận hình thể khác nhau nhờ vào sự bắt màu khác nhau của những bộ phận đó Phết nhuộm này được xem với vật kính dầu (độ phóng đại 1000 lần)

Có nhiều cách nhuộm, phổ biến nhất là nhuộm Trichrome (Wheatley – Gomori), nhuộm Haematoxylin sắt và nhuộm Zeihl – Neelsen cải tiến

1 NHUỘM TRICHOME (GOMORI – WHEATLEY)

1.1 Mô tả

– Nhuộm Trichome là một kỹ thuật nhuộm nhanh, đơn giản để nhuộm đơn bào đường ruột, nhất

là để xem các trùng roi, tế bào của người, nấm hạt men và các KST giả trong khoảng 45 phút

– Có thể dùng để nhuộm mẫu phân tươi hoặc lưu trong cồn Polyvinyl hay phân mới được gắn với dung dịch Schaudinn

– Không dùng để nhuộm mẫu phân đã được tập trung bằng formol – ether

1.2 Vật liệu, hóa chất

a) Thuốc nhuộm Trichome

– Thành phần:

– Cách pha và bảo quản:

+ Cho 1,0ml acid acetic vào các chất nói trên

+ Để yên trong 15 – 30 phút ở nhiệt độ phòng

+ Cho 100ml nước cất vào, dung dịch có màu tím

+ Bảo quản trong lọ thủy tinh hoặc nhựa ở nhiệt độ phòng Giữ được trong 24 tháng

b) Dung dịch cồn ethylic–Iod

– Thành phần:

– Bảo quản trong lọ màu tối

– Khi dùng pha loãng với cồn ethylic 70o cho tới khi có màu trà đậm

– Giữ được khoảng 1 tuần hoặc tới khi nào thấy màu nhạt thì bỏ

c) Dung dịch Acid – Cồn ethylic

Cố định tiêu bản phân là bước rất quan trọng trong quá trình nhuộm để có được tiêu bản đẹp Trước đây, người ta thường cố định tiêu bản phân bằng dung dịch Schaudinn vì nó định hình rất tốt thể hoạt động và bào nang của đơn bào, nhưng vì dung dịch Schaudinn có thủy ngân, rất độc, nên ngày nay người ta có thể dùng dung dịch Schaudinn để cố định hay bỏ tùy người sử dụng

a) Quy trình cố định tiêu bản bằng dung dịch Schaudinn

 Nhúng ngay phết phân vừa làm xong vào trong dung dịch Schaudinn, để 30 phút hoặc qua đêm, sau đó lấy tiêu bản ra và nhúng lần lượt vào:

b) Quy trình không dùng dung dịch Schaudinn

Nhúng tiêu bản phân vào:

Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu x100, nền sẽ có màu đỏ hay xanh lá cây, đơn bào có màu xám nhạt hay lá cây xanh nhạt

1.4 Kết quả

– Thể hoạt động và bào nang của đơn bào được nhận thấy dễ dàng

– Trứng giun, sán và ấu trùng có thể khó nhận diện vì thuốc nhuộm đậm đặc

– Có thể nhận ra nấm men, sợi tơ nấm giả và các bạch cầu

– Không thấy được trùng bào tử như Cryptosporidium sp

2 NHUỘM HAEMATOXYLIN SẮT (SPENCER– MONROE METHOD)

– Khi dùng, pha loãng với cồn ethylic 70o cho tới khi có màu trà đậm.

– Giữ được khoảng 1 tới vài tuần hoặc tới khi nào thấy màu nhạt thì bỏ

d) Dung dịch Acid – cồn ethylic

– Thể hoạt động và bào nang của đơn bào được nhận thấy dễ dàng

– Trứng giun, sán và ấu trùng có thể khó được nhận diện vì thuốc nhuộm đậm đặc

– Có thể nhận ra nấm men, sợi tơ nấm giả và các bạch cầu

– Không thấy được trùng bào tử như Cryptosporidium sp

– Các trùng bào tử đường ruột (Cryptosporidium, Cyclospora…) khó được xác định bằng cách

soi phân trực tiếp Vì vậy, người ta dùng phương pháp nhuộm để tạo sự tương phản giữa màu của KST và nền cặn bã phân

– Kỹ thuật nhuộm Ziehl–Neelsen cải tiến được dùng dựa trên đặc điểm kháng acid của các KST này Nguyên tắc của kỹ thuật này là nhuộm tiêu bản phân bằng carbon fuschin, sau đó tẩy

màu và nhuộm nền tiêu bản bằng màu xanh Do có tính kháng acid nên các trùng bào tử giữ lại màu hồng của fuschin

– Kỹ thuật nhuộm Ziehl–Neelsen cải tiến có thể áp dụng cho phân tươi, hoặc phân được cố định trong formol, hoặc các loại bệnh phẩm khác như dịch hút tá tràng, mật, đàm (đờm)

– Xanh Malachit 1% hoặc Xanh Methylen 1%

a) Pha Carbon Fuchsin

– Dung dịch A:

– Dung dịch B:

– Trộn 10ml dung dịch A với 90ml B lại với nhau

– Bảo quản được 1 năm ở nhiệt độ phòng

b) Pha dung dịch xanh Malachit

Có thể thay xanh Malachit bằng xanh Methylen

Bảo quản được 1 năm ở nhiệt độ phòng

c) Pha dung dịch cồn – acid chlorhydric

3.4 Quy trình nhuộm

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Tại sao phải nhuộm phân?

2 Có mấy phương pháp nhuộm phân?

3 Mô tả phương pháp nhuộm Trichome

4 Nêu sự khác biệt giữa phương pháp nhuộm Trichome và Haematoxylin

Kỹ thuật nhuộm Ziehl–Neelsen cải tiến

1 Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để làm tiêu

bản phân.

Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để nhuộm phân.

2 Làm phết phân mỏng trên lam kính Phết phân mỏng, đều.

4 Cố định bằng methanol trong 5 phút Để

khô ngoài không khí. Đúng thời gian quy định.

5 Nhuộm với carbon–Fuchsin trong 5 phút. Phủ thuốc nhuộm phết phân, không

nghiêng đổ

6 Rửa lam kính với nước. Nhúng vào sâu vào chậu nước, tránh

cặn bám vào tiêu bản.

7 Tẩy màu bằng cồn–acid cho tới khi màu

không trôi ra nữa.

Nếu tẩy kỹ quá (thời gian tẩy kéo dài hoặc nồng độ acid đậm) sẽ làm cho KST không còn bắt màu sau khi nhuộm

8 Rửa dưới vòi nước chảy Dòng nước chảy vừa phải, không quá

mạnh