NGHIÊN cứu đột BIẾN GEN EGFR TRONG UNG THƢ PHỔI KHÔNG tế bào NHỎ

Với mong muốn tìm ra một phương pháp đơn giản, rẻ tiền, có thể áp dụng ở những nơi chưa có kỹ thuật giải trình tự gen, chúng tôi tiến hành phương pháp xét nghiệm hóa mô miễn dịch HMMD sử

 _

NGÔ THỊ TUYẾT HẠNH

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN EGFR

TRONG UNG THƢ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

TP HỒ CHÍ MINH – NĂM 2016

* * * * * * * * *

NGÔ THỊ TUYẾT HẠNH

NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN EGFR

TRONG UNG THƢ PHỔI KHÔNG TẾ BÀO NHỎ

Chuyên ngành: Giải phẫu bệnh và pháp y

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất cứ công trình nào khác

Nghiên cứu sinh

Ngô Thị Tuyết Hạnh

TRANG PHỤ BÌA

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT - ANH i

BẢNG DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ vii

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Dịch tễ học 4

1.2 Cơ chế bệnh sinh phân tử của ung thư phổi không tế bào nhỏ 6

1.3 Đặc điểm lâm sàng 26

1.4 Xếp hạng lâm sàng theo tnm 26

1.5 Đặc điểm giải phẫu bệnh 28

1.6 Điều trị 37

1.7 Tiên lượng 40

1.8 Tình hình nghiên cứu đột biến gen EGFR và nhuộm HMMD sử dụng kháng thể đặc hiệu trong UTPKTBN tại Việt Nam 40

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

2.1 Đối tượng nghiên cứu 42

2.2 Phương pháp nghiên cứu 42

3.1 Xác định tỷ lệ đột biến gen EGFR trong utpktbn bằng phương pháp

giải trình tự gen 58

3.2 Xác định tỷ lệ biểu hiện protein EGFR DelE746_A750 và L858R bằng phương pháp HMMD 73

3.3 Đối chiếu kết quả nhuộm HMMD protein EGFR DelE746_A750 và L858R với kết quả giải trình tự gen EGFR 80

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 85

4.1 Xác định tỷ lệ đột biến EGFR trong ung thư phổi không tế bào nhỏ 86 4.2 Biểu hiện của protein EGFR 103

4.3 Đối chiếu kết quả giữa đột biến gen EGFR với nhuộm HMMD sử dụng kháng thể đặc hiệu với đột biến E746_A750 và L858R 107

4.4 Hạn chế của đề tài 112

KẾT LUẬN 113

KIẾN NGHỊ 115 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ I TÀI LIỆU THAM KHẢO II PHỤ LỤC

- DANH SÁCH BỆNH NHÂN A

- PHIẾU THU THẬP SỐ LIỆU E

BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT - ANH

Chết theo chương trình Apoptosis

Cục Quản lý Thuốc và Thực phẩm

Điểm kiểm soát chu kỳ tế bào Cycle checkpoint

Giá trị hấp thu chuẩn Standardized Uptake Value

Giá trị tiên đoán âm tính Negative predictive value

Giá trị tiên đoán dương tính Positive predictive value

Thêm đoạn Duplication

Thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu

Thụ thế yếu tố hoại tử khối u Tumor necrosis factor receptor

BẢNG DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AJCC American Joint Committee on Cancer

ARMs Amplification Refactory Mutation System

ASO - PCR Allele Specific Oligonucleotide PCR

COSMIC Catalogue of Somatic Mutations in Cancer

EGFR - TKI Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase

Inhibitor EGFR Epidermal Grownth Factor Receptor

FISH Fluorescence In situ hybridisation

HDGC Hereditary diffuse gastric cancer

IARC International Agency for Research on Cancer

MSI Microsatellite instability

NPV Negative predictive value

PDGF Platelet derived growth factor

PDK1 Phosphoinositide - dependent kinase - 1

PET - CT Positron Emission Tomography - Computed

Tomography PPV Positive predictive value

SCCA Squamous Cell Carcinoma Antigen

TNFR Tumor necrosis factor receptor

TPS Tissue Polypeptide Specific Antigen

UPA Urokinase plasminogen activator

UTPKTBN Ung thƣ phổi không tế bào nhỏ

UTPTBN Ung thƣ phổi tế bào nhỏ

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Phân bố các trường hợp UTPKTBN theo tuổi 58

Bảng 3.2 Phân bố các trường hợp UTPKTBN theo giới 59

Bảng 3.3 Thói quen hút thuốc lá 60

Bảng 3.4 Các loại mô học trong UTPKTBN 61

Bảng 3.5 Tỷ lệ các trường hợp đột biến trên exon 18 - 21 của gen EGFR 64

Bảng 3.6 Tỷ lệ bệnh nhân theo số lượng đột biến trên bệnh nhân 65

Bảng 3.7 Mô tả phổ đột biến EGFR đã phát hiện trên 43 trường hợp 66

Bảng 3.8 Liên quan đột biến gen với giới tính 69

Bảng 3.9 Liên quan đột biến gen với tuổi 70

Bảng 3.10 Liên quan đột biến gen với tình trạng hút thuốc lá 70

Bảng 3.11 Liên quan đột biến gen với loại mô học 71

Bảng 3.12 Liên quan giữa các kiểu đột biến và loại mô học 72

Bảng 3.13 Tỷ lệ biểu hiện của protein EGFR 73

Bảng 3.14 Biểu hiện của protein EGFR theo từng loại đột biến 74

Bảng 3.15 Liên quan giữa nhuộm HMMD sử dụng kháng thể đặc hiệu với đột biến delE746_A750 và L858R với giới tính 76

Bảng 3.16 Liên quan giữa nhuộm HMMD sử dụng kháng thể đặc hiệu với đột biến E746_ A750 và L858R với độ tuổi 77

Bảng 3.17 Liên quan giữa nhuộm HMMD sử dụng kháng thể đặc hiệu với đột biến E746_A750 và L858R với thói quen hút thuốc lá 78

Bảng 3.18 Liên quan giữa nhuộm HMMD sử dụng kháng thể đặc hiệu với đột biến E746_A750 và L858R với loại mô học 79

Bảng 3.19 So sánh đột biến EGFR và HMMD sử dụng kháng thể đặc hiệu với đột biến delE746_A750 80

Bảng 3.20 So sánh đột biến EGFR và HMMD sử dụng kháng thể đặc hiệu với

đột biến L858R 81

Bảng 3.21 So sánh chung đột biến EGFR và HMMD 81

Bảng 3.22 So sánh đột biến EGFR và HMMD delE746_A750 82

Bảng 3.23 So sánh đột biến EGFR và HMMD L858R 83

Bảng 3.24 So sánh chung đột biến EGFR và HMMD 83

Bảng 4.1 So sánh tuổi trung bình của bệnh nhân trong nghiên cứu của chúng tôi với một số tác giả khác 86

Bảng 4.2 So sánh tỷ lệ hút thuốc lá với nghiên cứu khác 88

Bảng 4.3 So sánh tỷ lệ các loại mô học với nghiên cứu khác 89

Bảng 4.4 Tỷ lệ đột biến gen EGFR trên bệnh nhân UTPKTBN ở một số nghiên cứu 94

Bảng 4.5 Phân bố đột biến gen EGFR trên exon 18-21 theo một số nghiên cứu 95

Bảng 4.6 So sánh liên quan đột biến EGFR với tuổi và giới tính 100

Bảng 4.7 So sánh liên quan đột biến EGFR với thuốc lá 101

Bảng 4.8 Biểu hiện của EGFR trong nghiên cứu của Chi Hong K 105

Bảng 4.9 So sánh độ nhạy và độ đặc hiệu của HMMD sử dụng kháng thể đặc hiệu với một số nghiên cứu 108

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Quy trình giải trình tự chuỗi DNA 49

Sơ đồ 4.1 Các bước khi thực hiện HMMD sử dụng kháng thể đặc hiệu 111

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Trang Biểu đồ 3.1 Phân bố các trường hợp UTPKTBN theo giới tính và theo tuổi 59 Biểu đồ 3.2 Liên quan giữa tình trạng hút thuốc lá và giới tính 60

Biểu đồ 3.3 Liên quan giữa loại mô học và độ tuổi 61

Biểu đồ 3.4 Liên quan giữa các loại mô học và giới tính 62

Biểu đồ 3.5 Liên quan giữa loại mô học và thói quen hút thuốc lá 63

Biểu đồ 3.6 Phân bố đột biến theo exon trên gen EGFR theo tỷ lệ phần trăm 65

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô 8

Hình 1.2 (a) Cấu trúc thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGFR); (b) Sự hoạt hóa của EGFR 8

Hình 1.3 Đường truyền tín hiệu của EGFR 9

Hình 1.4 Đột biến gen EGFR trong ung thư phổi không tế bào nhỏ 11

Hình 1.5 Các dạng đột biến gen EGFR quyết định tính đáp ứng với EGFR TKIs 12

Hình 1.6 Carcinôm tuyến ở phổi 34

Hình 1.7 Carcinôm tế bào gai ở phổi 35

Hình 1.8 Carcinôm tế bào lớn ở phổi 36

Hình 1.9 Carcinôm gai - tuyến ở phổi 37

Hình 2.1 Cách đánh giá sự biểu hiện protein EGFR: 48

Hình 3.1 Phân bố vị trí các đột biến gen EGFR đã phát hiện 67

Hình 3.2 Đột biến mất đoạn trên exon 19 gen EGFR 69

Hình 3.3 Hóa mô miễn dịch sử dụng kháng thể đặc hiệu với đột biến E746_A750 75

Hình 3.4 Hóa mô miễn dịch sử dụng kháng thể đặc hiệu với đột biến L858R 76

Hình 4.1 Các bước khi thực hiện HMMD sử dụng kháng thể đặc hiệu 111

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư phổi (UTP) hiện nay đang là vấn đề đáng lo ngại trên toàn cầu với tỷ lệ UTP ngày càng tăng nhanh, tỷ lệ tử vong cao, độ tuổi mắc bệnh ngày càng giảm và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trong những loại ung thư trên thế giới [52] Theo báo cáo ung thư toàn cầu của Viện Nghiên Cứu Ung Thư Quốc Tế, cho biết năm 2012 trên thế giới UTP chiếm 1,8 triệu trường hợp (12,9%) với 1,59 triệu trường hợp tử vong (19,4%) [52], vượt lên ung thư gan đứng hàng thứ nhất Điều đáng chú ý là ngày nay phần lớn các trường hợp UTP được phát hiện tại các nước đang phát triển, với sự gia tăng từ 31% trong tổng số UTP được chẩn đoán trên thế giới vào năm 1980 lên 55% vào thời gian gần đây [40] Riêng tại khu vực Đông Nam Á, UTP chiếm hàng đầu của ung thư ở nam giới, với tỷ suất bệnh mới là 29,6/100.000 dân, xếp trên cả ung thư gan (21,4/100.000) và ung thư đại trực tràng (15,2/100.000) Ở khu vực này, UTP của nữ giới xếp hàng thứ tư (11,9/100.000 dân) sau ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư đại trực tràng UTP có tiên lượng rất xấu, là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu do ung thư ở cả hai giới ở Đông Nam Á (ở nam giới là 26,3/100.000 dân, ở nữ giới là 10,4/100.000) [40]

Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê năm 2013 của bệnh viện Ung Bướu Thành phố Hồ Chí Minh, hằng năm có khoảng 116.000 trường hợp mắc mới

và hơn 80.000 trường hợp tử vong [4] Khảo sát về xuất độ ung thư trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh trong 5 năm trở lại đây với 33.126 bệnh nhân ung thư, kết quả cho thấy trong 5 loại ung thư gặp nhiều nhất ở nữ, UTP đứng thứ

tư, còn ở nam giới UTP đứng hàng thứ nhất Qua khảo sát trên cũng cho thấy

ở cả nam và nữ khi bước qua tuổi 40 thì nguy cơ mắc các bệnh ung thư cao hơn [4]

Khoảng hơn 80% trường hợp UTP là dạng ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN) Những khối u loại này còn được phân chia thành các loại

mô bệnh học chính là carcinôm tuyến, carcinôm tế bào gai, carcinôm tế bào lớn và carcinôm gai - tuyến Đa số UTP được phát hiện ở giai đoạn muộn, mặc dù có nhiều tiến bộ trong điều trị nhưng tỷ lệ sống còn 5 năm chỉ khoảng

10 - 15% [40]

Gần đây các nghiên cứu cho thấy rằng đột biến gen EGFR có thể dẫn

đến tăng sinh bất thường và cũng như sự chuyển dạng tế bào, dẫn đến bệnh lý

ác tính Đột biến EGFR có tiên lượng xấu và khả năng đáp ứng tốt với thuốc

nhắm trúng đích phân tử ức chế miền tyrosine kinase và đã được báo cáo đầu tiên năm 2004 trên những bệnh nhân có đáp ứng với genfitinib [69], [78] Tuy

vậy, đột biến gen EGFR rất đa dạng và tỷ lệ bệnh nhân có mang đột biến khác

nhau giữa các chủng tộc Tỷ lệ này xấp xỉ 3% ở người Mỹ, nhưng lên đến 32% ở người Nhật [78], 36,4% ở Hàn Quốc [18], 55% ở Đài Loan [49], 57,4% ở Thái Lan [106], đột biến cũng thường tìm thấy nhiều hơn trên bệnh nhân nữ so với bệnh nhân nam, trên bệnh nhân không có tiền căn hút thuốc lá

so với người từng hút thuốc lá, đột biến hầu như chỉ gặp trên loại carcinôm tuyến, hiếm khi tìm thấy ở carcinôm gai - tuyến [70], [108] Tỷ lệ đột biến tìm thấy trên người châu Á rất cao, phù hợp với quan sát trong những thử nghiệm lâm sàng trước đây, trong đó bệnh nhân châu Á có đáp ứng tốt hơn hẳn với

thuốc điều trị đặc hiệu so với bệnh nhân Âu - Mỹ Đột biến gen EGFR thường

gặp nhất là đột biến mất đoạn xảy ra trên exon 19 chiếm khoảng 50% (thường xuyên nhất là mất đoạn E746_A750) và kế đến là đột biến điểm L858R tại exon 21 chiếm khoảng 35 - 45% (thay thế của leucine 858 bởi arginine) Các đột biến thêm đoạn trên exon 20 hay đột biến điểm trên exon 18 ít gặp hơn chiếm khoảng 5%, chính vì vậy việc xác định có hay không có đột biến gen

EGFR rất quan trọng cho việc lựa chọn điều trị nhắm trúng đích cho bệnh

nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN)

Hiện nay có nhiều loại phương pháp giúp xác định đột biến gen EGFR,

phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất là kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA, các kỹ thuật khác như phân tích đa hình chuỗi đơn dựa trên PCR, phân tích sản phẩm PCR dựa trên tính nóng chảy, ARMS - PCR và đây là tiêu

chuẩn vàng để xác định đột biến gen EGFR Tuy nhiên muốn giải trình tự gen

đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại và kỹ thuật viên phải có trình độ cao Với mong muốn tìm ra một phương pháp đơn giản, rẻ tiền, có thể áp dụng ở những nơi chưa có kỹ thuật giải trình tự gen, chúng tôi tiến hành phương pháp xét nghiệm hóa mô miễn dịch (HMMD) sử dụng kháng thể đặc hiệu delE746

- A750 và L858R nhằm đánh giá biểu hiện của protein EGFR giúp cho việc

phát hiện sớm đột biến EGFR nhằm giúp ích cho việc điều trị nhắm trúng

đích trên UTP ở Việt nam Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “nghiên cứu đột

biến gen EGFR trong UTPKTBN” với các mục tiêu sau:

1 Xác định tỷ lệ đột biến và các kiểu đột biến gen EGFR trong UTPKTBN

bằng phương pháp giải trình tự gen

2 Xác định tỷ lệ biểu hiện protein EGFR delE746_A750 tại exon 19 và L858R tại exon 21 bằng phương pháp HMMD

3 Đối chiếu kết quả kết quả nhuộm HMMD protein EGFR delE746_A750

và L858R với kết quả giải trình tự gen EGFR trong UTPKTBN

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 DỊCH TỄ HỌC

1.1.1 Xuất độ

Ung thư phổi chiếm tỷ lệ cao nhất và cũng là nguyên nhân tử vong hàng đầu trong tất cả các bệnh ung thư Về mặt chẩn đoán, UTP nguyên phát được chia thành nhóm UTPKTBN và ung thư phổi tế bào nhỏ (UTPTBN) Trên thế giới, trong số khoảng 12,7 triệu trường hợp ung thư mới được chẩn đoán hàng năm, ung thư phổi chiếm 1,61 triệu trường hợp (12,7%), với 1,38 triệu trường hợp tử vong Điều đáng chú ý là ngày nay phần lớn các trường hợp UTP được phát hiện tại các nước đang phát triển, với sự gia tăng từ 31% trong tổng số UTP được chẩn đoán trên thế giới vào năm 1980 lên 55% vào thời điểm gần đây [40] Riêng tại khu vực Đông Nam Á, trong 4 loại ung thư phổ biến nhất ở nam giới, UTP chiếm hàng đầu trên cả ung thư gan, ung thư đại trực tràng, ung thư dạ dày Ở khu vực này, UTP của nữ giới xếp hàng thứ

tư (11,9/100.000 dân) sau ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư đại trực tràng Tuy nhiên, UTP có tiên lượng rất xấu, là nguyên nhân tử vong hàng đầu

do ung thư ở cả hai giới

1.1.2 Các yếu tố nguy cơ

Khói thuốc lá, chứa hơn 60 loại chất sinh ung như nitrosamine và benzopyrene, được xác định là nguyên nhân trực tiếp và quan trọng nhất gây nên UTP Hút thuốc lá là nguyên nhân của 85% - 90% trong tổng số các trường hợp UTP trên toàn thế giới [14] Nguy cơ trọn đời bị UTP của người không hút thuốc lá được ước tính khoảng 1,3% - 1,4%; nguy cơ này sẽ gia tăng thành 17,2% ở người nam hút thuốc lá và 11,6% ở người nữ hút thuốc lá [115] Tiếp xúc lâu dài với nicotine gây nên sự ức chế hoạt động của đáp ứng miễn dịch chống lại sự tăng sinh ác tính trong các mô phổi Các chất sinh ung

có trong khói thuốc lá gây ra hàng chục ngàn kiểu đột biến trên DNA của tế bào, trong số đó có ít nhất 134 kiểu đột biến nằm trên các exon mã hóa protein [84]

Ngoài khói thuốc lá, tiếp xúc nghề nghiệp với các chất như asbestos, nickel, chromium và arsenic cũng làm tăng nguy cơ bị UTP Các nghiên cứu cho thấy tiếp xúc với khí radon trong không khí là nguyên nhân gây UTP quan trọng thứ hai sau khói thuốc lá [28] Khí radon không mùi vị, được tạo

ra từ sự phân rã phóng xạ radium vốn xuất phát từ uranium có trong lớp vỏ trái đất Các sản phẩm phân rã phóng xạ gây nên sự ion hóa các vật chất di truyền, từ đó xuất hiện các đột biến gen và ung thư

Gần đây có những bằng chứng gợi ý vai trò của virus trong việc gây ra UTP [44] Các virus như human papilloma virus, simian virus 40 hay cytomegalo virus hiện diện trong mô UTP, được cho là đã gây nên sự rối loạn chu kỳ tế bào và ức chế quá trình chết tế bào theo lập trình, mở đường cho hiện tượng UTP xuất hiện Chi tiết về các cơ chế phân tử mà virus khởi phát trong tế bào ký chủ để tạo nên các dạng ung thư, trong đó có UTP, là một lĩnh vực đang thu hút được rất nhiều nghiên cứu y sinh học trong thời gian qua Tỷ

lệ HPV dương tính trong mẫu UTP trung bình là 24,5%, dao động từ 15% ở Châu Âu và Bắc Mỹ cho đến 35,7% ở Châu Á [60] và các thường là nhiễm các type virus nguy cơ cao là 16, 18, 31 và 33

Nguyên nhân di truyền của UTP mới chỉ được chú ý nghiên cứu trong thời gian gần đây Ở cả người hút thuốc và không hút thuốc lá, tính đa hình thái của các gen có vai trò điều hòa chuyển hóa các chất sinh ung, kiểm soát quá trình sửa chữa DNA và chu kỳ tế bào có thể có ảnh hưởng quan trọng vào tính mẫn cảm với UTP Ví dụ, các nghiên cứu đã tìm ra ít nhất 3 gen trên nhánh dài của nhiễm sắc thể 15 có liên quan với nguy cơ mắc UTP, đó là các

gen CHRNA3, CHRNA5 và CHRNB4, mã hóa cho các tiểu đơn vị cấu trúc của

thụ thể nicotinic acetylcholine [16], [111] Một phân tích gộp của 23 nghiên

cứu bao gồm 15.857 đối tượng cho thấy alen Proline tại codon 72 của p53 là

một yếu tố nguy cơ UTP, đặc biệt trên người Châu Á, người da trắng và người hút thuốc lá [63]

Chế độ ăn uống có thể cũng ảnh hưởng tới UTP Ở chuột, thức ăn có nhiều gốc phosphate có thể hoạt hóa đường truyền tín hiệu AKT trong tế bào gây nên kích thích quá mức sự tăng sinh tế bào, thúc đẩy tiến triển của UTP [53], trái lại, một phân tích gộp của 22 nghiên cứu cho thấy uống trà xanh giúp giảm nguy cơ UTP [110]

1.2 CƠ CHẾ BỆNH SINH PHÂN TỬ CỦA UNG THƯ PHỔI

KHÔNG TẾ BÀO NHỎ

Ngày nay cơ chế sinh ung thư trong đó có UTP ngày càng được hiểu rõ hơn Kết quả giải trình tự hệ gen của UTPKTBN đã cho thấy cơ chế sinh ung thư trong UTPKTBN chủ yếu dựa vào nguồn tín hiệu sinh trưởng của một hoặc một nhóm gen sinh ung nhất định, những gen sinh ung này mã hóa các protein đóng vai trò then chốt trong các con đường tín hiệu nội bào Những đột biến này làm cho các tế bào liên tục tăng sinh, liên tục phân chia, tế bào không chết theo chương trình, xâm lấn và di căn [45], [46] Ngay ở mức độ tế bào, sự phát triển của u, sự tăng trưởng và sự tiến triển được xác định bởi một phức hợp tác động qua lại của các yếu tố bao gồm sự hoạt động và sự kích thích của các thụ thể bề mặt tế bào u bởi các yếu tố tự tiết được phóng thích từ

tế bào u, nhằm đáp ứng với các yếu tố cận tiết theo dòng tuần hoàn được phóng thích từ tế bào mô đệm của cơ thể (được gọi là vòng phản hồi tự tiết) Như vậy, tế bào u rơi vào tình trạng tăng trưởng đến nỗi không kiểm soát được chính mình, cả hai cơ chế trực tiếp và gián tiếp, qua đường dẫn truyền hóa học để khởi phát cho quá trình dẫn truyền tín hiệu tế bào ở thụ thể đầu tiên Những yếu tố tăng trưởng gắn kết với các thụ thể bề mặt tế bào là sự

điều hòa quan trọng của sự tăng trưởng và phân chia tế bào Mất điều hòa các yếu tố tăng trưởng và/hoặc những thụ thể của chúng cung cấp những tác nhân kích thích cho sự tăng trưởng tế bào không kiểm soát và đó là những đặc trưng đầu tiên của ung thư Thí dụ những yếu tố tăng trưởng quan trọng như: yếu tố tăng trưởng biểu bì; yếu tố tăng trưởng chuyển dạng alpha; heregulin; yếu tố tăng trưởng dạng insulin

1.2.1 Bất thường của yếu tố tăng trưởng biểu bì trong UTP

1.2.1.1 Đột biến gen EGFR

EGFR là một nhóm protein có chức năng thụ thể màng tế bào ở các tế bào có nguồn gốc biểu mô, trung mô và thần kinh, được phát hiện lần đầu tiên bởi Carpenter và cộng sự năm 1978, bao gồm 4 thành viên: EGFR (HER1/ErbB1), HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3) và HER4 (ErbB4) [27]

Protein EGFR mang hoạt tính tyrosine kinase, là khởi nguồn của con đường tín hiệu tyrosine kinase trong tế bào Phân tử EGFR gồm một vùng gắn kết các phối tử nằm ngoài màng tế bào, một vùng xuyên màng đặc hiệu và một vùng nội bào Phần ngoài màng của EGFR có trọng lượng khoảng 100 kDa có hai vùng giàu cystein là nơi để gắn kết các phối tử của EGFR Vùng xuyên màng trọng lượng nhỏ 3 kDa, tập trung tại vùng phân cực phospholipid màng Phần trong tế bào trọng lượng khoảng 60 kDa là protein kinase với đuôi tận cùng carboxyl là nơi xảy ra phản ứng tự phosphoryl hóa của EGFR (Hình 1.1 và Hình 1.2) [62]

Hình 1.1 Cấu trúc thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô

“Nguồn: Burgess AW, 2003” [24]

Hình 1.2 (a) Cấu trúc thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGFR);

tế bào gây kích hoạt: con đường PI3K/Akt, sự tăng sinh mạch máu, di căn và

ức chế quá trình chết theo chương trình, tín hiệu Ras/mitogenactivated protein kinase và các con đường dẫn truyền tín hiệu phiên mã [29], [72], [121] Trong các tế bào khỏe mạnh, con đường tín hiệu nội bào trên được kiểm soát một cách nhịp nhàng và chặt chẽ, đảm bảo sự phát triển bình thường của tế bào (Hình 1.3)

Hình 1.3 Đường truyền tín hiệu của EGFR

“Nguồn: Wislez M, 2012” [118]

Gen EGFR nằm trên nhiễm sắc thể số 7, tại locus 7p12 với chiều dài

gần 200 kb, chứa 28 exon, mã hóa cho protein có 1210 amino acid, được xếp vào nhóm gen tiền sinh ung

Trong các tế bào ung thư, hoạt tính tyrosine kinase của EGFR bị rối loạn bởi các cơ chế phát sinh ung thư bao gồm đột biến gen EGFR, tăng số lượng bản sao gen EGFR hoặc biểu hiện quá mức protein EGFR. Việc hoạt

hóa sai chức năng tyrosine kinase của EGFR làm tăng tỷ lệ phát sinh, tốc độ

phát triển, khả năng xâm lấn và di căn của các tế bào ung thư ác tính Sự biểu

hiện quá mức EGFR được quan sát thấy ở những khối u của hơn 60% các

bệnh nhân mắc UTPKTBN đã di căn, những trường hợp này thường có tiên

lượng bệnh xấu [67] Chính vì vậy, EGFR được coi như một đích lâm sàng

trong việc phát triển các liệu pháp chống ung thư thế hệ mới

Đột biến gen EGFR, vốn có liên quan tới đáp ứng với thuốc ức chế đặc

hiệu protein EGFR trong carcinôm tuyến của phổi, xảy ra với các tần suất rất khác nhau tùy theo chủng tộc, giới tính, tình trạng hút thuốc lá và loại mô bệnh học Đột biến hầu như chỉ gặp trên loại carcinôm tuyến, rất hiếm khi tìm thấy ở carcinôm gai - tuyến Hơn nữa, tỷ lệ bệnh nhân có mang đột biến

EGFR rất khác nhau giữa các chủng tộc: tỷ lệ này chỉ xấp xỉ 3% ở người Mỹ,

nhưng lên đến khoảng 32% ở người Nhật [78], 36% ở Hàn Quốc [18], 55% ở Đài Loan [49] và 57% ở Thái Lan [106] Đột biến cũng thường tìm thấy hơn trên bệnh nhân nữ so với bệnh nhân nam, trên bệnh nhân không có tiền căn hút thuốc lá so với người từng hút thuốc lá Tỷ lệ tìm thấy trên người Châu Á

có đáp ứng cao hơn hẳn với điều trị đặc hiệu so với bệnh nhân Âu - Mỹ [70], [108]

Hình 1.4 Đột biến gen EGFR trong ung thư phổi không tế bào nhỏ

“Nguồn: Marmor M D, 2004” [72]

Tất cả các đột biến gây hoạt hóa EGFR đều thuộc vùng bám adenosine

triphosphate (ATP) của thụ thể tyrosine kinase, cũng đồng thời là vị trí tương

tác của các loại thuốc ức chế hoạt tính tyrosine kinase của EGFR (EGFR TKIs) [72], [90] Đột biến gen EGFR thuộc bốn exon mã hóa vùng tyrosine

kinase (exon 18 - exon 21) mã hóa vùng tyrosine kinase, khiến cho protein EGFR luôn trong trạng thái hoạt hóa không phụ thuộc vào phối tử, có tác dụng tăng sự nhạy cảm của khối u hoặc giúp kháng lại các EGFR TKIs (Hình 1.4) Những đột biến này được chia làm ba nhóm, trong đó các đột biến quyết định tính nhạy cảm của khối u với thuốc ức chế tyrosine kinase chủ yếu thuộc hai nhóm I và II (Hình 1.5)

Nhóm I gồm các đột biến xóa đoạn ở exon 19, phổ biến nhất (khoảng 44%) là kiểu đột biến xóa từ vị trí acid amin vị trí 746 - glutamate tới acid amin vị trí 750 - alanine (đột biến LREA)

Hình 1.5 Các dạng đột biến gen EGFR quyết định tính đáp ứng với EGFR

TKIs

“Nguồn: Yasuda H, 2013” [122]

Nhóm II gồm các đột biến thay thế một nucleotid làm thay đổi acid amin ở exon 18 và 21 Đột biến điểm thường gặp nhất (khoảng 41%) là đột biến ở exon 21 thay arginine bằng leucine tại codon 858 (đột biến L858R) Một số đột biến khác như đột biến thay thế glycine ở codon 719 thành serine (G719S), thành alanine (G719A) hoặc thành cysteine (G719C) chiếm 4%; một số đột biến nhầm nghĩa khác chiếm 6%

Nhóm III (5%) gồm các đột biến lặp đoạn, thêm đoạn và đột biến điểm

tại exon 20 gen EGFR Exon 20 chứa hầu hết là các đột biến làm cho tế bào

UTP kháng lại với thuốc điều trị đích như đột biến điểm T790M, V769L, S768I và các đột biến thêm đoạn Tuy nhiên, gần đây các nhà khoa học đã phát hiện ra một ngoại lệ, một đột biến thêm 4 acid amin tại exon 20, đột biến

Đột biến liên quan đến

A763 - Y764insFQEA, lại làm tăng tính nhạy cảm của tế bào UTP với thuốc điều trị đích [122] (Hình 1.5)

Cho đến nay, đã có nhiều bằng chứng cho thấy trạng thái cân bằng “tắt

- mở” của hoạt tính tyrosine kinase - EGFR bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi đột biến gen Những phân tích động học đã chứng minh đột biến thuộc hai nhóm I

và II làm tăng hệ số phân li Km của ATP với EGFR và giảm hệ số phân li Km của EGFR TKIs so với khi thụ thể ở trạng thái bình thường Những đột biến này khiến EGFR giảm mạnh ái lực với ATP, giúp EGFR TKIs không phải cạnh tranh tại vị trí tương tác với thụ thể, thụ thể trở nên nhạy cảm một cách đặc biệt với các thuốc này [26], [87] (Hình 1.4)

Tóm lại, đột biến EGFR gây nên tình trạng hoạt hóa liên tục của thụ thể

tyrosine kinase Các đột biến này cũng thường liên quan đến tính nhạy cảm

hoặc đề kháng với thuốc ức chế EGFR Tình trạng đột biến của gen EGFR có

ý nghĩa hơn các đặc điểm lâm sàng trong việc chọn lựa bệnh nhân phù hợp với điều trị ưu tiên bước 1 bằng thuốc ức chế EGFR [51] Các nghiên cứu hồi cứu cũng như tiền cứu đều cho kết quả là những bệnh nhân UTP có mang đột biến EGFR nếu được điều trị bằng thuốc ức chế EGFR có tỷ lệ đáp ứng cao hơn và thời gian sống không tiến triển bệnh kéo dài hơn so với nhóm bệnh nhân không mang đột biến [43], [51]

Các kỹ thuật phát hiện các đột biến: Thường được sử dụng nhất để

phát hiện đột biến gen EGFR là giải trình tự chuỗi DNA [101] Các kỹ thuật

khác bao gồm phân tích tính đa hình chuỗi đơn dựa trên PCR, phân tích sản phẩm PCR dựa trên tính nóng chảy, ARMS - PCR, có lợi điểm nhanh hơn và đảm bảo độ nhạy cũng như độ đặc hiệu cao Tuy nhiên, các kỹ thuật này vẫn cần đến giải trình tự chuỗi DNA để khẳng định lại các đột biến [42] Mô cố định trong formalin và được vùi nến thường được chọn cho khảo sát đột biến, nhưng cần lưu ý bảo quản bệnh phẩm đúng quy cách để có kết quả chính xác

Các bệnh phẩm cố định trong ethanol hoặc khử canxi, cũng như những bệnh phẩm có chứa quá nhiều mô hoại tử thì không nên chọn để phân tích đột biến gen

Kỹ thuật PCR-RFLP: Kỹ thuật PCR-RFLP dựa trên cơ sở kỹ thuật PCR cổ điển Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa vào hoạt tính của các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn loại nucleotid Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng để làm các phân tử DNA nền để tổng hợp các DNA mới trong chu

kỳ tiếp theo Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài là khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm được xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi

Sau khi kết thúc phản ứng, sản phẩm PCR đặc hiệu sẽ được tinh sạch

và xử lý với enzym cắt giới hạn đã được lựa chọn nhằm tạo ra những phân đoạn DNA nhỏ hơn Sau khi được điện di trên gel agarose, số lượng và chiều dài các đoạn DNA này sẽ giúp phát hiện các trường hợp đột biến Phương

pháp phát hiện đột biến gen EGFR bằng kỹ thuật PCR-RFLP dựa trên nguyên lý: exon 21 của gen EGFR kiểu dại có vùng trình tự đặc hiệu cho enzym MscI, đột biến tại exon 21 gen EGFR làm mất vị trí cắt của enzym do đó sản

phẩm PCR không bị cắt bởi enzym MscI [17] Với thiết kế kỹ thuật tương tự

như khi tìm đột biến gen EGFR, sản phẩm khuếch đại codon 12 gen KRAS sẽ được xử lý với enzym NlaI và codon 13 với HaeIII [33] Sau khi phân cắt, các

sản phẩm sẽ được phân tích kết quả trên thạch agarose Đây là phương pháp truyền thống, kinh tế nhưng rất hiệu quả và cho độ tin cậy cao

Kỹ thuật giải trình tự gen: Đoạn DNA cần được giải trình tự được sử

dụng như trình tự mẫu cho phản ứng giải trình tự bắt đầu từ vị trí gắn mồi

Hỗn hợp của deoxy- và dideoxynucleotid được sử dụng trong phản ứng với nồng độ sao cho các dideoxynucleotid sẽ gắn vào mỗi vị trí mà các deoxynucleotid thường gắn trên đoạn DNA đang được tổng hợp Sự gắn của các dideoxynucleotid sẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các đoạn DNA được tổng hợp, kết quả sẽ tạo ra hỗn hợp các sợi DNA có kích thước khác nhau Nucleotid tận cùng trên mỗi sợi DNA được xác định bằng cách chạy một phản ứng hỗn hợp nhưng từng loại dideoxynucleotid được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang đặc hiệu khác nhau

Sản phẩm sau phản ứng giải trình tự sẽ được đọc trình tự bằng máy giải trình tự tự động sử dụng bảng gel polyacrylamide Máy gồm 2 phần: phần dùng điện di gel, phần phát hiện các vạch điện di Các vạch điện di được các con mắt cảm quang phát hiện khi đi qua chùm tia laser và phát sáng lên Tín hiệu được mắt cảm quang truyền về máy tính để hiển thị thành các đỉnh cường độ sáng Sau đó, trình tự gen của mẫu nghiên cứu sẽ được đối chiếu với trình tự gen tham chiếu trên ngân hàng gen thế giới và được phân tích để xác định vùng hoặc điểm đột biến

Do các đột biến gen EGFR trên exon 18 - 21 rất đa dạng, kỹ thuật giải

trình tự gen được xem là tốt nhất để khảo sát các đột biến này

Kỹ thuật Scorpion ARMS: Kỹ thuật Scorpion ARMS là một trong số

ít những kỹ thuật được các cơ quan quản lý Y Dược của Châu Âu và Hoa Kỳ cấp giấy phép công nhận đạt tiêu chuẩn ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng

(European Union in vitro Diagnostic Medical Device Directive 98/79/EC)

Scorpion ARMS là sự kết hợp của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến (ARMS) và công nghệ Scorpion trong phản ứng real-time PCR để phát hiện các đột biến Trong đó, nguyên lý của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến là dựa vào đặc tính của Taq DNA polymerase chỉ khếch đại hoàn chỉnh một phân tử DNA một khi đầu 3’ của mồi và sợi khuôn bổ sung

hoàn toàn với nhau Khi đầu 3’ của mồi không bổ sung với sợi khuôn phản ứng PCR bị ức chế hoàn toàn Dựa trên nguyên lý này, kỹ thuật cho phép khuếch đại đặc hiệu một trình tự đột biến ngay cả trong trường hợp alen đột biến đó chiếm một tỷ lệ rất nhỏ (1%) trong tổng số sợi khuôn DNA

Scorpion là phân tử có cấu tạo một đầu mang trình tự của đoạn mồi đặc hiệu với alen đột biến cần khuếch đại, đầu trình tự này được nối với một đầu

dò Phần kích thích phát tín hiệu huỳnh quang (fluorophore) của đầu dò được gắn với phần ức chế (quencher) có nhiệm vụ dập tắt tín hiệu huỳnh quang của phần kích thích Trong phản ứng PCR khi đầu dò bám với đoạn trình tự khuếch đại, phần kích thích phát tín hiệu huỳnh quang được giải phóng khỏi phần ức chế, phát tín hiệu đến bộ phận cảm biến của máy real-time PCR

Kỹ thuật Scorpion ARMS cho phép phát hiện được gần như toàn bộ các

đột biến có liên quan đến mức độ đáp ứng thuốc của gen EGFR: G719A,

G719C và G719S (Exon 18); 19 dạng đột biến xóa đoạn thường gặp ở exon 19; T790M và S768I (Exon 20), 3 dạng đột biến thêm đoạn thường gặp ở exon 20; L858R và L861Q (Exon 21) [20]

Kỹ thuật Smart Amplification Process (SMAP): Kỹ thuật SMAP là

một công nghệ mới nhất được phát triển bởi các nhà khoa học tại viện công

nghệ Riken - Nhật Bản nhằm phát hiện các đột biến trên gen EGFR và KRAS

Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật SMAP là: Khuếch đại DNA = Phát hiện đột biến Để thực hiện được nguyên lý này kỹ thuật SMAP sử dụng (I) các cặp mồi phát hiện đột biến được thiết kế bất đối xứng nhằm giảm thiểu các khả năng mồi ghép cặp sai với sợi khuôn (II) một loại protein mới với khả năng nhận biết và bám đặc hiệu tại vị trí có sự ghép cặp không tương đồng giữa mồi và khuôn (Taq MutS) ngăn không cho phức hợp mồi - khuôn được khuếch đại trong phản ứng kéo dài chuỗi Chỉ những phức hợp mồi - khuôn DNA ghép cặp hoàn mới được khếch đại nhờ DNA polymerase, tín hiệu của

sản phẩm khuếch đại đặc hiệu đột biến được phát hiện trong hệ thống máy real - time PCR [48]

Thực tế cho thấy một trong những khó khăn của việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như giải trình tự gen, Scorpion ARMS trong thực tế lâm sàng thường đòi hỏi qua nhiều bước, đội ngũ kỹ thuật viên có kiến thức chuyên sâu về sinh học phân tử, giá thành cao, thời gian phân tích kết quả lâu Các công trình nghiên cứu áp dụng kỹ thuật SMAP cho thấy kỹ thuật vận hành qua một bước duy nhất “Khuếch đại DNA = Phát hiện đột biến”, có độ chính xác cao, thời gian từ khâu tách mẫu đến cho kết quả phân tích đột biến gen rất ngắn: khoảng 30 phút Đây là một ưu thế nổi bật của kỹ thuật SMAP

so với các kỹ thuật khác như giải trình tự gen (1 - 2 ngày), PCR - RFLP (1 - 2 ngày), Scorpion ARMS (3 - 4 giờ) Một khi kỹ thuật SMAP được áp dụng thành công, kỹ thuật mới này sẽ là một công cụ đắc lực giúp các nhà nghiên cứu và lâm sàng Việt Nam hiện thực hóa mục tiêu y học cá thể - khám

và chữa bệnh dựa trên tình trạng gen của bệnh nhân

1.2.1.2 Tính đặc hiệu của đột biến gen EGFR trong ung thư phổi

Đột biến gen EGFR thường gặp trong carcinôm tuyến của phổi chứ

không hoàn toàn đặc hiệu cho loại ung thư này Trong lâm sàng, phần lớn đột

biến gen EGFR được phát hiện trên bệnh nhân carcinôm tuyến, với tỷ lệ rất

nhỏ gặp trong các dạng ung thư khác của phổi: 5% trên carcinôm tế bào gai

và hầu như ít gặp trong carcinôm tế bào lớn [76] Mặc dù đột biến gen EGFR

hiếm gặp trong các dạng UTP khác ngoài carcinôm tuyến, một số trường hợp báo cáo bệnh nhân có mang đột biến đã cho thấy điều trị bằng thuốc ức chế EGFR vẫn là một cách tiếp cận điều trị hiệu quả De Pas và cộng sự báo cáo một trường hợp bệnh nhân nữ với ung thư phổi tế bào lớn đã di căn có đột

biến gen EGFR Hình ảnh PET scan sau 2 tháng điều trị bằng gefitinib cho

thấy đáp ứng ngoạn mục với điều trị cả ở khối u nguyên phát lẫn vị trí di căn [32]

Thành công trong điều trị nhắm trúng đích phân tử dựa trên các đột biến gây ung thư trong carcinôm tuyến của phổi đã đặt lại vấn đề liệu chẩn đoán UTPKTBN như một thực thể lâm sàng đồng nhất đã thỏa đáng hay chưa Các bằng chứng hiện có cho thấy rằng nếu chỉ chẩn đoán một khối u là UTPKTBN thì chưa đủ ý nghĩa cho việc điều trị bệnh nhân, và thuật ngữ UTPKTBN nên được loại bỏ Gần đây, các chuyên gia thuộc Hội Nghiên Cứu Ung thư phổi Quốc tế đã đề nghị một hệ thống phân loại UTP mới, trong đó

sử dụng phối hợp các yếu tố lâm sàng, phân tử và giải phẫu bệnh để phân biệt

rõ hơn các thể UTP [114] Khả năng ứng dụng các liệu pháp dựa trên các đột biến đặc hiệu đã thay đổi sâu sắc nền tảng điều trị cho bệnh nhân UTP Bệnh

nhân không có đột biến gen EGFR hiếm khi có đáp ứng với điều trị nhắm

trúng đích EGFR Chi phí cho điều trị bằng các thuốc nhắm trúng đích phân

tử rất tốn kém bởi vì chúng được nghiên cứu công phu, có bản quyền sản xuất

và chỉ thích hợp cho một nhóm nhỏ bệnh nhân Việc chỉ định không phù hợp các thuốc này gây ra các nguy cơ thất bại lâm sàng, tốn kém chi phí điều trị không cần thiết và thậm chí là các độc tính nguy hiểm tính mạng

1.2.1.3 Đề kháng nguyên phát với điều trị nhắm trúng đích EGFR

EGFR thể tự nhiên (wild - type)

EGFR thể tự nhiên là một dấu ấn quan trọng để dự đoán tình trạng không đáp ứng với thuốc ức chế EGFR Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng IPAS (Iressa Pan - Asia Study) cho thấy hầu hết các trường hợp không có đột

biến của gen EGFR thì không đáp ứng với gefitinib [77] Những khối u không

có đột biến gen EGFR thì thường có đột biến các gen khác ảnh hưởng trên các

con đường tín hiệu thiết yếu trong carcinôm tuyến Tình trạng đề kháng thuốc

nguyên phát không phải chỉ do thiếu đột biến của gen EGFR mà chính yếu là

do có các đột biến gen khác trong tế bào ung thư gây nên

Đột biến KRAS

KRAS là một thành viên của gia đình gen RAS, mã hóa cho một

guanosine triphosphate GTPase vốn có hai trạng thái: trạng thái bất hoạt có gắn GDP và trạng thái hoạt động có gắn với GTP Là một chất truyền tin hạ nguồn của EGFR, KRAS có vai trò quan trọng trong việc khởi phát và tiến triển của một số ung thư như carcinôm tuyến của đại tràng, phổi và tụy Khi đột biến xảy ra sẽ làm mất hoạt tính ATPase và giữ phân tử protein KRAS ở trạng thái gắn ATP liên tục, dẫn đến hậu quả là các phân tử truyền tin hạ nguồn luôn hoạt động để duy trì tín hiệu tăng sinh tế bào Trong UTP, đột

biến gen KRAS chủ yếu xảy ra ở codon 12 và 13 Đột biến thường gặp nhất của gen KRAS trên bệnh nhân UTPKTBN có hút thuốc lá là sự thay thế G

thành T (84%) để biến glycin thành cystein, valine, aspartate hoặc alanine

[50] Đột biến gen KRAS gặp trong 15% - 30% bệnh nhân UTPKTBN và

được coi là một trong những đột biến gen thường gặp nhất của bệnh này

Cũng giống như đột biến gen EGFR, đột biến gen KRAS thường gặp trong

carcinôm tuyến nhưng ít gặp trong carcinôm tế bào gai của phổi Đột biến gen

KRAS thường gặp trên người hút thuốc lá so với người không hút, nhưng tiền

căn không hút thuốc lá không phải là yếu tố giúp loại trừ hoàn toàn sự xuất hiện của đột biến này

KRAS đột biến đóng vai trò quan trọng cả trong hình thành ung thư

cũng như sự đề kháng với điều trị Trong ung thư đại trực tràng, sự hiện diện

của đột biến gen KRAS là một yếu tố tiên lượng xấu độc lập và tiên đoán kháng với điều trị chống EGFR [54] Bệnh nhân UTPKTBN mang đột biến codon 12 của gen KRAS có tiên lượng xấu hơn, với thời gian sống toàn bộ và

thời gian sống không bệnh ngắn hơn [104] Một phân tích gộp của 53 nghiên

cứu trên bệnh nhân UTPKTBN cũng cho thấy đột biến gen KRAS liên quan với thời gian sống toàn bộ ngắn hơn [73] Đột biến gen KRAS là một yếu tố

tiên đoán không đáp ứng với điều trị bằng kháng thể đơn dòng chống EGFR cũng như với thuốc ức chế hoạt tính kinase của EGFR trong carcinôm tuyến của phổi [64]

Đột biến BRAF

BRAF mã hóa cho serine/threonine kinase không phải thụ thể, là một

thành tố trong đường tín hiệu RAS/MAPk hạ nguồn của RAS Một khi đã được hoạt hóa thì BRAF trực tiếp phosphoryl hóa MEK, rồi MEK sẽ hoạt hóa ERK để điều hòa đáp ứng tế bào với các tín hiệu tăng trưởng Davies và cộng

sự là những người lần đầu tiên mô tả đột biến gen BRAF qua nghiên cứu 923

bệnh phẩm ung thư [31] Đột biến sai nghĩa được tìm thấy trong 60%

mêlanôm và 15% ung thư đại trực tràng Ngoài ra, đột biến gen BRAF cũng

được phát hiện trong nhiều loại ung thư khác với tỷ lệ thấp hơn, trong đó có 3% bệnh nhân UTPKTBN Trong ung thư nói chung, phần lớn đột biến gen

BRAF là do thay thế valine bằng glutamate tại codon 600 (V600E)

Gần đây, những bệnh nhân UTPKTBN da trắng đã được khảo sát để

xác định tỷ lệ, sự phân bố và ý nghĩa tiên lượng của đột biến gen BRAF Đột

biến gen chủ yếu xảy ra ở carcinôm tuyến (97,3%), trong đó có 57% là đột biến V600E và 43% là đột biến khác V600E [71] Đột biến V600E thường gặp ở bệnh nhân nữ hơn bệnh nhân nam, bệnh nhân không hút thuốc lá hơn bệnh nhân có hút thuốc lá Trái lại, đột biến không phải V600E chỉ gặp trên bệnh nhân hút thuốc lá Hơn nữa, bệnh nhân UTPKTBN mang đột biến V600E có kiểu mô bệnh học ác tính hơn với các đặc điểm vi xâm nhập mạch

và liên quan với tiên lượng xấu hơn Tương tự, Paik và cộng sự cũng nhận thấy tỷ lệ đột biến không phải V600E cao hơn ở bệnh nhân UTPKTBN so với

mêlanôm, có thể phản ảnh tác động sinh ung thư gây ra do khói thuốc lá ở bệnh nhân UTP [79]

Khuếch đại gen MET

Gen MET cũng góp phần vào cả sự kháng nguyên phát và mắc phải với

thuốc ức chế EGFR Gen này nằm trên nhiễm sắc thể số 7, mã hóa cho thụ thể yếu tố tăng trưởng tế bào gan là một tyrosine kinase Sự kháng thuốc ức chế

EGFR do khuếch đại gen MET qua cơ chế chuyển đổi kinase (kinase switch)

Nhìn chung, có khoảng 20% khối u từ những bệnh nhân đề kháng mắc phải

với thuốc ức chế EGFR biểu hiện sự khuếch đại gen MET [25], [82] Sự khuếch đại gen MET xảy ra trong cả carcinôm tuyến và carcinôm tế bào gai Nhiều nghiên cứu in vitro cho thấy rằng sự khuếch đại gen MET liên quan đến

sự gia tăng nồng độ của thụ thể yếu tố tăng trưởng tế bào gan đã được phosphoryl hóa Những hiểu biết này đã thúc đẩy sự phát triển các thuốc ức chế tyrosine kinase nhắm vào thụ thể yếu tố tăng trưởng tế bào gan Những thử nghiệm lâm sàng đang được thực hiện với hy vọng mang lại một loại thuốc nhắm trúng đích khác cho những bệnh nhân không đáp ứng với thuốc

ức chế EGFR

Đề kháng mắc phải với điều trị nhắm trúng đích EGFR

Có hai cơ chế kháng thuốc mắc phải đã được tìm hiểu kĩ: sự phát sinh

thêm các đột biến mới làm thay đổi các bộ ba mã hóa trên gen EGFR trong

quá trình điều trị, và khuếch đại các gen trong con đường tín hiệu sinh ung

thư như RAS và MET

Kobayashi và cộng sự đã báo cáo trường hợp 1 bệnh nhân carcinôm tuyến giai đoạn tiến triển bị tái phát sau 2 năm có đáp ứng hoàn toàn với gefitinib Ở bệnh nhân này, trong mẫu bệnh phẩm của lần tái phát xuất hiện đột biến thứ phát làm thay đổi amino acid ở vị trí 790 từ threonine thành

methionine (T790M) [61] Đột biến này cũng được xác nhận lại bởi Pao và cộng sự trên những bệnh nhân biểu hiện sự đề kháng mắc phải với gefitinib hay với erlotinib [81] Codon 790 của protein EGFR được xem như là “người gác cổng”, ảnh hưởng quyết định đến ái lực của các phân tử ức chế với vùng gắn ATP của phân tử EGFR Sự thay thế amino acid threonine ở vị trí này bởi một phân tử lớn hơn là methionine có thể gây ra sự kháng thuốc do tương tác không gian ở vùng gắn với chất ức chế men tyrosine kinase, bao gồm cả gefitinib và erlotinib Đây là đột biến tạo ra ưu thế sinh tồn cho khối u và được chọn lọc trong quá trình bệnh nhân được điều trị bằng thuốc ức chế tyrosine kinase Đột biến thứ phát này khá phổ biến, được tìm thấy trong

khoảng 50% bệnh nhân có đột biến gen EGFR được điều trị với thuốc ức chế

EGFR thế hệ thứ nhất

Các thuốc ức chế EGFR thế hệ mới đang được phát triển nhằm gắn một cách ổn định vào vùng gắn ATP khi có sự hiện diện của đột biến T790M Một loại thuốc này, mang tên WZ4002, có ái lực chọn lọc với các tế bào có đột biến thứ phát và do đó có thể là một liệu pháp điều trị ưu tiên bước hai cho những bệnh nhân có sự đề kháng mắc phải do đột biến T790M gây ra [81] Những thử nghiệm lâm sàng là cần thiết trong thời gian tới để đánh giá hiệu quả của những liệu pháp này trước khi áp dụng vào lâm sàng Do những đột biến thứ phát khác trong vùng quy định hoạt tính tyrosine kinase là hiếm gặp hơn nên xét nghiệm thường quy để phát hiện các đột biến này không được khuyến cáo

1.2.1.4 Gen tổ hợp EML4 - ALK

Gen ALK mã hóa cho một thụ thể tyrosine kinase được tìm thấy trong

nhiều protein tổ hợp chứa vùng nội bào có hoạt tính men kinase của ALK và

đầu tận cùng amin của nhiều protein khác Gen tổ hợp EML4 - ALK là kết quả

của sự đảo đoạn trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 2 [105] Gen tổ hợp này đã

được chứng minh là một gen ung thư, mã hóa một protein tyrosine kinase luôn ở trạng thái tự hoạt hóa

Gen tổ hợp EML4 - ALK là một bất thường hiếm gặp, được tìm thấy

trong khoảng 3 - 13% bệnh nhân carcinôm tuyến [105] Trong protein tổ hợp, phần ALK được hoạt hóa tham gia vào sự ức chế quá trình chết tế bào theo lập trình, thúc đẩy tăng trưởng tế bào thông qua hoạt hóa con đường tín hiệu

hạ nguồn PIK3CA/AKT1 Protein tổ hợp EML4 - ALK còn có thể hoạt hóa liên tục con đường tín hiệu RAS/RAF1/MAP2K1/MAPK1 Con đường tín hiệu này đóng vai trò rất quan trọng cho sự tăng sinh tế bào So với những

bệnh nhân có kiểu gen ALK và EGFR bình thường, những bệnh nhân có kiểu gen tổ hợp EML4 - ALK thường trẻ hơn (trung bình 52 so với 64), có nguồn

gốc châu Á, thường được phát hiện ở giai đoạn muộn, xuất hiện ở bệnh nhân nam nhiều hơn nữ (58% so với 32%) và thường gặp hơn ở những người không hút thuốc lá (74% so với 26%) Trong công trình nghiên cứu của Shaw

và cộng sự, tất cả 10 bệnh nhân có gen tổ hợp EML4 - ALK đều kháng với erlotinib [95] Vì gen tổ hợp EML4 - ALK và đột biến gen EGFR thường loại

trừ lẫn nhau nên một điều vẫn chưa được giải thích rõ ràng là sự kháng với

thuốc ức chế đặc hiệu EGFR do bản chất của gen EML4 - ALK hay là do gen EGFR thể tự nhiên gây ra

Ung thư phổi có gen tổ hợp ALK kháng với thuốc ức chế đặc hiệu

EGFR (gefitinib, erlotinib), nhưng nhạy với các phân tử nhỏ nhắm đích ALK Các thuốc ức chế đặc hiệu ALK, trong đó có crizotinib, có hiệu quả điều trị trong những mô hình tiền lâm sàng cho những bệnh nhân ung thư mang gen

tổ hợp ALK [91] Trong một thử nghiệm lâm sàng, crizotinib có hoạt tính ức

chế khối u trong phần lớn các bệnh nhân carcinôm tuyến có mang gen tổ hợp

EML4 - ALK Phân tích trên 82 bệnh nhân UTP có gen tổ hợp ALK cho thấy

điều trị với crizotinib làm tăng thời gian sống so với nhóm chứng không sử

dụng crizotinib [96] Thời gian sống thêm ở những bệnh nhân mang gen nối

ALK sử dụng crizotinib trong liệu pháp điều trị bước 2 hay bước 3 cũng tốt

hơn so với sử dụng bất kỳ một loại thuốc nào cho liệu pháp điều trị bước 2

Mặc dù có sự đáp ứng đáng kể ở giai đoạn đầu, các bệnh nhân này cuối cùng cũng kháng với crizotinib trong khoảng 1 năm điều trị, do đó giới hạn lợi ích lâm sàng tiềm năng của thuốc này Katayama và cộng sự thấy rằng những tế bào kháng với crizotinib liều trung bình có sự khuếch đại gen

EML4 - ALK hoặc có đột biến L1196M trong vùng hoạt tính kinase [55]

Kỹ thuật Dual - color - split - apart FISH được khuyến cáo cho chẩn

đoán gen tổ hợp EML4 - ALK Các tế bào dương tính chiếm >15% trong

khoảng 50 tế bào được phân tích là ngưỡng phát hiện dương tính được khuyến cáo bởi Hội Giải phẫu bệnh và Hội Bệnh học Phân tử Mỹ Kết quả xét nghiệm

FISH cho gen ALK cần được kiểm chứng độc lập bởi 2 nhân viên có kinh

nghiệm RT - PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) là kỹ thuật không được khuyến cáo do sự thiếu chính xác của các xét nghiệm dựa vào RNA đối với các mẫu mô vùi nến HMMD hiện tại cũng không phải là một phương pháp được khuyến cáo vì sự biểu hiện thấp và kỹ thuật chưa được tối ưu hóa về độ nhạy và độ đặc hiệu

1.2.1.5 Thay đổi biểu hiện protein EGFR

Hóa mô miễn dịch (HMMD) là kết hợp phản ứng miễn dịch kháng nguyên - kháng thể đánh giá biểu hiện các kháng nguyên hiện diện trong mô (bào tương, màng bào tương, nhân tế bào) Phương pháp HMMD giúp đánh

giá gián tiếp biểu hiện gen EGFR thông qua việc phát hiện tình trạng biểu

hiện quá mức EGFR trên bề mặt tế bào u

Có 3 loại xét nghiệm HMMD chính để đánh giá protein EGFR: EGFR tổng, EGFR đã được phosphoryl hóa và EGFR có đột biến

Tăng biểu hiện của protein EGFR tổng gặp trong 40 - 80% trường hợp UTP với các thể mô bệnh học khác nhau Tuy nhiên, việc sử dụng dấu ấn tăng biểu hiện của protein EGFR để đánh giá tiên lượng bệnh không có ý nghĩa trong lâm sàng [92] Nhiều nghiên cứu cho thấy tình trạng biểu hiện protein EGFR không phải là một dấu ấn đáng tin cậy cho việc tiên đoán khả năng đáp ứng với thuốc ức chế đặc hiệu EGFR [117] Tình trạng tăng biểu hiện protein

EGFR độc lập với tình trạng đột biến gen EGFR

Sự phosphoryl hóa ở đầu carboxyl của protein EGFR giữ vai trò quan trọng để các phân tử truyền tin có thể tập kết và hoạt hóa các con đường tín hiệu hạ nguồn Ý nghĩa của việc phát hiện EGFR đã được phosphoryl hóa vẫn còn chưa rõ ràng do sự lo ngại về tính bền vững của trạng thái protein này trong tế bào cũng như khả năng phát hiện trong thực hành giải phẫu bệnh thường quy Các nghiên cứu thêm nữa cần tập trung đánh giá khả năng ứng dụng vào lâm sàng của những kháng thể dùng để phát hiện các protein EGFR

đã được phosphoryl hóa

Các kháng thể đã được thương mại hóa để phát hiện đột biến EGFR bằng HMMD sử dụng kháng thể đặc hiệu Hiện tại có thể phát hiện được hai kiểu đột biến thường gặp nhất là đột biến mất đoạn delE746_A750 của exon

19 và đột biến điểm L858R của exon 21 Cả hai kiểu đột biến chiếm khoảng 90% các trường hợp đột biến EGFR (chiếm tỷ lệ cao) Đây cũng là phương pháp mà chúng tôi sử dụng vì khi nhuộm HMMD sử dụng những kháng thể đặc hiệu với hai loại đột biến chiếm tỷ lệ cao kể trên để phát hiện đột biến EGFR trong ung thư phổi không tế bào nhỏ, có thể được ứng dụng để sàng lọc nhanh những bệnh nhân phù hợp với điều trị bằng thuốc ức chế đặc hiệu EGFR Theo nghiên cứu của Ju và cộng sự [123] các kháng thể này phát hiện được 51 trường hợp đột biến EGFR từ 217 bệnh nhân ung thư phổi loại carcinôm tuyến, kết quả đã được kiểm chứng bằng giải trình tự chuỗi DNA

Một số nghiên cứu khác trên thế giới như nghiên cứu của Chi H và cộng sự cho thấy khi nhuộm HMMD sử dụng kháng thể đặc hiệu với đột biến E746-A750 và L858R có độ nhạy (78,3% và 72,7%) và độ đặc hiệu (90,9% và 96,3%), giá trị tiên đoán dương (78,3% và 88,9%), giá trị tiên đoán âm (90,9% và 89,7%) [29] Tuy nhiên, độ nhạy và độ đặc hiệu thay đổi theo các nghiên cứu khác nhau từ 40%-94% và từ 24%-100%, đó cũng là vấn đề cần quan tâm khi sử dụng HMMD để chẩn đoán đột biến EGFR do hiện nay các kháng thể đặc hiệu chỉ có thể phát hiện được các đột biến phổ biến, sẽ bỏ sót các đột biến khác ít gặp, thêm vào đó ngưỡng sử dụng để đánh giá một xét nghiệm là dương tính hay âm tính vẫn cón mang tính chất chủ quan và chưa thống nhất rõ ràng

1.3 ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG

Ung thư phổi có diễn tiến âm thầm, thường không biểu hiện triệu chứng

ở giai đoạn đầu của bệnh vì phổi có ít thần kinh cảm giác đau và nhờ khả năng dự trữ hô hấp khá lớn của cả hai phổi Các triệu chứng lâm sàng của UTP không hoàn toàn đặc hiệu, có thể cũng gặp trong các bệnh lý lành tính của phổi, cần lưu ý rằng khoảng 10% trường hợp UTP không hề có triệu chứng nào khi được chẩn đoán, chỉ được phát hiện tình cờ trên phim phổi khi khám sức khỏe tổng quát Khối u có thể phát triển bên trong khí đạo, gây khó thở do tắc nghẽn Sự tắc nghẽn cũng làm ứ đọng các chất tiết, tạo điều kiện cho viêm phổi xuất hiện Các khối u thường có hệ thống mạch máu cung cấp rất phong phú nhưng lại dễ vỡ, gây nên triệu chứng ho ra máu Các triệu chứng và dấu hiệu lâm sàng khác bao gồm đau ngực, mệt mỏi, chán ăn, ngón tay dùi trống, tràn dịch màng phổi

1.4 XẾP HẠNG LÂM SÀNG THEO TNM

Xếp giai đoạn UTP đóng vai trò rất quan trọng trong việc lập chiến lược điều trị cho bệnh nhân cũng như mang ý nghĩa tiên lượng sống còn Đối

với UTPKTBN, bảng xếp hạng lâm sàng TNM năm 2002 (phiên bản lần thứ 6) của Hiệp hội phòng chống ung thư thế giới (UICC) cho đến nay vẫn được

sử dụng rộng rãi [93] Năm 2010, UICC phát hành ấn bản thứ 7 [103]

T 3 : U kích thước bất kỳ, nhưng đã xâm lấn đến cơ hoành, màng

phổi trung thất, màng ngoài tim

T 4 : U kích thước bất kỳ nhưng đã xâm lấn đến trung thất, tim,

mạch máu lớn, khí quản, thực quản, cột sống, chỗ khí quản chia ra hai phế quản chính hoặc u đã có tràn dịch màng phổi hay tràn dịch màng tim

N 2 : Di căn hạch trung thất cùng bên và/hoặc hạch cạnh chỗ khí

quản chia ra hai phế quản chính