Trong những năm gần đây, cùng những thành tựu mang tính đột phá trong lĩnh vực sinh học thì hiểu biết về chức năng và hoạt động của cơ thể sống ở mức độ tế bào, mức độ phân tử ngày càng được làm rõ. Các thuốc chống ung thư mới ra đời hầu hết đều bắt nguồn từ mục tiêu phân tử nhằm tăng hiệu quả điều trị và giảm độc tính so với các phương pháp cổ điển như hóa trị hay xạ trị. Một số đích tác dụng mà các thuốc chống ung thư hiện nay đang hướng đến như các protein kinase, protein gây ung thư Bcl2, HAT, HDAC… trong đó đích HDAC đang mở ra nhiều triển vọng. Rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự huy động quá mức các HDAC có khả năng gây nên các sai lệch trong quá trình phiên mã, làm kích thích sự phát triển của các tế bào ung thư 15, 23. Hiện nay, trong các chất ức chế HDAC được tổng hợp và công bố, nhóm các dẫn chất của acid hydroxamic có hoạt tính khá tốt trong đó điển hình là SAHA (Zolinza®) là chất ức chế enzym HDAC đầu tiên được FDA cấp phép lưu hành năm 2006 cho điều trị u da tế bào lympho T (CTCL) 6. Sau đó là belinostat (Beleodaq®), gần đây nhất panobinostat (Farydax®) cũng được FDA cấp phép sử dụng trong điều trị một số bệnh ung thư.Theo hướng tiếp cận này, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược Đại học Dược Hà Nội cũng đã thiết kế, tổng hợp, thử hoạt tính và công bố nhiều dãy chất dẫn xuất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt 1, 30, 31. Một số bài báo gần đây của nhóm nghiên cứu đã cho kết quả rất khả quan khi sử dụng khung benzothiazol hoặc khung 5aryl1,3,4thiadiazol thay cho vòng phenyl trong cấu trúc của SAHA để làm nhóm khóa hoạt động. Nhiều chất đã thể hiện tác dụng ức chế HDAC tốt hơn SAHA từ vài lần đến vài chục lần 31, 32.Trên cơ sở các nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Tổng hợp một số Nhydroxybutanamidpentanamid mang khung 1(triazol4yl)methylindolin2on hướng tác dụng kháng ung thư” với hai mục tiêu: 1. Tổng hợp Nhydroxy4(4((3(hydroxyimino)2oxoindolin1yl)methyl)1H1,2,3triazol1yl)butanamid và 4 dẫn chất.2. Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các chất tổng hợp được.Histon có hai dạng tồn tại là acetyl hóa hoặc deacetyl hóa được chuyển hóa qua nhau nhờ 2 enzym là histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC). Ở dạng acetyl hóa dưới xúc tác của HAT, điện tích dương nhóm εNH2 của lysin ở đầu N của histon bị trung hòa, NST được tháo xoắn, quá trình phiên mã được xảy ra 16. Ngược lại, ở dạng deacetyl hóa dưới tác dụng của HDAC, histon tích điện dương lớn ở đầu N, tương tác mạnh với ADN, đóng xoắn NST, ngăn cản quá trình phiên mã 15 (xem hình 1.1). 1.1.2. Phân loại các HDACHiện nay, các nhà khoa học đã xác định được 18 loại HDAC có mặt ở con người và chúng được chia thành 4 nhóm 7, 8, 29: Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8. Nhóm II: HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC9, HDAC10. Nhóm III: Sirtuin 17. Nhóm IV: HDAC11.
Trang 2Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa Dược
HÀ NỘI - 2017
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Trước khi trình bày nội dung những phần thuộc đề tài của mình, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến những người trong suốt thời gian qua đã luôn hỗ trợ động viên tôi hoàn thành một cách tốt nhất khóa luận tốt nghiệp của mình
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến với những người thầy, người cô
đáng kính của tôi: GS.TS Nguyễn Hải Nam, PGS.TS Phan Thị Phương Dung,
DS Đỗ Thị Mai Dung - Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội Thầy cô
đã không chỉ tạo những điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận mà đã luôn có những chỉ dẫn chính xác, kịp thời và động viên tôi những lúc khó khăn
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đại học quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận này
Cuối cùng, tôi muốn cảm ơn gia đình, bạn bè, các anh chị, các bạn của nhóm
nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược, đặc biệt là anh Lê Văn Cường, anh Lê Xuân
Thiện, em Lê Công Trực, Cao Việt Phương, Phạm Nguyễn Khánh Linh và bạn Đào An đã chia sẻ buồn vui, giúp đỡ và khích lệ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu
Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2016
Sinh viên
Dương Tiến Anh
Trang 41.1.1 Khái niệm về histon deacetylase (HDAC) 2
1.1.3 Cấu trúc enzym HDAC và cơ chế deacetyl hóa 3
1.2.1 Phân loại các chất ức chế HDAC 5 1.2.2 Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 6 1.2.3 Liên quan cấu trúc tác dụng của các chất ức chế HDAC 7 1.3 MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TRONG TỔNG HƠP CÁC ACID
HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI
9
1.3.1 Thay đổi nhóm khóa hoạt động 9
1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC VÀ
HÓA HỌC CLICK
12
1.4.1 Các phương pháp tổng hợp acid hydroxamic 12
Trang 5CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.2 Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được 18
Trang 6DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
13C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon
(Carbon-13 nuclear magnetic resonance)
1H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
(Proton nuclear magnetic resonance) A549 : Dòng tế bào ung thư phổi người
AcOH : Acid acetic
ADN : Acid desoxyribonucleic
AsPC-1 : Dòng tế bào ung thư tuyến tụy người
CU : Nhóm liên kết (Connecting unit)
d : Vạch đôi trong phổ NMR (Doublet)
DCM : Dicloromethan
dd : Vạch chẻ đôi 2 lần trong phổ NMR (Doublet of doublet)
DMF : Dimethylformamid
DMSO : Dimethylsulfoxid
DMSO-d 6 : Dimethylsulfoxid deuteri hóa
ESI : Ion hóa phun bụi điện tử (Electrospray ionization)
FBS : Huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum)
FDA : Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ
(U.S Food and Drug Administration)
H (%) : Hiệu suất
HAT : Histon acetyltransferase
HCT116 : Dòng tế bào ung thư ruột kết người
HDAC : Histon deacetylase
HDACi : Các chất có tác dụng ức chế HDAC (Histon deacetylase inhibitors) HepG2 : Dòng tế bào ung thư gan người
IC50 : Nồng độ ức chế 50% (The half maximal inhibitory concentration)
IR : Hồng ngoại (Infrared)
J : Hằng số ghép cặp trong phổ NMR
Trang 7KRIBB : Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc
(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)
m : Đa vạch trong phổ NMR (Multiplet)
MeCN : Acetonitril
MeOH : Methanol
MS : Phổ khối lượng (Mass spectrometry)
NAD+ : Nicotinamid adenin dinucleotid
NST : Nhiễm sắc thể
PC-3 : Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt người
Rf : Hệ số lưu giữ trong TLC
s : Vạch đơn trong phổ NMR (Singlet)
SAHA : Acid suberoylanilid hydroxamic
SRG : Nhóm nhận diện bề mặt (Surface recognition group)
SW620 : Dòng tế bào ung thư đại tràng người
ZBG : Nhóm kết thúc gắn kẽm (Zinc binding group)
δ (ppm) : Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) trong phổ NMR
ν : Dao động hóa trị trong phổ IR
Trang 8DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid hydroxamic từ ester 33
Bảng 3.2 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (to
nc) của các dẫn chất VIa-d, X 34
Bảng 3.7 Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất VIa-d, X 40
Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất VIa-d, X 41
Trang 9DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Trang
Hình 1.5 Cấu trúc của SAHA tương ứng với cấu trúc chung của các chất ức
chế HDAC
7
Hình 1.7 Cấu trúc chung các acid hydroxamic mang khung benzothiazol 9
Hình 1.10 Cấu trúc chung của một số dẫn chất mang khung 2-oxoindolin 11
Hình 3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của dẫn chất VIc (giãn rộng) 49
Hình 3.3 Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất VIc-d trên
các dòng tế bào SW620, PC-3 và AsPC-1
51
Trang 10DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 1.3 Phản ứng đóng vòng 1,3-lưỡng cực giữa alkyn và azid với xúc tác
Cu(I) (CuAAC)
14
Trang 111
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, cùng những thành tựu mang tính đột phá trong lĩnh vực sinh học thì hiểu biết về chức năng và hoạt động của cơ thể sống ở mức độ tế bào, mức độ phân tử ngày càng được làm rõ Các thuốc chống ung thư mới ra đời hầu hết đều bắt nguồn từ mục tiêu phân tử nhằm tăng hiệu quả điều trị và giảm độc tính
so với các phương pháp cổ điển như hóa trị hay xạ trị Một số đích tác dụng mà các thuốc chống ung thư hiện nay đang hướng đến như các protein kinase, protein gây ung thư Bcl-2, HAT, HDAC… trong đó đích HDAC đang mở ra nhiều triển vọng Rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự huy động quá mức các HDAC có khả năng gây nên các sai lệch trong quá trình phiên mã, làm kích thích sự phát triển của các tế bào ung thư [15], [23] Hiện nay, trong các chất ức chế HDAC được tổng hợp và công
bố, nhóm các dẫn chất của acid hydroxamic có hoạt tính khá tốt trong đó điển hình là SAHA (Zolinza®) là chất ức chế enzym HDAC đầu tiên được FDA cấp phép lưu hành năm 2006 cho điều trị u da tế bào lympho T (CTCL) [6] Sau đó là belinostat (Beleodaq®), gần đây nhất panobinostat (Farydax®) cũng được FDA cấp phép sử dụng trong điều trị một số bệnh ung thư
Theo hướng tiếp cận này, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội cũng đã thiết kế, tổng hợp, thử hoạt tính và công bố nhiều dãy chất dẫn xuất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt [1], [30], [31] Một số bài báo gần đây của nhóm nghiên cứu đã cho kết quả rất khả quan khi sử dụng khung benzothiazol hoặc khung 5-aryl-1,3,4-thiadiazol thay cho vòng phenyl trong cấu trúc của SAHA để làm nhóm khóa hoạt động Nhiều chất đã thể hiện tác dụng ức chế HDAC tốt hơn SAHA từ vài lần đến vài chục lần [31], [32]
Trên cơ sở các nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Tổng hợp một số
N-hydroxybutanamid/pentanamid mang khung
1-(triazol-4-yl)methylindolin-2-on hướng tác dụng kháng ung thư” với hai mục tiêu:
1 Tổng hợp
N-hydroxy-4-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)butanamid và 4 dẫn chất
2 Thử tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào của các chất tổng hợp được
Trang 122
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC)
1.1.1 Khái niệm về histon deacetylase (HDAC)
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng cấu trúc của nhiễm sắc thể (NST) đóng một vai trò quan trọng trong điều hòa biểu hiện gen [4], [10] NST là những phức hợp đại phân tử được cấu tạo từ 3 thành phần chính là ADN, histon và protein không phải histon [10] Cấu trúc cơ bản của NST là nucleosom, gồm một lõi protein octamer hình đĩa của các histon (1 tetramer H3/H4 và 2 dimer H2A/H2B) được quấn quanh bởi 146 cặp nucleotid của một đoạn ADN [8], [20] Các cặp histon có cấu trúc 2 phần quan trọng: đầu C nằm bên trong lõi, đầu N nằm bên ngoài nucleosom với acid amin kết thúc là lysin Đầu N đặc biệt là ở H3, H4 là đích của nhiều biến đổi trong quá trình phiên mã như acetyl/deacetyl hóa, methyl hóa, phosphoryl hóa
Hình 1.1 Cấu trúc của nucleosom và vai trò của HAT, HDAC
Histon có hai dạng tồn tại là acetyl hóa hoặc deacetyl hóa được chuyển hóa qua nhau nhờ 2 enzym là histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC)
Ở dạng acetyl hóa dưới xúc tác của HAT, điện tích dương nhóm ε-NH2 của lysin ở đầu N của histon bị trung hòa, NST được tháo xoắn, quá trình phiên mã được xảy ra [16] Ngược lại, ở dạng deacetyl hóa dưới tác dụng của HDAC, histon tích điện dương
Trang 133
lớn ở đầu N, tương tác mạnh với ADN, đóng xoắn NST, ngăn cản quá trình phiên mã [15] (xem hình 1.1)
1.1.2 Phân loại các HDAC
Hiện nay, các nhà khoa học đã xác định được 18 loại HDAC có mặt ở con người
và chúng được chia thành 4 nhóm [7], [8], [29]:
- Nhóm I: HDAC-1, HDAC-2, HDAC-3, HDAC-8
- Nhóm II: HDAC-4, HDAC-5, HDAC-6, HDAC-7, HDAC-9, HDAC-10
- Nhóm III: Sirtuin 1-7
- Nhóm IV: HDAC-11
Hình 1.2 Bảng phân loại các HDAC
Nhóm I, II và IV được coi là những HDAC “kinh điển” là những enzym phụ thuộc Zn2+ Vị trí xúc tác của chúng có dạng túi với một ion Zn2+ ở đáy nên những enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelat với Zn2+ như các acid hydroxamic Nhóm III là những sirtuin không bị ức chế bởi những hợp chất như vậy
vì chúng có cơ chế hoạt động khác là phụ thuộc vào NAD+ [17]
1.1.3 Cấu trúc enzym HDAC và cơ chế deacetyl hóa
Trang 144
Bằng phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X, người ta xác định được cấu trúc tinh thể của các HDAC khác nhau
Hình 1.3 Phức hợp HDAC-8 và acid hydroxamic
Nhìn chung, các cấu trúc của chúng đều tương tự nhau, bao gồm 2 phần chính
là ion Zn2+và kênh enzym:
+ Ion Zn2+ là coenzym của HDAC, nằm dưới đáy kênh enzym và cũng là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon qua liên kết phối trí Trong phân tử HDAC ion Zn2+ có thể tạo 4 liên kết phối trí với các acid amin và 1 liên kết phối trí với nguyên tử oxy của nhóm acetyl của acetyl lysin ở đầu N của histon từ đó xúc tác tách loại nhóm acetyl Thường các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với
Zn2+ thì tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào càng mạnh [36] Như acid hydroxamic, ức chế HDAC bằng cách tạo hai liên kết phối trí với Zn2+ qua 2 nguyên
tử oxy của nó (xem hình 1.3)
+ Kênh enzym có dạng túi hình ống hẹp, là nơi chứa cơ chất và tham gia liên
kết Van der Waals với cơ chất, được cấu tạo bởi các acid amin thân dầu đặc biệt là các acid amin có nhân thơm như: Phe, Tyr, Pro, His Nó có cấu trúc khá linh động có thể thay đổi kích thước để phù hợp với cơ chất Miệng túi có một vài vòng xoắn protein để tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC Đáy túi có một vài phân
tử nước, có nhiệm vụ vận chuyển nhóm acetyl trong phản ứng deacetyl hóa và tạo
Trang 151.2.1 Phân loại các chất ức chế HDAC
Dựa vào cấu trúc hóa học, các chất ức chế HDAC được chia thành 6 nhóm: các acid hydroxamic, các acid carboxylic mạch ngắn, các peptid vòng, các aminobenzamid, các epoxyceton và các phân tử lai [34], [41] (xem hình 1.4) Mỗi nhóm chất ức chế HDAC đều có những ưu nhược điểm riêng, trong đó nhóm acid hydroxamic bị nhanh thải trừ, tác dụng ức chế HDAC không chọn lọc nhưng có ưu điểm là ức chế ở nồng độ rất thấp (cỡ nM) và cấu trúc đơn giản [8], [21]
Năm 1990, trichostatin A (TSA) là chất đầu tiên thuộc nhóm acid hydroxamic được tìm thấy có tác dụng ức chế HDAC bởi Yosida và cộng sự [8] Sau đó, SAHA (vorinostat) với cấu trúc tương tự TSA là chất ức chế HDAC đầu tiên được FDA phê duyệt cho điều trị u da tế bào lympho T (CTCL) [12] Cho đến nay, FDA đã cấp phép lưu hành trên thị trường 3 thuốc có tác dụng ức chế HDAC trong điều trị ung thư bao gồm: SAHA (2006), belinostat (2014) và panobinostat (2015)
Trang 166
Hình 1.4 Phân loại các chất ức chế HDAC
1.2.2 Cấu trúc của các chất ức chế HDAC
Dựa trên cấu trúc của SAHA, các chất ức chế HDAC thường bao gồm 3 phần chính [13](xem hình 1.5):
- Nhóm nhận diện bề mặt hay còn gọi là nhóm khóa hoạt động (Capping group
- SRG): là các vòng thơm hoặc peptid vòng, thường tham gia vào quá trình nhận diện với bề mặt amino acid của enzym
- Vùng cầu nối (Linker): thường là các nhóm sơ nước, gồm các hydrocarbon thân dầu mạch thẳng hoặc vòng, có thể no hoặc không no, có vai trò tạo liên kết Van der Waals với kênh enzym, tạo nên tương tác với các thành phần nằm trên kênh và giúp cho cơ chất cố định trong kênh
- Nhóm kết thúc gắn với kẽm (Zinc binding group - ZBG): có thể là acid hydroxamic, các thiol, nhóm o-aminoanilin của benzamid, mercaptoceton Nhóm kết thúc gắn với kẽm tham gia tạo tương tác với ion Zn2+ tại trung tâm hoạt động của các HDAC
Trang 177
Hình 1.5 Cấu trúc của SAHA tương ứng với cấu trúc chung của các HDACi
1.2.3 Liên quan cấu trúc tác dụng của các chất ức chế HDAC
1.2.3.1 Ảnh hưởng của nhóm nhận diện bề mặt
Cấu trúc của nhóm nhận diện bề mặt có ảnh hưởng rất nhiều đến hoạt tính của các chất ức chế HDAC Những phân tử không có nhóm nhận diện bề mặt kị nước thì
có hoạt tính yếu [37]
Trong một nghiên cứu vào năm 2006 của nhóm tác giả Juvale [22] cho thấy, sự
có mặt của nhóm phenyl hay thêm một nhóm thế trên cầu nối ở vị trí sát với nhóm phenyl trong nhóm nhận diện bề mặt sẽ góp phần làm tăng hoạt tính Ngược lại, khi
có nhóm thế sát nhóm acid hydroxamic thì gây bất lợi cho hoạt tính Tương tự nhóm phenyl, các nhóm chức và cấu trúc giàu mật độ electron ở nhóm nhận diện bề mặt đều góp phần làm tăng hoạt tính
Cấu trúc của nhóm nhận diện bề mặt và sự tương ứng cấu trúc miệng túi enzym HDAC còn tạo nên tính chọn lọc của các chất ức chế HDAC Trong nghiên cứu của nhóm tác giả Di Micco S đã giải thích sự ức chế chọn lọc của các hợp chất cyclopeptid thiên nhiên mang vòng lớn (azumamid E và apicidi) trên HDAC nhóm I (xem hình 1.6) [9]
Hình 1.6 Cấu trúc apicidin và azumamid E
O
N O
Trang 181.2.3.2 Ảnh hưởng của cầu nối
Trung tâm hoạt động của các HDAC là dạng túi kỵ nước, có chiều dài từ miệng túi đến ion Zn2+ ở đáy túi là 4-6 C, do vậy các chất ức chế HDAC có vùng cấu nối dài tương ứng sẽ cho hoạt tính tốt hơn [17] Trong một nghiên cứu của công ty TopoTarget (Anh), khi thiết kế và tổng hợp gần 40 dẫn chất amid ngược (AH8) của SAHA cũng đã chỉ ra khi cầu nối 5-6 C thì hoạt tính của chúng đạt được là tối ưu [2]
1.2.3.3 Ảnh hưởng cúa nhóm kết thúc gắn kẽm (ZBG)
- Cấu trúc ZBG
Năm 2005, khi nghiên cứu cấu trúc của vùng chứa ion Zn2+ trong HDAC, Vanommeslaeghe K và cộng sự thấy rằng, vùng này chứa 1 gốc Tyr và 2 nhóm His-Asp [39] Từ đó, tác giả đã đưa ra cấu trúc của nhóm kết thúc gắn với kẽm trong phân
tử chất ức chế HDAC gồm 5 phần:
+ Phần A: mang đôi electron không liên kết, có khả năng tạo liên kết hydro với
H trong nhóm OH của tyrosin, đồng thời tạo liên kết chelat với ion Zn2+ Tuy nhiên
A cũng có thể chứa hydro (để nhận điện tử từ oxy trong nhóm phenol của tyrosin tạo liên kết hydro)
+ Phần B: nối ZBG với vùng cầu nối, do đó B phải tạo ít nhất 3 liên kết
+ Phần C: chứa hydro linh động, tạo liên kết hydro với His132
+ Phần D: là nhóm cho proton cho His131, tạo liên kết tĩnh điện với His131 và liên kết chelat mạnh với Zn2+
+ Phần L: vùng cầu nối
1.2.3.4 Ảnh hưởng của các yếu tố khác
- Năng lượng solvat hóa của phân tử tăng, hoạt tính ức chế HDAC giảm [41]
Trang 199
- Các phân tử thân dầu thường có hoạt tính tốt, tuy nhiên kích thước phân tử quá lớn sẽ bất lợi với hoạt tính [22] Khi phân tử thuốc quá thân dầu hoặc chứa quá nhiều vòng 6 cạnh sẽ tạo hiệu ứng không gian, do vậy hoạt tính của chất sẽ giảm [5] Những chất có tính thân dầu - thân nước cân bằng thường có lợi cho hoạt tính của các chất
ức chế HDAC-6 [26]
- Phân tử có xu hướng cầu hóa sẽ làm thu nhỏ vùng cho dung môi thâm nhập
do các nhóm thân nước bị che khuất Cấu trúc phân tử càng có xu hướng “mở”, hoạt tính ức chế HDAC sẽ tăng [40]
- Phân tử ở dạng gấp khúc là điều kiện tiên quyết cho tác dụng ức chế chọn lọc HD1-A (tương đồng HDAC nhóm II) Ngược lại, khi phân tử ở dạng thẳng lại cho tác dụng ức chế chọn lọc trên HD1-B (tương đồng HDAC nhóm I) [33]
1.3 MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TRONG TỔNG HƠP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI 1.3.1 Thay đổi nhóm khóa hoạt động
Năm 2011, với việc sử dụng SAHA như là một chất dẫn đường, NCS Đào Thị Kim Oanh và cộng sự [1] đã nghiên cứu dãy chất mang nhóm khóa hoạt động benzothiazol với cầu nối là từ 2-6 nhóm methylen Kết quả cho thấy, việc thay nhóm phenyl của SAHA bằng nhóm benzothiazol tạo ra các chất có hoạt tính khá tốt, thậm chí chất với cầu nối 6C còn có hoạt tính mạnh hơn cả SAHA (xem hình 1.7)
Hình 1.7 Cấu trúc chung các acid hydroxamic mang khung benzothiazol
Trên thế giới, năm 2013, Feng T và cộng sự [14] đã nghiên cứu các chất ức chế HDAC dẫn xuất N-hydroxyfurylacrylamid có mạch nhánh ở nhóm khoá hoạt động
Các hợp chất này được thử hoạt tính kháng ung thư in vitro trên các dòng tế bào ung
thư tuyến tiền liệt (PC-3), tế bào ung thư ruột kết (HCT116), tế bào ung thư phổi (A549), tế bào ung thư gan (HepG2) và khả năng ức chế chọn lọc các enzym HDAC-
Trang 2010
1, HDAC-4, HDAC-6 Kết quả nghiên cứu cho thấy các chất 3a, 3b, 3c, 3d cho tác dụng chọn lọc tốt nhất trên HDAC-6 đồng thời 3a, 3b, 3c còn có khả năng ức chế
HDAC-1 Qua nghiên cứu docking, tác giả giải thích tác dụng chọn lọc HDAC-6 của
3b là do mạch nhánh cồng kềnh ở nhóm khoá hoạt động có kích thước đủ lớn, vừa
khít với rãnh trên bề mặt HDAC-6, nhưng không khít với rãnh trên bề mặt HDAC-1
và HDAC-4 [14] (xem hình 1.8)
Hình 1.8 Cấu trúc chung các chất trong nghiên cứu của Feng T
Năm 2016, Zhang Z và cộng sự [42] đã thiết kế, tổng hợp và thử hoạt tính in
vitro các acid hydroxamic mà trong nhóm khóa bề mặt có chứa khung
dimethylisoxazol Kết quả nghiên cứu chỉ ra các dẫn chất có hoạt tính tương đối tốt,
ví dụ như chất 4 dưới đây có tác dụng ức chế mạnh HDAC-1 với IC50 = 0,15 μM (xem hình 1.9)
Hình 1.9 Cấu trúc chung các chất trong nghiên cứu của Zhang Z
1.3.2 Thay đổi cầu nối
Bên cạnh hướng thay đổi nhóm khóa hoạt động, một số nhà khoa học lại tập trung vào việc thay đổi cầu nối như thay đổi nhóm thế, thay đổi mạch carbon no bằng các mạch chứa liên kết đôi, vòng thơm hay dị vòng nhằm tăng tác dụng ức chế HDAC cũng như tăng tính chọn lọc của các thuốc mới sau này
Trang 2111
Cũng trong nghiên cứu của mình năm 2011, cùng với việc thay nhóm khóa hoạt động là benzothiazol, tác giả Đào Thị Kim Oanh còn thay đổi chiều dài cầu nối từ 2 đến 6C Kết quả thử hoạt tính sinh học trên các HDAC-3,4 của cầu nối 6C được cải thiện đồng thời ức chế 5 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 trung bình là 0,81 µg/ml [1], [32]
Gần đây nhất, NCS Đỗ Thị Mai Dung và cộng sự [11] đã thiết kế nghiên cứu và tổng hợp các hydroxamic mang khung 2-oxoindolin có nhóm thế ở vị trí số 3 Kết quả nghiên cứu cho thấy, hầu hết các chất trong dãy đều có hoạt tính khá tốt trên các
dòng tế bào thử nghiệm (chất 5a, 5b) (xem hình 1.10)
Hình 1.10 Cấu trúc chung của một số dẫn chất mang khung 2-oxoindolin
Nghiên cứu cấu trúc không gian của các HDAC, các nhà khoa học phát hiện rằng trung tâm hoạt động của HDAC-1 nhỏ hơn trung tâm hoạt động của HDAC-6 [3] Do vậy, nhằm tăng tác dụng chọn lọc vào HDAC-6, nhóm nghiên cứu của Lee J.H và cộng sự đã thay thế cầu nối mạch thẳng của SAHA bằng các cầu nối cồng
kềnh hơn về không gian Kết quả cho thấy hợp chất
N-hydroxy-4-(2-[(2-hydroxyethyl)(phenyl)amino]-2-oxoethyl)benzamid (HPOB) 6 cho hoạt tính ức chế
chọn lọc HDAC-6 in vitro và in vivo [27] (xem hình 1.11)
Hình 1.11 Cấu trúc HPOB trong nghiên cứu của Lee J.H và cộng sự
Trang 2212
1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC VÀ HÓA HỌC CLICK
1.4.1 Các phương pháp tổng hợp acid hydroxamic
Acid hydroxamic là sản phẩm thu được của phản ứng giữa các dẫn chất của acid carboxylic như ester, clorid acid, anhydrid… với hydroxylamin Dưới đây, khóa luận xin trình bày một số phương pháp phổ biến tổng hợp acid hydroxamic đi từ nguyên liệu ester và acid carboxylic cho tác dụng với hydroxylamin
1.4.1.1 Tổng hợp acid hydroxamic từ ester
Đây là phương pháp được nhiều nhóm nghiên cứu áp dụng để tổng hợp các acid hydroxamic, ví dụ như Andrianov và cộng sự (năm 2008) [2] hay Hanessian và cộng sự (năm 2007) [18] Các nhóm nghiên cứu trên đều tổng hợp acid hydroxamic
từ methyl ester phản ứng với hydroxylamin trong dung môi MeOH ở môi trường kiềm NaOH Phản ứng xảy ra ở điều kiện từ 0-25°C với hiệu suất khá cao (xem sơ
đồ 1.1)
Sơ đồ 1.1 Tổng hợp một số dẫn chất amid ngược của SAHA
Tuy nhiên, ở một số trường hợp, điều kiện phản ứng và dung môi phản ứng có thể thay đổi phụ thuộc vào bản chất của ester tham gia Ví dụ, trong nghiên cứu tổng hợp các acid hydroxamic mang cầu nối chứa vòng triazol giữa methyl ester với hydroxylamincủa Chen và cộng sự [6], dung môi phản ứng lại là hỗn hợp KCN:THF (1:1) ở nhiệt độ phòng Hiệu suất phản ứng vẫn đạt trên 80%
1.4.1.2 Tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic
Ngoài phương pháp tổng hợp acid hydroxamic từ ester, người ta có thể đi từ acid carboxylic nếu phản ứng trực tiếp giữa methyl ester và hydroxylamin khó xảy
ra Khi đó, trong một số trường hợp cần sử dụng tác nhân hoạt hóa acid carboxylic
và sử dụng hydroxylamin có nhóm bảo vệ -OH [1]
Trang 2313
Năm 2008, trong nghiên cứu tổng hợp acid phenylthiazol hydroxamic, Kozikowski và cộng sự [26] đã sử dụng tác nhân isobutyl cloroformat để hoạt hóa acid carboxylic trong điều kiện 0°C tạo thành anhydrid ngay trong phản ứng Tuy nhiên hiệu suất của phương pháp này không cao, chỉ khoảng 26-30% (xem sơ đồ 1.2)
Sơ đồ 1.2 Tổng hợp các acid phenylthiazol hydroxamic
Như vậy, trong hai phương pháp tổng hợp acid hydroxamic từ 2 nguồn ester và acid carboxylic, phương pháp đi từ ester có điều kiện phản ứng đơn giản hơn và cho hiệu suất cao hơn Tuy nhiên, phụ thuộc vào nguyên liệu ban đầu và sản phẩm, các nhà hóa học có thể chọn phương pháp và các tác nhân hoạt hóa phù hợp
1.4.2 Hóa học Click
Khái niệm “hóa học Click’’ lần đầu tiên được đưa ra vào năm 2001 bởi ba nhà khoa học Kolb H C., Finn M G và Sharpless K B mô tả quá trình tổng hợp một chất mới bằng cách kết nối những phân tử cấu trúc nhỏ lại với nhau thông qua liên kết dị tố
Theo Sharpless và cộng sự, phản ứng Click là “những phản ứng lưỡng cực, phạm vi rộng, hiệu suất cao, cho các sản phẩm phụ không độc hại, có thể được loại
bỏ bằng những phương pháp đơn giản như kết tinh hoặc chưng cất và có tính chọn lọc lập thể” [24], [25]
1.4.2.1 Đặc điểm của phản ứng Click
Phản ứng Click có một số đặc điểm: điều kiện đơn giản (phản ứng không nhạy cảm với oxy và nước), nguyên liệu và tác nhân sẵn có, không sử dụng dung môi hoặc nếu sử dụng thì chỉ dùng các dung môi dễ kiếm, dễ tách loại và tinh chế sản phẩm Quá trình tinh chế có thể sử dụng các phương pháp đơn giản như kết tinh hoặc chưng cất Sản phẩm thu được bền vững trong điều kiện thường [24]
Trang 2414
1.4.2.2 Một số phản ứng Click thường gặp
Các phản ứng Click hay được sử dụng trong tổng hợp hữu cơ bao gồm [24]:
- Phản ứng cộng đóng vòng các hợp chất không no, đặc biệt là phản ứng đóng vòng 1,3-lưỡng cực bao gồm cả phản ứng Diels-Alder Trong đó, phản ứng giữa azid
và alkyn tạo vòng 1,2,3-triazol có tính ứng dụng cao của hóa học Click
- Phản ứng mở vòng ái nhân, đặc biệt là các dị vòng ái điện tử như epoxid, aziridin
- Phản ứng không aldol hóa của nhóm carbonyl như sự hình thành ure, thioure,
dị vòng thơm, oxim ether, hydrazon, amid
- Phản ứng cộng vào liên kết bội carbon-carbon, đặc biệt là các phản ứng oxy hóa như epoxid hóa, dihydroxyl hóa, aziridin hóa, phản ứng cộng sulfenyl halogenid, phản ứng cộng Micheal của các hợp chất Nu-H
Phản ứng đóng vòng alkyn-azid xúc tác Cu(I) (CuAAC)
Cả alkyn và azid đều là những nhóm chất nhiều năng lượng nhưng khả năng phản ứng kém Trong tự nhiên, phản ứng giữa hai nhóm chất này xảy ra chậm, cần điều kiện nhiệt độ cao và không chọn lọc, thường tạo hai đồng phân cấu tạo có nhóm thế ở vị trí 1,4 và 1,5 với tỉ lệ ngang nhau
Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Fokin và Sharpless [35], Meldal và cộng sự [38] đã độc lập công bố về ảnh hưởng của xúc tác Cu(I) đến tốc độ phản ứng Huisgen Với quy trình mới này phản ứng xảy ra nhanh, hoàn toàn và chọn lọc cho ra sản phẩm chính là sản phẩm thế 1,4-1,2,3-triazol
Sơ đồ 1.3 Phản ứng đóng vòng 1,3-lưỡng cực giữa alkyn và azid với xúc tác Cu(I)
Trang 2515
Một số nhóm xúc tác thường dùng trong phản ứng CuAAC:
- Các hợp chất Cu(I) (CuBr hoặc CuOAc) với các phối tử (ligand) base hoặc amin và một tác nhân khử (thường dùng natri ascorbat) để ức chế quá trình oxy hóa hiếu khí cho Cu(II)
- Muối Cu(II) (thường dùng CuSO4) cùng với một chất khử (natri ascorbat) để tạo thành hợp chất Cu(I)
- Một số muối Cu(II) hoặc phức chất như Cu(OAc)2 được sử dụng luôn làm xúc tác mà không cần thêm chất khử vì chúng là những chất oxy hóa mạnh dễ dàng bị alkyn khử hóa thành Cu(I)
- Kim loại Cu được oxy hóa thành Cu(I)
Hiện nay, các chất xúc tác cho phản ứng CuAAC vẫn đang tiếp tục được tìm kiếm nhằm nâng cao hiệu quả phản ứng Gần đây, nhóm nghiên cứu của Lipshutz và cộng sự [29] đã sử dụng chất xúc tác Cu trong than hoạt tính (Copper-in-charcoal),
là chất xúc tác dị thể đơn giản, không tốn kém và hiệu quả cao Nó có thể kết hợp được trong nhiều loại dung môi, loại được dễ dàng bằng phương pháp lọc và tái sử dụng được ít nhất trong hai vòng phản ứng mà không bị mất hoạt tính
Một số dung môi thường dùng trong phản ứng đóng vòng alkyn-azid xúc tác Cu(I) theo Meldal và Tornøe [19]:
- Dung môi không phân cực: toluen, cloroform, dicloromethan
- Dung môi phân cực yếu: tetrahydrofuran, pyridin, dioxan
- Dung môi phân cực: aceton, MeCN, DMF, DMSO, alcol
Ngoài ra, người ta còn có thể sử dụng hỗn hợp nước và các dung môi aceton, THF, MeCN, DMSO, đi kèm theo đó là các nhóm xúc tác Cu(0) hoặc CuSO4 kèm chất khử như natri ascorbat Ngược lại, với nhóm dung môi không chứa nước thường được sử dụng với nhóm xúc tác Cu(I)
Như vậy, với xúc tác Cu(I) trong dung môi phù hợp, phản ứng đóng vòng Huisgen xảy ra nhanh, hiệu suất cao, chọn lọc cho ra sản phẩm thế 1,4 của vòng 1,2,3-triazol
Trang 2616
Vòng 1,2,3-triazol tương đối trơ về mặt hóa học, không bị thủy phân, hầu như không bị khử hay oxy hóa, có moment lưỡng cực lớn (~ 5D), dễ dàng kết hợp với mục tiêu sinh học thông qua liên kết hydro và tương tác lưỡng cực-lưỡng cực Nó có thể coi như là một nhóm liên kết (CU) được đưa vào cấu trúc nhằm tăng khả năng tương tác giữa nhóm khóa hoạt động với các amino acid bề mặt gần lối vào túi thân dầu của HDAC, đồng thời cải thiện dược động học và tăng tính chọn lọc với đích cụ thể, hạn chế độc tính của thuốc hơn so với khi sử dụng nhóm amid hay ceton [6]
Từ những kết quả nghiên cứu về HDAC, các chất ức chế HDAC cũng như về hóa học Click đã tạo nền tảng cho khóa luận tiếp cận hướng nghiên cứu thiết kế, tổng
hợp một số N-hydroxybutanamid/pentanamid mang khung
1-(triazol-4-yl)methylindolin-2-on với vòng 1,2,3-triazol là cầu nối Khóa luận hy vọng tìm ra các dẫn chất hydroxamic mới có tác dụng ức chế HDAC với hoạt tính kháng tế bào ung thư vượt trội
Trang 2717
CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1 Hóa chất
Dung môi, hoá chất dùng phân tích, kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn HPLC
Các dung môi, hóa chất dùng cho tổng hợp hóa học được nhập từ công ty Aldrich hoặc Merck Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp, không trải qua thêm bất kỳ quá trình tinh chế nào Bao gồm:
Các dung môi, hóa chất khác như: nước cất, N,N-dimethylformamid (DMF),
acetonitril (MeCN), dicloromethan (DCM), methanol (MeOH), acid acetic (AcOH), aceton, ethyl acetat, K2CO3, KI, NaCl, Na2SO4, NaOH, HCl, CuI, FeCl3…
2.1.2 Thiết bị, dụng cụ
- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC
- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 và 100 ml có nút mài, bình nón, bình chiết, phễu thủy tinh, pipet, ống đong, cốc có mỏ các loại
- Bình chạy sắc ký Camag
- Bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng
- Đèn tử ngoại VILBER LOURMAT bước sóng 254 nm và 366 nm
- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimadzu
- Máy cất quay chân không Buchi R-200
- Tủ lạnh, tủ sấy Memmert, máy siêu âm
- Máy Melting point apparatus Smp3 để xác định nhiệt độ nóng chảy
- Máy Cary 660 FTIR để xác định phổ IR
Trang 28- Kiểm tra độ tinh khiết
- Xác định cấu trúc của các chất vừa tổng hợp được
2.2.2 Thử tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được
Trang 2919
+ Phản ứng Click 1,2,3-triazol với tác nhân là dẫn chất của azid, xúc tác CuI + Một số phản ứng cơ bản khác
- Theo dõi tiến trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)
2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC (xác định thời điểm kết thúc phản ứng, độ tinh khiết của sản phẩm sau quá trình tinh chế) và xác định nhiệt độ nóng chảy
2.3.1.3 Xác định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được
Các chất sau khi được tổng hợp và đánh giá sơ bộ là tinh khiết được xác định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng
từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR)
- Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy Cary 660 FTIR tại bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội với kỹ thuật viên nén KBr, quét phổ trong vùng 4000-
400 cm-1 Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với
tỷ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không để loại bỏ hơi ẩm Ghi phổ ở độ phân giải 4 cm-1
- Phổ khối lượng (MS): được ghi bằng máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM tại Khoa Hóa - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, hoạt động theo phương pháp ion hóa phun bụi điện tử ESI, chế độ ESI(-)-MS, dung môi MeOH
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR): được ghi bằng máy Bruker AV-500tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300 K, dung môi
DMSO-d 6
2.3.2 Thử tác dụng sinh học
2.3.2.1 Thử tác dụng ức chế HDAC
Trang 3020
Tác dụng ức chế HDAC của dẫn chất tổng hợp được thử tại Khoa Dược trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc Enzym HDAC-2 được cung cấp bởi BPS Bioscience (San Diego, CA, USA) sử dụng bộ kit định lượng Fluoregenic HDAC
Assay Kit (BPS Bioscience)
Kết quả độ hấp thụ được đưa vào phần mềm excel tính toán thu được phần trăm trung bình mẫu thử gắn với HDAC Phần trăm này chuyển sang phần mềm GraphPad prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) để tính toán IC50 Độ lệch chuẩn tương đối không quá 10%
2.3.2.2 Thử độc tính tế bào
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người (thử độc tính tế bào) in vitro được tiến
hành tại Khoa Dược, Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc Dòng tế bào thử nghiệm: PC-3 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt), SW620 (tế bào ung thư đại tràng) và AsPC-1 (tế bào ung thư tuyến tuỵ) Các dòng tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB)
và được nuôi cấy trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò) Thử độc tính tế bào theo phương pháp Sulforhodamin B (SRB)
* Nguyên tắc thử
Dựa trên khả năng gắn thuốc nhuộm với các acid amin cơ bản của protein trong
tế bào, sử dụng phương pháp đo màu để tính tổng lượng protein, từ đó suy ra số lượng
tế bào
* Tính kết quả
Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy) Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 3 lần đo độc lập với độ khác nhau không quá 5% Giá trị IC50 được tính dựa theo phương pháp Probits
Trang 3121
CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 HÓA HỌC
3.1.1 Tổng hợp hóa học
Quá trình tổng hợp 5 chất VIa-d, X trong khóa luận được thực hiện theo sơ đồ quy
trình chung như sau:
Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung
2: Propargyl bromid, K 2 CO 3, KI, DMF, 50°C, 3 h
3,6: Acetonitril, CuI, 50°C, 4 h
4,7: NH 2 OH.HCl, NaOH, MeOH-H 2 O, -5°C, 30 phút
3.1.1.1 Tổng hợp nguyên liệu methyl 4-azidobutanoat (II)
Hợp chất II được tổng hợp từ methyl 4-bromobutanoat (I) bằng phản ứng thế
nucleophin với tác nhân NaN3 theo sơ đồ 3.2:
Trang 32- Cất quay chân không ở 60°C loại dung môi
- Phân tán cắn thu được vào 50 ml DCM
- Lọc bỏ tủa NaN3 và NaBr không tan
- Cất quay chân không ở 40°C loại dung môi
- Bảo quản sản phẩm trong ngăn mát tủ lạnh ở 0-5°C, đậy nút kín
Kết quả:
+ Cảm quan: Chất lỏng, màu vàng nhạt
+ Hiệu suất: 85,08% (0,73 g)
3.1.1.2 Tổng hợp nguyên liệu methyl 5-azidopentanoat (VIII)
Hợp chất VIII được tổng hợp từ methyl 5-bromopentanoat (VII) bằng phản ứng
thế nucleophin với tác nhân NaN3 theo sơ đồ 3.3:
Sơ đồ 3.3 Quy trình tổng hợp chất VIII
Chất VIII được tổng hợp từ 0,39 g (2,0 mmol) chất VII Quy trình tổng hợp được thực hiện tương tự như tổng hợp chất II Kết thu được như sau:
+ Cảm quan: Chất lỏng, màu vàng nhạt
+ Hiệu suất: 82,8% (0,26 g)
3.1.1.3 Tổng hợp dẫn chất yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)butanamid (VIa)
Trang 33N-hydroxy-4-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-23
a Tổng hợp chất IVa:
Tổng hợp chất 1-(prop-2-yn-1-yl)indolin-2,3-dion (IVa) từ nguyên liệu isatin (IIIa) qua phản ứng alkyl hóa với propargyl bromid có mặt xúc tác là K2CO3 và KI theo sơ đồ 3.4 sau:
Sơ đồ 3.4 Quy trình tổng hợp chất IVa
Tiến hành phản ứng:
- Hòa tan 0,29 g (2,0 mmol) chất IIIa vào 1,5 ml DMF khan trong bình cầu
sạch đáy tròn dung tích 50 ml; thêm 0,28 g (2,0 mmol) K2CO3
- Khuấy hỗn hợp trong bình ở 50ºC trong 1 h đến khi toàn bộ khối phản ứng đổi màu sẫm hoàn toàn
- Thêm 0,33 g (2,0 mmol) KI và 0,29 g (2,4 mmol) propargyl bromid vào bình phản ứng
- Tiếp tục tiến hành phản ứng trong 3 h vẫn ở 50ºC
- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là DCM:MeOH = 100:1
Xử lý phản ứng:
- Làm lạnh bình phản ứng
- Trung tính hóa hỗn hợp phản ứng bằng HCl 5% lạnh
- Thêm vào 40 ml nước cất lạnh để tạo tủa
- Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh
- Sấy khô tủa bằng tủ sấy ở 60ºC
Trang 3424
b Tổng hợp chất Va:
Điều chế chất methyl
4-(4-((2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)butanoat (Va) từ chất IVa thông qua phản ứng Click với chất II sử dụng xúc tác
là CuI Phản ứng theo sơ đồ 3.5 sau:
Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp chất Va
Tiến hành phản ứng:
- Hòa tan 0,19 g (1,0 mmol) chất IVa, 0,17 g (1,2 mmol) chất II và 0,19 g
(1,0 mmol) CuI vào 4,0 ml MeCN trong bình cầu sạch dung tích 50 ml
- Khuấy hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ 50oC trong 3 h
- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là DCM:MeOH = 10:1
Xử lý phản ứng:
- Cất quay chân không ở 60ºC loại dung môi MeCN
- Phân tán cắn vào 30 ml DCM, gia nhiệt đến 40ºC để hòa tan hết chất Va và
còn CuI không tan lắng ở đáy bình
- Lọc loại bỏ CuI, làm khan dịch lọc bằng Na2SO4
- Cất quay loại dung môi thu hỗn hợp 2 chất Va và II (có thể còn dư)
- Hòa tan cắn vào một lượng MeCN tối thiểu, thêm từ từ nước cất vào đến khi thấy tủa không tăng nữa thì dừng Để lạnh để ổn định tủa
- Gạn, lọc lấy tủa, rửa tủa với nhiều lần nước cất để loại chất II
- Sấy khô tủa bằng tủ sấy ở 60ºC
Trang 3525
Dẫn chất
N-hydroxy-4-(4-((3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)butanamid (VIa) được tổng hợp qua phản ứng tạo hydroxamic giữa
chất Va và hydroxylamin hydroclorid theo sơ đồ phản ứng 3.6 sau:
Sơ đồ 3.6 Quy trình tổng hợp dẫn chất VIa
Tiến hành phản ứng:
- Phân tán 0,20 g (0,6 mmol) chất Va và 0,42 g (6,0 mmol) NH2OH.HCl vào 5,0 ml MeOH trong bình cầu sạch dung tích 50 ml
- Làm lạnh bình phản ứng đến -5ºC bằng hỗn hợp đá muối
- Khuấy phân tán hỗn hợp trong bình phản ứng
- Chuẩn bị dung dịch NaOH bão hòa trong nước, đã được làm lạnh Chuyển
từ từ dung dịch NaOH vào bình phản ứng đến pH = 12
- Tiếp tục cho phản ứng thêm 30 phút ở -5ºC
- Theo dõi phản ứng bằng thuốc thử FeCl3 5% và TLC, tiến trình thực hiện như sau:
+ Lấy 0,05 ml dịch từ bình phản ứng lên khay sứ, acid hóa bằng dung dịch HCl 5% Nhỏ 1 giọt thuốc thử FeCl3 5% vào hỗn hợp trên, nếu thấy xuất hiện màu
đỏ vang chứng tỏ đã có sản phẩm acid hydroxamic
+ Acid hóa 0,05 ml dịch lấy từ bình phản ứng bằng dung dịch HCl loãng 5% trong vial, thêm ethyl acetat để chiết lấy sản phẩm Đưa pha dung môi hữu cơ lên bản mỏng Tiến hành TLC với pha động DCM:MeOH = 5:2 Phản ứng kết thúc khi
thấy vết ester Va đã mất đi hoàn toàn
Xử lý phản ứng:
- Trung tính hóa hỗn hợp trong bình phản ứng bằng HCl lạnh 5%
- Thêm vào 20 ml nước cất lạnh
- Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh
- Tinh chế sản phẩm:
Trang 3626
+ Kết tinh lại bằng hệ MeOH - H2O: Hòa tan sản phẩm thu được trong lượng MeOH tối thiểu Nhỏ từ từ nước cất vào cho đến khi bắt đầu xuất hiện tủa mịn và ổn định Để lạnh ở 0-5ºC trong 48 h
+ Lọc tủa, sấy ở 60ºC
Kết quả:
- Cảm quan: Chất rắn, màu vàng
- Hiệu suất: 53,3% (0,11 g)
- Nhiệt độ nóng chảy (tºnc) và Rf được trình bày trong bảng 3.2
- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5 và 3.6
3.1.1.4 Tổng hợp dẫn chất yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N-hydroxybutanamid (VIb)
4-(4-((5-fluoro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-Dẫn chất VIb được tổng hợp qua chuỗi các phản ứng được trình bày theo sơ đồ 3.7
Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hợp dẫn chất VIb.
ii) Acetonitril, CuI, 50°C, 3 h
iii) Hydroxylamin hydroclorid, NaOH, MeOH-H 2 O, -5°C, 30 phút.
a Tổng hợp chất IVb:
Trang 37Điều chế chất methyl
4-(4-((5-fluoro-2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)butanoat (Vb) từ chất IVb thông qua phản ứng Click với chất II sử dụng
4-(4-((5-fluoro-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N-hydroxybutanamid (VIb) được tổng hợp qua phản ứng tạo
hydroxamic giữa chất Vb và hydroxylamin hydroclorid
Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng 0,21 g (0,6 mmol) chất Vb
Trang 3828
Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng hệ
dung môi kết tinh lại là MeOH - H2O
Kết quả:
- Cảm quan: Chất rắn, màu vàng
- Hiệu suất: 55,3% (0,12 g)
- Nhiệt độ nóng chảy (tºnc) và Rf được trình bày trong bảng 3.2
- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5 và 3.6
3.1.1.5 Tổng hợp dẫn chất yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N-hydroxybutanamid (VIc)
4-(4-((5-bromo-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-Dẫn chất VIc được tổng hợp theo các phản ứng trình bày trong sơ đồ 3.8:
Sơ đồ 3.8 Quy trình tổng hợp dẫn chất VIc.
ii) Acetonitril, CuI, 50°C, 3 h
iii) Hydroxylamin hydroclorid, NaOH, MeOH-H 2 O, -5°C, 30 phút.
Trang 39Điều chế chất methyl
4-(4-((5-bromo-2,3-dioxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)butanoat (Vc) từ chất IVc thông qua phản ứng Click với chất II sử dụng
4-(4-((5-bromo-3-(hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N-hydroxybutanamid (VIc) được tổng hợp qua phản ứng tạo
hydroxamic giữa chất Vc và hydroxylamin hydroclorid
Tiến hành phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng 0,24 g (0,6 mmol) chất Vc
Xử lý phản ứng: Tiến hành tương tự quá trình tổng hợp chất VIa, sử dụng hệ
dung môi kết tinh lại là MeOH - H2O
Kết quả:
- Cảm quan: Chất rắn, màu vàng
- Hiệu suất: 51,3% (0,13 g)
Trang 4030
- Nhiệt độ nóng chảy (tºnc) và Rf được trình bày trong bảng 3.2
- Xác định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể trong bảng 3.3, 3.4, 3.5, 3.6
3.1.1.6 Tổng hợp dẫn chất oxoindolin-1-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)butanamid (VId)
N-hydroxy-4-(4-((3-(hydroxyimino)-5-methoxy-2-Dẫn chất VId được tổng hợp theo các phản ứng trình bày trong sơ đồ 3.9:
Sơ đồ 3.9 Quy trình tổng hợp dẫn chất VId
ii) Acetonitril, CuI, 50°C, 3 h
iii) Hydroxylamin hydroclorid, NaOH, MeOH-H 2 O, -5°C, 30 phút.