Bào chế hệ tiểu phân nano artemisinin và đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét trên chuột

MỞ ĐẦU Trong vài thập kỉ gần đây, công nghệ nano đã, đang phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau. Công nghệ nano tạo nên các tiểu phân hoặc cấu trúc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm. Tuy nhiên, trong dược phẩm, tiểu phân nano bao gồm cả những tiểu phân có kích thước từ 1 nm đến 1 µm được ứng dụng để chuyển giao hoạt chất đến nơi tác động [147]. Với cấu trúc được thiết kế đặc biệt, tiểu phân nano có ưu điểm nổi trội như bảo vệ hoạt chất, tăng tính thấm thuốc qua hàng rào sinh học, giải phóng hoạt chất có kiểm soát, phóng thích tại đích và bảo vệ mô lành, tránh sự đa đề kháng thuốc. Hoạt chất được nghiên cứu thuộc nhiều nhóm dược lý, gồm các chất có tác dụng kháng ung thư, chống thải ghép, tiểu đường hay diệt ký sinh trùng,... Trong nhóm diệt ký sinh trùng phải kể đến thuốc điều trị sốt rét – đặc biệt là artemisinin (ART) và dẫn chất – vì chúng có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát bệnh. ART và dẫn chất đã được WHO đưa vào phác đồ điều trị sốt rét từ năm 2001, cho đến nay vẫn chưa có chất mới nào có thể thay thế được. Tu Youyou – nhà khoa học phát minh ART – nhận giải Nobel năm 2015 cùng với Satoshi Omura và William Campbell đã nói lên giá trị khoa học, giá trị thực tiễn và tính thời sự của ART. Hạn chế của ART do tính chất rất kém tan (thực tế không tan) trong nước và cũng rất ít tan trong dầu [2], [149] ảnh hưởng tới sinh khả dụng của thuốc. Hiện nay, vẫn còn khoảng 3,2 tỉ dân số thế giới có nguy cơ mắc bệnh sốt rét. Năm 2015 có khoảng 214 triệu trường hợp mới mắc và 438.000 trường hợp tử vong do sốt rét [153]. Ở nhiều khu vực, ký sinh trùng Plasmodium falciparum đề kháng lan rộng với cloroquin, quinin dẫn đến thất bại điều trị và tăng tỉ lệ tử vong [150], [152]. Một trong những nguyên nhân gây đề kháng là do tính chất của hoạt chất như kém tan, kém bền nên sinh khả dụng thấp hay thời gian bán thải ngắn khiến nồng độ thuốc không đạt yêu cầu điều trị. Trong khi đó, quá trình phát minh hoạt chất mới có tác dụng trên ký sinh trùng cần rất nhiều thời gian và chi phí, đến nay các nghiên cứu vẫn trong giai đoạn thử nghiệm. Vì những trở ngại này, trong kế hoạch ngăn chặn sự đề kháng của ký sinh trùng sốt rét trên toàn cầu, WHO đã chọn cải tiến kỹ thuật là giải pháp được ưu tiên hàng đầu nhằm bảo vệ hiệu quả điều trị của ART và dẫn chất [151]. Giải pháp được quan tâm hiện nay là ứng dụng công nghệ nano trong kỹ thuật bào chế [118]. Khi đó, quá trình đến đích sinh học của hoạt chất không còn phụ thuộc vào tính chất lý hóa của hoạt chất mà phụ thuộc phần lớn vào kích thước, hình dạng, tính chất bề mặt,... của tiểu phân. Bào chế hệ tiểu phân nano lipid nhằm cải thiện độ tan và khả năng phân tán của ART trong môi trường để có thể sử dụng bằng đường uống hoặc tiêm tĩnh mạch, từ đó cải thiện sự hấp thu và sinh khả dụng cũng như kiểm soát quá trình phóng thích hoạt chất, tăng thời gian tác dụng của thuốc nhằm hạn chế sự đề kháng [34], [121]. Với mục đích đó, đề tài “Bào chế hệ tiểu phân nano artemisinin và đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét trên chuột” được thực hiện với các nội dung nghiên cứu sau:  Đánh giá sự tương tác giữa hỗn hợp lipid (Compritol ® 888 ATO – Labrafac TM PG) và ART.  Xây dựng công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART.  Đánh giá tính chất của hệ tiểu phân nano ART.  Đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét của hệ tiểu phân nano ART trên chuột gây nhiễm Plasmodium berghei.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHƯU MỸ LỆ

BÀO CHẾ HỆ TIỂU PHÂN NANO ARTEMISININ

VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG DIỆT KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT TRÊN CHUỘT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2017

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt, bảng đối chiếu thuật ngữ Anh – Việt

Danh mục các bảng, hình, biểu đồ và sơ đồ

MỞ ĐẦU 1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tình hình nghiên cứu và thành tựu của công nghệ nano 4

1.2 Khái niệm và phân loại tiểu phân nano trong ngành dược 7

1.3 Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano lipid 9

1.4 Phương pháp phân tích tính chất của hệ tiểu phân nano lipid 16

1.5 Các tá dược dùng trong bào chế hệ tiểu phân nano ART 25

1.6 Artemisinin và nghiên cứu ứng dụng trong điều trị sốt rét 27

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Đối tượng nghiên cứu 37

2.2 Phương pháp nghiên cứu 39

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 59

3.1 Kết quả đánh giá sự tương tác giữa hỗn hợp lipid (Compritol 888® ATO – LabrafacTM PG) và ART 59

3.2 Kết quả xây dựng công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART 65

3.3 Kết quả đánh giá tính chất của hệ tiểu phân nano ART 92

3.4 Kết quả đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét của hệ tiểu phân nano ART

trên chuột gây nhiễm P berghei 122

Chương 4 BÀN LUẬN 127

4.1 Tương tác giữa hỗn hợp lipid (Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG) và ART 1274.2 Công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART 1284.3 Tính chất của hệ tiểu phân nano ART 1364.4 Tác động diệt ký sinh trùng sốt rét của hệ tiểu phân nano ART trên chuột gây

nhiễm Plasmodium berghei 142

KẾT LUẬN 144 KIẾN NGHỊ 146 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFM Atomic force microscopy

ACTs Artemisinin – based combination therapies

ARTs Artemisinin and its derivatives

DSC Differential scanning calorimetry

HPH High pressure homogenization

HPLC High performance liquid chromatography

HSNH Hiệu suất nang hóa

PdI Poly dispersity index

PEG Polyethylen glycol

PN Pha nước

PTHC Phóng thích hoạt chất

PTNH Phần trăm nang hóa

RESS Rapid expansion from supercritical solutions

SAS Supercritical antisolvent

SEM Scanning electron microscopy

SLN Solid lipid nanoparticles

TEM Transmission electron microscope

BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ ANH – VIỆT

Artemisinin and its derivatives Artemisinin và dẫn chất

Artemisinin – based combination therapies Các liệu pháp phối hợp dựa vào

artemisinin Atomic force microscopy Phương pháp kính hiển vi lực

nguyên tử

Differential scanning calorimetry Quét nhiệt vi sai

High pressure homogenization Đồng nhất hóa áp suất cao

High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nanostructured lipid carriers Giá mang lipid cấu trúc nano Photon correlation spectroscopy Phổ tương quan photon

Rapid expansion from supercritical solutions Khuếch trương nhanh từ dung

dịch siêu tới hạn

Scanning electron microscopy Phương pháp kính hiển vi điện

tử quét Solid lipid nanoparticles Tiểu phân nano lipid rắn

Supercritical antisolvent Đối kháng dung môi siêu tới hạn Transmission electron microscopy Phương pháp kính hiển vi điện

tử truyền qua

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Số lượng công bố về vật liệu nano ở một số nước ASEAN và Nhật 5

Bảng 1.2 Một số chế phẩm thuốc nano đang lưu hành trên thị trường 6

Bảng 1.3 Một số lipid lớp đơn và dầu dùng trong bào chế tiểu phân nano lipid 10

Bảng 1.4 Ưu nhược điểm của các phương pháp bào chế tiểu phân nano 15

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 37

Bảng 2.2 Hóa chất và dung môi nghiên cứu 37

Bảng 2.3 Trang thiết bị nghiên cứu 38

Bảng 2.4 Thành phần công thức bào chế tiểu phân nano ART 42

Bảng 2.5 Các mức của yếu tố khảo sát 46

Bảng 3.1 Thể chất của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG 59

Bảng 3.2 Nhiệt độ tan chảy của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG và lượng ART khác nhau 64

Bảng 3.3 Thành phần các công thức bào chế hệ tiểu phân nano 65

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát một số tính chất của hệ tiểu phân nano 65

Bảng 3.5 Thông số KTTP của CT 6 68

Bảng 3.6 Thành phần công thức với chất diện hoạt polysorbat 80 69

Bảng 3.7 Thông số KTTP của mẫu 25, 26 và 27 69

Bảng 3.8 Thành phần công thức với hỗn hợp chất diện hoạt polysorbat 80 – Gelucire® 50/13 71

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá một số tính chất của mẫu 19, 20 và 21 71

Bảng 3.10 Thông số KTTP của mẫu 19, 20 và 21 71

Bảng 3.11 Thành phần công thức với hỗn hợp polysorbat 80 - phosphatidylcholin 73 Bảng 3.12 Kết quả đánh giá một số tính chất của CT 22, 23 và 24 73

Bảng 3.13 Thông số KTTP của CT 22, 23 và 24 75

Bảng 3.14 Thành phần các công thức phối hợp phosphatidylcholin 75

Bảng 3.15 Kết quả đánh giá một số tính chất của CT 16, 17 và 18 76

Bảng 3.16 Thông số KTTP của CT 17 và 18 77

Bảng 3.17 Thành phần công thức với hỗn hợp chất diện hoạt polysorbat 80 – SimulsolTM 4000 P 78

Bảng 3.18 Thông số KTTP của CT 28, 29 và 30 80

Bảng 3.19 Thông số KTTP của mẫu đồng nhất hóa bằng HPH 82

Bảng 3.20 Thông số KTTP của mẫu sau khi tăng áp suất đồng nhất hóa 84

Bảng 3.21 Tính chất của các hệ tiểu phân có hàm lượng ART khác nhau 85

Bảng 3.22 Các mức của yếu tố khảo sát 87

Bảng 3.23 Ma trận bố trí thí nghiệm và kết quả 87

Bảng 3.24 KTTP của 6 TN ở điều kiện cơ bản 88

Bảng 3.25 Kích thước tiểu phân TB của thí nghiệm tiến đến vùng gần dừng 89

Bảng 3.26 Thông số KTTP của các lô kiểm chứng 90

Bảng 3.27 Sự thay đổi KTTP trong quá trình khảo sát 91

Bảng 3.28 Thông số kích thước của hệ tiểu phân nano ART 92

Bảng 3.29 Các thông số sắc ký của thẩm định tính tuyến tính 97

Bảng 3.30 Các thông số thẩm định độ lặp lại 98

Bảng 3.31 Các thông số sắc ký của ART 99

Bảng 3.32 Các thông số thẩm định độ đúng 99

Bảng 3.33 Hàm lượng % và hiệu suất nang hóa của hệ tiểu phân nano ART 100

Bảng 3.34 Dữ liệu lượng hoạt chất phóng thích của hệ tiểu phân nano ART 101

Bảng 3.35 Thành phần công thức bào chế hệ tiểu phân nano ART 102

Bảng 3.36 Tiêu chuẩn nguyên liệu của công thức bào chế hệ tiểu phân nano ART 103

Bảng 3.37 Chỉ tiêu chất lượng của hệ tiểu phân nano ART 103

Bảng 3.38 Thông số KTTP của hệ tiểu phân nano ART các lô nâng cấp 109

Bảng 3.39 Hàm lượng %, PTNH và HSNH của lô nâng cấp 111

Bảng 3.40 Lượng hoạt chất phóng thích của lô nâng cấp 112

Bảng 3.41 Tính chất của hệ tiểu phân lô nâng cấp 113

Bảng 3.42 Bảng tóm tắt tính chất của tiểu phân lô tối ưu và lô nâng cấp 113

Bảng 3.43 Kết quả tính chất cảm quan của hệ tiểu phân nano không chứa ART 114

Bảng 3.44 Thông số KTTP của hệ tiểu phân nano không chứa ART ở 6 ± 2 oC 115

Bảng 3.45 Giá trị p so sánh KTTP của hệ tiểu phân nano không chứa ART theo thời gian bảo quản với tháng 0 115

Bảng 3.46 Tính chất cảm quan của hệ tiểu phân nano ART ở 6 ± 2 oC 116

Bảng 3.47 Giá trị p so sánh KTTB của hệ tiểu phân nano ART ở 6 ± 2 oC 116

Bảng 3.48 KTTP và HSNH của hệ tiểu phân nano ART ở 6 ± 2 oC 117

Bảng 3.49 Tính chất cảm quan của hệ tiểu phân ART ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH 119 Bảng 3.50 Giá trị p so sánh kích thước của hệ tiểu phân nano ART theo thời gian bảo quản với tháng 0 ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH 119

Bảng 3.51 KTTP và HSNH của hệ tiểu phân nano ART ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH 120

Bảng 3.52 Mật độ KST (KST/vi trường) của lô chứng âm và các lô điều trị 122

Bảng 3.53 Giá trị p đánh giá mật độ KST giữa lô chứng âm và lô điều trị 123

Bảng 3.54 Tỉ lệ giảm mật độ KST trong máu chuột giữa lô chứng âm và lô điều trị 124

Bảng 3.55 Thời gian sống sót của chuột lô chứng âm và các lô điều trị (ngày 35) 125 Bảng 3.56 Thời gian sạch KST trong máu chuột của các lô điều trị (ngày 35) 125

Bảng 3.57 Thời gian duy trì tình trạng sạch KST trong máu chuột của các lô điều trị (ngày 35) 126 Bảng 4.1 Kích thước của tiểu phân nano ART ở các áp suất và chu kỳ khác nhau135

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Tỉ lệ bằng sáng chế trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe của một số quốc gia

trên thế giới (a) và tỉ lệ bằng sáng chế trong các lĩnh vực ứng dụng (b) 5

Hình 1.2 Cấu tạo SLN (a), NLC dạng I (b), NLC dạng II (c) và NLC dạng III (d) 9

Hình 1.3 Hình minh họa cấu tạo (a) và cơ chế hoạt động (b) của máy HPH 13

Hình 1.4 Các phương pháp đo kích thước và vùng kích thước phù hợp 17

Hình 1.5 Vị trí định vị hoạt chất nang hóa ở tiểu phân 22

Hình 1.6 Hình minh họa sự giải phóng hoạt chất qua túi thẩm tách 24

Hình 1.7 Hình minh họa tế bào Franz 24

Hình 1.8 Công thức hóa học của artemisinin 27

Hình 3.1 Hình ảnh tiểu phân của CT 13 quan sát bằng KHV (x 100) 66

Hình 3.2 Hình ảnh tiểu phân của CT 12 quan sát bằng KHV (x 100) 66

Hình 3.3 Hình ảnh tiểu phân của CT 9 quan sát bằng KHV (x 100) 67

Hình 3.4 Hình ảnh tiểu phân của CT 6 quan sát bằng KHV (x 100) 67

Hình 3.5 Hình ảnh tiểu phân nano ART chụp bằng TEM (x 50.000) 94

Hình 3.6 Hình ảnh tiểu phân của lô nâng cấp chụp bằng TEM (x 30.000) 110

Hình 3.7 Hình ảnh tiểu phân ART sau 3 tháng bảo quản ở 6 ± 2 oC (x 50.000) 118

Hình 3.8 Hình ảnh tiểu phân ART sau 6 tháng bảo quản ở 6 ± 2 oC (x 30.000) 118

Hình 3.9 Hình ảnh tiểu phân sau 4 tháng bảo quản ở 30 ± 2 oC / 75 ± 5% RH (x 30.000) 121

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Biểu đồ nhiệt (a) Compritol® 888 ATO, (b) hỗn hợp Compritol® 888

ATO – LabrafacTM PG (7 : 3) 60

Biểu đồ 3.2 Biểu đồ nhiệt độ chảy của Compritol® 888 ATO và các hỗn hợp lipid 61 Biểu đồ 3.3 Biểu đồ nhiệt của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG – ART 62 Biểu đồ 3.4 Biểu đồ nhiệt độ tan chảy của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG và lượng ART khác nhau 63

Biểu đồ 3.5 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của CT 6 68

Biểu đồ 3.6 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của CT 25 (a), 27 (b) và 26 (c) 70

Biểu đồ 3.7 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân CT 20 (a), CT 21 (b) và 19 (c) 72

Biểu đồ 3.8 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân CT 22 (a), 24 (b) và 23 (c) 74

Biểu đồ 3.9 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của CT 18 (a) và 17 (b) 76

Biểu đồ 3.10 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của CT 30 (a), 28 (b) và 29 (c) 79

Biểu đồ 3.11 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của mẫu HPH 500 bar 10 chu kỳ 81 Biểu đồ 3.12 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân sau HPH 800 bar 10 chu kỳ (a), 1.000 bar 10 chu kỳ (b) và 1.100 bar 5 chu kỳ (c) 83

Biểu đồ 3.13 Biểu đồ hiệu suất nang hóa của các hệ tiểu phân nano ART 86

Biểu đồ 3.14 Biểu đồ so sánh các thông số KTTP của các mẫu khảo sát 91

Biểu đồ 3.15 Biểu đồ phân bố kích cỡ của hệ tiểu phân nano ART 93

Biểu đồ 3.16 Biểu đồ phân bố thế zêta của hệ tiểu phân nano ART 94

Biểu đồ 3.17 Sắc ký đồ HPLC của ART (a) mẫu chuẩn và (b) mẫu thử 95

Biểu đồ 3.18 Sắc ký đồ (a) pha động (b) mẫu bào chế không chứa ART (c) mẫu chứa ART và (d) mẫu không chứa ART thêm chuẩn 96

Biểu đồ 3.19 Đồ thị biểu thị tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh 97

Biểu đồ 3.20 Lượng hoạt chất phóng thích của hệ tiểu phân nano ART 101

Biểu đồ 3.21 Biểu đồ phân bố kích cỡ tiểu phân của lô nâng cấp 108

Biểu đồ 3.22 Biểu đồ phân bố thế zêta của lô nâng cấp 110

Biểu đồ 3.23 Lượng hoạt chất phóng thích của tiểu phân nano ART lô nâng cấp 112 Biểu đồ 3.24 Biểu đồ lượng hoạt chất phóng thích của lô tối ưu và nâng cấp 114

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ các phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano 11

Sơ đồ 1.2 Các phương pháp xác định kích thước tiểu phân 16

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ các bước bào chế hệ tiểu phân nano ART 45

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART 106

MỞ ĐẦU

Trong vài thập kỉ gần đây, công nghệ nano đã, đang phát triển mạnh mẽ và được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau Công nghệ nano tạo nên các tiểu phân hoặc cấu trúc có kích thước từ 1 nm đến 100 nm Tuy nhiên, trong dược phẩm, tiểu phân nano bao gồm cả những tiểu phân có kích thước từ 1 nm đến 1 µm được ứng dụng

để chuyển giao hoạt chất đến nơi tác động [147] Với cấu trúc được thiết kế đặc biệt, tiểu phân nano có ưu điểm nổi trội như bảo vệ hoạt chất, tăng tính thấm thuốc qua hàng rào sinh học, giải phóng hoạt chất có kiểm soát, phóng thích tại đích và bảo vệ mô lành, tránh sự đa đề kháng thuốc

Hoạt chất được nghiên cứu thuộc nhiều nhóm dược lý, gồm các chất có tác dụng kháng ung thư, chống thải ghép, tiểu đường hay diệt ký sinh trùng, Trong nhóm diệt ký sinh trùng phải kể đến thuốc điều trị sốt rét – đặc biệt là artemisinin (ART)

và dẫn chất – vì chúng có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát bệnh ART và dẫn chất đã được WHO đưa vào phác đồ điều trị sốt rét từ năm 2001, cho đến nay vẫn chưa có chất mới nào có thể thay thế được Tu Youyou – nhà khoa học phát minh ART – nhận giải Nobel năm 2015 cùng với Satoshi Omura và William Campbell đã nói lên giá trị khoa học, giá trị thực tiễn và tính thời sự của ART Hạn chế của ART

do tính chất rất kém tan (thực tế không tan) trong nước và cũng rất ít tan trong dầu [2], [149] ảnh hưởng tới sinh khả dụng của thuốc

Hiện nay, vẫn còn khoảng 3,2 tỉ dân số thế giới có nguy cơ mắc bệnh sốt rét Năm

2015 có khoảng 214 triệu trường hợp mới mắc và 438.000 trường hợp tử vong do

sốt rét [153] Ở nhiều khu vực, ký sinh trùng Plasmodium falciparum đề kháng lan

rộng với cloroquin, quinin dẫn đến thất bại điều trị và tăng tỉ lệ tử vong [150], [152] Một trong những nguyên nhân gây đề kháng là do tính chất của hoạt chất như kém tan, kém bền nên sinh khả dụng thấp hay thời gian bán thải ngắn khiến nồng độ thuốc không đạt yêu cầu điều trị Trong khi đó, quá trình phát minh hoạt chất mới

có tác dụng trên ký sinh trùng cần rất nhiều thời gian và chi phí, đến nay các nghiên cứu vẫn trong giai đoạn thử nghiệm Vì những trở ngại này, trong kế hoạch ngăn

chặn sự đề kháng của ký sinh trùng sốt rét trên toàn cầu, WHO đã chọn cải tiến kỹ thuật là giải pháp được ưu tiên hàng đầu nhằm bảo vệ hiệu quả điều trị của ART và dẫn chất [151]

Giải pháp được quan tâm hiện nay là ứng dụng công nghệ nano trong kỹ thuật bào chế [118] Khi đó, quá trình đến đích sinh học của hoạt chất không còn phụ thuộc vào tính chất lý hóa của hoạt chất mà phụ thuộc phần lớn vào kích thước, hình dạng, tính chất bề mặt, của tiểu phân Bào chế hệ tiểu phân nano lipid nhằm cải thiện độ tan và khả năng phân tán của ART trong môi trường để có thể sử dụng bằng đường uống hoặc tiêm tĩnh mạch, từ đó cải thiện sự hấp thu và sinh khả dụng cũng như kiểm soát quá trình phóng thích hoạt chất, tăng thời gian tác dụng của thuốc nhằm

hạn chế sự đề kháng [34], [121] Với mục đích đó, đề tài “Bào chế hệ tiểu phân nano artemisinin và đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét trên chuột”

được thực hiện với các nội dung nghiên cứu sau:

 Đánh giá sự tương tác giữa hỗn hợp lipid (Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG) và ART

 Xây dựng công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART

 Đánh giá tính chất của hệ tiểu phân nano ART

 Đánh giá tác động diệt ký sinh trùng sốt rét của hệ tiểu phân nano ART trên

chuột gây nhiễm Plasmodium berghei

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1 Xác định được tỉ lệ của hỗn hợp Compritol® 888 ATO – LabrafacTM PG – ART nhằm thu được pha dầu đồng nhất cho công thức điều chế hệ tiểu phân nano ART thông qua khảo sát, đánh giá sự thay đổi về nhiệt độ tan chảy của Compritol® 888 ATO và sự hiện diện của ART trong biểu đồ nhiệt DSC

2 Xác định thành phần công thức và quy trình bào chế hệ tiểu phân nano ART ở quy mô phòng thí nghiệm (100 g), làm cơ sở để nâng cỡ mẫu bào chế lên 1.000 g bằng phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao nhiệt độ cao

3 Xác định được kích thước, hình thể học, thế zêta, phần trăm nang hóa, hiệu suất nang hóa và độ ổn định của hệ tiểu phân nano ART, từ đó xây dựng tiêu chuẩn cho sản phẩm nghiên cứu

4 Đánh giá hiệu quả điều trị của hệ tiểu phân nano ART trên chuột gây nhiễm

Plasmodium berghei thông qua các chỉ tiêu: Mật độ ký sinh trùng, tỉ lệ giảm mật

độ ký sinh trùng, thời gian sạch ký sinh trùng và thời gian duy trì tình trạng sạch

ký sinh trùng trong máu chuột bằng cách so sánh với nhóm chứng dương

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu và thành tựu của công nghệ nano 1.1.1 Thành tựu của công nghệ nano trên thế giới

Năm 2000, Mỹ là quốc gia đầu tiên thành lập hiệp hội chuyên trách về công nghệ nano, đó là Hiệp hội Công nghệ nano quốc gia (National Nanotechnology Initiative, NNI) [44], [117] Theo NNI, công nghệ nano là kỹ thuật kiểm soát kích thước của vật chất từ 1 nm đến 100 nm, khi đó, tính chất mới hình thành tạo nên ứng dụng mới Công nghệ nano kết hợp lý thuyết khoa học về nano, thiết bị và công nghệ để thao tác, chế tạo và ứng dụng vật chất ở kích thước nm [83], [119]

Lux Research ước tính tổng ngân sách dành cho công nghệ nano trên toàn cầu khoảng 18,5 tỉ USD, với doanh thu khoảng 731 tỉ USD trong năm 2012, con số này

có thể đạt 4,4 nghìn tỉ USD vào 2018 Công nghệ nano hướng đến các lĩnh vực: Điều trị, phòng ngừa nhằm giảm tỉ lệ tử vong hay ngăn ngừa ung thư

Cơ quan mới để thay thế bộ phận bị bệnh trong cơ thể

Miếng dán qua da, bộ phận cảm biến và cảnh báo mức đường huyết

Hệ thống lọc nước di động để nước sạch đến được khắp nơi trên toàn thế giới Cung cấp năng lượng, lưu trữ thông tin, cảnh báo ô nhiễm, [86], [129] Lượng công bố về công nghệ nano trong chăm sóc sức khỏe chiếm 4% với 6 lĩnh vực chính Đầu tiên là hệ phân phối thuốc (drug delivery) nhằm cải thiện sinh khả dụng và dược động học của thuốc, gồm liposome, tiểu phân polyme, tinh thể nano, Hai là, thuốc và liệu pháp (drugs and therapy) với hoạt chất kích thước nano

như dendrimers Tiếp đến là chế tạo tác nhân chẩn đoán hình ảnh in vivo và in vitro (in vivo imaging, in vitro diagnostics) như oxid sắt từ, ống nano Ngoài ra còn có

vật liệu sinh học kích thước nano dùng trong nha khoa hay cấy phóng xạ (active implants) tiểu phân từ tính dùng cho MRI [43], [159] Trong đó, hệ phân phối thuốc chiếm trọng tâm nghiên cứu khi có 59% bằng sáng chế (Hình 1.1b) Mỹ có nhiều nghiên cứu nhất với 32% lượng công bố và 54% bằng sáng chế (Hình 1.1a) [141]

Hình 1.1 Tỉ lệ bằng sáng chế trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe của một số quốc gia

trên thế giới (a) và tỉ lệ bằng sáng chế trong các lĩnh vực ứng dụng (b)

"Nguồn: Wagner V, 2006" [141]

Tại Châu Á, số liệu liên quan đến lĩnh vực dược phẩm chưa được thống kê Tuy nhiên, ở lĩnh vực vật liệu nano, Nhật và các thành viên ASEAN đã có những đóng góp đáng kể Nhật có nhiều nghiên cứu được công bố nhất (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Số lượng công bố về vật liệu nano ở một số nước ASEAN và Nhật

Quốc gia Nhật Singapore Malaysia Thái Lan Việt Nam Indonesia

"Nguồn: Tanthapanichakoon W, 2014" [133]

1.1.2 Thành tựu của công nghệ nano trong nước

Mặc dù chậm hơn so với thế giới nhưng Việt Nam cũng đã có những công bố về các nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực vật liệu nano (Bảng 1.1) [133] Ngoài các bài báo được đăng tải trên các website nước ngoài, còn có các nghiên cứu được công bố trong các hội nghị và tạp chí chuyên ngành trong nước Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu về bào chế hệ tiểu phân nano artemisinin được công bố

1.1.3 Các chế phẩm thuốc của công nghệ nano đang có trên thị trường

Một số sản phẩm thuốc ứng dụng công nghệ nano trong bào chế đang lưu hành trên thị trường được nêu trong Bảng 1.2 [41], [106]

Bảng 1.2 Một số chế phẩm thuốc nano đang lưu hành trên thị trường

Abraxane Paclitaxel Liên kết protein Hỗn dịch tiêm truyền Ung thư di căn

Abelcet Amphotericin B Liposome Hỗn dịch tiêm truyền Nhiễm nấm

Adagen Adenosin

deaminase Gắn kết polyme PEG Dung dịch tiêm bắp

Liệu pháp thay thế enzym

AmBisome Amphotericin B Liposome Bột đông khô tiêm

truyền tĩnh mạch Nhiễm nấm Amphotec Amphotericin B Liposome Bột đông khô tiêm IV Nhiễm nấm

Avinza Morphin sulfat Tinh thể nano Viên nang PTKD Đau mãn tính vừa - nặng DaunoXome Daunorubicin Liposome Hỗn dịch tiêm truyền Ung thư

DepoCyt Cytarabin Liposom PTKD Hỗn dịch tiêm Ung thư

Depodur Morphin sulfat Liposome Hỗn dịch tiêm Đau mãn tính vừa - nặng Doxil/CaelyX Doxorubicin Liposome Hỗn dịch, tiêm truyền Ung thư

Emend Aprepitant Tinh thể nano Bột tiêm truyền Nôn, buồn nôn do hóa trị Estrasorb Estradiol Micell Nhũ tương, ngoài da Hội chứng tiền mãn kinh Fosrenol Lanthanum

carbonat Tiểu phân nano vô cơ

Viên nén (có thể nhai) Bệnh thận giai đoạn cuối Genexol-PM Paclitaxel Micell polyme Dung dịch, tiêm IV Ung thư

Myocet Doxorubicin

citrat Liposom

Bột đông khô, tiêm truyền Ung thư Megace ES Megestrol Tinh thể nano Hỗn dịch uống Ung thư

Naprelan Naproxen Tinh thể nano Viên nén Viêm khớp mãn tính Nanoxel Paclitaxel Tiểu phân nano

polyme Dung dịch tiêm Ung thư Neulasta Filgrastim Gắn kết với polyme

Dung dịch, tiêm bắp hoặc tiêm tĩnh mạch Ung thư Pegasys Peginterferon

alfa 2a

Gắn kết với polyme PEG

Dung dịch, tiêm dưới

PegIntron Peginterferon

alfa 2b

Gắn kết với polyme PEG

Bột đông khô, tiêm dưới da Viêm gan C mãn tính Rapamune Sirolimus Tinh thể nano Viên nén Ức chế miễn dịch Somavert Pegvisomant Phức hợp protein

Tricor ® Fenofibrat Tinh thể nano Viên nén Lipid máu cao

Triglide ® Fenofibrat Tinh thể nano Viên nén Lipid máu cao

Megace ES ® Megestrol Hỗn dịch nano Hỗn dịch uống Suy yếu, sụt cân trên

bệnh nhân AIDS Norvir ® Ritonavir Vi nhũ tương Nhũ tương uống HIV

Sandimmune

Neoral ® Cyclosporin Vi nhũ tương Nhũ tương uống Thải ghép khi cấy ghép cơ quan Diazepam-

Lipuro Diazepam Nhũ tương nano Nhũ tương uống Mất ngủ, lo âu

"Nguồn: Desai PP, 2012 Nijhara R, 2006 Wagner V, 2006" [41], [106], [141]

1.2 Khái niệm và phân loại tiểu phân nano trong ngành dược 1.2.1 Khái niệm tiểu phân nano trong ngành dược

Trong dược phẩm, tiểu phân nano được định nghĩa là hạt phân tán (particulate dispersion) có kích thước từ 1 nm đến 1 µm [39], [147]

Tiểu phân nano lipid là tiểu phân nano cấu tạo bởi lớp màng lipid bao quanh lõi lipid ở trạng thái rắn, lỏng hoặc hỗn hợp rắn – lỏng; hoạt chất được hòa tan, phân tán trong lipid hoặc gắn kết trên bề mặt tiểu phân [47]

1.2.2 Phân loại tiểu phân nano trong ngành dược

Theo thành phần cấu tạo, tiểu phân nano bao gồm: tiểu phân nano vô cơ, polyme và tiểu phân nano lipid Ngoài ra, còn có tinh thể nano, là dạng cấu trúc đặc biệt vì không có chất mang [47], [134] Trong phạm vi nghiên cứu, đề tài chỉ tổng hợp các thông tin về tiểu phân nano lipid Đây là tiểu phân được ứng dụng nhiều trong phân phối thuốc nhờ tính tương thích sinh học của tá dược [146], [160]

1.2.3 Một số tiểu phân nano lipid ứng dụng trong bào chế dược phẩm 1.2.3.1 Micelle

Micelle gồm lipid hoặc các phân tử thân nước khác như polyme hoặc polyamino acid, được hình thành do sự tự sắp xếp của các phân tử có khối lượng phân tử thấp với đầu kỵ nước hướng vào trong tạo thành lipid lớp đơn có lõi thân dầu, kích thước

từ 10 – 100 nm Micelle đảo tạo thành từ sự tự sắp xếp của chất diện hoạt trong dung môi hữu cơ (đầu kỵ nước hướng ra môi trường) [20], [48]

1.2.3.2 Liposome

Liposome tạo thành do sự sắp xếp của phospholipid theo trình tự đuôi thân nước hướng vào trong đầu kỵ nước hướng ra ngoài Vì vậy, lõi liposome chứa chất tan trong nước, đặc biệt là protein và peptid Màng phospholipid mang hoạt chất thân dầu vì đó là lipid lớp kép Phospholipid màng có một hoặc nhiều lớp kép của lipid thân nước Kích thước của liposome từ 20 nm đến vài µm [134], [138]

1.2.3.3 Vi nhũ tương (microemulsion)

Vi nhũ tương có cấu tạo là nhũ tương D/N hoặc N/D, được bào chế từ việc phân tán pha dầu vào pha nước có chất diện hoạt Kích thước của giọt lỏng thường khoảng

100 nm Vi nhũ tương có thể chứa cả hoạt chất thân nước lẫn thân dầu Tuy nhiên, tỉ

lệ chất diện hoạt cần thiết để ổn định vi nhũ tương thường khá cao Vi nhũ tương không bền khi pha loãng với nước [48], [118]

1.2.3.4 Nhũ tương nano (nano emulsion)

Sự phối hợp hai pha dầu – nước bằng lực khuấy mạnh với sự hiện diện của chất diện hoạt tạo thành nhũ tương nano với kích thước giọt dầu từ 20 – 200 nm Nhũ tương nano không bền do sự kết tụ tạo thành tiểu phân lớn hơn khi nồng độ chất tan quá bão hòa trong môi trường (Oswald ripening) [101]

Vi nhũ tương và nhũ tương nano đều là hệ phân tán dầu trong nước với tiểu phân phân tán có kích thước nm Tuy nhiên, vi nhũ tương là hệ bền về nhiệt động học (thermodynamically stable), trong khi đó, nhũ tương nano bền về động lực học (kinetic stability) Trong quá trình bào chế, để thu được nhũ tương nano cần năng lượng cao và lực phân tán mạnh còn vi nhũ tương được tạo thành tại điểm cân bằng nhiệt động học nên cần dùng lượng chất diện hoạt cao [48], [137]

1.2.3.5 Tiểu phân nano lipid rắn (solid lipid nanoparticles, SLN)

SLN được bào chế bằng cách thay thế thành phần dầu lỏng của nhũ tương D/N bằng một hoặc hỗn hợp lipid rắn So với nhũ tương nano, SLN kiểm soát sự phóng thích tốt hơn Tuy nhiên, tỉ lệ chứa hoạt chất của SLN khá thấp do nhiều hoạt chất ít tan trong lipid rắn Sau khi bào chế, lipid rắn thường ở dạng có mức năng lượng cao (α, β’) Trong quá trình bảo quản, chúng có xu hướng trở về mức năng lượng thấp hơn (dạng β) ở trạng thái kết tinh nên dễ đẩy hoạt chất ra khỏi tiểu phân [104], [148]

1.2.3.6 Giá mang lipid cấu trúc nano (NLC)

Với NLC, pha dầu là hỗn hợp lipid rắn – lỏng với tỉ lệ khác nhau nhưng vẫn tạo nên

tiểu phân rắn ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ cơ thể Có 3 dạng NLC Dạng kết tinh

không hoàn toàn, (imperfect lipid matrix), có lipid rắn chiếm tỉ lệ cao hơn lipid

lỏng Khi về nhiệt độ phòng sẽ có sự xáo trộn trong cấu trúc, tạo thành các “khoảng

trống” chứa hoạt chất (dạng I, Hình 1.2 b) Dạng cấu trúc lipid lỏng/rắn/nước có tỉ

lệ lipid lỏng cao hơn lipid rắn Sự tách pha trong quá trình làm nguội tạo nên các hạt

dầu li ti với cấu trúc lipid lỏng/rắn/nước (dạng II, Hình 1.2 c) Dạng vô định hình có

tỉ lệ lipid lỏng nhất định nhằm ngăn sự kết tinh hoàn toàn của lipid rắn và giúp chúng tồn tại ở dạng vô định hình (dạng III, Hình 1.2 d) [99], [146]

1.3 Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano lipid

Thành phần lipid: Lipid có nguồn gốc từ tự nhiên, bán tổng hợp hoặc tổng hợp, có

thể thoái biến sinh học [114], [161] gồm triglycerid, steroid, sáp và phospholipid [46],[70] Dựa vào sự tương tác với nước, có thể chia thành hai nhóm:

 Lipid lớp kép: Trong môi trường nước, các lipid tạo thành lớp lipid kép do sự

sắp xếp “đuôi nối đuôi” của các phân tử lipid lớp đơn, điển hình là phospholipid Phospholipid có nhóm chức (phosphatidylcholin) có thể thay đổi tính chất của tiểu phân lipid như sự trương nở, liên kết và thoái hóa

 Lipid không tạo lớp kép: Lipid trong vật thể sống chủ yếu là lipid lớp đơn

Chúng được ứng dụng trong phân phối thuốc nhờ khả năng tạo thành mạng

Hoạt chất

matrix, gồm triglycerid và sáp Chúng tác động đến tính chất của tiểu phân nano do sự khác nhau về điểm chảy, tính chất kết tinh và dạng đa hình Đặc biệt, lipid còn làm tăng sự hấp thu các hoạt chất thân dầu [26], [90]

Acid béo dùng trong bào chế tiểu phân nano lipid thường được chiết xuất từ một số dầu lỏng dùng trong dược phẩm: Acid caprylic, acid capric, acid lauric, acid palmitic, acid stearic, acid oleic, acid linoleic, acid behenic,…[46], [72] Một số lipid và dầu lỏng dùng trong bào chế tiểu phân nano lipid được nêu ở Bảng 1.3

Bảng 1.3 Một số lipid lớp đơn và dầu dùng trong bào chế tiểu phân nano lipid

Lipid rắn Lipid rắn trong tự nhiên Hỗn hợp mono, di và triglycerid

Acid stearic

Acid palmitic

Acid behenic

Chất béo từ dê Dầu béo từ cacao

Witepsol Glyceryl monostearat Glyceryl behenat Glyceryl palmitostearat

Dầu dừa Dầu ô liu Dầu đậu nành Dầu lạc

"Nguồn: Katdare A, 2006" [72]

Phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano lipid: Phương pháp bào chế hệ tiểu phân

nano thường dựa vào hai nguyên lý cơ bản, đó là nguyên lý từ trên xuống (top down) hoặc từ dưới lên (bottom up) [62], [135]

Nguyên lý “từ dưới lên”: Tiểu phân nano được tạo thành từ sự phát triển hoặc tự

sắp xếp của nguyên tử hoặc phân tử tạo thành khối do sự tương tác vật lý hoặc hóa học trong điều kiện có hoặc không có sự hiện diện của chất mầm [26], [109]

Nguyên lý “từ trên xuống”: Nguyên liệu kích thước lớn được biến đổi thành kích

thước nhỏ bằng cách bẻ gãy hoặc cắt nhỏ nguyên liệu [26], [62]

Dựa vào hai nguyên lý này, có thể chia các phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano như trình bày trong Sơ đồ 1.1 [134], [147]

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ các phương pháp bào chế hệ tiểu phân nano

1.3.1 Kỹ thuật cơ học

1.3.1.1 Đồng nhất hóa bằng áp suất cao hoặc siêu âm

Quy trình bào chế bằng phương pháp đồng nhất hóa thường gồm hai bước chính:

Bước 1 Tạo nhũ tương (D/N): Hòa tan hoạt chất vào pha dầu và phân tán hỗn hợp

này với pha nước chứa chất nhũ hóa Khuấy tốc độ cao để tạo nhũ tương [31], [45]

Bước 2 Đồng nhất hóa kích thước giọt bằng siêu âm hoặc áp suất cao [27], [125]

 Kỹ thuật siêu âm

Áp lực từ những đợt sóng siêu âm tác động vào chất lỏng, kết hợp với điều kiện xác định sẽ tạo bong bóng khí Chúng lớn dần đến mức độ nhất định sẽ chuyển động dữ dội và vỡ ra (hiện tượng sủi bong bóng, cavitation), tạo nên những đợt sóng có đủ năng lượng bẻ gãy liên kết đồng hóa trị, làm giảm kích thước giọt lỏng [55], [137]

KT bay hơi trong nước

Nhũ hóa bay hơi

DM

Kỹ thuật chất lỏng STH

Kỹ thuật kháng

DM STH

Khuếch trương nhanh từ dung dịch STH

Siêu

âm

Bào chế hệ tiểu phân nano

Thu hệ tiểu phân nano

 Kỹ thuật đồng nhất hóa bằng áp suất cao

Hệ phân tán bị đẩy qua khe hẹp vào khe đồng nhất hóa có áp suất cao Lực nén làm dòng chất lỏng di chuyển dữ dội, áp suất động học tăng lên và được bù trừ bằng sự giảm áp suất tĩnh xuống dưới áp suất hơi bão hòa của nước tạo thành bong bóng khí (gas bubbles) Chúng vỡ ra đột ngột sau khi rời khỏi khe (hiện tượng sủi bong bóng, cavitation) hình thành sóng có lực tác động rất mạnh Năng lượng từ những đợt sóng này, cộng với sự chuyễn động hỗn loạn của dòng chất lỏng và lực trượt làm giọt lỏng bị chia nhỏ (Hình 1.3) Trong dòng chảy, giọt lỏng va chạm vào nhau và

có thể kết tụ lại nếu không được bao phủ bởi chất diện hoạt Nếu tiến hành HPH lạnh thì hiện tượng sủi bong bóng ít xảy ra [57], [89], [135]

Quá trình đồng nhất hóa có thể tiến hành ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tan chảy của tá dược (HPH nóng), áp suất đồng nhất hóa thường từ 500 – 1.500 bar [75], [126] hoặc dưới nhiệt độ phòng (HPH lạnh) [90] So với HPH nóng, HPH lạnh có thể cho kích thước tiểu phân lớn hơn nhưng phù hợp với hoạt chất nhạy cảm với nhiệt độ [26], [158] Quy trình bào chế ở nhiệt độ thấp thường qua các bước:

Phối hợp pha dầu ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ chảy của chất mang

Làm rắn hỗn hợp bằng nước đá hoặc nitơ lỏng, nghiền mịn thành bột Phân tán bột vào pha nước có chứa chất diện hoạt

Đồng nhất hóa ở nhiệt độ thấp hơn hoặc bằng nhiệt độ phòng với HPH Thu hệ tiểu phân nano [90]

Máy HPH được thiết kế có một hoặc hai cấp đồng nhất hóa Với cấu tạo một cấp (Hình 1.3), sản phẩm đầu vào qua một buồng đồng nhất hóa và tiếp tục chu kỳ mới

Ở máy hai cấp, sản phẩm được đồng nhất hóa ở buồng thứ nhất, sau đó, đến buồng thứ hai (thường dùng áp suất bằng 1/10 áp suất của buồng thứ nhất) Tại đó các tiểu phân gắn kết nhau sẽ được tách ra và phân tán riêng rẽ trở lại giúp kích thước của tiểu phân đồng đều hơn Trên thị trường, máy HPH dành cho nghiên cứu có dung tích 40 ml, 500 ml và 2000 ml Máy có dung tích lớn hơn, có thể đồng nhất hóa 2 tấn sản phẩm trong một giờ, thường dùng cho quy mô công nghiệp [113], [123]

(a)

1 Vùng bong bóng vỡ 2 Vùng va chạm và sôi 3 Vùng lực trượt 4 Dòng chuyển động

(b)

Hình 1.3 Hình minh họa cấu tạo (a) và cơ chế hoạt động (b) của máy HPH

"Nguồn: Thassu D, 2007" [135]

1.3.1.2 Kỹ thuật nghiền

Ứng dụng phương pháp nghiền khô cổ điển có thể thu được tiểu phân từ 1 – 10 µm

do nhiệt tạo thành trong quá trình nghiền và dạng bột khô thường có lực tĩnh điện rất cao dễ gây kết tụ tiểu phân Tuy nhiên, phương pháp nghiền ướt được cải tiến có thể khắc phục nhược điểm này bằng cách nghiền tiểu phân (µm) đã được phân tán trong nước có chất diện hoạt Kết quả có thể thu tiểu phân dưới 200 nm [110], [147]

1.3.2 Kỹ thuật nhũ hóa

Kỹ thuật này được phát triển thành phương pháp pha loãng vi nhũ tương Phương pháp này gồm hai bước là bào chế nhũ tương D/N hoặc N/D từ acid béo có nhiệt độ tan chảy thấp Sau đó, phân tán dần nhũ tương nóng vào nước lạnh (2 – 3 oC) bằng cách khuấy để thu được tiểu phân nano Tỉ lệ vi nhũ tương và nước thường khoảng

1 : 25 hoặc 1 : 50 [26], [90]

1.3.3 Kỹ thuật kết tủa

Kỹ thuật này cần có giai đoạn hòa tan hoạt chất vào dung môi, sau đó kết tủa lại bằng một dung môi đối kháng (antisolvent) – hoạt chất kém tan trong dung môi này – hoặc bay hơi dung môi Chất diện hoạt hoặc chất ổn định cũng được dùng để ổn định tiểu phân

Hệ tiểu phân nano Khe đồng nhất hóa

Hệ phân tán thô Piston

1.3.3.1 Kỹ thuật đối kháng dung môi

 Phương pháp kết tủa có kiểm soát

Hoạt chất và chất ổn định được hòa tan trong dung môi hỗn hòa nước (benzyl alcohol, ethanol, ), sau đó phân tán hỗn hợp này vào pha nước Quá trình khuếch tán dung môi vào nước gây nên sự chuyển động giữa bề mặt hai pha, hạt mầm hình thành và phát triển dần Chất ổn định và chất ức chế có thể được phối hợp ở cả hai pha để ức chế sự phát triển và thu được kích thước tiểu phân như mong muốn Loại dung môi hữu cơ bằng cách cô quay trong chân không [93], [134]

 Phương pháp bay hơi kết tủa trong dung dịch nước

Trong phương pháp này, hoạt chất kém tan bị kết tủa do sự bay hơi của dung môi hữu cơ ở gần hoặc trên điểm sôi và tiếp xúc với môi trường nước Trước hết, hoạt chất được hòa tan trong dung môi hữu cơ Hỗn hợp sau đó bị nén, đun nóng và phun qua vòi bằng thép không gỉ để vào môi trường nước có chất ổn định đã được đun nóng Áp suất và sự đun nóng làm bay hơi dung môi hữu cơ và nhờ vậy, hạt mầm tạo thành rồi kết tủa thành tiểu phân nano [147]

 Phương pháp nhũ hóa bay hơi dung môi

Hòa tan lipid và hoạt chất trong dung môi hữu cơ không hỗn hòa nước (dicloromethan, ethyl acetat), phân tán hỗn hợp vào pha nước có chất diện hoạt Bay hơi dung môi dưới áp suất giảm, tiểu phân nano sẽ được tạo thành [71], [134]

1.3.3.2 Kỹ thuật chất lỏng siêu tới hạn

Chất lỏng siêu tới hạn thường dùng là CO2 với hai phương pháp cơ bản là kháng dung môi siêu tới hạn (supercritical antisolvent, SAS) và khuếch trương nhanh từ dung dịch siêu tới hạn (rapid expansion from supercritical solutions, RESS) SAS dùng dung môi có thể hỗn hòa với CO2 tới hạn để hòa tan chất tan Do không tan trong CO2 tới hạn nên khi CO2 tới hạn ly trích (extract) vào dung môi, chất tan lập tức kết tủa, hình thành tiểu phân Trong RESS, hoạt chất được hòa tan vào CO2, sau

đó, hỗn hợp đi vào vùng có áp suất thấp hơn Sự thay đổi áp suất đột ngột làm giảm khả năng hòa tan của CO2 và lập tức chất tan bị kết tủa [93]

Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng (Bảng 1.4) Tuy nhiên, HPH được dùng trong bào chế tiểu phân lipid phổ biến hơn cả, ngoài những ưu điểm đã tóm tắt còn có một số ưu điểm nổi bật khác như:

Không dùng dung môi hữu cơ

Có thể nâng cấp lên quy mô công nghiệp [123]

Có tính tiếp nối do quy trình đã được ứng dụng trong ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm và bơ sữa [124], [132]

Bảng 1.4 Ưu nhược điểm của các phương pháp bào chế tiểu phân nano

Kỹ thuật nghiền Phù hợp với hoạt chất kém tan cả

trong nước và dung môi hữu cơ

Nhiễm tạp từ thiết bị nghiền

Nhũ hóa bay hơi

CO2 siêu tới hạn Không dùng dung môi hữu cơ Trang thiết bị đắt tiền Pha loãng vi nhũ

tương

Phương pháp đơn giản Tỉ lệ lipid thấp

Tỉ lệ chất diện hoạt cao

1.4 Phương pháp phân tích tính chất của hệ tiểu phân nano lipid 1.4.1 Tính chất cảm quan của hệ tiểu phân

Các đặc điểm đánh giá là thể chất, màu sắc của hệ phân tán Hệ phân tán nano lipid

có thể trong suốt, đục mờ hoặc đục như sữa tùy theo kích thước và nồng độ hạt phân tán Nếu nồng độ hạt cao thì hệ thường có màu đục như sữa nhưng mức độ đục sẽ giảm dần khi pha loãng hệ tiểu phân

Các hiện tượng cảm quan khác cần được đánh giá và theo dõi là sự kết bông, tạo kem, tách pha Hệ phân tán bền khi không có các hiện tượng này xảy ra

1.4.2 Kích thước và dãy phân bố kích cỡ tiểu phân

Kích thước là một trong những tính chất quan trọng của tiểu phân nano vì có ảnh hưởng đến khả năng nang hóa, giải phóng hoạt chất và độ bền của hệ tiểu phân

Ngoài ra, đó là tác nhân định vị tiểu phân trong tuần hoàn, quyết định sự phân bố in

vivo, độc tính và khả năng hướng mục tiêu của tiểu phân [80], [105]

Phân bố kích cỡ thể hiện độ đồng nhất về kích thước của tiểu phân Dãy phân bố có thể một hay nhiều đỉnh và được biễu diễn ở dạng đường cong phân bố tần số hay đường cong phân bố tích lũy [30], [101] Kích thước và dãy phân bố kích cỡ được xác định bằng các kỹ thuật khác nhau (Sơ đồ 1.2) [103], [148]

Sơ đồ 1.2 Các phương pháp xác định kích thước tiểu phân

Phương pháp xác định KTTP

Rây Quan sát

với KHV quang học

Đo tốc

độ lắng đọng

sát với KHV điện tử

Phân tích bằng PCS

Phân tích bằng

LD

Mỗi phương pháp xác định kích thước hạt có ưu nhược điểm khác nhau, tuy nhiên, thường dựa vào kích thước hạt của mẫu để chọn phương pháp phù hợp (Hình 1.4) Trong các phương pháp đã nêu, phổ tương quan photon (photon correlation spectroscopy, PCS) và nhiễu xạ laser (laser diffraction, LD) được dùng để phân tích kích thước hạt nano nhiều nhất do khả năng phát hiện các hạt nhỏ, có thể là hạt vài

nm [90] Các phương pháp còn lại mang tính chất kiểm tra và so sánh

Hình 1.4 Các phương pháp đo kích thước và vùng kích thước phù hợp

1.4.2.1 Đánh giá phân bố cỡ tiểu phân dựa trên sự khuếch tán ánh sáng

PCS hay tán xạ ánh sáng (dynamic light scattering, DLS) là kỹ thuật đo kích thước dựa vào sự khuếch tán ánh sáng của tiểu phân có kích thước dưới 6 µm [147] trong

hệ phân tán bằng nguồn sáng đơn sắc, ví dụ tia laser [67], [120] PCS phân tích cường độ dao động theo thời gian của tia sáng được tạo thành từ chuyển động Brown của tiểu phân có kích thước nhỏ hơn bước sóng của tia tới ở góc tới xác định Cường độ khuếch tán phụ thuộc vào kích thước tiểu phân Tiểu phân nhỏ di chuyển nhanh do chúng có hệ số khuếch tán cao, trong khi tiểu phân lớn hơn di chuyển chậm, cường độ dao động thấp hơn Từ đường cong biểu diễn cường độ khuếch tán theo thời gian sẽ cho các thông tin về kích thước và phân bố kích cỡ tiểu phân, đại diện là hai thông số kích thước trung bình và hệ số phân tán PdI [104], [137] PCS dựa vào việc xác định hệ số khuếch tán của tiểu phân nên chỉ gián tiếp xác định kích thước tiểu phân qua công thức Stokes – Einstein (1) [98], [101]:

Khuếch tán ánh sáng

Nhiễu xạ laser

Đo tốc độ lắng Quan sát với KHV điện tử

Quan sát với KHV QH

Rây

D = kT/3d (1) Trong đó:

D: Hệ số khuếch tán T: Nhiệt độ

d: Đường kính trung bình của tiểu phân k: Hằng số Boltzmann

: Độ nhớt môi trường phân tán

Dựa vào công thức, có thể thấy rằng nhiệt độ đo, độ nhớt của hệ phân tán ảnh hưởng đến kết quả phân tích [101]

1.4.2.2 Đo kích thước tiểu phân bằng nhiễu xạ laser

Nhiễu xạ laser (laser diffraction, LD) là phương pháp thích hợp để xác định kích thước tiểu phân từ 10 nm đến 1 mm và có dãy phân bố rộng [122], [147] LD đo sự phân bố kích thước tiểu phân bằng cách đo cường độ dao động của góc nhiễu xạ khi tia laser đi qua hệ phân tán Nếu kích thước tiểu phân lớn hơn độ dài sóng của chùm tia sáng hoặc tỉ số chỉ số khúc xạ của pha phân tán và pha liên tục khác nhau thì LD tuân theo nguyên tắc của nhiễu xạ Fraunhofer, ngược lại, sẽ tuân theo nguyên tắc Lorenz – Mie [104], [137] Phân tích sự phân bố cường độ góc nhiễu xạ sẽ thu được thông tin về kích thước tiểu phân (trung bình, trung vị, mode, d10 hoặc d90) [67], [134] Mẫu được tuần hoàn qua tế bào đo nên kết quả có độ tin cậy cao [147]

1.4.3 Hình thể học của tiểu phân nano lipid

Tiểu phân là vật thể có cấu trúc ba chiều và có nhiều hình dạng khác nhau Ngoài kích thước, hình dạng cũng là tính chất quan trọng ảnh hưởng độ ổn định hóa lý, tỉ

lệ nang hóa, hiệu suất nang hóa của tiểu phân Ngoài ra, khi vào cơ thể, hình dạng của tiểu phân tác động không nhỏ đến khả năng hướng mục tiêu, phân phối hoạt chất và sự thoái hóa [148] Tuy nhiên, các phương pháp phân tích kích thước thường không phản ánh chính xác hình dạng của chúng Vì vậy, cần sử dụng các phương pháp phân tích có thể quan sát trực tiếp hình dạng của tiểu phân

Các phương pháp thường được dùng để khảo sát hình dạng của tiểu phân là kỹ thuật quan sát hình ảnh với thiết bị là KHV như KHV quang học, TEM, SEM và AFM

Chúng cung cấp thông tin về kích thước, cấu trúc bề mặt và sự kết tụ (nếu có) của tiểu phân KHV điện tử quan sát vật thể thông qua tia electron Do có độ phóng đại lớn và độ phân giải cao nên đây là thiết bị phù hợp để khảo sát cấu trúc và hình dạng tiểu phân nano [30], [81]

1.4.3.1 Kính hiển vi quang học

Kính hiển vi quang học thường được dùng để khảo sát hình dạng các vật thể nhỏ Tuy nhiên, do sử dụng nguồn sáng khả kiến và thấu kính thủy tinh để phân tích mẫu nên rất hạn chế khi phân tích tiểu phân có kích thước nano Kính hiển vi quang học chủ yếu được dùng để khảo sát sơ bộ kích thước hạt hoặc sự hiện diện của tinh thể hoạt chất không nang hóa hoặc phát hiện các hạt to trong mẫu [101]

1.4.3.2 KHV điện tử truyền qua (transmission electron microscopy, TEM)

TEM cung cấp thông tin về hình ảnh tiểu phân một cách trực tiếp với độ phân giải tới mức độ kích thước phân tử (< 1 nm) [148] TEM sử dụng chùm electron năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu Các thấu kính từ tạo ảnh với độ phóng đại cực lớn

Độ phóng đại phụ thuộc vào tỉ lệ khoảng cách giữa mẫu và thấu kính mục tiêu cùng với mặt phẳng ảnh Đây là kỹ thuật thường dùng để kiểm tra kích thước và quan sát cấu trúc tiểu phân [90], [161] Có thể kết hợp với kỹ thuật cắt lớp (cryofracture) trước khi quan sát cấu trúc bên trong tiểu phân TEM có độ phân giải cao nhưng yêu cầu mẫu khảo sát phải là một lớp thật mỏng để tia điện tử có thể chiếu xuyên qua,

có khi lớp mẫu này mỏng hơn 50 nm Không giống như SEM, TEM quan sát hình ảnh vật thể trong không gian hai chiều với độ phân giải cao hơn, độ phóng đại lớn hơn và không cần bao phủ bề mặt mẫu bởi các kim loại dẫn điện [81], [82]

1.4.3.3 Kính hiển vi điện tử quét (scanning electron microscopy, SEM)

SEM là loại kính hiển vi điện tử có thể tạo ra ảnh với độ phân giải cao bằng cách sử dụng một chùm điện tử hẹp quét trên bề mặt mẫu Việc tạo ảnh được thực hiện thông qua ghi nhận và phân tích các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu Phương pháp này cho biết thông tin cơ bản về hình dạng và đặc tính bề mặt tiểu phân SEM thường dùng để phân tích hình thể học, kích thước, cấu

trúc bề mặt, sự phân tán và kết tụ của tiểu phân Hình ảnh của mẫu khi khảo sát bằng SEM sẽ được ghi nhận trong không gian ba chiều [75], [148] Tương tự TEM, SEM duy trì hoạt động trong chân không nên trước khi khảo sát, mẫu được làm khô bằng cách loại bỏ toàn bộ nước, ngoài ra chúng còn được phủ bởi lớp kim loại có thể dẫn điện, thường là vàng hoặc platin [95], [134]

1.4.3.4 Kính hiển vi lực nguyên tử (atomic force microscopy, AFM)

AFM quan sát cấu trúc vi mô bề mặt của vật rắn dựa trên nguyên tắc xác định lực tương tác nguyên tử giữa một đầu mũi dò nhọn với bề mặt mẫu ở một khoảng cách rất gần (0,2 – 10 nm) với độ phân giải khoảng 10 nm [90], [147]

Đầu dò nhọn, có dạng tháp cao vài µm và bán kính khoảng vài nm, thường được làm bằng silicon, gồm hai phần: đầu mũi dò và giá đỡ Đầu dò quét trên bề mặt mẫu tạo nên lực tương tác và thay đổi độ lệch của giá đỡ Độ lệch này được xác định bằng bộ phận phản chiếu laser ở trên đỉnh của giá đỡ và được chuyển thành các tín hiệu hình ảnh Đầu dò có thể quét và tạo ảnh với độ phân giải khoảng 0,5 nm Kỹ thuật này có thể xác định hình thể của tiểu phân trong không gian ba chiều [148] Giống như TEM và SEM, AFM được dùng để khảo sát kích thước, hình dạng, cấu trúc, sự phân tán và kết tụ của tiểu phân lipid Điểm khác biệt giữa chúng chính là AFM có thể hoạt động trong môi trường có không khí hoặc môi trường lỏng Đây là

ưu điểm chỉ có ở AFM [63], [104]

1.4.4 Thế zêta của hệ tiểu phân nano lipid

Trong môi trường phân tán, bề mặt tiểu phân có thể tích điện tạo nên lực đẩy giữa các tiểu phân và chống lại sự kết tụ, giúp chúng ổn định hơn Lớp điện tích này hấp dẫn các ion trái dấu tạo nên lớp Stern, là lớp khá dày bao bọc lấy tiểu phân Lớp ngoài cùng là lớp khuếch tán, gồm các ion tự do trong môi trường Lực đẩy giữa các tiểu phân thể hiện bởi thế năng zêta Đây là thông số không phụ thuộc kích thước

mà phụ thuộc vào bề mặt tiểu phân, sự hiện diện của chất diện hoạt và ion trong môi

trường, Nó có thể bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi pH hoặc lực ion trong môi trường cũng như hình thái bề mặt của tiểu phân [137], [154]

Để đo lường, hỗn dịch pha loãng của tiểu phân nano được cho vào một từ trường yếu, sự chuyển động của tiểu phân được xác định bởi phép đo gió Doppler laser Kết quả thu được giá trị điện chuyển  (tốc độ tiểu phân / độ mạnh của điện trường)

và gián tiếp xác định thế zêta theo công thức Helmholtz- Smoluchowski (2) [101]:

𝜇 = 𝜀./

Trong đó: : Điện chuyển

: Thế zêta

: Hằng số điện môi

: Độ nhớt của môi trường phân tán

Thế zêta giúp dự đoán độ ổn định vật lý của hệ tiểu phân nano lipid trong thời gian bảo quản hoặc khi tương tác với dịch sinh lý Tuy nhiên, việc đánh giá độ ổn định của hệ tiểu phân không chỉ dựa vào thế zêta, nhất là khi có sự PEG hóa hoặc gắn kết với các đại phân tử trên bề mặt tiểu phân, vì đây là một cơ chế khác tạo nên sự ổn định cho tiểu phân: hiệu ứng không gian [101]

1.4.5 Sự nang hóa hoạt chất của tiểu phân nano lipid

Nang hóa phản ánh khả năng hoạt chất bị bắt giữ hoặc hấp phụ trên bề mặt của tiểu phân nano Sự nang hóa hoạt chất liên quan trực tiếp đến độ bền của hoạt chất, độ

ổn định của hệ tiểu phân cũng như cơ chế và tốc độ giải phóng hoạt chất từ tiểu phân Vì vậy, đây là thông số rất quan trọng, phản ánh chất lượng của hệ tiểu phân nano [134]

1.4.5.1 Sự định vị của hoạt chất đối với tiểu phân

Tùy theo bản chất của hoạt chất, khả năng chứa của lipid và phương pháp bào chế,

sự phân bố hoạt chất ở tiểu phân có thể xảy ra theo nhiều kiểu khác nhau (Hình 1.5)

Điều này ảnh hưởng rất lớn đến khả năng giải phóng hoạt chất in vitro và in vivo từ

tiểu phân nano [102], [155]

(2)

Hình 1.5 Vị trí định vị hoạt chất nang hóa ở tiểu phân

A: Hoạt chất hòa tan hoặc phân tán đồng nhất (cốt) B: Hoạt chất tập trung tại vỏ C: Hoạt chất tập trung tại lõi D: Hoạt chất hấp phụ trên bề mặt E: Khối kết tụ của hoạt chất

"Nguồn: Schäfer-Korting M, 2007" [122]

Kiểu matrix đồng nhất với hoạt chất phân tán ở dạng vô định hình có thể thu được khi bào chế bằng HPH nhiệt độ thấp hoặc phối hợp hoạt chất rất thân dầu vào lipid bằng HPH nhiệt độ cao Khi nguội dần, hoạt chất được phân tán trong lipid tạo nên matrix đồng nhất giúp tiểu phân có thể giải phóng hoạt chất kéo dài [71], [99] Kiểu tập trung tại vỏ tạo thành khi có hiện tượng tách pha trong quá trình nguội dần

từ giọt lipid trở thành tiểu phân lipid rắn Lipid kết tủa trước nên lõi tiểu phân không chứa hoạt chất Song song đó, nồng độ hoạt chất trong lipid lỏng tăng dần, cuối cùng chúng tập trung tại lớp vỏ của tiểu phân Hoạt chất nang hóa tại vỏ được phóng thích nhanh hơn khi tiếp xúc với môi trường [71], [99]

Ngược lại, kiểu định vị tại lõi hình thành khi hoạt chất kết tinh trước Tỉ lệ hoạt chất

ở vỏ tiểu phân ít đi do rất nhiều hoạt chất tan tốt trong chất mang và được bắt giữa trong lõi của chất mang Khi đó, quá trình giải phóng hoạt chất sẽ được kiểm soát tốt hơn và kéo dài hơn Sự phóng thích hoạt chất phụ thuộc vào quá trình khuếch tán hoạt chất từ lõi tiểu phân và tốc độ thoái biến của lipid [137], [155]

1.4.5.2 Các phương pháp tách hoạt chất không nang hóa trong tiểu phân

Kỹ thuật tách các hoạt chất tự do thường dựa vào kích thước tiểu phân, bao gồm:

 Thẩm tách (dialysis)

Thẩm tách là quá trình hoạt chất tự do khuếch tán qua màng có kích thước lỗ phù hợp theo gradient nồng độ Kích thước lỗ màng phải nhỏ hơn kích thước tiểu phân Hoạt chất có thể bị hấp phụ trên màng dẫn đến sai số [89], [147]

 Siêu ly tâm (ultracentrifugation)

Kỹ thuật này dùng lực ly tâm rất lớn (20.000 – 40.000 g) để tách hoạt chất tự do ra khỏi hệ tiểu phân [61], [128] Nếu tỉ trọng của tiểu phân nhỏ hơn môi trường, chúng

sẽ nổi trên bề mặt dịch lọc, hoạt chất tự do hòa tan trong môi trường hoặc lắng xuống khi quá bão hòa Ngược lại, nếu tỉ trọng cao hơn, tiểu phân sẽ sa lắng Để loại hết hoạt chất tự do, cần thực hiện lặp lại nhiều lần Do lực ly tâm lớn nên có thể tách được hoạt chất tự do và không cần pha loãng mẫu [22], [29]

 Siêu lọc (ultrafiltration)

Cho hệ tiểu phân nano đi qua màng lọc có kích thước lỗ lọc siêu nhỏ Hoạt chất tự

do theo dịch lọc qua màng, tiểu phân bị giữ lại trên màng lọc Phương pháp này được áp dụng khi tỉ trọng của tiểu phân nhỏ hơn tỉ trọng môi trường phân tán [128]

1.4.6.1 Phương pháp khuếch tán trực tiếp

Tiểu phân được đặt trực tiếp trong môi trường hòa tan, lấy mẫu phân tích trong khoảng thời gian nhất định, ly tâm (hoặc lọc) và định lượng hoạt chất [63], [69]

1.4.6.2 Phương pháp khuếch tán qua màng

 Túi thẩm tách

Tiểu phân được phân tán trong môi trường hòa tan và cho vào túi thẩm tách Kẹp chặt miệng túi lại Đặt túi vào môi trường hòa tan, sau đó lấy mẫu định lượng ở từng thời điểm trong khoảng thời gian xác định (Hình 1.6) [30], [158]

Hình 1.6 Hình minh họa sự giải phóng hoạt chất qua túi thẩm tách

 Thẩm tách ngược

Trong kỹ thuật này, túi thẩm tách chứa khoảng 1 ml môi trường được đặt vào hệ phân tán Sau đó, hỗn hợp hệ phân tán này được cho vào môi trường hòa tan Lấy mẫu định lượng hoạt chất phóng thích theo thời gian [155]

 Tế bào Franz

Tế bào Franz gồm hai tế bào khuếch tán gắn kết với nhau và chia thành hai ngăn bởi lớp màng mỏng Ngăn cho chứa mẫu, ngăn nhận chứa đầy môi trường hòa tan (Hình 1.7) Khuấy đều môi trường với tốc độ phù hợp, hoạt chất trong tiểu phân được phóng thích và hòa tan vào môi trường ngăn nhận, lấy mẫu định lượng theo từng thời điểm trong khoảng thời gian xác định [35], [103], [139]

Màng thường là cellulose acetat, cellulose nitrat, kích thước lỗ màng thường nhỏ hơn kích thước tiểu phân, hoặc màng cấu tạo bằng mô người hay động vật [134]

Hình 1.7 Hình minh họa tế bào Franz

Sinh hàn Màng

Ngăn nhận Nơi rút mẫu

1.5 Các tá dược dùng trong bào chế hệ tiểu phân nano ART 1.5.1 Compritol® 888 ATO

Tên khoa học: Glycerol dibehenat (EP), tribehenin, glyceryl behenat (USP), là

diester của glycerin và acid behenic

Ứng dụng: Là một trong số ít tá dược lipid đa năng, Compritol® 888 ATO được dùng làm tá dược tạo khung cho thuốc uống phóng thích kéo dài, làm tá dược trơn cho viên nén, viên nang và là tá dược dính trong dập thẳng Ngoài ra, với 22 carbon trong chuỗi acid béo, Compritol® 888 ATO được nghiên cứu rất nhiều với vai trò là chất tạo khung mang hoạt chất trong SLN, NLC Tá dược này còn giúp tiểu phân nano trở về dạng rắn ở nhiệt độ cơ thể và kiểm soát tốc độ phóng thích hoạt chất [16], [52]

1.5.2 LabrafacTM PG

Tên khoa học: Propylen glycol dicaprylocaprat (EP)

Tính chất: Là dầu trung tính dạng lỏng, rất bền, trong suốt, không màu hoặc vàng

nhạt, không mùi vị

Ứng dụng: Dùng làm pha dầu trong bào chế nhũ tương D/N hoặc N/D, làm dung

môi hòa tan cho các hoạt chất thân dầu hoặc là dầu lỏng trong bào chế tiểu phân nano NLC Phù hợp để đóng nang cứng hoặc mềm Với số carbon trong chuỗi acid béo từ 8 – 10 carbon, LabrafacTM PG có vai trò hòa tan và làm tăng độ tan của hoạt chất trong Compritol® 888 ATO Khi phối hợp với tỉ lệ nhất định, hỗn hợp lipid rắn – lỏng có thể tạo tiểu phân dạng rắn ở nhiệt độ cơ thể Ngoài ra, hỗn hợp lipid còn là khung bảo vệ, giúp hoạt chất giảm thiểu sự tiếp xúc với môi trường bất lợi [72], [98]

1.5.3 Polysorbat 80

Tên khoa học: Polyoxyethylen 20 sorbitan monooleat, tween 80

Tính chất: Là chất diện hoạt không ion hóa dạng lỏng, sánh, có màu vàng nhạt Dễ

tan trong nước tạo dung dịch màu vàng

Ứng dụng: Vì có tính an toàn cao nên polysorbat 80 được dùng ở tỉ lệ khá cao để

làm tác nhân trợ tan Ngoài ra, polysorbat 80 còn là chất nhũ hóa tạo nhũ tương D/N Trong bào chế hệ tiểu phân nano lipid, polysorbat 80 là chất diện hoạt giúp tạo nhũ tương và ổn định hệ SLN, NLC trong thời gian bảo quản [29], [38], [42]

1.5.4 SimulsolTM 4000 P

Tên khoa học: Polyoxyl 40 hydrogenated castor oil,

polyoxyethylenglyceroltrihydroxystearat, macrogol-glycerolhydroxystearat

Tính chất: Là chất diện hoạt không ion hóa dạng lỏng, sánh, có màu trắng đến vàng

nhạt Tan trong nước tạo dung dịch có mùi rất nhẹ và hầu như không vị

Ứng dụng: Là chất đồng diện hoạt để bào chế nhũ tương D/N và là chất trợ tan cho

hoạt chất dùng cho đường uống và ngoài da SimulsolTM 4000 P cũng là chất diện hoạt để bào chế hệ SLN, NLC [38]

1.5.5 Gelucire® 50/13

Tên khoa học: Stearoyl macrogol-32 glycerid, steroyl polyoxylglycerid

Ứng dụng: Là tá dược làm tăng sinh khả dụng của những hoạt chất kém tan và là

chất nhũ hóa cho nhũ tương D/N Dùng làm tá dược cho viên nén, viên nang, vi nang với vai trò là chất trợ tan, tăng thấm cho hoạt chất Gelucire® 50/13 được dùng làm chất nhũ hóa trong bào chế hệ SLN, NLC [53]

1.5.6 Phosphatidylcholin

Tên khoa học: Phosphatidylcholin

Tính chất: Phosphatidylcholin thuộc nhóm phospholipid, thành phần chính của

màng tế bào, có thể được chiết xuất từ lòng đỏ trứng hoặc màng tế bào, chứa 85% acid stearic và 15% acid palmitic

Ứng dụng: Là thành phần công thức của liposome và nhũ tương trong bào chế mỹ

phẩm và dược phẩm và là chất nhũ hóa cho nhũ tương D/N [17], [27], [128]

1.6 Artemisinin và nghiên cứu ứng dụng trong điều trị sốt rét 1.6.1 Artemisinin (ART)

ART là một sesquiterpen lacton endoperoxid (Hình 1.8), hoạt chất chính của cây

Thanh hao Thanh hao có tên khoa học là Artemisia annua L., thuộc họ Cúc

(Asteraceae) Quốc gia có nhiều Thanh hao mọc hoang là Trung Quốc, Ấn Độ, Mông Cổ, Bắc Mỹ Trung Quốc cũng là nơi gieo trồng để chiết xuất ART cung cấp cho thị trường nhiều nhất hiện nay Tại Việt Nam, kết quả điều tra từ năm 1986 –

1990 (Viện Dược liệu) cho thấy thanh cao hoa vàng mọc tự nhiên ở một số tỉnh phía Bắc Ngoài ra, Thanh hao đã được trồng trọt thành công, sản lượng không những đáp ứng được nhu cầu ART trong nước mà còn có thể xuất khẩu [4], [6]

Bộ phận dùng là lá được thu hái ở cây sắp ra hoa, tốt nhất vào mùa hè, phơi nắng nhẹ hoặc sấy 30 oC – 40 oC đến khô (độ ẩm không quá 13%) Hàm lượng ART thay đổi tùy theo điều kiện thổ nhưỡng Tính theo dược liệu khô, thanh hao Trung Quốc

có hàm lượng ART từ 0,01% – 0,5%, cây trồng tại Việt Nam cho tỉ lệ ART từ 0,4% – 0,6% [4], [6]

ART được phân lập vào năm 1972, là hoạt chất có nhóm peroxid nội rất ít gặp trong

tự nhiên Nguồn cung cấp ART hiện nay chủ yếu vẫn từ dược liệu Phương pháp tổng hợp, bán tổng hợp và sinh tổng hợp ART đã được nghiên cứu nhưng chưa được ứng dụng vào sản xuất vì quy trình phức tạp và giá thành rất cao

Hình 1.8 Công thức hóa học của artemisinin

Tên khoa học:

(3R,5aS,6R,8aS,9R,12S,12aR)-octahydro-3,6,9-trimethyl-3,12-epoxy-12H-pyrano[4,3-j]-1,2-benzodioxepin-10(3H)-on

Tên gọi khác: Artemisin; arteannuin; QHS; qinghaosu; thanh hao tố, quinghaosu Công thức phân tử: C15H22O5, khối lượng phân tử: 282,3

Tính chất vật lý: ART có tinh thể hình kim không màu hoặc bột màu trắng óng ánh,

không mùi Thực tế không tan trong nước, tan trong methanol và ethanol, rất tan trong dicloromethan, dễ tan trong aceton và ethylacetat Năng suất quay cực [𝛼]𝐷20𝑜𝐶

từ + 75o đến + 78o (dung dịch 1,0% trong ethanol) ART có nhiệt độ nóng chảy từ

151 oC – 154 oC, bền vững với nhiệt, không bị phân hủy ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy nên có thể tinh chế bằng phương pháp thăng hoa [4], [149]

Tính chất hóa học: ART là sesquiterpenlacton có nhóm peroxyd nội bị thủy phân

bởi acid hoặc kiềm mạnh làm mất hoạt tính kháng ký sinh trùng (KST) sốt rét

Tác dụng dược lý: ART tác dụng trực tiếp lên KST sốt rét ở giai đoạn thể phân liệt

trong hồng cầu, có hiệu lực cao đối với P falciparum kể cả chúng kháng cloroquin,

không bị đề kháng chéo với cloroquin [92], [108] ART có thời gian sạch KST trong máu rất nhanh, có thể loại trừ và cải thiện triệu chứng nhanh hơn cloroquin, kể cả

với chủng đã kháng cloroquin hoặc đa đề kháng ART diệt giao bào P falciparum,

làm ngăn chặn quá trình lây lan Do không tác dụng đối với giai đoạn phát triển ở gan của KST nên ART không được dùng dự phòng Tỉ lệ tái phát trong vòng một tháng khá cao do thời gian bán thải ngắn [2], [4], [6]

Cơ chế tác dụng: Cầu peroxyd nội trong cấu trúc của ART đóng vai trò quyết định

đối với tác dụng diệt KST sốt rét Các nghiên cứu chứng minh rằng sự khử cầu peroxyd xúc tác bởi hemin kích hoạt quá trình sản sinh gốc tự do từ cầu peroxyd Gốc tự do tạo thành phá hủy màng tế bào của KST thông qua quá trình akyl hóa Môi trường nội bào của KST trong hồng cầu vốn giàu hemin, do thu nhận được từ

sự phân giải protein của tế bào ký chủ Điều này lý giải vì sao ART có tác dụng rất chọn lọc trên KST [2], [92], [108]