Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp và kháng thể đặc hiệu để ứng dụng phát triển que thử phát hiện nhanh virus rota (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐỖ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN VP6 TÁI TỔ HỢP VÀ KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỂ ỨNG DỤNG PHÁT TRIỂN QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH VIRUS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

ĐỖ THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN VP6 TÁI TỔ HỢP VÀ KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỂ ỨNG DỤNG PHÁT TRIỂN QUE

THỬ PHÁT HIỆN NHANH VIRUS ROTA

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 62420201

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – 2017

Công trình được hoàn thành tại:

Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS Trương Quốc Phong

GS TS Nguyễn Đăng Hiền

Vào hồi …… giờ, ngày … tháng … năm ………

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1 Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội

2 Thư viện Quốc gia Việt Nam

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN

1 Do Thi Thu Ha, Ngo Thu Huong, Nguyen Dang Hien, Le Thi

Luan, Luong Trinh Thuy Linh, Truong Quoc Phong (2015)Development of a lateral flow immunoassay strip for rapid

detection of rotavirus in fecal samples Journal of Biology,

Vietnam Academy of Science and Technology Vol

37(1SE):12-17.DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se.6070

2 Do Thi Thu Ha, Truong Quoc Phong (2015) Cloning and

expression of gene coding for rotavirus VP6 protein in

Escherichia coli Journal of Science and Technology Technical Universities 105(A):10-14.

3 Trương Quốc Phong, Đỗ Thị Thu Hà (2015) Tối ưu mã di

truyền để biểu hiện protein VP6 của virus rota trong Escherichia coli Tạp chí Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam, 13 (2A) 619-626

4 Do Thi Thu Ha, Luong Trinh Thuy Linh, Nguyen Thi Ngoc

Anh, Ngo Thu Huong, Nguyen Dang Hien, Truong Quoc Phong(2015) Optimization of a lateral flow immunoassay test strip for

the sensitive detection of rotavirus in fecal samples The Proceeding of the 9 th South East Asian Technical University Consortium (SEATUC) Symposium, ISSN 1882-5796, pp 219-

224

5 Do Thi Thu Ha, Truong Quoc Phong (2015) Optimization of

culture conditions for high-level expression of human rotavirus

VP6 protein in Escherichia coli The Proceeding of the 9 th South East Asian Technical University Consortium (SEATUC) Symposium, ISSN 1882-5796, pp 230-233.

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Virus rota là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tiêu chảy nặng phảinhập viện, thậm chí tử vong ở trẻ nhỏ trên toàn cầu cũng như ở ViệtNam ProteinVP6 nằm là lớp giữa của hạt virus, nhưng VP6 lại đượccoi là tiểu phần quan trọng của hạt virus, không chỉ vì khối lượng lớn,chiếm hơn 51% khối lượng hạt virus mà protein, VP6 là kháng nguyênchung cho tất cả nhóm A, bảo tồn với độ tương đồng khoảng 92% vềtrình tự axit amin giữa các chủng virus rota nhóm A Do có tính bảothủ cho các chủng virus rota thuộc nhóm A nên protein VP6 được coinhư là một dấu chỉ sinh học xác định virus rota Đã có nhiều nghiêncứu protein VP6 như là một tiểu đơn vị để ứng dụng cho sản xuất vắcxin, hay sản xuất protein VP6 TTH như một kháng nguyên tạo khángthể đặc hiệu cho phục vụ cho chuẩn đoán virus rota bằng phương phápELISA hoặc sắc ký miễn dịch Xuất phát từ những cơ sở lý luận và

thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: " Nghiên c ứu

t ạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp và kháng thể đặc hiệu để ứng dụng

- Mục tiêu đề tài

- Tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp của virus rota

- Tạo kháng thể đặc hiệu kháng protein VP6

- Thử nghiệm ứng dụng cho phát triển que thử phát hiện nhanh virusrota dựa vào nguyên lý sắc ký miễn dịch

2.Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein Vp6 tái tổhợp (TTH)

- Tạo chủng E.coli BL21(DE3) mang pET22(b)::vp6 và nghiên cứu

điều kiện biểu hiện VP6 TTH dạng dại và tối ưu hóa gen tổng hợp

- Lựa chọn điều kiện thu hồi kháng nguyên VP6 TTH và nghiên cứuđặc tính của VP6

- Nghiên cứu gây miễn dịch thu kháng thể đặc hiệu kháng VP6 TTH

- Ứng dụng kháng thể kháng VP6 tạo que thử phát hiện nhanh rotavius

3 Những đóng góp mới của luận án

- Thành công trong việc tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp có đặc tínhtương tự VP6 tự nhiên của virus rota

- Tạo kháng thể đặc hiệu kháng protein VP6 virus rota

- Ứng dụng kháng thể tạo que thử chẩn đoán rota vius

4 Bố cục của luận án

Luận án gồm 149 trang, trong đó phần đặt vấn đề 02 trang, tổngquan tài liệu 48 trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 23 trang,kết quả nghiên cứu 52 trang, kết luận và kiến nghị 2 trang, phụ lục 12trang, tài liệu tham khảo 9 trang với 177 tài liệu tham khảo Trong luận

án có 7 Bảng và 73 Hình

Chương 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH BỆNH TIÊU CHẢY DO VIRUS ROTA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

Theo thông kê bệnh tiêu chảy là một trong những nguyên nhân gâybệnh tật và tử vong cho trẻ em ở các nước đang phát triển.Ước tính đếntháng 4 năm 2016, tố chức Y tế thế giới (WHO) ước tính trên toàn cầutrung bình có 215.000 trẻ dưới 5 tuổi tử vong nguyên do tiêu chảy bởivirus rota Ở Việt Nam mãi đến năm 1980 mới nghiên cứu và xác địnhvirus này là nguyên nhân chính gây nên bệnh tiêu chảy ở trẻ em, theothống kê dịch tễ tỷ lệ trẻ em mắc bệnh tiêu chảy cấp do virus rotachiếm trên 50% trong tổng số trẻ mắc tiêu chảy cấp phải nhập việnhàng năm, số trẻ chết do virus rota chiếm từ 4% - 8% trong tổng số trẻdưới 5 tuổi bị chết vì mọi nguyên nhân Bình quân ở nước ta, 1 trẻdưới 5 tuổi mỗi năm mắc từ 0,8 - 2,2 đợt tiêu chảy

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA VIRUS ROTA

Virus rota có dạng khối cầu 20 mặt,

được cấu tạo nên bởi 6 protein cấu trúc

(VP1 tới VP7) và 6 protein phi cấu trúc

(NSP1-NSP6) do 11 mảnh gen mã hóa

Protein VP2 và VP6 tạo nên các hạt hai

lớp được phủ bởi lớp protein VP7,

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIRUS ROTA

1.3.1 Quan sát bằng kính hiển vi điện tử

1.3.2 Phương pháp điện di

1.3.3 Phương pháp RT-PCR hoặc real time-PCR

1.3.4 Phương pháp giải trình tự gen

1.3.5 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 1.3.6 Phương pháp ngưng kết hạt nhựa (latex agglutination)

1.3.7 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatograpic)

1.4 ĐẶC ĐIỂM PROTEIN VP6 VIRUS ROTA

1.4.1 Gen tổng hợp VP6:

Mảnh protein vỏ VP6 virus được mã hóa từ dsRNA 6 có trọnglượng 1356 bp, protein tổng hợp 44,8 kDa chứa 397 axit amin mRNAvirus chứa cấu trúc ở đầu 5’-methylated cap nhưng khuyết đuôi polyA.Thay vào đó mRNA có đầu kết thúc 3’ chứa chuỗi UGACC và đượcbảo tồn trong tất cả 11 gen của virus.

1.4.2 Đặc điểm protein VP6

Các tiểu đơn vị VP6 là một khối

cuộn gấp nếp β với đầu N và đầu C tạo

thành một hệ gấp α lớn Hai vùng A và

B đều tham gia giữ ổn định cấu trúc

tam phân của VP6, VP6 là một protein

chứa ion kim loại Zn2+, axit amin

His153 được bảo tồn nghiêm ngặt

trong nhóm virus rota A và không có

mặt trong nhóm huyết thanh virus rota

khác

1.5 MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP PROTEIN TÁI TỔ HỢP

1.5.1 Ảnh hưởng của chất cảm ứng

1.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ tổng hợp protein tái tổ hợp

1.5.3 Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng

1.5.4 Ảnh hưởng của tối ưu hóa các codons

1.6 TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH PROTEIN

1.6.1 Thu nhận và làm tan thể vùi

1.6.2 Tinh sạch VP6 bằng cột sắc ký ái lực Ni 2+

1.6.3 Tái cuộn gấp VP6 tái tổ hợp

1.6.4 Định lượng định tính và đánh giá hoạt tính protein VP6 1.7 SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐA DÒNG Ở ĐỘNG VẬT 1.7.1 Chọn lọc động vật

1.7.2 Quy trình gây miễn dịch và giám sát động vật

1.8 CÁC KIT THƯƠNG MẠI CHO CHUẨN ĐOÁN VIRUS ROTA

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.2 Plasmid

2.1.3 Các cặp mồi sử dụng

2.1.4 Các kháng thể sử dụng

2.1.4.1 Kháng th ể cho tạo que thử

2.1.4.2 Kháng th ể cho Western Blot và ELISA

2.1.5 Hóa chất và thiết bị máy móc

2.1.5.1 V ật liệu, hóa chất

2.1.5.2 Thi ết bị máy móc cơ bản

2.2.1 Các phương pháp vi sinh

Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật Phương pháp giống vi sinh vật Phương pháp tạo tế bào khả biến.

2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử

Phương pháp tách chiết RNA tổng số (QIAgen RNA extract Kit) Phương pháp RT-PCR và PCR Phương pháp tách chiết plasmid Phương pháp ghép nối gen vào vector tách dòng Biến nạp vào tế bào E.coli Phương pháp cắt DNA plasmid bằng enzyme giới hạn Thiết kế vector bi ểu hiện pET22b(+) mang gen vp6 Phương pháp tinh sạch DNA t ừ gel agarose bằng QIAquick Gel Extraction kit Điện di DNA trên gel agarose Phương pháp biểu hiện gen Điện di biến tính trên gel polyacrylamide-SDS.

2.2.3 Các phương pháp hóa sinh protein

2.2.3.1 Phương pháp tách chiết protein thể vùi

2.2.3.2 Phương pháp thu nhận và làm tan thể vùi

2.2.3.3 Phương pháp tinh sạch protein bằng sắc ký ái lực his-tag và

2.2.4.2 Phương pháp chẩn độ hiệu giá kháng thể kháng protein VP6

tái t ổ hợp bằng phương pháp ELISA

2.2.4.3 Phương pháp tinh sạch IgG bằng cột sắc ký ái lực gắn protein

A-Sepharose

2.2.4.4 Phương pháp soi hiển vi miễn dịch

2.2.5 Phương pháp tạo que thử sắc ký miễn dịch

2.2.6 Các phương pháp tin sinh

Nghiên c ứu đã sử dụng các phương pháp: Kiểm tra mồi bằng phần

m ềm FastPCR Kiểm tra vị trí của các enzyme hạn chế trên gen đích

b ằng phần mềm Nebcutter Phân tích trình tự gen bằng phần mềm NCBI(Blast, …) Chuyển mã trình tự DNA sang trình tự axit amin bằng

ExPASy.D ự đoán cấu trúc VP6 bằng phần mềm RaptorX Xác định độ

s ạch của protein VP6 sau khi tinh sạch bằng phần mềm Quantity One

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VP6

TRONG E COLI

3.1.1 Tách dòng gen vp6 từ virus rota

3.1.1.1 Khu ếch đại gen vp6

Gen vp6 được khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu VP6nat F và

VP6nat R, khuôn là RNA virus rota Qua Hình 3.1 sản phẩm PCR ta

thấy xuất hiện một băng DNA với kích thước khoảng 1,2 Kb, kíchthước này phù hợp với kích thước lý thuyết của đoạn gen mã hóaprotein VP6 theo thiết kế Từ kết quả trên chúng tôi kết luận đã khuếchđại thành công đoạn gen mã hóa protein VP6 bằng kỹ thuật RT – PCR

Hình 3.1 : Điện di đồ sản phẩm

khu ếch đại gen vp6 trên gel

agarose 0,8% Đường chạy M:

VP6nat đặc hiệu Đường chạy

1-7 : S ản phẩm PCR từ 7 ḍng Đường chạy M: DNA chẩn 100bp (Thermo Scientific).

3.1.1.2 Tách dòng gen vp6 trong vector pJET1.2

Sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại gen vp6 được tinh sạch và gắn vào vector tách dòng pJET1.2/blunt Sau khi được biến nạp vào tế bào E.coli DH5α, plasmid pJET1.2::vp6 được tách từ 7 khuẩn lạc ngẫu

nhiên được sử dụng làm khuân cho PCR với cặp mồi VP6nat F vàVP6nat R sử dụng enzyme Taq polymerase Kết quả điện di đồ xuất

hiện một băng duy nhất có kích thước ~1,2kDa (Hình 3.2) Cho nên có

thể khẳng định băng sản phẩm PCR trên phổ điện di đồ là từ đoạn gen

vp6 được chèn vào, chứng tỏ các dòng kiểm tra đều mang gen đích vp6.

Hai dòng khuẩn lạc có kết quả PCR tốt tiếp tục được xử lý với hai

enzyme giới hạn BamHI và SalI Kết quả điện di Hình 3.3A thấy xuất

hiện hai băng DNA rõ nét có kích thước lần lượt là 1,2kb và 2,9kb, thể

hiện cho kích thước của gen vp6 và vector pJET1.2.

Đồng thời kết quả cắt bằng enzyme NheI kết quả nhận thấy đường

chạy xuất hiện hai sản phẩm với trọng lượng là 337 và 831 bp tương

đương với tổng trọng lượng của gen vp6 (1168 bp) ( Hình 3.3 B) Từ các kết quả trên chúng tôi khẳng định plasmid pJET1.2 đã nhận gen vp6 là plasmid tái tổ hợp pJET1.2::vp6, và chúng tôi lựa chọn plasmid

này cho các nghiên cứu tiếp theo

Hình 3.3: K ết quả chọn dòng bằng xử lý

plasmid pJET::vp6 v ới enzyme cắt hạn chế

BamHI/SalI (A) Đường chạy 1, 2: plasmid

trước cắt Đường chạy 1RE và 2RE: xử lý

v ới enzyme cắt hạn chế BamHI/SalI (B)

Đường chạy 3: sản phẩm PCR từ dòng 1 xử

lý v ới enzyme cắt hạn chế NheI Đường chạy

M: DNA ch ẩn 100 bp (Thermo Scientific).

Gen vp6 trên plasmid của dòng 1 được phân tích bằng giải trình tự gen vp6 trong vector tách dòng pJET1.2::vp6,trình tự gen vp6 được phân

tích Trình tự này đã được đăng ký trên ngân hàng gen của NCBI với

mã số KR261090.1

So sánh trình tự gen lên ngân hàng dữ liệu để tìm trình tự tương đồng,

kết quả phân tích trình tự gen vp6 trên ngân hàng dữ liệu có độ tương đồng về trình tự gen vp6 là 99% với typ virus rota nhóm A G1P[8],

G3P[8], G4P[8], G9P[8] AB605599.1, JN258829.1, KT921117.1,KT921018.1, KT920886.1, KJ559167.1, KJ559068.1, KJ559057.1,KF371996.1, KJ559101.1, EF426125.1, EF426122.1, KC687050.1,KJ559253.1, KJ412714.1, GQ477099.2, Q477096.2, EF472944.1,EU372748.1, EF426121.1 98% với các virus rota KT988220.1,KT988209.1, KT988165.1, KT988154.1, KT988143.1, KJ454599.1,KJ454598.1

So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein VP6 phân tích vớicác chủng virus rota 100% độ tương đồng với chủngALH21152.1 và99% với các chủng AIL83499.1, AFI59853.1, AHZ91014.1,AGM46790.1, AGF86310.1, ACV85661.2, AEO45626.1,ADK46567.1, ABA34211.1, ANN82937.1, ANN82935.1,ANC33794.1, ALQ76591.1, AJA72632.1

3.1.2 Tạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp mang gen mã hóa protein

BL21(DE3) bằng phương pháp sốc nhiệt Các thể biến nạp được sànglọc bằng cách nuôi cấy trên môi trường LB-Amp Tách plasmid và cắt

kiểm tra bằng hai enzyme giới hạn BamHI/SalI (Hình 3.5).

c ắt giới hạn (A) Sản phẩm PCR (B).

S ản phẩm cắt bằng enzyme hạn chế Đường chạy 1, 2, 3: Sản phẩm PCR của các khuôn plasmid t ừ 3 clones tương ứng M: thang DNA chuẩn 100 bp (Thermo Scientific).Đường chạy 4: Plasmid pET22b(+)::vp6nat c ắt bằng

c ặp enzyme cắt hạn chế BamHI/SalI.

pET22b(+)::vp6nat M: thang DNA

ch ẩn 500 bp (Thermo Scientific).

Vector biểu hiện pET22b::vp6 sau khi xử ký với hai enzyme giới hạn BamHI/SalI cho hai băng DNA có kích thước lần lượt là 1,2kb và 5,4 kb; trong đó băng 1,2kb là tương đương với kích thước của gen vp6

và băng 5,4kb tương đương với kích thước của vector pET22b(+)

Ngoài ra, để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen vp6 trong vector biểu hiện, thực hiện phản ứng PCR khuếch đại gen vp6 từ plasmid

pET22b::vp6 bằng cặp mồi VP6 F/R cho sản phẩm PCR có một băng

DNA duy nhất có kích thước khoảng 1,2kb trên bản gel điện di agarose

0,8% (Hình 3.6A), khi kiểm tra bằng xử lý enzyme giới hạn (Hình 3.6B) kết qua như mong đợi sản phẩm chứ đoạn gen vp6~1,2 kb.Như vậy, vector biểu hiện pET22b::vp6 đã được thiết kế thành công.

3.1.2.2 Nghiên c ứu biểu hiện protein VP6nat trong E.coli BL21(DE3)

Để xác định protein tạo ta là dạng protein tái tổ hợp và đặc hiệu chúngtôi tiến hành thực hiện phương pháp WB với kháng thể kháng histidine

và kháng thể kháng VP6 thương mại Kết quả được trình bày ở Hình 3.8 và 3.9 Ở cả hai bản WB đều thấy xuất hiện băng tín hiệu rõ nét có

kích thước khoảng 47kda, kích thước này phù hợp với kích thước dựđoán của VP6nat

Hình 3.8: K ết quả kiểm tra sự biểu

hi ện của 6xHis-VP6nat của chủng

E.coli BL21(DE3)/pET22::vp6.

(A) Nhu ộm ink màng , (B) Western

Blot Đường chạy 1, 3 là protein

t ổng s ố t ừ E.coli

BL21(DE3)/pET22 Đường chạy

2,4: D ịch protein tổng số từ E.coli

BL21(DE3)/pET22::vp6nat

Hình 3.9: K ết quả kiểm tra sự

bi ểu hiện protein VP6nat với mAb anti-vp6 (Abcam).(A) Màng nhu ộm ink (B) Western Blot Đường chạy 1, 2: Protein t ổng số từ BL21(DE3)/pET22::VP6nat Đường chạy M: thang protein

ch ẩn (iNtRON)

Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến tổng hợp protein VP6nat

Lượng protein VP6nat tổng hợp cao nhất khi nồng độ IPTG là 0,3

mM Nồng độ IPTG này cũng nằm trong dải phù hợp với các công bố

khi cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp ở E.coli.

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tổng hợp protein VP6nat

Tại nhiệt độ biểu hiện 370C cho thấy khả năng tổng hợp proteinVP6nat là cao nhất (17,1%) và được lựa chọn sử dụng trong nghiêncứu tiếp theo

 Ảnh hưởng của thời gian đến biểu hiện protein VP6nat

Hàm lượng protein VP6 cao nhất là 9,3% tại thời điểm 4 giờ saukhi cảm ứng Vì vậy, chúng tôi lựa chọn thời điểm thu nhận proteinVP6 là 4 giờ sau khi cảm ứng để phục vụ nghiên cứu tiếp theo

3.1.2.3 T ạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp mang gen mã hóa protein

VP6 t ối ưu (VP6opt)

3.1.2.3.1 Tối ưu hóa gen vp6 phù hợp hệ biểu hiện E.coli

Kết quả axit amin suy diễn nhận thấy, sau khi tối ưu condon trình

tự amino acid không đổi, điều này đảm bảo cho protein tổng hợp bảotồn tính chất của VP6 protein từ virus rota

3.1.2.3.2 Tách dòng gen vp6 tối ưu trong vector pET22(b+)

Tương tự quy trình tách dòng trên pET22b(+) với gen vp6 tự nhiên, chỉ khác với gen vp6opt là nguồn tổng hợp hóa học (hãng GenScrip) Gen vp6opt được khuếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu

VP6optF/R và tinh sạch bằng kit purelink PCR (invitrogen) khi sau xử

lý tạo đầu sole với cặp enzyme BamHI/ SalI Đoạn gen này được nối ghép vào vector pET22b(+) Sản phẩm nối gen vp6opt vào vector pET22b(+) được biến nạp vào tế bào E.coli BL21(DE3), trải trên đĩa

LB-Amp, ủ và chọn các khuẩn lạc mọc trên mặt thạch làm khuẩn lạc

dự tuyển

Hình 3.15: K ết quả chọn dòng bằng xử lý

enzyme c ắt hạn chế BamHI/ SalI và PCR với

c ặp mồi VP6opt Đường chạy 1: plasmid

pET22b(+)::vp6opt Đường chạy 2: plasmid

pET22b(+)::vp6opt đã được xử lý với cặp

enzyme c ắt hạn chế BamHI/ SalI Đường chạy

3: S ản phẩm PCR với cặp mồi VP6opt F/R.

Đường chạy M: thang DNA chẩn 500bp

(Fermentas)

Kết quả điện di (Hình 3.5) sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn BamHI/SalI thấy xuất hiện một băng có kích thước 1,2kb (vp6opt) và

một băng có kích thước khoảng 5,4kb (pET22b) Và kết quả sản phẩm

cắt bằng enzyme hạn chế BamHI/ SalI cũng trùng với băng của sản

phẩm PCR với cặp mồi VP6opt F/R

 Ki ểm tra trình tự gen vp6 tối ưu trên vector biểu hiện pET22b(+) Kết quả giải trình tự cho thấy trình tự gen vp6opt mức độ tương đồng

so với trình tự lý thuyết được tối ưu hóa chính xác 100% Vậy có thể

nói rằng chúng tôi đã thành công trong việc tạo cấu trúc biểu hiện gen

vp6opt trong plasmis pET22b(+) Kết quả khung đọc mở tổng hợp

VP6opt dự đoán bao gồm 430 axit amin tương đương 47kDa

 D ự đoán cấu trúc vp6 bằng phần mềm RaptorX

Sử dụng phần mềm RaptorX để kiểm tra trình tự axit amin của gen

vp6opt có nối đuôi 6His-tag tại đầu C và pelB đầu N, và đồng thời xét

trình tự VP6opt không mang His-tag và pelB

Hình 3.17: C ấu trúc 3D của protein VP6 tái tổ hợp được dự đoán bằng

ph ần mềm RaptorX (A): Trình tự axit amin của gen VP6opt không mang his-tag và pelB ở đầu C và N (B): Trình tự axit amin của gen VP6opt có n ối đuôi 6His-tag tại đầu C và pelB đầu N (87 – 96) và (231 – 240): vị trí dự đoán 2 epitope LLGTTLLNLD và

FEHIVQLRRAL

 D ự đoán trình tự epitope bằng phần mềm SVMtriP

Chúng tôi nhận thấy có khả năng tồn tại 2 epitope làLLGTTLLNLD, FEHIVQLRRAL cao nhất trong trình tự axít amincủa protein VP6 TTH (score >=0,9).Định vị trình tự LLGTTLLNLD(87-96) phía gần đầu N, thuộc vùng xoắn α và trình tựFEHIVQLRRAL (231-240) nằm ở vùng gấp nếp β trên cấu trúcmonomer của cấu trúc dự đoán trên Hình 3.17 Trên trimer, hai trình từnày đều nằm trong vùng dự đoán chứa epitope của protein VP6 virus

rota thuộc tác giả Aiyegbo, et al., (2013) Trình tự pElB và His-tag

không xuất hiện epitope chứng tỏ sự có mặt của 2 trình tự này khôngảnh hướng đến khả năng gây miễn dịch của kháng nguyên Từ kết quảphân tích trên, chúng tôi có thể khẳng định protein VP6 TTH có đủ khảnăng gây miễn dịch tạo kháng thể

3.1.2.4 Nghiên c ứu biểu hiện gen vp6 tối ưu (VP6opt )

Vậy từ kết quả western blot kiểm tra sự biểu hiện của 6xHis-tagkết luận rằng đã tạo được cấu trúc vector tái tổ hợp chứa đoạn gen