Nghiên cứu tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp và kháng thể đặc hiệu để ứng dụng phát triển que thử phát hiện nhanh virus rota

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI --- ĐỖ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN VP6 TÁI TỔ HỢP VÀ KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỂ ỨNG DỤNG PHÁT TRIỂN QUE THỬ PHÁT HIỆN NHAN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

ĐỖ THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN VP6 TÁI TỔ HỢP VÀ KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỂ ỨNG DỤNG PHÁT TRIỂN QUE

THỬ PHÁT HIỆN NHANH VIRUS ROTA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI – 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

ĐỖ THỊ THU HÀ

NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN VP6 TÁI TỔ HỢP VÀ KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỂ ỨNG DỤNG PHÁT TRIỂN QUE

THỬ PHÁT HIỆN NHANH VIRUS ROTA

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Mã số : 62420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 PGS TS TRƯƠNG QUỐC PHONG

2 GS TS NGUYỄN ĐĂNG HIỀN

HÀ NỘI – 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả Phần còn lại chưa được tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

GVHD 1

PGS TS Trương Quốc Phong

GVHD 2

GS TS Nguyễn Đăng Hiền

Nghiên cứu sinh

Đỗ Thị Thu Hà

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS TS Trương Quốc Phong – giám đốc Trung tâm nghiên cứu và phát triển CNSH, trường Đại học Bách khoa Hà Nội và GS

TS Nguyễn Đăng Hiền – giám đốc Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế

(Bộ Y tế) đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận án này;

Để hoàn thành luận án, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ và động viên từ PSG TS Tô Kim Anh, PGS TS Khuất Hữu Thanh – Nguyên ban lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu - phát triển CNSH cùng toàn thể bạn bè và đồng nghiệp Tôi xin chân thành cảm sự giúp đỡ quý báu đó;

Tôi chân thành cảm ơn tập thể cán bộ một số phòng nghiên cứu thuộc Trung tâm nghiên cứu, sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế đã tạo điều kiện giúp đỡ để tôi hoàn thành nghiên cứu của mình;

Với tất cả lòng kính yêu và biết ơn chân thành nhất, tôi xin dành cho gia đình bố, mẹ, chồng và các con, những người thân yêu đã thông cảm, động viên, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn cùng tôi trong suốt thời gian qua!

Đỗ Thị Thu Hà

MỤC LỤC I DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VI DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH IX DANH MỤC CÁC BẢNG X

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TÌNH HÌNH BỆNH TIÊU CHẢY DO VIRUS ROTA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 3

1.1.1 Tình hình nhiễm virus rota trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình nhiễm virus rota ở Việt Nam 3

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA VIRUS ROTA 4

1.2.1 Phân loại virus rota 4

1.2.2 Đặc điểm cấu trúc của virus rota 5

1.2.3 Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus rota 8

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIRUS ROTA 9

1.3.1 Quan sát bằng kính hiển vi điện tử 10

1.3.2 Phương pháp điện di 10

1.3.3 Phương pháp Real time -PCR 11

1.3.4 Phương pháp giải trình tự gen 11

1.3.5 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 11

1.3.6 Phương pháp ngưng kết hạt nhựa (latex agglutination) 12

1.3.7 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch ( immunochromatographic) 12

1.4 ĐẶC ĐIỂM PROTEIN VP6 VIRUS ROTA 12

1.4.1 Gen tổng hợp VP6 12

1.4.2 Đặc điểm protein VP6 13

1.4.2.1 Cấu trúc protein 13

1.4.2.2 Đặc tính của VP6 16

1.5 PROTEIN VP6 TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG DỤNG 18

1.5.1 Protein VP6 tái tổ hợp 18

1.5.2 Sản xuất protein tái tổ hợp trong hệ biểu hiện E coli 21

1.5.2.1 Đặc điểm E coli 21

1.5.2.2 Hệ thống pET biểu hiện protein dung hợp với 6xHis 21

1.5.2.3 Các mã hiếm khi biểu hiện protein trên E.coli 22

1.5.3 Ứng dụng kháng thể kháng VP6 trong tạo kit thử chẩn đoán 25 1.6 MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP PROTEIN TÁI TỔ HỢP26

1.6.1 Ảnh hưởng của chất cảm ứng 26

1.6.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 27

1.6.3 Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng 27

1.6.4 Ảnh hưởng của tối ưu hóa các codons 28

1.7 TINH SẠCH PROTEIN VP6 TÁI TỔ HỢP 29

1.7.1 Thu nhận và làm tan thể vùi 29

1.7.2 Tinh sạch VP6 bằng cột sắc ký ái lực AF-Chelate-650 resin gắn Ni 2+ 30

1.7.3 Tái cuộn gấp VP6 tái tổ hợp 31

1.8 SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐA DÒNG Ở ĐỘNG VẬT 31

1.8.1 Chọn lọc động vật 32

1.8.2 Quy trình gây miễn dịch và giám sát động vật 32

1.8.2.1 Chuẩn bị kháng nguyên 32

1.8.2.2 Lựa chọn tá dược 33

1.8.2.3 Đường tiêm 33

1.8.2.4 Liều lượng kháng nguyên, thể tích và số mũi tiêm 33

1.8.2.5 Giám sát động vật 33

1.8.2.6 Lấy máu 34

1.8.2.7 Tinh sạch kháng thể 34

1.9 KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH 34

1.9.1 Nguyên lý que thử 34

1.9.2 Ðặc tính các thành phần que thử 35

1.9.2.1 Hạt nano vàng (AuNPs) 35

1.9.2.2 Cộng hợp kháng thể VP6 - hạt nano vàng 36

1.9.2.3 Miếng cộng hợp 37

1.9.2.4 Miếng thấm mẫu 37

1.9.2.5 Màng nitrocellulose 38

1.9.2.6 Miếng thấm hút (absorbent pad) 38

1.10 CÁC KIT THƯƠNG MẠI CHO CHẨN ĐOÁN VIRUS ROTA 39

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG NGHIÊN CỨU 41

2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THẾT BỊ 41

2.1.1 Sơ đồ tổng thể nghiên cứu 41

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 41

2.1.3 Vật liệu 41

2.1.4 Các cặp mồi sử dụng 42

2.1.5 Các kháng thể sử dụng 43

2.1.5.1 Kháng thể cho tạo que thử 43

2.1.5.2 Kháng thể cho Western Blot và ELISA 43

2.1.6 Hóa chất và thiết bị máy móc 44

2.1.6.1 Vật liệu, hóa chất 44

2.1.6.2 Thiết bị máy móc cơ bản 45

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45

2.2.1 Các phương pháp vi sinh 45

2.2.1.1 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 45

2.2.1.2 Phương pháp giữ giống vi sinh vật 46

2.2.1.3 Phương pháp tạo tế bào khả biến 46

2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 46

2.2.2.1 Phương pháp tách chiết RNA tổng số (QIAgen RNA extract Kit) 46

2.2.2.2 Phương pháp RT – PCR 47

2.2.2.3 Phương pháp tách chiết plasmid 48

2.2.2.4 Phương pháp ghép nối gen vào vector tách dòng 48

2.2.2.5 Biến nạp vào tế bào E.coli 49

2.2.2.6 Phương pháp cắt DNA plasmid bằng enzyme giới hạn 49

2.2.2.7 Thiết kế vecter biểu hiện pET 22b(+) mang gen vp6 50

2.2.2.8 Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose bằng QIAquick Gel Extraction kit 51

2.2.2.9 Điện di DNA trên gel agarose 51

2.2.2.10 Phương pháp biểu hiện gen 52

2.2.2.11 Phương pháp điện di biến tính trên gel polyacrylamide – SDS 52

2.2.3 Phương pháp hóa sinh 53

2.2.3.1 Phương pháp tách chiết protein tổng số 53

2.2.3.2 Phương pháp tách chiết protein thể tan 53

2.2.3.3 Thu nhận và làm tan thể vùi 54

2.2.3.4 Phương pháp tinh sạch protein trên cột His-tag kết hợp tái cuộn gấp 54

2.2.3.5 Phương pháp lọc tách hạt virus rotavà các tiểu thể thành phần 55

2.2.3.6 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford 55

2.2.3.7 Phương pháp Western Blot 56

2.2.3.8 Phương pháp ELISA 56

2.2.4 Phương pháp miễn dịch học 57

2.2.4.1 Phương pháp sản xuất kháng thể 57

2.2.4.2 Phương pháp tinh sạch IgG bằng cột sắc ký ái lực gắn protein A-Sepharose 58

2.2.4.3 Phương pháp soi hiển vi miễn dịch 59

2.2.5 Phương pháp tạo que thử sắc ký miễn dịch 59

2.2.5.1 Tìm pH tối ưu cho phản ứng gắn kháng thể và nano vàng 59

2.2.5.2 Phương pháp tạo cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng 60

2.2.5.3 Phương pháp cố định kháng thể lên màng 60

2.2.5.4 Phương thức hoạt động que thử nhanh 60

2.2.5.5 Phương pháp phân tích mẫu bằng que thử 61

2.2.5.6 Phương pháp tính độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử 61

2.2.6 Các phương pháp tin sinh 61

2.2.6.1 Kiểm tra mồi bằng phần mềm FastPCR 61

2.2.6.2 Kiểm tra vị trí của các enzyme hạn chế trên gen đích bằng phần mềm Nebcutter 62

2.2.6.3 Phân tích trình tự gen bằng phần mềm NCBI (Blast,…) 62

2.2.6.4 Chuyển mã trình tự DNA sang trình tự axit amin bằng ExPASy 62

2.2.6.5 Dự đoán cấu trúc VP6 bằng phần mềm RaptorX [121] 62

2.2.6.6 Dự đoán trình tự epitope trên chuỗi axit amin bằng phần mềm SNMTriP 63

2.2.6.7 Xác định độ sạch của protein VP6 sau khi tinh sạch bằng phần mềm Quanty-One 4.6.9 (Bio-rad) 63 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64

3.1 TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VP6 TRONG E COLI 64 3.1.1 Tách dòng gen vp6 kiểu dại 64

3.1.1.1 Khuếch đại gen vp6 64

3.1.1.2 Tách dòng gen vp6 trong vector pJET1.2 65

3.1.2 Biểu hiện gen vp6 kiểu dại mã hóa protein VP6 69

3.1.2.1 Tạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp mang gen kiểu dại mã hóa protein VP6 (VP6nat) 69

3.1.2.2 Nghiên cứu biểu hiện gen vp6nat trong E coli BL21(DE3) 71

3.1.2.3 Tạo cấu trúc biểu hiện tái tổ hợp mang gen tối ưu mã hóa protein VP6 (VP6opt) 76

3.1.2.4 Nghiên cứu biểu hiện gen vp6 tối ưu trong E coli BL21(DE3) 82

3.1.3 Đánh giá so sánh biểu hiện gen vp6nat và vp6opt 87

3.2 THU NHẬN PROTEIN VP6 TÁI TỔ HỢP TINH SẠCH 88

3.2.1 Tách chiết protein VP6 88

3.2.2 Tinh sạch protein VP6 tái tổ hợp và tái cuộn gấp 89

3.2.2.1 Tinh sạch protein VP6 tái tổ hợp bằng sắc ký ái lực gắn Ni 2+ 89

3.2.2.2 Đánh giá khả năng tái cuộn gấp của protein VP6 tái tổ hợp sau tinh sạch 91

3.2.3 Đánh giá đặc tính protein VP6 tái tổ hợp sau tinh sạch 92

3.3 TẠO KHÁNG THỂ KHÁNG PROTEIN VP6 VIRUS ROTA TÁI TỔ HỢP 94

3.3.1 Quy trình gây miễn dịch trên thỏ 94

3.3.2 Xác định hiệu giá kháng thể bằng phương pháp ELISA 94

3.3.3 Thu nhận và tinh sạch kháng thể kháng protein VP6 bằng sắc ký ái lực cột protein A-Sepharose 95

3.3.4 Xác định đặc tính kháng thể 97

3.4 TẠO QUE THỬ CHẨN ĐOÁN VIRUS ROTA 100

3.4.1 Nghiên cứu điều kiện cộng hợp anti-VP6IgG với phức PEG-AuPNs 101

3.4.2 Nghiên cứu cố định kháng thể trên màng nitrocellulose 105

3.4.3 Tối ưu dịch ly giải mẫu 106

3.4.4 Khảo sát đánh giá que thử 107

3.4.4.1 Khảo sát phản ứng chéo 109

3.4.4.2 Khảo sát ngưỡng phát hiện 110

3.4.4.3 Khảo sát khả năng của que thử với các nhóm virus rota khác type 111

3.4.4.4 Khảo sát độ nhạy và độ đặc hiệu trên mẫu bệnh phẩm 113

3.4.4.5 Khảo sát thời gian bảo quản que thử 113

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 115

4.1 KẾT LUẬN 115

4.2 KIẾN NGHỊ 116

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 117

TÀI LIỆU THAM KHẢO 118

PHỤ LỤC 127

Phụ lục 1: Môi trường và hóa chất 127

Phụ lục 2: Trình tự gen vp6 trên ngân hàng dữ liệu NCBI 129

Phụ lục 3: Trình tự gen vp6 trên vector tách dòng pJET1.2 so sánh với trình tự gen ( GenBank: HQ392338.1 ) 130

Phụ lục 4: Cây phân loại theo trình tự gen vp6 của virus rota 132

Phụ lục 5: Cây phân loại theo trình tự axit amin VP6 của virus rota 133

Phụ lục 6: Kết quả giải trình tự gen vp6nat trên vector pET22b+ 134

Phụ lục 7: Kết quả giải trình tự gen vp6opt trên vector pET22b+ 137

Phụ lục 8: Trình tự gen VP6opt trên pET22b(+) so sánh với trình từ gen VP6 tổng hợp (Genscript) 141

Phụ lục 9: Kết quả tín hiệu ELISA OD 450nm 143

Phụ lục 10: Tóm tắt quy trình xét nghiệm 144

Phụ lục 11: Kết quả khảo sát thử nghiệm kit trên mẫu bệnh phẩm 146

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AP Alkaline phosphatase Enzyme Alkaline phosphatase

Anti-VP6IgG Anti VP6 protein-IgG Kháng thể kháng protein VP6 tái tổ hợp AuNPs Gold nanoparticle Hạt nano vàng

BCIP 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl

phosphate disodium salt

Muối 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium

BSA Bovine Albumine Serum Albumine huyết thanh bò

CBB Coomassie Brilliant Blue Coomassie Brilliant Blue

CBD Chitin-binding domain Vùng gắn với chitin

Deoxyribonucleic acid

Chuỗi Axit Deoxyribonucleic acid bổ sung

CFU Colony forming unit Đơn vị hình thành huẩn lạc

dATP Deoxyadenosine triphosphate Nucleotid Adenosine -A

dCTP Deoxycytidine triphosphate Nucleotid Cytidine - C

dGTP Deoxyguanosine triphosphate Nucleotid Guanosine -G

dTTP Deoxythymidine triphosphate Nucleotid Thymidine - T

DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic

dNTPs Deoxyribonucleoic Triphosphates Chứa 4 nucleotid A,T,C và G

dsRNA Double stranded Ribonucleic

DTT 1,4-Dithiothreitol 1,4-Dithiothreitol

EDC

dimethylaminopropyl) carbodiimide

1-Ethyl-3-(3-1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid Ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent

Assay

Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme

FCA Freund‟s Complete Adjuvant Tá dược toàn phần

FIA Freund‟s Incomplete Adjuvant Tá dược không toàn phần

FPLC Fast protein liquid

mAb Monoclonal Antibody Kháng thể đơn dòng

mRNA Messenger Ribonucleic Acid RNA thông tin

NBT Nitro blue tetrazolium Nitro blue tetrazolium

NHS N-Hydroxysuccinimide N-Hydroxysuccinimide

NSP Non-Structural Protein Protein phi cấu trúc

pAb Polyclonal Antibody Kháng thể da dòng

PAGE Polyacrylamide Gel

Electrophoresis Điện di trên gel polyacrylamide PBS Phosphate Buffered Saline Dung dịch đệm muối phốt phát

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

PEG Polyethylene Glycol Polyethylene Glycol

pET22(b)::vp6 pET22(b)::vp6 Vector pET22(b) mang gen vp6

Polyvac

Center for research and production of vaccines and biologicals

Trung tâm nghiên cứu sản xuất vắc xin

và sinh phẩm y tế

Primer R Primer Reverese Mồi ngược

VLPs Virus-like particles Tiểu thể giống virus

rVP6 Recombinant VP6 protein Protein VP6 tái tổ hợp

RT-PCR Reverse Transcription PCR PCR dùng enzyme phiêm mã ngược

SDS Sodium dodecyl sulphase Sodium dodecyl sulphase

TAE Tris – Acid Acetic – EDTA Tris – Acid Acetic – EDTA

TMB Tetramethylbenzidine Tetramethylbenzidine

VP6nat VP6nat - native VP6 kiểu dại

VP6opt VP6opt - optimum VP6 tối ưu

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Biểu đồ phân bố các chủng virus rota type G và P lưu hành tại Việt Nam 1998-2004 [1] 4

Hình 1 2: Cấu trúc virus rota 5

Hình 1 3: Mẫu bệnh phẩm chứa virus rota quan sát dưới kính hiển vi điện tử 9

Hình 4: Sự phân bố khác nhau của dsRNA của các chủng virus rota nh m A, B và C trên gel

polycrylamide [125] 11

Hình 5: Vị trí và hình thái của lớp protein VP6 trong hạt virus rota [7 13

Hình 6: Cấu tạo tiểu đơn vị VP6 14

Hình 7: Xác định khu vực epitope dự đoán của VP6 bằng phương pháp trao đổi H/D kết hợp khối phổ (Hydrogen–deuterium exchange mass spectroscopy)[14] 15

Hình 1 8: Chuột được gẫy nhiễm VP6, VP4 và VP7 tái tổ hợp với các đường nhiễm và tá dược khác nhau [32] 17

Hình 9: Đáp ứng miễn dịch của chuột với L lactis NZ9000/pCWA:VP6, NZ9000[54] 18

Hình : Sơ đồ vùng T-DNA của vector pILTAB 57-VP6 20

Hình 1.11: Cấu trúc vector pET 22b+ 22

Hình : Sơ đồ tinh sạch protein VP6 trên cột sắc ký ái lực gắn Ni2+ 30

Hình 1 13:Cấu tạo que thử phát hiện nhanh virus rota 35

Hình 1 14:Một kháng thể được cộng hợp với hạt nano vàng đã gắn sẵn lớp PEG [169] 37

Hình 1 15: Bộ kit SD bioline rotavirus (Hàn Quốc) 40

Hình 2 1: Sơ đồ vector tách dòng pJET1.2/blunt (Thermo scientific) [173] 42

Hình 2 2: Vùng tách dòng và biểu hiện trên vector pET22b(+) [172] 42

Hình : Sơ đồ tạo cấu trúc tái tổ hợp mang gen vp6nat trên vector pET22b(+) 50

Hình 4: Sơ đồ tạo cấu trúc tái tổ hợp mang gen vp6opt trên vector pET22b(+) 50

Hình : Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen vp6 trên gel agarose 0,8% 64

Hình 3 2: Phổ điện di sản phẩm PCR thu được từ 6 dòng với cặp mồi VP6nat đặc hiệu 66

Hình 3.3: Kết quả chọn dòng bằng xử lý plasmid pJET::vp6 với enzyme cắt hạn chế BamHI/SalI 67

Hình 3 4: Trình tự nucleotide với trình tự axit amin tương ứng suy diễn của gen tách dòng gen vp6 trên pJET1.2/blunt 69

Hình 3 5: Kết quả xử lý 2 plasmid pET22b(+) và pJET1.2::vp6nat bằng BamHI/SalI 69

Hình 3.6: Kết quả chọn dòng E coli BL21(DE3) tái tổ hợp bằng phương pháp PCR và cắt hạn chế 70

Hình 3.7: Trình tự nucleotide và axit amin suy diễn trên vector biểu hiện pET22b(+) 71

Hình 3.8: Kết quả kiểm tra sự biểu hiện gen vp6nat trong E coli BL21(DE3) /pET22::vp6 72

Hình 3.9: Kết quả kiểm tra sự biểu hiện gen vp6nat bằng WB sử dụng kháng thể đơn dòng kháng VP6 73

Hình 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ cảm ứng tới biểu hiện gen vp6nat 73

Hình 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ cảm ứng tới biểu hiện gen vp6nat 74

Hình 3.12: Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng tới biểu hiện gen vp6nat 75

Hình 3.13: Tối ưu mã di truyền gen vp6 của virus rota 77

Hình 3.14: So sánh trình tự gen vp6 trước và sau khi tối ưu mã di truyền tương ứng trình tự axit amin suy diễn 78

Hình 3.15: Kết quả chọn dòng bằng xử lý enzyme cắt hạn chế BamHI/ SalI và PCR với cặp mồi VP6opt 79

Hình 6: Khung đọc mở dịch mã tổng hợp protein VP6 trong vector pET22b(+) 80

Hình 3.17: Cấu trúc 3D của protein VP6 tái tổ hợp được dự đoán bằng phần mềm RaptorX 81

Hình 3 18:Ví trí các epitope dự đoán trên VP6 protein bằng phần mềm SVMtriP 82

Hình 3 19: Kết quả kiểm tra sự biểu hiện của 6xHis-VP6opt ở chủng E coli BL2(DE3) 83

Hình 3.20: Kết quả kiểm tra sự biểu hiện protein VP6 với mAb kháng VP6 (Abcam) 84

Hình 3.21: Ảnh hưởng của nồng độ cảm ứng tới biểu hiện gen vp6opt 85

Hình 3.22: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới biểu hiện gen vp6opt 86

Hình 3.23: Ảnh hưởng của thời gian tới biểu hiện gen vp6opt 87

Hình 3 24: So sánh khả năng biểu hiện gen vp6 tự nhiên và tối ưu trên cùng hệ biểu hiện 87

Hình 3.25: Kết quả xử lý và hòa tan protein bằng phương pháp 89

Hình 3 26: Kết quả tinh sạch protein VP6 TTH bằng sắc ký ái lực giữa His-tag và Ni2+ 90

Hình 3 27: Kết quả ELISA đánh giá khả năng tái cuộn gấp của protein VP6 TTH tinh sạch 92

Hình 3 28: Kết quả kiểm tra sự đặc hiệu của protein VP6 bằng phương pháp WB 93

Hình 3.29: Kết quả ELISA đánh giá trạng thái cấu trúc VP6 TTH so với VP6 tự nhiên 93

Hình 3 30: Hiệu giá kháng thể kháng VP6 protein virus rota tại các thời điểm lấy máu 95

Hình 3 31: Sắc ký đồ tinh sạch IgG từ huyết thanh thỏ sử dụng cột protein A-Sapharose 96

Hình 3.32: Phổ điện di tinh sạch kháng thể thỏ kháng VP6 TTH virus rota 97

Hình 3 33: Kết quả Western Blot kiểm tra độ đặc hiệu của kháng thể kháng protein VP6 TTH so với VP6 tự nhiên 98

Hình 3 34: Kết quả ELISA đánh giá khả năng nhận biết của anti-VP6IgG với kháng nguyên VP6 TTH và VP6 tự nhiên 99

Hình 5: Đánh giá khả năng nhận biết của anti-VP6IgG với các vùng bộ lộ epiope của VP6 protein trên hạt virus rota nguyên vẹn 100

Hình 3 36: Thử nghiệm thiết lập que thử với điều kiện ban đầu 101

Hình 3.37: Ảnh hưởng nồng độ anti-VP6IgG với phức PEG-AuNPs 102

Hình 3.38: Ảnh hưởng của nồng độ anti-VP6IgG với phức PEG-AuNPs tới tín hiệu vạch kiểm tra và kiểm chứng trên que thử 102

Hình 3.39: Ảnh hưởng của pH cộng hợp anti-VP6IgG với phức PEG-AuNPs 103

Hình 3.40: Ảnh hưởng nồng độ EDC/NHS tới cộng hợp anti-VP6IgG với phức PEG-AuNPs 104

Hình 3.41: Ảnh hưởng nhiệt độ cộng hợp anti-VP6IgG với phức PEG-AuNPs 104

Hình 3.42: Ảnh hưởng thời gian cộng hợp anti-VP6IgGt với phức PEG-AuNPs 105

Hình 3.43: Kết quả ảnh hưởng của nồng độ vạch kiểm chứng (control line) ảnh hưởng đến tín hiệu của que thử 106

Hình 3.44: Ảnh hưởng của dịch ly giải mẫu tới tín hiệu của que thử 106

Hình 3 45: Ảnh chụp TEM mẫu virus rota trên màng lọc 100kDa 107

Hình 3 46: Ảnh chụp TEM các tiểu thể của virus rota dưới màng lọc 100kDa 108

Hình 3 47: Ảnh chụp TEM mẫu bệnh phẩm 108

Hình 3 48: Kết quả đánh giá khả năng phát hiện của que thử 108

Hình 3.49: Kiểm tra phản ứng chéo của que thử với 14 tác nhân gây bệnh tiêu chảy 109

Hình 3 50: Kiểm tra ngưỡng phát hiện của que thử 110

Hình 3.51: Kết quả que thử với các type virus rota 112

Hình 3 52: Kết quả bảo quản que thử trong 7 tháng và 9 tháng bảo quản ở điều kiện (40C và nhiệt độ phòng) 113

Hình 3 53: Thử nghiệm que thử trên mẫu bệnh phẩm dương tính với virus rota 147

Hình 3 54: Thử nghiệm que thử trên mẫu bệnh phẩm âm tính với virus rota 149

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1: Gen tổng hợp protein của virus rota, vị trí và chức năng 6

Bảng : Phân tích các mã sử dụng của E coli cho gen vp6 tự nhiên và gen vp6 tối ưu các codon [ 23

Bảng : Đánh giá so sánh biểu hiện VP6nat và VP6opt trên cùng 1 hệ biểu hiện 88

Bảng 3 2: Các số liệu thu hồi và tinh sạch protein VP6 91

Bảng 3 3: Kết quả hiệu giá kháng thể kháng protein VP6 tái tổ hợp 94

Bảng 4: Điều kiện tạo kit thử nghiệm 110

Bảng 3 5: Kết quả tổng hợp khảo sát thử nghiệm kit trên mẫu bệnh phẩm 113

ĐẶT VẤN ĐỀ

Virus rota là nguyên nhân gây tử vong do tiêu chảy cao nhất ở trẻ em dưới 5 tuổi Hàng năm virus này đã làm cho khoảng 25 triệu trẻ mắc bệnh trong đ c triệu trẻ phải nhập viện và đã gây tử vong hơn 6 trẻ, trong số này hơn 8 là ở các nước đang phát triển [119] Theo số liệu thống kê tại Việt Nam, hàng năm tỷ lệ mắc tiêu chảy do virus rota chiếm trên 50% trong tổng số trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy [6] Bệnh tiêu chảy do virus rota gây ảnh hưởng lớn đến sự tăng trưởng của trẻ và là gánh nặng kinh tế đối với toàn xã hội, mỗi năm chi phí để điều trị tiêu chảy do loài virus này ở nước ta lên tới 5,3 triệu đô la Mỹ, trong

đ , triệu cho chi phí y tế trực tiếp, khoảng 685.000 cho chi phí không thuộc lĩnh vực y tế

và 1,5 triệu khác cho chi phí gián tiếp [35, 45, 103]

Việc sử dụng vắc xin đã ngăn ngừa được 74% trẻ nhỏ không bị nhiễm virus rota [113] Nhưng thực tế, giá thành của vắc xin rota là một trở ngại đối với các nước đang phát triển

Do đ , hiện nay còn một t lệ lớn trẻ dưới 5 tuổi chưa được chủng ngừa bằng vắc xin nên t lệ trẻ nhiễm virus rota là rất cao, chiếm 5 số trẻ tiêu chảy phải nhập viện [3] Không giống như nhiễm khuẩn, bệnh tiêu chảy do virus rota không thể sử dụng kháng sinh, vì vậy việc chẩn đoán nhanh, xác định chính xác được căn nguyên gây bệnh để c phương án điều trị hợp

lý là rất cần thiết Các phương pháp chẩn đoán virus rota được Tổ chức y tế thế giới (WHO) khuyến cáo bao gồm: (1) nhận diện virus rota bằng kính hiển vi điện tử; (2) phát hiện vật liệu

di truyền của virus; (3) phát hiện kháng nguyên virus bằng một số kỹ thuật miễn dịch Mỗi phương pháp đều có những ưu, nhược điểm điểm như điều kiện thực hiện, giá thành phép thử, thời gian thực hiện Phương pháp chẩn đoán dựa vào kháng nguyên (ELISA, ngưng kết hạt nhựa - latex agglutination và sắc ký miễn dịch) được đánh giá c ưu thế hơn bởi một số ưu điểm như nhanh, đơn giản, chính xác, giá thành hợp lý có thể áp dụng trên quy mô mẫu bệnh lớn Các phương pháp như quan sát hình thái và phát hiện vật liệu di truyền (PCR, Real time-PCR) thường ch phù hợp dùng trong các phòng nghiên cứu, trung tâm giám sát dịch tễ Hiện nay, các bệnh viện và cơ sở y tế chủ yếu dùng kit nhanh dạng que thử để phát hiện virus rota trong mẫu phân bệnh nhân Tuy nhiên, các kit này đều phải nhập khẩu, giá thành cao và không chủ động nguồn sinh phẩm

Cấu trúc virus rota gồm có 3 lớp capsit; lớp ngoài là do protein VP7, VP4 tạo thành, lớp trong do VP2 và protein capsit nằm ở giữa của virus rota là VP6 tạo thành Virus rota được chia thành 7 nhóm (A, B, C, D, E, F và G) phụ thuộc vào kháng nguyên của các protein capsit ngoài, ch có nhóm A, B và C gây bệnh cho người và động vật [107] Protein VP6 chiếm hơn 5 khối lượng hạt virus và có tính bảo thủ cao với độ tương đồng khoảng 92%

về trình tự axit amin giữa các chủng virus rota nhóm A [68, 129] Protein VP6 được coi là

kháng nguyên chung cho tất cả virus thuộc nhóm A [75], nhóm được coi là nguyên nhân chính (chiếm 90%) gây tiêu chảy thể nặng ở người, đặc biệt là trẻ dưới 5 tuổi [16] Do có tính bảo thủ cho các chủng virus rota thuộc nhóm A nên protein VP6 được coi như là một dấu ch sinh học xác định virus rota [56, 109, 160] Đã c một số nghiên cứu ứng dụng protein VP6

để phát triển vắc xin tiểu phần [130], sử dụng làm kháng nguyên tạo kháng thể đặc hiệu cho phục vụ cho chẩn đoán virus rota bằng phương pháp ELISA hoặc sắc ký miễn dịch [98, 170]

Xuất phát từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu

đề tài: " Nghiên cứu tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp và kháng thể đặc hiệu để ứng dụng

phát triển que thử phát hiện nhanh virus rota"

Với các mục tiêu:

- Tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp của virus rota

- Tạo kháng thể đặc hiệu kháng protein VP6 virus rota

- Thử nghiệm ứng dụng cho phát triển que thử phát hiện nhanh virus rota dựa vào nguyên lý sắc ký miễn dịch

Nội dung nghiên cứu:

- Nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein VP6 tái tổ hợp, tạo chủng

E.coli BL21(DE3) mang pET22(b)::vp6 và nghiên cứu điều kiện biểu hiện VP6

tái tổ hợp từ gen dạng dại và tối ưu h a gen tổng hợp

- Nghiên cứu điều kiện thu hồi và tinh sạch kháng nguyên VP6 tái tổ hợp và đặc tính kháng nguyên VP6

- Nghiên cứu gây miễn dịch thu kháng thể đặc hiệu kháng VP6 tái tổ hợp, xác định tính đặc hiệu kháng thể

- Ứng dụng kháng thể kháng VP6 tái tổ hợp tạo que thử phát hiện nhanh rota vius

Những đóng góp mới của luận án :

- Tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa protein VP6 của virus rota phân lập

tại Việt Nam Trên cơ sở đã tối ưu h a trình tự gen vp6 để tăng hiệu suất biểu hiện protein VP6 trong E coli đạt 0,24 mg/ ml dịch nuôi

- Tạo được nguồn kháng nguyên VP6 tái tổ hợp c đặc tính tương tự kháng nguyên VP6 tự nhiên của virus rota và kháng thể đa dòng kháng VP6 tái tổ hợp

- Bước đầu thử nghiệm ứng dụng kháng thể kháng protein VP6 tạo que thử nhanh dựa trên nguyên tắc sắc ký miễn dịch cho phát hiện nhanh virus rota đạt được kết quả tốt trong phạm vi thử nghiệm C ý nghĩa ứng dụng thực tiễn cao

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÌNH HÌNH BỆNH TIÊU CHẢY DO VIRUS ROTA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.1.1 Tình hình nhiễm virus rota trên thế giới

Năm 97 , Bishop et al., quan sát dưới kính hiển vi điện tử mảnh sinh thiết niêm mạc

ruột của một em bé chết vì tiêu chảy cấp đã phát hiện ra một loại virus c đường kính hơn 7

nm, thuộc giống Reovirus Theo thống kê bệnh tiêu chảy là một trong những nguyên nhân gây bệnh và tử vong cho trẻ em ở các nước đang phát triển, người ta ước tính trên thế giới hàng năm c 5 triệu trẻ em dưới năm tuổi mắc ít nhất một đợt tiêu chảy và 4 triệu trẻ em dưới 5 tuổi hàng năm chết vì bệnh tiêu chảy Tiêu chảy là nguyên nhân thứ hai gây tử vong cho trẻ

em sau nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính, 80% tử vong do tiêu chảy xảy ra ở trẻ dưới 2 tuổi Một phần ba số trẻ em tử vong dưới 5 tuổi có liên quan tới tiêu chảy cấp, trong đ virus rota là căn nguyên hàng đầu Virus rota có phạm vi lưu hành trên khắp các châu lục [157, 162]

Tỷ lệ phát hiện virus rota tuy khác nhau giữa các nước nhưng bệnh vẫn tập trung chủ yếu ở trẻ em dưới 5 tuổi và thường vào mùa khô lạnh Ước tính đến tháng 4 năm 6, tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính trên toàn cầu trung bình có 215.000 trẻ dưới 5 tuổi tử vong do tiêu chảy bởi virus rota Số lượng trẻ chết nhiều nhất là Ấn Độ (47.100 trẻ em) chiếm

22 %, 4 quốc gia Ấn Độ, Nigeria, Pakistan và Cộng hòa Fdân chủ Congo chiếm khoảng một nửa (49 %) của tất cả các ước tính trường hợp tử vong do virus rota vào năm [177]

1.1.2 Tình hình nhiễm virus rota ở Việt Nam

Ở Việt Nam, năm 98 mới nghiên cứu và xác định virus này là nguyên nhân chính gây nên bệnh tiêu chảy ở trẻ em, theo thống kê dịch tễ tỷ lệ trẻ em mắc bệnh tiêu chảy cấp do virus rota chiếm trên 50% trong tổng số trẻ mắc tiêu chảy cấp phải nhập viện hàng năm, số trẻ chết do virus rota chiếm từ 4% - 8% trong tổng số trẻ dưới 5 tuổi bị chết vì mọi nguyên nhân [4] Bình quân ở nước ta, 1 trẻ dưới 5 tuổi mỗi năm mắc từ 0,8 - , đợt tiêu chảy [6, 103] Tiêu chảy là nguyên nhân hàng đầu gây suy dinh dưỡng, ảnh hưởng tới sự tăng trưởng của trẻ Bệnh tiêu chảy ở trẻ em và người lớn có những căn nguyên cũng như biểu hiện tương đối giống nhau Tuy nhiên do chưa hoàn ch nh về hệ miễn dịch nên trẻ em là đối tượng nhạy cảm hơn với nguồn bệnh và khối lượng nước ở trẻ em (70 - 8 ) cao hơn so với người lớn (50 - 60%) dẫn đến nguy cơ mất nước lớn gây nên việc trẻ tiêu chảy dễ đối mặt với nguy cơ

tử vong cao hơn Theo kết quả giám sát bệnh tiêu chảy do virus rota tại các bệnh viện chính

của Việt Nam từ 998 đến 2004 (Hình 1.1) cho thấy rằng chủng virus rota lưu hành tại nước

ta chiếm phần lớn là type G P(8), đây cũng là type gây bệnh phổ biến trên toàn thế giới

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA VIRUS ROTA

1.2.1 Phân loại virus rota

Virus rota gây bệnh ở người và động vật được chia thành 7 nhóm A, B, C, D, E, F và

G, ch có nhóm A, B, C gây bệnh cho cả người và động vật Trong đ , nh m A hay gặp nhất, gây ra hầu hết các ca dịch tiêu chảy nặng ở trẻ em Nhóm B là nhóm duy nhất gây tiêu chảy ở người lớn và ch được phát hiện ở một số nước Châu Á Nh m C cũng gây bệnh ở trẻ em nhưng rất hiếm gặp Nhóm D, E, F, G ch thấy ở động vật [107, 132]

Virus rota được phân loại nhóm dựa vào tính kháng nguyên của các protein capsit lớp ngoài Capsit trong (VP6) mang kháng nguyên đặc hiệu nhóm, capsit ngoài (VP4, VP7) mang kháng nguyên đặc hiệu type Type huyết thanh G đại diện cho VP7 và type P đại diện cho VP4 Cho đến nay có 23 type G đã được xác định bằng ELISA và 11 trong số đ được phân lập từ người, trong khi đ ch 12 trong 32 type P đã xác định được phân lập từ người [107], [134] Các type huyết thanh phổ biến gây bệnh cho người là G1P(8), G2P(9), G3P(8), và G4P(8) và một tỷ lệ nhỏ G5, G8 và G9 [105, 134] Trước năm 6 chủng G1P(8) chiếm tỷ lệ cao nhất, chủng G3 ch chiếm 3,3% các chủng phân lập được trên thế giới cũng như ở Việt nam Từ năm 6, chủng G3P(8) là chủng lưu hành rộng rãi ở phía Bắc nước ta Chủng này

có nguồn gốc từ Trung Quốc và Nhật Bản Trên thế giới tần suất phát hiện chủng G tăng dần vào những năm 4 [45] Việc xuất hiện đột ngột và chiếm ưu thế của các chủng G3 cho thấy sự cần thiết phải liên tục giám sát các chủng virus lưu hành đặc biệt là sau khi vắc xin phòng virus rota được sử dụng

Virus rota gây nhiễm động vật đã vượt qua hàng rào ngăn cản loài để gây nhiễm cho người do chúng đã trải qua quá trình tổ hợp và sắp xếp lại hệ gen giữa các đồng chủng (homologous) và dị chủng (heterologous) dựa vào hệ gen phân đoạn của mình [12, 55, 96] Bên cạnh khả năng sắp xếp và tái tổ hợp lại hệ gen, những đột biến điểm và sự tích lũy các đột biến điểm cũng được nghiên cứu [134] Hiện tại đã c cụm kiểu gen P(8) (gọi là P(8)-1, P(8)-2, và P(8)- ) trong đ chủng vắc xin Rotarix thuộc nhóm P(8)-1 còn các chủng P(8) lưu hành tại thời điểm 2006-2009 lại thuộc nhóm P(8)-2, và P(8)- Như vậy nguồn gen virus rota gây nhiễm cho người ngày càng tăng do sự tái tổ hợp khác nhau của các type huyết thanh P và

G, của các đơn type khác nhau trong cùng một kiểu huyết thanh Do vậy, việc phát triển một loại vắc xin có hiệu lực đối với tất cả các dạng virus rota cần quan tâm đến yếu tố này Tuy nhiên điều may mắn là một type huyết thanh virus rota cũng c thể gây ra miễn dịch bảo vệ đối với type khác [50, 96]

1.2.2 Đặc điểm cấu trúc của virus rota

Virus rota có dạng khối cầu 20 mặt, đường kính ~74nm Chuỗi nuleocapsit của virus hình thành bởi 3 vòng gấp đồng tâm do đoạn RNA kép tạo thành Capsit của virus đối xứng 20 mặt, do 132 capsomer sắp xếp đối xứng gấp

Hình 1 2: Cấu trúc virus rota (vwww.reoviridae.or)

Virus rota có dạng khối cầu 20 mặt, được cấu tạo nên bởi 6 protein cấu trúc (VP1-VP7)

và 6 protein phi cấu trúc (NSP1-NSP6) do 11 mảnh gen mã hóa Protein VP2 và VP6 tạo nên các hạt hai lớp được phủ bởi lớp protein VP7, VP4 dimer tạo nên lớp mạng nhện nhô ra phía

ngoài

Vật liệu di truyền của virus rotalà RNA sợi đôi Hệ gen của virus rota phân mảnh, gồm đoạn RNA c kích thước 660-3300 bp mã hóa cho 12 protein: 6 protein cấu trúc VP1 (125 kDa), VP2( 94 kDa), VP3 (88 kDa), VP4 (88 kDa), VP6 (44 kDa), VP7 (38 kDa) và 6 protein phi cấu trúc NSP1(53 kDa), NSP2 (34 kDa), NSP3 (35 kDa), NSP4 (28 kDa), NSP5 (26 kDa), NSP6 ( kDa) Đoạn gen 11 mã hóa cho 2 protein NSP5, NSP6 [58]

 Đặc điểm gen tổng hợp protein của virus rota

Bảng 1 1: Gen tổng hợp protein của virus rota, vị trí và chức năng

mã (protein trưởng thành)

% trọng lượng

so với hạt

Vị trí và chức nănga Tên (kDa)

b

polymerase, liên kết RNA, tương tác với VP2 và VP3

2 2687 VP2 102,4 Myristylation

(nhóm axit myristic liên kết hóa trị với amide,

kỵ nước và liên kết màng)

15 Protein lõi trong; gắn với

RNA; kẹp leucine (axit amin

1,5 Protein bề mặt (dimer)

Glycoprotein kháng nguyên (hemagglutinin)

Trung hòa kháng nguyên (serotype đặc hiệu) protein tổng hợp màng tế bào

C độc lực và có khả năng gây bệnh

5 1581 NSP1 58,6 Phi cấu trúc Liên kết với RNA, zinc fingers

- protein liên kết với các Zn2+

mục đích tạo nếp gấp ổn định

6 1356 VP6 44,8 Myristylation 51 Protein lõi trong, trimer, kỵ

nước, phân nhóm kháng nguyên, cần thiết cho quá trình phiên mã

7 1104 NSP2 34,6 Phi cấu trúc Quan trọng đối với sự sao chép

của hệ gen virus, thành phần chính của thể vùi, NTPase, liên kết với RNA, tương tác với NSP5

8 1059 NSP3 36,6 Phi cấu trúc Quan trọng đối với sự sao chép

của hệ gen virus và

là thành phần của thể vùi

9 1062 VP7 34,3 Chứa tín hiệu cắt

glycosyl hoá gắn nhóm mannose mức cao

30 glycoprotein màng với ER

(mạng lưới nội chất), protein

gắn với tế bào, trung hòa

kháng nguyên, hai vùng NH2- đầu cuối kỵ nước, vùng gắn Ca2+ (axit amin 127 tới 157)

10 751 NSP4 20,2 Phi cấu trúc

Tín hiệu dẫn không cắt, glycosyl hoá gắn nhóm mannose mức cao

glycoprotein xuyên màng liên kết với ER, có vai trò trong hình thái, chứa độc tố ruột

11 667 NSP5 21,7 Phi cấu trúc

Phosphoryl hoá, glycosyl hóa

O-Thành phần của thể vùi, tương tác với NSP2, gắn RNA, protein kinase

a

Một số các chức năng được biết tham khảo của Estes., et al, 2001 [55] và Pesavento., et al,

2006 [122]

b

Trọng lượng phân tử xác định bởi phương pháp SDS-page

 Các protein phi cấu trúc:

Protein NSP được mã hóa bởi đoạn gen 5, là độc tố của virus rota đối với chuột nhưng lại không độc đối với lợn hay thỏ Một nghiên cứu gần đây cho rằng NSP1 phá vỡ đáp

ứng miễn dịch tự nhiên bằng cách phân hủy yếu tố điều hòa interferon 3 (IRF3) [19] Protein NSP được mã hóa bởi đoạn gen 7 là một oligo NTPase có hoạt tính phá vỡ sự bền vững của cấu trúc gấp và có thể protein này cũng c vai trò trong quá trình đ ng g i RNA và độc tính của virus Protein NSP được mã hóa bởi đoạn gen 8, liên kết với eIF4G (protein liên quan đến quá trình phiên mã) và ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào qua đ tăng cường quá trình dịch mã trên mRNA của virus [156] Chức năng cụ thể của 2 protein NSP5 và NSP6 vẫn chưa được rõ, tuy nhiên dựa vào khả năng liên kết của chúng với RNA cho thấy có thể chức năng của chúng là vận chuyển các protein khác của virus từ nơi tổng hợp vào khu vực virus lắp ráp trong tế bào chất, hoặc tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đ ng g i RNA, hoặc tham gia vào quá trình di chuyển các hạt virus từ tế bào chất vào mạng lưới nội chất [120] Protein NSP4 được mã hóa bởi đoạn gen 10 có chức năng định hình virus, mang hoạt tính như thụ thể đối với hạt 2 lớp nhờ đ các hạt virus này đi vào trong khoang của mạng lưới nội chất nhờ hình thức nảy chồi NSP4 cũng là một độc tố ruột quan trọng tham gia vào quá trình phát sinh bệnh [17]

1.2.3 Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus rota

Sự xâm nhiễm, nhân lên, đ ng g i và giải phóng virus gồm các bước cơ bản sau: (1) Giai đoạn hấp phụ qua trung gian VP4 và VP7 (2) Thâm nhập vào tế bào và cởi vỏ (3) Tổng hợp vật liệu di truyền và dịch mã tổng hợp protein virus và (4) Lắp ráp và giải phóng các hạt virus

 Giai đoạn hấp phụ

Virus rota thường gây nhiễm tế bào nhung mao trưởng thành ở ruột non, với cấu tạo

có ba lớp protein capsit giúp virus vượt qua điều kiện pH thấp và các enzyme tiêu hóa trong đường ruột Một số chủng virus rota gây nhiễm trên động vật cần axit silic trên bề mặt tế bào

để quá trình hấp phụ thành công trong khi đ virus rota gây nhiễm trên người thì không phụ thuộc axit silic [78-79, 128]

 Thâm nhập vào tế bào và cởi vỏ

Sau khi gây nhiễm, protein VP4 đ ng vai trò là thụ thể, cho phép virus thâm nhập vào

tế bào VP4 được cắt bởi trypsin thành VP8 và VP5 giúp cho việc thâm nhập tế bào dễ dàng hơn Khi đã ở trong tế bào, transcriptase của virus được hoạt h a để phiên mã vật liệu di truyền Quá trình này được kích thích bởi giai đoạn cởi áo virus và quá trình protein VP4 và VP7 tách ra khỏi cấu trúc 3 lớp của virus Quá trình tách vỏ VP4 và VP7 có thể do ảnh hưởng của nồng độ Ca2+ trong nội bào [44]

 Tổng hợp vật liệu di truyền và dịch mã tổng hợp protein virus

Sau khi hoàn thành quá trình cởi vỏ, hoạt tính RNA polymerase của phức hợp

VP1-VP được hoạt hóa trong cấu trúc 2 lớp của virus dẫn đến quá trình phiên mã và nhô ra của 11 sợi mRNA từ cấu trúc 2 lớp này Sợi RNA thông tin chịu trách nhiệm cho cả quá trình giải mã

và tổng hợp sợi RNA âm tính để tạo sợi RNA kép Lõi trung gian được hình thành, mRNAs dịch mã trong polysomes tạo 12 protein virus (6 protein cấu trúc và 6 protein phi cấu trúc) Cả sợi RNA dương và âm đều có thể tìm thấy sau 3 giờ nhiễm virus Quá trình phiên mã đạt đ nh cao trong khoảng 9-12 giờ sau khi nhiễm [146]

 Lắp ráp và giải phóng các hạt virus

Quá trình này xảy ở mạng lưới nội chất của tế bào (ER), cấu trúc không hoàn ch nh của hạt virus được lắp ráp trong tế bào chất sau đ qua lưới nội chất cùng với protein VP7 và NSP4 tạo nên hạt virus có vỏ NSP4 và có thể cả VP4 có hoạt tính làm tan màng cùng với nồng độ Ca2+ cao trong dịch của ER giúp cho việc loại bỏ vỏ lipid tạm thời Nhiều nghiên cứu

đã ch rằng, việc tích lũy cao nồng độ Ca2+

trong mạng lưới nội chất giúp cho việc ổn định việc hình thành các hạt virus hoàn ch nh [128] Sự tăng cao nồng độ Ca2+ trong tế bào dẫn đến việc thay đổi tính thấm của màng plasma do việc bù Ca2+ từ ngoại bào vào bên trong tế bào, kết quả là tế bào bị mất nước trong quá trình thải virus qua phân ra ngoài môi trường

Quá trình này là đ nh điểm của việc nhiễm virus rota, bệnh phẩm có thể lên tới 109

-1010 hạt virus/ ml [74] Trong bệnh phẩm ngoài có các hạt virus nguyên vẹn, còn chứa các tiểu thể, thành phần hạt đ ng g i chưa hoàn toàn và một số hạt đang ở giai đoạn suy thoái (Hình 1.3) [126]

Hình 1 3: Mẫu bệnh phẩm chứa virus rota quan sát dưới kính hiển vi điện tử

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIRUS ROTA

Khi các tác nhân gây tiêu chảy xâm nhập vào đường tiêu hóa sẽ sản xuất ra các độc tố

ruột (enterotoxin) kích thích bài tiết các chất điện giải, xâm lấn trực tiếp và phá hủy tế bào biểu mô niêm mạc ruột gây tổn thương tại ruột và toàn thân Các nguyên nhân tiêu chảy như

100nm

Hạt nguyên vẹn

Hạt đóng gói chưa hoàn toàn Hạt trong giai đoạn suy thoái

đã biết có thể là do các nguyên nhân do vi sinh vật như vi khuẩn, ký sinh trùng hoặc virus Do với mỗi loại tác nhân gây tiêu chảy sẽ có một cách điều trị khác nhau, việc xét nghiệm phân tìm nguyên nhân tiêu chảy là một khâu rất quan trọng để bác sĩ đưa ra phác đồ điều trị bệnh hợp lý

Vậy việc xác định nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy c ý nghĩa quan trọng đến việc điều trị, giải quyết xử lý ngay tại các bệnh viện địa phương giảm tải cho các bệnh viện tuyến trên

Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp phát hiện sự có mặt virus rota: kính hiển

vi điện tử, phát hiện kháng nguyên (miễn dịch enzyme, ngưng kết latex và sắc ký miễn dịch), phát hiện axit nucleic (điện di polyacrylamide –PAGE, khuếch đại axit nucleic RT-PCR, giải trình tự gen)…Phần lớn các phương pháp này tương đối hiệu quả cho xác định virus rota, mỗi phương pháp đều có những ưu, nhược điểm riêng của n Các phương pháp này đều được WHO khuyến cáo sử dụng trong những trường hợp nhất định, trong đ phương pháp được khuyến cáo sử dụng trong xét nghiệm tại các cơ sở y tế đ là ELISA và que thử sắc ký miễn dịch (WHO, 2009) [162]

1.3.1 Quan sát bằng kính hiển vi điện tử

Kính hiển vi điện tử có khả năng phát hiện chính xác virus rota qua hình thái Phương pháp này xác định được hình dạng của virus rota nhưng phải cần số hạt virus đủ lớn Mặt khác phương pháp này cũng không phù hợp trong việc phát hiện virus rota cho một lượng lớn mẫu phân Kính hiển vi điện tử là thiết bị đắt tiền và nhân viên phải được đào tạo chuyên sâu, đặc biệt sử dụng phương pháp này không thể phân biệt được giữa các nhóm virus rota khác nhau [4, 123]

1.3.2 Phương pháp điện di

Mười một đoạn dsRNA virus rota có thể được phát hiện trong các mẫu lâm sàng bằng cách tách chiết RNA và phân tích bằng điện di trên gel polyacrylamide sau đ nhuộm bạc Khi điện di qua gel polyarcylamide các đại phân tử RNA tích điện âm này phân tách theo kích thước Các nhóm virus rota ở người A, B và C có sự phân bố các đoạn gen khác nhau Kết quả điện di dựa trên sự phân bố đặc trưng sẽ tương ứng với sự có mặt của một nh m đặc hiệu virus rota nào đ Điện di bộ gen của virus rota cho phép phát hiện và phân loại virus thành hai nh m electrophorotypes dài (L) hay ngắn (S) dựa vào kiểu hình di truyền của các mảnh

và trên gel polyacrylamide Phương pháp này tương đối khó, mất nhiều thời gian, đòi hỏi nhân viên phải có nghiệp vụ, nhưng lợi thế chính của PAGE là cho kết quả rõ ràng [82]

Hình 1 4: Sự phân bố khác nhau của dsRNA của các chủng virus rota nh m A, B và C trên

gel 10% polycrylamide [125]

1.3.3 Phương pháp Real time -PCR

Phương pháp này được phát triển dựa trên các cặp mồi đặc hiệu cho các gen virus rota khác nhau [53, 69, 88] Phương pháp c độ nhạy rất cao có thể phát hiện ở nồng độ thấp vài phân tử, tương đối nhanh và c độ tin cậy cao tuy nhiên phương pháp đòi hỏi các thiết bị chuyên dụng và các nhân viên phải được đào tạo chuyên sâu, chi phí hóa chất cao Việc định type cũng c thể thực hiện được bằng phương pháp semi-nested PCR với các mồi đặc hiệu cho các vùng gen mã hóa VP7 (type G) hoặc VP4 (type P) [60, 69]

1.3.4 Phương pháp giải trình tự gen

Phương pháp giải trình tự gen: được sử dụng khi gặp các chủng không thể định type bằng các phương pháp trên do biến đổi di truyền từ các chủng phổ biến hoặc là các chủng mới Các nhà nghiên cứu đã đọc trình tự nucleotide để xác định các chủng này và thiết kế lại các mồi định type Đọc trình tự cũng c thể được sử dụng để khẳng định các kết quả định type [73, 83]

1.3.5 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

ELISA là phương pháp phát hiện kháng nguyên thích hợp nhất cho các nghiên cứu giám sát quy mô lớn Phương pháp này sử dụng các kháng thể đặc hiệu virus rota để bắt giữ các kháng nguyên (hạt virus) Kháng nguyên sau đ được phát hiện nhờ phản ứng màu bằng cách sử dụng 1 kháng thể đặc hiệu virus rota thứ cấp được gắn với enzyme Giới hạn phát hiện của phương pháp > 8 x 5 hạt/ml Phương pháp ELISA c độ nhạy, tính đặc hiệu cao và

có thể phân tích một lượng lớn mẫu Thời gian phân tích 2-3 giờ [91] Kỹ thuật này có thể sử dụng các kháng thể đơn dòng để xác định các phân nhóm dựa vào VP6 và các type dựa vào VP4, VP7 [42, 76] Phương pháp này cho phép xác định các thông tin type G và có thể đưa ra

RNA

1 2,3

thông tin sự khác nhau về mặt kháng nguyên giữa các chủng virus của cùng một type Tuy nhiên, một bất lợi của định type sử dụng các kháng thể đơn dòng đ là đòi hỏi các hạt virus nguyên vẹn Mặt khác sự biến đổi tính kháng nguyên ở các type phổ biến làm cho chúng không có hoạt tính với các kháng thể đơn dòng và các chất ức chế có mặt trong mẫu phân làm thay đổi liên kết của virus với kháng thể

1.3.6 Phương pháp ngưng kết hạt nhựa (latex agglutination)

Phương pháp này sử dụng các hạt nhựa được phủ bởi các kháng thể kháng virus rota

có thể được dùng như một phương pháp thay thế ELISA Phương pháp này c giới hạn phát hiện tương tự như ELISA, đơn giản nhanh ch mất khoảng 30 phút tuy nhiên không thích hợp với số lượng lớn [123]

1.3.7 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch ( immunochromatographic)

Kỹ thuật sắc ký miễn dịch cũng được sử dụng để phát hiện kháng nguyên virus rota Hiện nay dạng que nhúng đã được thiết kế dựa trên nguyên tắc sắc ký miễn dịch để phát hiện kháng nguyên virus rota trong mẫu phân [20] Que nhúng này có chứa một kháng thể kháng virus rota được gắn cộng hợp với các hạt vàng dạng keo tụ (phức cộng hợp vàng) Kháng thể kháng virus rota được cố định tại vị trí kiểm tra của que nhúng (vạch kiểm tra) Một kháng thể khác kháng kháng thể trong phức cộng hợp vàng cố định tại vị trí đối chứng (vạch đối chứng) Nếu dịch chiết mẫu phân có chứa kháng nguyên virus rota thì khi đưa que nhúng vào sẽ tạo thành phức hợp kháng nguyên – kháng thể - hạt vàng Khi phức hợp này di chuyển dọc theo que nhúng tới vị trí kiểm tra hình thành một vạch màu hồng tía và thể hiện trạng thái dương tính (positive) Phần cộng hợp còn lại không gắn với kháng nguyên di chuyển tới vị trí đối chứng cho vạch màu hồng tía chứng tỏ que nhúng hoạt động bình thường, kết quả có giá trị Như vậy khi xuất hiện cả 2 vạch hồng tía ở vạch kiểm tra và đối chứng chứng tỏ mẫu dương tính với virus rota, khi ch có một vạch hồng tía ở vị trí đối chứng kết luận mẫu âm tính với virus rota Phương pháp này nhanh, đơn giản và được đánh giá là c độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian phân tích rất nhanh 2-20 phút [161]

1.4 ĐẶC ĐIỂM PROTEIN VP6 VIRUS ROTA

1.4.1 Gen tổng hợp VP6

Mảnh protein capsit VP6 virus được mã h a từ dsRNA 6 c kích thước 1356 bp, protein tổng hợp 44,8 kDa chứa 97 axit amin Các mRNA virus chứa cấu trúc ở đầu 5‟-methylated cap nhưng khuyết đuôi polyA Thay vào đ mRNA c đầu kết thúc ‟ chứa chuỗi UGACC và được bảo tồn trong tất cả 11 gen của virus [172]

Sự phân nhóm (SG-subgroup) dựa theo sự hiện diện của các epitope trên capsit VP6,

trong nghiên cứu phân loại di truyền từ mảnh cDNA 379-bp của gen vp6 chủng virus rota gây

bệnh người và động vật, được xây dựng bằng phân mềm Clustal Đối với mỗi dòng được định danh và năm phân lập, loại G và P, vị trí địa lý, và huyết thanh học hiển thị SG xác định Kết quả ch ra rằng tất cả các chủng được xác định là SG I bằng ELISA cùng 2 dòng di truyền là

IA và IB (genogroup I) Tất cả các chủng khác như SG II, SG I+II và SG non-I, non – II thuộc dòng genogroup II Ba dòng di truyền IIA, IIB và IIC đã được phân biệt trong genogroup II nhưng không c tương quan giữa SG huyết thanh và dòng di truyền [67, 154] Một số nghiên cứu phát hiện thấy rằng, các axit amin bảo tồn ở phân nhóm SG I và SG II ở 6 vị trí là: ví trí

83 (Asn ở SG I và Thr ở SG II), 86 (Asp ở SG I và Glu ở SG II), 89 và 92 (Val ở SG I and Ile

ở SG II), 101 and 217 (Val ở SG I and Ala ở SG II ) [67-68]

1.4.2 Đặc điểm protein VP6

1.4.2.1 Cấu trúc protein

VP6 c cấu trúc tam phân (trimeric) và là lớp trung gian được hình thành bởi các protein VP6 , còn được gọi là lớp hạt đúp (Double Layered ParticleS - DLPS) Lớp VP6 duy trì sự đối xứng đa điện của hạt virus cùng với lớp VP7, VP6 là protein chính của hạt virus rota theo trọng lượng, đ ng một vai trò quan trọng trong việc tổ chức tổng thể của kiến trúc virus rota bởi tương tác với các protein lớp ngoài VP7 và VP4, và lớp trong VP2

Hình 1 5: Vị trí và hình thái của lớp protein VP6 trong hạt virus rota [72]

A Mặt cắt hạt virus B Lớp VP6 khi bỏ lớp ngoài VP4 và VP7 C Cấu trúc trimer của

phân tử protein VP6

Trong phân tích cấu trúc protein VP6 của Mathieu, et al., (2001) và Pesaven et al.,

(2006) Các tiểu đơn vị VP6 là một khối cuộn gấp nếp β với đầu N và đầu C tạo thành một hệ xoắn α lớn Bằng phương pháp X-ray, cấu trúc của VP6 đã được xác định thấy rằng VP6 c hai miền, một miền ngoài - vùng A với gấp nếp β khoảng 8 axit amin tiếp xúc với lớp VP7,

và miền trong - vùng B, bao gồm của một cụm xoắn α khoảng 49 axit amin, tiếp xúc với lớp

VP2 bên trong, liên kết giữa vùng này c một khoảng xoắn α khoảng 8 axit amin (Hình 1.6)

cả vùng A và B đều tham gia giữ ổn định cấu trúc tam phân của VP6, VP6 là một protein chứa ion kim loại Zn2+ tại trung tâm của phân tử, liên kết Zn2+ được hỗ trợ bởi môt liên kết hydro giữa các Nδ của His153 và chuỗi carbonyl ở vị trí 9 từ các tiểu đơn vị lân cận, axit amin His 5 được bảo tồn nghiêm ngặt trong nhóm virus rota A và không c mặt trong nh m huyết thanh virus rota khác [106, 122]

Hình 1 6: Cấu tạo tiểu đơn vị VP6

(A) vùng ngoài (ở vị trí 151-331), vùng trong B (ở vị trí 1 – 150) và vị trí 331 – 339 giữa 2 vùng có chứa n 2+

(B) Zn 2+ được giữa bởi các liên kết hydro giữa các Nδ của His153 và chuỗi carbonyl ở vị trí 339 từ các tiểu đơn vị lân cận [106]

Khối lượng VP6 chiếm hơn 5 khối lượng hạt rivus, protein VP6 còn cấu trúc tam phân (trimeric) phức tạp và bền vững [68, 129] Protein VP6 là kháng nguyên chung cho tất

cả nhóm A [75], bảo tồn với độ tương đồng khoảng 92% trình tự axit amin giữa các virus rota

nh m A, nh m này được coi là nguyên nhân chính gây tiêu chảy ở người, đặc biệt là trẻ dưới

5 tuổi [16] VP6 thường chứa các epitope (do trao đổi chéo) giữa các virus rota nhóm khác, protein này chứa 4 phân nh m kháng nguyên phụ thuộc vào sự hiện diện của epitope là I và

II [58] Kháng thể đặc hiệu phân nh m nhận ra các vị trí epitope ch xuất hiện trong cấu hình không gian tam phân của VP6, nếu một đột biến axít amin ở vị trí 172 hoặc ở vị trí 305 (xoắn α) sẽ ảnh hưởng đến liên kết của các kháng thể phân nhóm I Một sự đột biến đổi ở vị trí 305

và 306 từ xoắn α ảnh hưởng đến việc nhận epitope phân nh m II của kháng thể [101] Các nghiên cứu phân tích các chủng virus rota nhóm A nhận thấy rằng epitope được bảo tồn cao

nằm trong khu vực axit amin 89 đến 302 [18] và vùng chứa trình tự biến đổi cao trong khu vực axit amin 8 đến 89 [58]

Các epitope trên protein VP6 có khả năng phản ứng chéo giữa các virus rota người và động vật và là protein đặc trưng nh m A [57-58] Ngược lại, một số mAbs (monoclonal antibodies) phản ứng đặc biệt với protein VP6 của chủng virus rota khác nhau Ví dụ, một nhóm các kháng thể phản ứng với protein VP6 của các type huyết thanh G2 điển hình với electropherotypeing ngắn, nhưng không phản ứng với hầu hết các type huyết thanh G1, G3, G4 và các chủng G9 với electropherotypes dài Những mô hình phản ứng được gọi là VP6 nhóm I (SG I) và nhóm II (SG II) t gặp hơn, điển hình virus rota người có thể phản ứng với

cả hai SG I và SG II MAbs [51] Trong nghiên cứu của Aiyegbo, et al., (2013) về VP6 protein

virus rota gây bệnh ở người, với mục đích tạo vắc xin Tác giả đã cho rằng các phản ứng miễn dịch của tế bào B đều hướng tới VP6 do các kháng thể kháng VP6 được kích ứng tạo ra bao vây hạt virus và ức chế sao chép của virus rota Quá trình này xảy ra ngay sau giai đoạn cởi

vỏ VP4 và VP7 khi mà hạt virus ch còn lớp capsit giữa VP6 Bằng phương pháp trao đổi hydrogen/ deuterium kết hợp khối phổ trong điều kiện nhiệt độ, áp suất cao có chất xúc tác

kim loại (deuterium), nhóm tác giả đã nhận dạng ra vùng khả năng cao chứa epitope (Hình

1.7) dựa trên cấu trúc protein VP6 và vùng linh hoạt của Fab khi liên kết với nhau [14]

Hình 1 7: Xác định khu vực epitope dự đoán của VP6 bằng phương pháp trao đổi H/D kết

hợp khối phổ (Hydrogen–deuterium exchange mass spectroscopy)[14]

A; Tỉ lệ phần trăm D-deuterium (%D) được thế vào vị trí H trên trình tự axit amin của VP6 B

và C; Các vị trí liên kết giữa qua liên kết VP6-Fab thông qua việc thay đổi màu sắc các axít

F

amin và các ảnh hưởng khi thế D D và E; Vị trí epitope dự đoán ở 2 vùng A và B trên cấu trúc 3D của trimer VP F; Các dạng bộc lộ epitop của VP6 trên hạt virus rota

1.4.2.2 Đặc tính của VP6

Các phân nhóm, SG I, II, I+II, và non-I, non II đã được xác định theo sự hiện diện hay vắng mặt của hai epitope khác nhau phản ứng với một, cả hai, hoặc không phải của các kháng thể đơn dòng (mAbs) 255/60 và 631/9 Các SG được xác định bằng phương pháp ELISA, phương pháp này sử dụng rộng rãi trong dịch tễ học nghiên cứu Các virus rota thường được tìm thấy trong con người thuộc về SG II trong khi SG I là phổ biến trong virus rota động vật [16, 101] Nghiên cứu trước đây đã lập bản đồ SG I đã xác định axit amin vị trí 305 và khu vực giữa các vị trí 296 và 299 và SG II đặc hiệu ở vị trí 315 Hiện vẫn chưa rõ SG đặc hiệu được xác định bởi các epitope tuyến tính hoặc thể cấu tạo nào, mặc dù có một số bằng chứng cho thấy epitope được công nhận bởi mAbs SG-đặc hiệu là theo thể cấu tạo và ch xuất hiện trong các dạng trimeric của VP6, các amin thay thế ở khá xa nhau trong các phân tử tuyến tính có thể ảnh hưởng đến cấu tạo của các epitope Protein VP6 liên kết với 2 protein VP4 và

VP7, đặc tính huyết thanh học của các protein bề mặt VP7 và VP4 theo một số nghiên cứu

cho là không đáng tin cậy do hiện tượng trôi kháng nguyên thông qua việc tích lũy các đột biến điểm [67]

Khả năng sinh miễn dịch

Khả năng sinh miễn dịch của kháng nguyên phụ thuộc vào các yếu tố đ là tính lạ, kích thước phân tử, thành phần và tính chất không thuần nhất về mặt h a học và c khả năng giáng h a để c thể xứ lý và trình diện cùng với một phân tử MHC (Major Histocompatibility Complex) VP6 protein là một ứng cử viên thỏa mãn là một kháng nguyên gây miễn dịch, protein này là đối tượng thường được sử dụng gây miễn dịch tạo kháng thể ứng dụng trong xét nghiệm chẩn đoán và là một ứng cử viên tạo vắc xin phòng chống virus rota [33, 160, 170] VP6 protein có nhiều nhất trong các hạt virus, chiếm hơn 5 khối lượng hạt, chúng c cấu tạo trimer và tính ổn định cao cùng với những đặc điểm là kết hợp với sự hiện diện của epitope bảo tồn giữa nhiều chủng virus, điều này giải thích tại sao VP6 được coi là kháng nguyên lớn nhằm mục tiêu trong xét nghiệm chẩn đoán [55]

Các vắc xin virus rota đang lưu hành đều thuộc loại vắc xin sống giảm độc lực, loại này về lâu dài có những nhược điểm nhất định (nhạy cảm, biến đổi chủng virus) Hai hướng chính phát triển và sản xuất vắc xin ngày nay là đi từ các tiểu thể; mảnh protein của virus, trong đ VP6 protein là một ứng cử viên sáng giá cho phát triển vắc xin loại này [97, 160] Phân nh m VP6 được nhận dạng đặc hiệu với kháng thể đơn dòng, SG của VP6 cũng như là

một ch thị trong phân loại bệnh tiêu chảy tác nhân là rivus rota Như đã biết, các chủng virus rota gây bệnh cho con người được tìm thấy trong các nhóm từ A – C, nhưng các chủng của

nh m A được cho là nguyên nhân ở các thể bệnh nặng Người ta tìm thấy phần lớn các kháng thể tạo ra trong cơ thể người là kháng VP6 protein [150] Khi virus xâm nhập vào tế bào, lớp ngoài VP4 và VP7 được cởi trước khi được nhân lên, lúc này trên bề mặt virus ch bao phủ VP6 nên việc trình diện kháng nguyên xảy ra trên bề mặt VP6, để tế bào lympho T nhận diện rồi đi vào con đường miễn dịch Ngoài ra, việc bộc lộ hoàn toàn lớp VP6 cũng giúp các sợi RNA có thể chui ra để thực hiện quá trình phiên mã Do đ , VP6 có vai trò thiết yếu trong chu trình nhân lên của virus và cùng với sự tiếp xúc của toàn bộ bề mặt protein VP6 trong giai đoạn xâm nhập này gây ra một đáp ứng miễn dịch đáng kể [57]

Trong nghiên cứu của A H.-C Choi et al., 1999 [32] đã chứng minh rằng, trong các

kháng nguyên tái tổ hợp VP4, VP6 và TrVP7 – thể khảm (thiết kế thiếu trình tự mã h a termind leader peptid) mẫn cảm độc lập trên chuột đã tạo ra kháng thể chống lại được virus rota thì kháng thể kháng VP6 tạo ra lượng cao nhất Các protein tái tổ hợp này được tổng hợp

N-từ hệ biểu hiện E coli BL21 (DE3), chứa pMAL-c c gắn gen mã h a gắn gốc maltose vào

protein biểu hiện (MBP) Khi so sánh lượng kháng thể của chuột tạo ra sau liều (9 g/liều) trong tuần, mẫn cảm qua đường tiêu h a và tiêm bắp, thu kháng thể sau một tháng, nhưng điều đặc biệt ở đây với nh m chuột được mẫn cảm bằng VP6 sinh ra lượng kháng thể cao

tá dược (P ≤ 2)

Qua ăn

Ti m bắp

kháng thể virus rota

Esteban, et al., 2013 biểu hiện VP6 trên bề mặt Lactoccus lactic NZ9000, plasmid

pCWA:Nuc, promtor PnisA, peptid tín hiệu (từ protein L.lactis MG 6 Usp45) và c trình tự

mã h a protein CWA – neo bám màng tế bào (mảnh protein từ S.pyogens M6) Liều gây mẫn

cảm trên chuột x 9

CFU L lactis VP6-CWA, các ngày thu kháng thể từ , 4, 8 và 4 ngày thu kháng thể [54] Kết quả được thể hiện ở Hình 1.9 Kết quả cho thấy, VP6 là một kháng nguyên được biểu hiện trên bề mặt L lactis gây được đáp ứng miễn dịch dịch thể trong

tế bào chuột thí nghiệm

Ngà

Hình 1 9: Đáp ứng miễn dịch của chuột với L lactis NZ9000/pCWA:VP6, NZ9000[54] Chuột miễn dịch bằng protein tái tổ hợp hoặc PBS lượng IgG thu được sau , 4, 8 và 4 ngày sau miễn dịch và được xác định bằng phương pháp ELISA Kháng thể đa dòng kháng

virus rota toàn phần làm đối chứng (+)

1.5 PROTEIN VP6 TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG DỤNG

1.5.1 Protein VP6 tái tổ hợp

Đã c rất nhiều nghiên cứu xung quanh vấn đề tạo protein VP6 trên các các hệ biểu

hiện như E.coli, tế bào côn trùng, trên tế bào động vật và thực vật để thu VP6 c tính kháng

nguyên và tính sinh miễn dịch với cho mục đích là làm vắc xin và sinh phẩm chẩn đoán

Nhằm nâng cao hiệu quả của vắc xin, năm 99 , Marta I Sahara et al., Canada [130]

đã đăng ký bàn quyền (patent số: 5, 7 ,65 ) tại Mỹ với nghiên cứu thành công tạo VP6 protein virus rota trên vi khuẩn như là một thành phần vắc xin Điều đặc biệt trong bản quyền này từ các monomer VP6 (45k) bằng cách tạo các cầu disulphide mà hình thành các trimer ( 5k) và các cặp trimer cuối cùng tạo thành một tập hợp các hexamer, tập hợp hexamer này

g p phần làm tăng khả năng sinh miễn dịch của vắc xin

Hiện nay, các nhà khoa học tiến tới tạo ra vắc xin tái tổ hợp, việc ngừa bệnh cho trẻ bằng cách uống, thông qua đường tiêu h a, vắc xin được đưa tới ruột, tại đây các kháng nguyên được thấm qua niêm mạc ruột, kích ứng gây miễn dịch cho trẻ Esteban và cộng sự

(2013) đã thành công việc biểu hiện VP6 trên bề mặt vi khuẩn Lactococcus lactis NZ9 ,

với vector biểu hiện pCWA [54] Cũng trên hệ biểu hiện nấm men, William A

Rodríguez-Limas et al.,(2011) biểu hiện VP , VP6 và VP7 trên chủng Saccharomyces cerevisiae, sử

dụng plasmid và promoter kết hợp khác nhau để thể hiện một hoặc ba protein trong cùng tế bào [127] Hiệu suất của các cấu trúc được đánh giá tốt nhất trong lên men và lên men liên tục

c bổ sung leucine, glutamate và succinate Chủng sử dụng đã c một ảnh hưởng quan trọng tới khả năng tổng hợp protein tái tổ hợp; chủng PD.U-267 sự thu được protein virus rota cao nhất, các hệ biểu hiện tốt nhất cho VP6 là chủng PJ T-6 và PD U-6 (9,7 và 6,88 g protein VP6/l) Khi biểu hiện trên hệ PD U gồm cả protein thì lượng VP6 tổng hợp ra cao gấp lần

VP và VP7, điều này được giải thích rằng do c cấu trúc tam phân nên VP6 được bảo vệ chống lại sự phân giải do protease trong quá trình lên men fed-batch

VP6 c cả hai tính miễn dịch và kháng nguyên, là protein thường xuyên nhất được sử

dụng trong xét nghiệm chẩn đoán để phát hiện virus rota, Zhu et al., (2013) nghiên cứu gen

vp6 của virus rota nhóm A và biểu hiện VP6 trong E.coli [170] Protein VP6 được tổng hợp từ

gen này làm nguyên liệu tạo kháng thể trên thỏ, kháng thể (khángVP6) được sử dụng chẩn đoán xác định virus rota bằng nguyên lý ELISA Cũng nhắm tới đích thu kháng thể kháng

VP6 từ động vật, trong nghiên cứu của Owen et al., đã tạo VP6 tái tổ hợp trên hệ biểu

hiện tế bào côn trùng Protein VP6 tái tổ hợp như một kháng nguyên gây miễn dịch trên thỏ, kháng thể IgG thu được có hiệu quả cao trong việc xác định đặc hiệu virus rota bằng phương pháp ELISA [90]

Biểu hiện VP6 virus rota trên thực vật là một hướng đáng quan tâm, Graham J

O Brien và cộng sự năm [117] đã thành công việc biểu hiện VP6 virus rota trên cây

thuốc lá bởi vector biểu hiện của virus khoai tây (PVX) VP6 được biểu hiện dưới dạng hợp

nhất với lớp vỏ protein PVX hoặc từ một subgenomic thêm promoter chèn để cho phép cả hai VP6 và protein áo PVX được biểu hiện một cách độc lập Cả hai phương pháp khả thi tạo VP6, mà vẫn giữ được khả năng tạo trimer Các tính kháng nguyên và miễn dịch vẫn bảo tồn

Hay nhằm mục đích chống lại việc nhiễm rota trên bò, In Sik Chung et al.,

nghiên cứu sản xuất VP6 tái tổ hợp trên tế bào cây cà chua VP6 được chèn plasmid pILTAB 57 để mang plasmid tái tổ hợp pILTAB357-VP6 (13,94 kb) [36] Trong cấu trúc

này, gen vp6 đã được đặt dưới sự kiểm soát phiên mã từ virus khảm sắn (promoter-CsVMV) Vector pILTAB357-VP6 này đã được đưa vào Agrobacterium tumefaciens để chuyển [49]

vào cây cà chua Kết quả nghiên cứu mở một hướng mới trong sản xuất vắc xin được sử dụng như một thực phẩm c tác dụng phòng bệnh ở động vật

Hình 1 10: Sơ đồ vùng T-DNA của vector pILTAB357-VP6 promoter pILTAB 57-VP6 từ vi khuẩn khảm của sắn, promoter PNOS tổng hợp nopalina,

terminator Nos ‟ tổng hợp nopaline [36]

Đã c nghiên cứu so sánh nhận thấy rằng, khi biểu hiện VP6 trên thực vật là cây khoai tây thì lượng protein thu được khoảng μg/g lá tươi, trong khi đ trên tế bào côn trùng ch đạt 1/3 [108] Và tính toán giá khi sản xuất protein VP6 tái tổ hợp trên thực vật giảm được 10

– 50 lần so với lên men E coli, lợi thế nuôi trồng thực vật dễ hơn so với vi khuẩn và tế bào

động vật, không cần đòi hỏi phương tiện đặc biệt Đây là hướng tiềm năng cho protein VP6 biểu hiện trong cây chuyển gen được phát triển thành vắc xin virus rota dưới dạng tiểu đơn vị

Khi biểu hiện VP6 trên tế bào côn trùng (Spodoptera frugiperda), nhóm nghiên cứu

M K Estes 999 đã thu được lượng protein đạt đến 5 μg/ml dịch nuôi [59] VP6 protein được tìm thấy ngoài môi trường nuôi và cả trong tế bào, hoạt tính của VP6 được khẳng định bằng kháng thể đặc hiệu, chứng tỏ protein tái tổ hợp tạo ra duy trì được cấu trúc nguyên bản Mục đích của nghiên cứu nhằm tạo ra kháng thể đặc hiệu kháng VP6 trên chuột lang và ứng dụng kháng thể cho các xét nhiệm miễn dịch xác định bệnh gây ra bởi virus rota

Năm , Haroldo Cid da Silva Junior đã nghiên cứu so sánh hệ biểu hiện VP6

protein trên dòng tế bào thận kh HEK 9 -T và tế bào côn trùng, nh m nghiên cứu nhận thấy VP6 tái tổ hợp biểu hiện trong HEK 9 -T tế bào không suy thoái và duy trì khả năng tạo trimer [46] Trong hệ thống tế bào côn trùng, rVP6 được thể hiện ở mức độ cao hơn nhưng c

sự thoái h a protein đ là mất khả năng hình thành trimer Các đặc hiệu nh m epitopes ch được duy trì ở trạng thái trimer mà không c ở dạng monomer [68, 101] Việc duy trạng thái oliomerization của VP6 trong HEK 9 -T là dấu hiệu tốt Điều bất lợi nữa là promotor polyhedrin mạnh ở giai đoạn cuối của tế bào côn trùng chu kỳ nhân lên liên quan đến sự ly giải tế bào ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của protein tái tổ hợp [84]

Với đích tạo một thể VLPs ( Virus-Like Particles ) – một dạng hạt có một hoặc một vài thành phần protein cấu trúc của virus rota ứng dụng cho sản xuất vắc xin, nhóm nghiên

cứu Z Shoja et al., 4 đã thành công trong việc biểu hiện VP2, VP7 và VP6 trong dòng tế

bào côn trùng [140] Trước tiên, tác giả biểu hiện VP2 trong tế bào côn trùng, tế bào này được

biến nạp đồng thời 2 vector pBiEx-3::vp6 và pBiEx-3::vp7, sau khi nuôi và chọn dòng bằng

phương phát PCR và WB Nh m nghiên cứu của Z Shoja đã biểu hiện protein ở 280

C trong 2 tuần thu hỗn hợp protein và lượng protein tái tổ hợp thu được VLP2/4/7 và DLP2/6 lần lượt là 12% và 88% trên tổng protein sinh khối

1.5.2 Sản xuất protein tái tổ hợp trong hệ biểu hiện E coli

1.5.2.1 Đặc điểm E coli

Escherichia coli là vi khuẩn gram âm, hiếu khí tùy tiện, hình que, c kích thước

khoảng 0,3-1,0 x 1,0-6, μm, di động, xuất hiện khắp nơi trong tự nhiên Do chúng có khả năng phát triển mạnh (thời gian thế hệ khoảng 20 phút) và nhu cầu dinh dưỡng đơn giản nên được ứng dụng nhiều trong công nghiệp với nhiều mục đích Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của

E coli là 370C, pH 6,0 – 7, , môi trường tối thiểu gồm glucose, muối khoảng (Na2HPO4,

KH2HPO4, NH4Cl, NaCl, Mg2SO4, CaCl2) Ngoài ra, tùy theo từng loại E coli khác mà những

môi trường chọn lọc khác nhau [116]

Sự lựa chọn vật chủ phụ thuộc trên hết vào mối liên hệ giữa cấu trúc protein với hoạt tính sinh học và ứng dụng của protein tái tổ hợp Ví dụ như protein biểu hiện trong vi khuẩn

sẽ không có các biến đổi sau dịch mã Vị trí biểu hiện của protein tái tổ hợp trong vật chủ sẽ ảnh hưởng đến sự lựa chọn phương pháp tách và tinh sạch sản phẩm như protein biểu hiện ở

vi khuẩn có thể được tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy, nằm ở vùng periplasm hay tích trữ ở dạng thể vùi trong tế bào chất Việc lựa chọn loại vật chủ phù hợp còn giúp tạo ra được các protein tái tổ hợp vốn c độc tính với tế bào Theo Saida và các cộng sự ( 6) [131], với các

protein độc đối với E coli, khuyến cáo sử dụng các dòng E coli c chứa pLysS/ pLysE/

pLysY để hạn chế sự tổng hợp protein khi chưa cảm ứng

1.5.2.2 Hệ thống pET biểu hiện protein dung hợp với 6xHis

Tùy thuộc vào đặc tính của protein cần tạo, mà sẽ lựa chọn sản xuất protein ở dạng tự nhiên hay dạng dung hợp Việc sử dụng vector dung hợp có một vài ưu điểm vượt trội như cho phép đơn giản h a được quá trình tinh sạch, tăng tính tan của protein, giúp định lượng được protein dễ dàng và ở một số hệ thống vector còn c khả năng tự hoàn nguyên protein tự nhiên

Hệ thống vector pET cho phép biểu hiện protein tái tổ hợp với một homooligohistidine

(6xHis) Sự biểu hiện gen mục tiêu của vector được kiểm soát bởi promotor T7 (pET) [64]

nhờ vào hoạt tính RNA polymerase của tế bào chủ được biến đổi bởi phage T7, hoạt tính này

được kiểm soát bởi IPTG cảm ứng trong promotor lac

Hình 1.11: Cấu trúc vector pET 22b+

Vector biểu hiện đoạn gen mã hóa ligo-histidine gọi đuôi dung hợp His-tag, đoạn này

có thể chứa 6, 8 hoặc 10 histidine Tùy theo His-tag mà có thể dung hợp ở đầu N hay đầu C

và có thể nằm giữa đoạn gen đích với vai trò hỗ trợ việc tinh chế protein mục tiêu và giúp cho

sự phát hiện protein mục tiêu ở dạng dung hợp nhờ kháng thể kháng histidine Cho dù được gắn với protein mục tiêu nhưng his-tag ít gây ảnh hưởng đến đặc tính của protein đích [26]

Nh m histidine này được bắt giữ bởi Ni2+

bởi liên kết ái lực giữa chúng trong quá trình tinh sạch qua cột sắc ký gắn Ni2+, phương pháp này c thể thu hồi protein c độ sạch trên 90% [110, 116]

1.5.2.3 Các mã hiếm khi biểu hiện protein trên E.coli

Hệ thống di truyền của mỗi vi sinh vật đều có những đặc điểm riêng biệt, thông thường các protein ngoại lai được biểu hiện không cùng loài với vật chủ Hiện này, bằng cách

can thiệp vào hệ thống di truyền, các hãng sản xuất đã thay đổi đặc tính của E coli thành các

biến chủng như chủng Rosetta BL21 có khả năng biểu hiện protein của loài nhân thực chứa

các mã hiếm khi biểu hiện ở E coli AUA, AGG, AGA, CGG, CUA, CCC, GGA, chủng

Rosetta-gami BL2 ngoài chứa các mã hiếm trên còn thêm khả năng hình thành rất nhiều liên kết disulfide trong tế bào chất [153]

Tác giả Choi et al., năm 4 nghiên cứu biểu hiện VP6 trong Escherichia coli BL

(DE ) và Rosetta (DE ) [31] Đoạn gen VP6 toàn vẹn chứa 87 axit amin, c khối lượng phân tử 45 kDa Thông thường trình tự toàn vẹn này bị cắt đi trong biểu hiện ở các chủng vi

khuẩn E coli BL (DE ), điều này ảnh hưởng đến xác xuất tổng hợp các mã hiếm giảm

Việc biểu hiện VP6 hoàn ch nh được tăng lên đồng thời với các mã hiếm khi chúng được biểu

hiện trong Rosetta (DE ) do c chứa gen LacI c khả năng làm tăng lượng tRNA Việc sử dụng các bộ ba mã hóa (codons) tổng hợp protein ở mỗi loài là khác nhau, khi so sánh tần suất

mã sử dụng tổng hợp axít amin của protein VP6 trong hệ biểu hiện E coli trước và sau tối ưu

có thể nhận thấy rằng khả năng tổng hợp axít amin tăng lên, giảm sự xuất hiện mã hiếm (Bảng

1.2 )

Bảng 1 2: Phân tích các mã sử dụng của E coli cho gen vp6 tự nhiên và gen vp6 tối ưu các

codon [30]

Codons E coli VP6 tự nhiên VP6 tối ưu

Tần xuất Tần xuất Số codons Tần xuất Số codons

Cấu trúc của vectơ biểu hiện là pMAL-c2X/CJNVP6-His6 đưa vào Escherichia coli

BL (DE ) và Rosetta (DE ) mang gen vp6, protein VP6 tái tổ hợp được tạo ra từ vật chủ

này cho mẫn cảm trên chuột, kết quả thu được giữa các nhóm của những con chuột được tiêm chủng c các giá trị khác nhau theo kết quả thu được kháng thể từ 87 đến 99 Do đ , biểu hiện của protein hoàn ch nh virus rota VP6 được tăng cường rất nhiều trong việc tối ưu

codons Trong nghiên cứu mới đây của Kumar et al., (2016), thay vào việc tối ưu h a codons thì tác giả đã chọn hệ biểu hiện protein VP6 trên pET32a(+) trên vật chủ là E coli Tuner

(DE3) và chất cảm ứng IPTG vẫn thu được lượng lớn protein đích (16mg/l) [94]