Nghiên cứu xác định các thông số công nghệ xử lý rong lục Việt Nam và lên men ethanol góp phần phát triển cồn nhiên liệu

MỞ ĐẦU Khi nhu cầu năng lượng thế giới tiếp tục tăng và nguồn nhiên liệu hóa thạch đang giảm, nhiên liệu sinh học là giải pháp thay thế thích hợp. Ethanol là sản phẩm nhiên liệu được sử dụng phổ biến nhất và được nhiều quốc gia tập trung nghiên cứu. Ethanol thường được sản xuất từ tinh bột, đường mía và phụ phẩm nông nghiệp. Tuy nhiên việc sử dụng các sản phẩm nông nghiệp làm nguồn nguyên liệu sản xuất ethanol còn có hạn chế là chiếm một lượng lớn đất nông nghiệp, cũng như nguồn nước, thời gian và công chăm sóc, canh tác… Hơn thế nữa vấn đề này cũng đang đối mặt với những ý kiến chỉ trích cho rằng không thể sử dụng các sản phẩm nông nghiệp để sản xuất ethanol trong khi mỗi ngày trên thế giới có hàng triệu người chết đói vì thiếu lương thực. Trước tình hình đó, hàng loạt các nghiên cứu nhằm tìm ra một nguồn nguyên liệu mới trong việc sản xuất cồn sinh học được đẩy mạnh. Trong đó rong biển là một lựa chọn thích hợp và đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Rong biển có sản lượng tự nhiên lớn, vòng đời sinh trưởng ngắn, dễ thu hoạch, giá thành rẻ và nuôi trồng thu được sinh khối lớn. Hàm lượng carbohydrate trong một số loài rong cao từ 40 - 79,4 %, rong có lignin thấp dễ thủy phân, thành phần đường chủ yếu là đường 6 carbon nên dễ dàng lên men tạo ethanol. Việt Nam có bờ biển dài hơn 3200 km có chứa sinh khối rong biển rất lớn, trong đó rong lục là phổ biến nhất. Ước tính mỗi năm có khoảng 2 triệu tấn khô được tạo thành. Tuy nhiên nguồn sinh khối này vẫn chưa được sử dụng hợp lý, chỉ có số ít loài được nghiên cứu chế biến các sản phẩm sinh học, số còn lại tự phân hủy ngoài tự nhiên gây hiện tượng ô nhiễm. Vì vậy nghiên cứu sản xuất ethanol từ rong lục là một giải pháp thích hợp để tạo ra nhiên liệu sạch, giải quyết ô nhiễm môi trường và gia tăng lợi ích kinh tế cho người dân ven biển. Để sản xuất được ethanol nhiên liệu từ rong lục, cần phải tiến hành các bước: lựa chọn đối tượng rong lục thích hợp, đảm bảo sinh khối ổn định bằng tiến hành nuôi trồng gia tăng sinh khối, sử dụng các kỹ thuật xử lý nguyên liệu, tìm các phương pháp thích hợp để đường hóa rong lục và lên men tạo ethanol. Về nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rong lục tại Việt Nam hiện nay mới được đề cập tuy vậy vẫn chưa có nghiên cứu cụ thể. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xác định các thông số công nghệ xử lý rong lục Việt Nam và lên men ethanol góp phần phát triển cồn nhiên liệu” để đưa ra được một cách hoàn chỉnh công nghệ lên men ethanol từ nguồn sinh khối rong lục.

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 RONG BIỂN 3

1.1.1 Phân loại rong biển 3

1.1.2 Thành phần hóa học của các loại rong biển 4

1.1.3 Rong lục 6

1.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ETHANOL TỪ RONG BIỂN 7

1.2.1 Tiềm năng rong biển để sản xuất ethanol 7

1.2.2 Quá trình xử lý sơ bộ nguyên liệu rong biển 9

1.2.3 Quá trình thủy phân rong biển 9

1.2.4 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong biển 17

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT ETHANOL TỪ NGUYÊN LIỆU RONG BIỂN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 24

1.3.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol từ nguyên liệu rong biển trên thế giới 24

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol từ nguyên liệu rong biển ở Việt Nam 27

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 VẬT LIỆU 30

2.1.1 Rong lục 30

2.1.2 Chế phẩm Enzyme 30

2.1.3 Chế phẩm nấm men 30

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.2.1 Các phương pháp phân tích 31

2.2.2 Phương pháp toán học 42

2.2.3 Thiết kế các nghiên cứu 43

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 51

3.1 LỰA CHỌN RONG LỤC VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC RONG LU C VIÊ T NAM 51

3.1.2 Thành phần hóa học của các loài rong đư c chọn 53

3.1.3 Nghiên cứu biến động thành phần hóa học của rong lục Chaetomorpha linum Cladophora socialis theo chu k s ng 56

3.1.4 Thành phần các loại đường của rong Chaetomorpha linum và Cladophora socialis 61

3.2 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN RONG CHAETOMORPHA LINUM64 3.2.1 Nghiên cứu xử lý nguyên liệu rong Chaetomorpha linum trước thủy phân 64

3.2.2 Nghiên cứu quá trình thủy phân rong lục bằng axit 66

3.2.3 Nghiên cứu quá trình thủy phân rong lục bằng chế phẩm enzyme thương mại 75 3.3 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN ETHANOL TỪ DỊCH THỦY PHÂN RONG CH LINUM 88

3.3.1Tuyển chọn chủng nấm men trên dịch thủy phân rong Ch.linum bằng axit 88

3.3.2 Tuyển chọn chủng nấm men trên dịch thủy phân rong Ch.linum bằng chế phẩm enzyme 89

3.3.3 Các yếu t ảnh hưởng đến quá trình lên men của dịch thủy phân bằng axit và enzyme bởi chế phẩm nấm men Red Ethanol 91

3.3.4 T i ưu hóa điều kiện lên men dịch thủy phân rong Ch.linum bằng axit bởi chế phẩm nấm men Red Ethanol 96

3.4 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH ĐƯỜNG HÓA VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI (SSF) CỦA DỊCH RONG LỤC SAU TIỀN XỬ LÝ 102

4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 105

4.1 KẾT LUẬN 105

4.2 KIẾN NGHỊ 106

TÀI LIỆU THAM KHẢO 108

PHỤ LỤC 116

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1 Thành phần hóa học của rong biển 4

Bảng 1 2 So sánh năng suất nuôi trồng của các nguồn sinh khối 7

Bảng 1 3 Thành phần hóa học rong biển và đường tạo thành bởi thủy phân của các loài rong biển 9

Bảng 1 4 Vi sinh vật lên men ethanol/butanol từ sinh khối rong biển 21

Bảng 1 5 Diện tích và sản lượng tại thời điểm khảo sát (2009) và dự kiến đến năm 2015 28

Bảng 3 1 Lựa chọn các loài rong lục ở Việt Nam 51

Bảng 3 2 Thành phần hóa học của các loài rong lục được chọn 54

Bảng 3 3 Biến động sinh lượng rong lục trong một vụ trồng vào mùa thuận lợi 56

Bảng 3 4 Năng suất thu hoạch của các đối tượng rong lục được nuôi trồng luân canh trong ao đầm tại miền Trung 57

Bảng 3 5 Thành phần carbonhydrate của sinh khối rong Ch.linum 62

Bảng 3 6 Thành phần các loại đường của rong Cladophora socialis 63

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của muối NaCl trong nguyên liệu đến quá trình thủy phân rong Ch linum 65

Bảng 3 8 Ảnh hưởng của kích thước rong đến quá trình thủy phân rong Ch linum 66

Bảng 3 9 Ảnh hưởng của tỷ lệ rong trong dung dịch đến quá trình thủy phân rong Ch linum 66

Bảng 3 10 Khoảng xác định của các yếu tố như sau 69

Bảng 3 11 Mức thí nghiệm 70

Bảng 3 12 Ma trận thực nghiệm 70

Bảng 3 13 Kết quả tính bước chuyển động (∆j) của các yếu tố 71

Bảng 3 14 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân rong theo Box-wilson 71

Bảng 3 15 Thành phần và hàm lượng của các loại đường trong dịch thủy phân rong Ch linum bằng axit 73

Bảng 3 16 Thành phần dịch thủy phân rong lục bằng axit 74

Bảng 3 17 Ảnh hưởng của nồng độ axit đến quá trình tiền xử lý rong lục 75

Bảng 3 18 Hoạt độ các loại enzyme trong chế phẩm enzyme Viscozyme L và Cellulase 76 Bảng 3 19 Khả năng thủy phân rong Ch.limum thành đường bởi các chế phẩm enzyme thương mại 77

Bảng 3 20 Khoảng xác định của các yếu tố trong tối ưu thủy phân bằng enzyme 81

Bảng 3 21 Mức thí nghiệm trong tối ưu thủy phân bằng enzyme 81

Bảng 3 22 Ma trận thực nghiệm trong tối ưu thủy phân bằng enzyme 82

Bảng 3 23 Kết quả tính bước chuyển động (∆j) của các yếu tố trong tối ưu thủy phân bằng enzyme 82

Bảng 3 24 Tối ưu hóa điều kiện thủy phân rong Ch linum bằng enzyme 83

Bảng 3 25 Thành phần và hàm lượng của các loại đường trong dịch thủy phân rong Ch linum bằng chế phẩm enzyme Viscozyme L 85

Bảng 3 26 Thành phần dịch thủy phân rong Chaetomorha linum bằng chế phẩm enzyme86 Bảng 3 27 Hiệu suất thủy phân rong Ch linum bằng axit và bằng chế phẩm enzyme Viscozyme L 87

Bảng 3 28 Khả năng lên men ethanol dịch thủy phân rong Ch.linum bằng axit bởi các chủng nấm men khác nhau 88

Bảng 3 29 Kết quả lên men ethanol và hiệu suất của các chủng nấm men trong môi trường dịch thủy phân rong lục bằng axit được xác định bằng HPLC 89

Bảng 3 30 Khả năng lên men ethanol dịch thủy phân rong Ch.linum bằng chế phẩm enzyme bởi các chủng nấm men khác nhau 90

Bảng 3 31 Kết quả lên men ethanol và hiệu suất của các chủng nấm men trong môi trường dịch thủy phân rong Ch linum bằng chế phẩm enzyme được xác định bằng HPLC 90

Bảng 3 32 Ảnh hưởng của nguồn nito đến quá trình lên men dịch thủy phân rong lục 91

Bảng 3 33 Khoảng xác định của các yếu tố trong lên men dich thủy phân bằng axit 96

Bảng 3 34 Mức thí nghiệm trong lên men dich thủy phân bằng axit 96

Bảng 3 35 Ma trận thực nghiệm trong lên men dịch thủy phân bằng axit 97

Bảng 3 36 Kết quả tính bước chuyển động (∆j) của các yếu tố trong lên men dich thủy phân bằng axit 98

Bảng 3 37 Tối ưu hóa điều kiện lên men dịch thủy phân rong lục bằng axit theo Box-wilson 98

Bảng 3 38 Hàm lượng các loại đường và ethanol biến đổi trong quá trình lên men từ dịch thủy phân axit 99

Bảng 3 39 Hàm lượng các loại đường và ethanol biến đổi trong quá trình lên men từ dịch thủy phân rong lục bằng enzyme 100

Bảng 3 40 Hiệu suất lên men ethanol của quá trình lên men từ dịch thủy phân rong lục bằng axit và bằng chế phẩm enzyme 101

Bảng 3 41 Kết quả của quá trình đường hóa và lên men đồng thời tại các thời điểm đường hóa ban đầu khác nhau 102

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Thành phần carbohydrate của rong đỏ, rong nâu, rong lục 5

Hình 3 1 Biến động hàm lượng protein theo chu kỳ sống của hai loài rong lục 58

Hình 3 2 Biến động hàm lượng tro theo chu kỳ sống của hai loài rong lục 59

Hình 3 3 Biến động hàm lượng lipid theo chu kỳ sống của hai loài rong 60

Hình 3 4 Biến động hàm lượng carbohydrate và tốc độ sinh trưởng theo chu kỳ sống của hai loại rong lục 60

Hình 3 5 Sắc ký đồ thành phần các loại đường của rong Chaetomorpha linum 62

Hình 3 6 Sắc ký đồ thành phần các loại đường của rong Cladophora socialis 63

Hình 3 7 Ảnh hưởng nồng độ axit sunfurit đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng axit 67

Hình 3 8 Ảnh hưởng nhiệt độ đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng axit sunfurit 68 Hình 3 9 Động thái của quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng axit 69

Hình 3 10 Sắc ký đồ các loại đường và ethanol của chuẩn (B) và dịch thủy phân rong Ch linum bằng axit (A) 72

Hình 3 11 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng enzyme 78

Hình 3 12 Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng enzyme 79

Hình 3 13 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng enzyme 79 Hình 3 14 Động thái của quá trình thủy phân rong Ch.linum bằng enzyme 80

Hình 3 15 Sắc ký đồ các loại đường và ethanol của chuẩn (B) và dịch thủy phân rong Ch linum bằng chế phẩm enzyme Viscozyme L (A) 84

Hình 3 16 Động thái nito tổng số trong quá trình lên men 92

Hình 3 17 Ảnh hưởng pH đến quá trình lên men dịch thủy phân rong Ch.linum 93

Hình 3 18 Ảnh hưởng nhiệt độ đến quá trình lên men dịch thủy phân rong Ch.linum 94

Hình 3 19 Động thái quá trình lên men dịch thủy phân rong Ch.linum 95

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

Khi nhu cầu năng lượng thế giới tiếp tục tăng và nguồn nhiên liệu hóa thạch đang giảm, nhiên liệu sinh học là giải pháp thay thế thích hợp Ethanol là sản phẩm nhiên liệu được sử dụng phổ biến nhất và được nhiều quốc gia tập trung nghiên cứu Ethanol thường được sản xuất từ tinh bột, đường mía và phụ phẩm nông nghiệp Tuy nhiên việc sử dụng các sản phẩm nông nghiệp làm nguồn nguyên liệu sản xuất ethanol còn có hạn chế là chiếm một lượng lớn đất nông nghiệp, cũng như nguồn nước, thời gian và công chăm sóc, canh tác… Hơn thế nữa vấn đề này cũng đang đối mặt với những ý kiến chỉ trích cho rằng không thể sử dụng các sản phẩm nông nghiệp để sản xuất ethanol trong khi mỗi ngày trên thế giới có hàng triệu người chết đói vì thiếu lương thực

Trước tình hình đó, hàng loạt các nghiên cứu nhằm tìm ra một nguồn nguyên liệu mới trong việc sản xuất cồn sinh học được đẩy mạnh Trong đó rong biển là một lựa chọn thích hợp và đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Rong biển có sản lượng tự nhiên lớn, vòng đời sinh trưởng ngắn, dễ thu hoạch, giá thành rẻ và nuôi trồng thu được sinh khối lớn Hàm lượng carbohydrate trong một số loài rong cao từ 40 - 79,4 %, rong có lignin thấp dễ thủy phân, thành phần đường chủ yếu là đường 6 carbon nên dễ dàng lên men tạo ethanol Việt Nam có bờ biển dài hơn 3200 km có chứa sinh khối rong biển rất lớn, trong đó rong lục là phổ biến nhất Ước tính mỗi năm có khoảng 2 triệu tấn khô được tạo thành Tuy nhiên nguồn sinh khối này vẫn chưa được sử dụng hợp lý, chỉ có số ít loài được nghiên cứu chế biến các sản phẩm sinh học, số còn lại tự phân hủy ngoài tự nhiên gây hiện tượng ô nhiễm Vì vậy nghiên cứu sản xuất ethanol từ rong lục là một giải pháp thích hợp để tạo ra nhiên liệu sạch, giải quyết ô nhiễm môi trường và gia tăng lợi ích kinh tế cho người dân ven biển

Để sản xuất được ethanol nhiên liệu từ rong lục, cần phải tiến hành các bước: lựa chọn đối tượng rong lục thích hợp, đảm bảo sinh khối ổn định bằng tiến hành nuôi trồng gia tăng sinh khối, sử dụng các kỹ thuật xử lý nguyên liệu, tìm các phương pháp thích hợp để đường hóa rong lục và lên men tạo ethanol Về nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rong lục tại Việt Nam hiện nay mới được đề cập tuy vậy vẫn chưa có nghiên cứu cụ thể Do đó, chúng tôi

tiến hành đề tài “Nghiên cứu xác định các thông số công nghệ xử lý rong lục Việt Nam và lên men ethanol góp phần phát triển cồn nhiên liệu” để đưa ra được một cách hoàn chỉnh

công nghệ lên men ethanol từ nguồn sinh khối rong lục

Mục tiêu của đề tài

Chọn được rong lục thích hợp làm nguyên liệu cho lên men ethanol

Chọn được giải pháp công nghệ xử lý và thủy phân rong lục để lên men tạo ethanol

Chọn được giải pháp công nghệ lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục

Các nội dung nghiên cứu của đề tài

1 Nghiên cứu lựa chọn nguồn rong lục Việt Nam làm nguyên liệu cho lên men ethanol

2 Nghiên cứu chọn giải pháp xử lý và thủy phân rong lục để lên men tạo ethanol

3 Nghiên cứu chọn giải pháp lên men ethanol từ dịch thủy phân rong lục

Những đóng góp mới của luận án

- Nghiên cứu đầu tiên một cách có hệ thống về rong lục từ khảo sát lựa chọn nguồn rong lục đến thủy phân và lên men ethanol

- Nghiên cứu nguồn rong biển Việt Nam làm nguyên liệu sản xuất ethanol bằng phương pháp thân thiện môi trường là hướng nghiên cứu phù hợp với xu thế của thế giới nhằm thay thế nguồn nhiên liệu hóa thạch

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 RONG BIỂN

1.1.1 Phân loại rong biển

Tảo được chia thành hai nhóm chính là microalgae và macroalgae, microalgae được gọi

là vi tảo hay tảo kích thước bé Rong biển là macroalgae, được gọi là tảo kích thước lớn Rong biển là thực vật bậc thấp sống tự dưỡng bằng cách quang hợp, hình thái dạng tản Quá trình phát triển của rong không qua giai đoạn phôi, có ba hình thức sinh sản: sinh sản dinh dưỡng, sinh sản vô tính bằng bào tử, sinh sản hữu tính bằng hình thức giao phối giữa phối tử đực và cái Rong biển sinh trưởng phát triển nhanh, có vòng đời sinh trưởng không quá 1 năm, tốc độ tăng trọng nhanh và tạo ra sinh khối lớn Rong biển chia thành ba ngành chính: rong lục, rong đỏ và rong nâu [12,17]

Ngành rong lục: Nét đặc trưng nhất của các loài là có màu lục, sản phẩm quang hợp là

tinh bột Về cấu tạo hình thái có nhiều dạng: dạng phiến, dang sợi, dạng ống Rong lục có vỏ bằng chất pectin hoặc xenluloza Trong chất nguyên sinh còn có những túi nhỏ chứa sản phấm của quá trình trao đổi chất Thể sắc tố chủ yếu là chlorophyll và caroten, trong thể sắc

tố còn có các hạt tạo bột hình tròn nhỏ và chứa tinh thể protein ở giữa Trong dịch bào, sản phẩm của quá trình trao đổi chất chủ yếu là đường, tanin, sunfat canxi và các chất có màu antoxyan [12,17]

Ngành rong nâu: Hình thái đơn giản là dạng phiến, dạng sợi và hình thái phức tạp là

dạng cây có "gốc" "rễ" "thân" và "lá" Vỏ tế bào chia thành hai lớp, lớp trong là xelluloza, lớp ngoài là keo fucoidin hay fucin Thể sắc tố gồm chlorophyll a, c; xanthophyll, caroten và fucoxanthyll - loại sắc tố có riêng trong rong nâu, có màu nâu, không tan trong nước Sản phẩm đồng hóa là mannitol, laminarin, glucoza , đặc tính cùa rong nâu là có túi đường fucoidan chứa đường fucoza [12,17]

Ngành rong đỏ: Rong có dạng trụ tròn, dẹp, phiến, chia nhánh hoặc không Vỏ tế bào

gồm hai lớp, lớp trong là xenluloza, lớp ngoài là chất keo và pectin Sắc tố của rong đỏ gồm

có : Sắc tố lục - chlorophyll, sắc tố vàng - xanthophyll, caroten, sắc tố đỏ - phycoerythrin, sắc

tố xanh lam - phycocyanin Màu sắc của rong đỏ được quyết định bởi sự phối hợp và thành phần của các sắc tố trên, vì vậy rong đỏ thường có màu đỏ (thẫm đến nhạt), màu hồng, màu vàng lục nhạt, màu tím hay màu lam lục Sản phẩm quang hợp của tế bào rong đỏ là một loại đường đôi [12,17]

1.1.2 Thành phần hóa học của các loại rong biển

Rong biển có thành phần hóa học biến đổi theo từng ngành rong và được tác giả Kim miêu tả tóm lược trong bảng 1.1 [51]

Bảng 1 1 Thành phần hóa học của rong biển Thành phần

70-80 25-35 30-60 (Agar, Carrageenan) 7-15 1-5

79-90 30-50 30-50 (Alginate, Fucoidan) 7-15 2-5

Thành phần hóa học của rong biển có bốn thành phần chính tro, lipid, protein và carbohydrate Sản xuất nhiên liệu sinh học chủ yếu sử dụng hai nguồn lipid và carbohyrate Trong rong biển carbohydrate chiếm tỷ trọng cao 25-60 %w thích hợp cho sản xuất nhiên liệu hơn so với lipid có hàm lượng 1-5 %w

Ở bảng 1.1 cũng cho thấy, thành phần polysaccharide khác nhau giữa các ngành rong biển: rong nâu, lục, đỏ Rong lục có thành phần polysaccharide như thực vật bậc cao, gồm tinh bột và cellulose Rong nâu và rong đỏ có thành phần polysaccharide dưới dạng agar, carrageenan, alginate Hàm lượng polysaccharide cao trong rong biển thì thích hợp để sản xuất ethanol sinh học

Rong biển có thành phần carbohydrate đa dạng, điều này được ghi nhận trong báo cáo của Kim [51] và thể hiện trong hình 1.1

Hình 1.1 Thành phần carbohydrate của rong đỏ, rong nâu, rong lục

Theo số liệu hình 1.1 cho thấy carbohydrate trong rong đỏ gồm: agar, carrageenan, xylane, mannan và một ít cellulose Agar chiếm 50-70% trọng lượng khô là nguồn carbohydrate chính, agar và carrageenan thủy phân tạo thành galactose, xylane thành xylose, mannane thành mannose, và rất ít glucose từ cellulose, qua đó cho thấy hàm lượng glucose được tạo ra từ rong đỏ sau thủy phân là rất thấp, nên rong đỏ không phải là nguyên liệu thích hợp để sản xuất ethanol

Trong rong nâu thành phần carbohydrate gồm alginate, fucoidan, laminaran, cellulose, hàm lượng alginate cao 30-40% trọng lượng khô, là nguồn carbohydrate chính trong rong nâu, và 5-6% cellulose, 7-10% fucoidan và laminaran Alginate thủy phân thành D-mannuronic axit và M,D-glucuronic, fucoidan thủy phân thành L-fucose, galactose và ít mannitol, cellulose thủy phân thành glucose, laminaran thủy phân thành glucose, mannitol Sản phẩm thủy phân cuối cùng của rong nâu có chứa nhiều loại đường và hàm lượng đường glucose thấp, do vậy việc sản xuất ethanol từ rong nâu không hiệu quả

Carbohydrate trong rong lục gồm cellulose, tinh bột, xylane, ulvan, paramylon, trong đó cellulose và tinh bột là 2 thành phần chính, cellulose và tinh bột khoảng 40-50% Do vậy khi thủy phân rong lục sẽ thu được một lượng lớn glucose, ngoài ra glucose còn được thu nhận từ

thủy phân paramylon (β-1,3-glucan), tạo ra nguồn glucose dồi dào Vì vậy trong rong biển, rong lục rất thích hợp làm nguồn nguyên liệu để sản xuất ethanol

1.1.3 Rong lục

Theo các mô tả của hai tác giả Nguyễn Hữu Dinh, Phạm Hoàng Hộ, Tsutsui cho đến nay các nhà nghiên cứu đã tìm thấy trong ngành rong lục có trên dưới 360 chi và hơn 5700

loài, phần lớn là sống trong nước ngọt, còn nước mặn chủ yếu là những chi sau đây:

Monostroma, Enteromorpha, Ulva, Ulothrix, Rhizoclonium, Cladophora, Chaetomorpha, Cladophoropsỉs, Boergesenm, Valonia, Valoniopsis, Struvea, Boodlea, Microdyction, Caulerpa, Bryopsis, Codium, Acetabularia v.v [12,17, 92]

Nét đặc trưng nhất của các loài trong ngành là có màu lục, sản phẩm quang hợp là tinh bột Hình dạng một tế bào hoặc nhiều tế bào có dạng phiến, dạng sợi, chia nhánh hoặc không; trừ một vài trường hợp rong chỉ là một tế bào trần không có vỏ, còn đại đa số đều có

vỏ cấu tạo pectin hoặc cellulose

Nguyên sinh chất có thành mỏng, ngay sát thành là vỏ tế bào; ở giữa là một túi lớn chứa đầy dịch bào Trong chất nguyên sinh còn có những túi nhỏ chứa sản phấm của quá trình trao đổi chất Thành phần nguyên sinh chất: Thể sắc tố có nhiều dạng khác nhau: phiến, đai vành móng ngựa, sao nhiều cạnh, xoắn lò xo, mắt lưới, hạt nhỏ v.v ; sắc tố chủ yếu là chlorophyll

và caroten, trong thể sắc tố còn có các hạt tạo bột hình tròn nhỏ và chứa tinh thể protit ở giữa, hạt tạo bột khi gặp dung dịch KI dễ bắt màu, nên trở thành một trong những tiêu chuẩn phân loại Nhân thường nằm ở giữa khoang túi dịch bào, hay sát bên thành lớp nguyên sinh,

thể nhiễm sắc hình que ngắn hay hạt nhỏ.Trong dịch bào, sản phẩm của quá trình trao đổi

chất chủ yếu là đường, tanin, sunfat canxi và các chất có màu antoxyan Ở một vài loài, sản phẩm quang hợp không phải là tinh bột mà là những giọt giống như chất bơ

Sinh sản bằng nhiều hình thức khác nhau Sinh sản dinh dưỡng: một tế bào mẹ cắt thành hai tế bào mới; loại nhiều tế bào thì có thể một phần cơ thể đứt ra rồi phát triển thành cây riêng khác Sinh sản vô tính: tế bào dinh dưỡng phân chia thành nhiều bào tử, gặp điều kiện thuận lợi hình thành vỏ tế bào và phát triển thành cá thể mới Sinh sản hữu tính bằng sự thụ tinh giữa phối tử đực với phối tử cái, phức tạp hơn là đã hình thành tinh tử và trứng gọi là noãn phối Sự hiểu biết chi tiết về sinh sản sẽ là tiền đề tạo ra sinh khối bền vững cho phát triển nhiên liệu [12,17, 92]

Rong Chaetomorpha linum (Ch.linum)

Hình dạng: Rong dạng sợi, hơi cứng, dai, dài 5-10cm hoặc hơn, không chia nhánh, có màu xanh lục, phần nổi trên mặt nước hơi vàng, sợi rong óng mượt như tơ Khi về già màu

xanh đậm hơn, sợi rong dày hơn, chiều ngang 100-150 µm, chiều dài các đốt không đều nhau, chiều dài bằng chiều ngang hoặc dài gấp 1,5 lần chiều ngang

Tế bào dinh dưỡng khi hình thành túi bào tử phình rộng ra 160-170 µm, có thể sắc tố dạng lưới, nhiều hạt tạo bột

Rong sống tự do thường đan kết vào nhau thành chùm và trộn lẫn với các loại rong khác

(Enteromopha, Caladophra, Rhizoclonium) Rong sống trong các đầm nước lợ và phát triển

1.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ETHANOL TỪ RONG BIỂN

1.2.1 Tiềm năng rong biển để sản xuất ethanol

Rong biển là nguồn sinh khối bền vững cho công nghiệp nhiên liệu xanh được thể hiện qua các ưu thế sau: đã tạo ra nguồn sinh khối vô tận cho tự nhiên, tốc độ tăng trọng nhanh, sinh khối rong biển chiếm ưu thế hơn so với các nguồn sinh khối khác, khả năng chuyển hóa thành các dạng năng lượng từ rong biển tốt hơn các sinh khối khác [34, 99] So với các loại sinh khối trên cạn, sản lượng rong biển thu hoạch hàng năm gấp 3 so với sản lượng cây lương thực và 60 lần so với cây lấy gỗ Thời gian thu hoạch liên tục nhiều lần trong năm (4-6 lần /năm) Rong biển dễ dàng canh tác nuôi trồng, sử dụng vùng biển rộng lớn, không sử dụng vật liệu khó khăn như: thuỷ lợi, phân bón, đất,….[51,78]

Bảng 1 2 So sánh năng suất nuôi trồng của các nguồn sinh khối

Nguyên liệu thô Mía đường, ngô,

các loại củ Gỗ mền và gỗ cứng Các loài rong biển

Thời gian thu hoạch 1-2 lần/ năm Ít nhất 8 năm 4-6 lần/ năm

Điều kiện nuôi trồng

Ánh sáng, CO2, thuỷ lợi, đất, phân

bón

Ánh sáng, CO2, thuỷ lợi, đất, phân bón

Ánh sáng, CO2, nước

biển

Theo đánh giá của tác giả Bruton rong biển không phải là cây lương thực nên không ảnh hưởng an ninh lương thực, nguồn nguyên liệu không cạnh tranh đất trồng nông nghiệp, không cần sử dụng phân bón, không gây ô nhiễm môi trường, hấp thụ tốt CO2 và chất dinh dưỡng cải tạo môi trường, khả năng sinh trưởng phát triển tốt, có sinh khối lớn, chu kỳ nuôi trồng ngắn, nuôi trồng đạt năng suất cao, mang lại lợi nhuận cao cho người trồng rong, vì vậy rong là nguồn nguyên liệu lý tưởng để sản xuất bioethanol [33,78]

Theo các tác giả Phạm Văn Ty và cs tế bào thực vật trên cạn có thành phần chính gồm cellulose, hemicellulose, lignin; ba thành phần này liên kết chặt chẽ với nhau có sức bền cơ học cao, trong đó lignin là cơ sở tạo ra các mô gỗ của cây, việc phân hủy tế bào hóa gỗ là vô cùng phức tạp [18] Do vậy nghiên cứu ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối gỗ gặp nhiều khó khăn, đòi hỏi công nghệ cao Trong khi đó theo báo cáo của Kim vi tảo và rong biển lại dễ bị phân hủy do chỉ chứa cellulose và các polysachrid hòa tan Dưới tác động của nhiệt, enzyme, axit các nhóm polysacchrid này bị thủy phân thành các dạng đường đơn Đây là nguồn cơ chất quan trọng cho vi sinh vật thực hiện quá trình lên men sản xuất nhiên liệu sinh học, điều này cho thấy sinh khối rong, tảo từ biển được sử dụng dễ dàng hơn so với sinh khối thực vật trên cạn [51]

Để sản xuất được nhiên liệu từ nguồn sinh khối thực vật trên cạn với quy mô công nghiệp thông thường sử dụng phương pháp kỹ thuật phức tạp trải qua nhiều công đoạn xử lý, những công nghệ này đòi hỏi đầu tư trang thiết bị hiện đại, vì vậy sẽ nâng giá thành sản phẩm lên cao [18] Ngược lại công nghệ cho sản xuất nhiên liệu từ nguồn sinh khối biển đơn giản hơn Các phương pháp xử lý nguyên liệu không yêu cầu kỹ thuật phức tạp, các công nghệ này đầu tư trang thiết bị ít tốn kém, hiệu suất ổn định, chất lượng tinh sạch cao

Theo báo cáo của John Rojan và Nigam nhiên liệu sinh học sản xuất từ rong biển là một thay thế cho nhiên liệu hóa thạch Các sản phẩm nhiên liệu từ sinh khối tảo thân thiện với môi trường và chất lượng ổn định Vì vậy nhiên liệu sinh học từ rong biển đang được khuyến khích phát triển tại hầu hết các quốc gia trên thế giới Các sản phẩm nhiên liệu sản xuất từ tảo: dầu thực vật, dầu diesel sinh học, ethanol sinh học, biogasoline, biomethanol, butanol sinh học và nhiên liệu khác [28,46, 68, 88]

Theo các tác giả Goh, Nahak và Jones quá trình nghiên cứu và sản xuất ethanol từ rong biển được thực hiện theo ba bước chính, bước 1 xử lý rong biển sau thu hoạch, bước 2 thủy phân rong biển đã được xử lý, bước 3 tiến hành lên men dịch thủy phân rong biển [67; 38;

47]

1.2.2 Quá trình xử lý sơ bộ nguyên liệu rong biển

Theo báo cáo của Bruton và Roesijadi hầu hết các dạng rong biển sau thu hoạch phải được tiền xử lý trước khi ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học Bước đầu tiên của tiền xử lý

là rong biển tươi sau thu hoạch được loại tạp, loại muối bằng cách tách mảnh vụn như đá, cát,

ốc hoặc rác rồi rửa với nước, sau đó rong được sấy khô đến độ ẩm 10-15%, lưu giữ, chuẩn bị cho quá trình thủy phân Trước khi thủy phân rong được xử lý cơ học, xay nghiền bằng máy nghiền búa nhằm làm nhỏ kích thước rong (0,5-5mm) giúp cho quá trình thủy phân diễn ra

dễ dàng [33, 79]

1.2.3 Quá trình thủy phân rong biển

Sau khi tiền xử lý, rong biển được thủy phân, quá trình này chuyển hóa các dạng polysaccharide thành monosaccharid, làm nguyên liệu cho quá trình lên men Rong biển được thủy phân bằng hai phương pháp, thủy phân bằng axit và thủy phân bằng enzyme

Nghiên cứu của Jang cho thấy carbohydrate rong biển của cả ba loại rong (nâu, đỏ, và lục) được thủy phân một cách hiệu quả để tạo ra monosacarid bởi axit sunfuric loãng ở nhiệt

độ cao [45] Bốn yếu tố quan trọng tác động đến quá trình trình thủy phân bằng axit sulfuric được xác định là (i) nhiệt độ phản ứng, (ii) thời gian phản ứng, (iii) nồng độ axit và (iv) khối lượng rong biển

Nghiên cứu của Kim chứng minh hiệu quả của việc kết hợp tiền xử lý bằng axit sau đó thủy phân bằng enzyme trong quá trình đường hóa rong biển, tạo ra hàm lượng đường cao

0,566 g/g rong Gracilaria amansii và 0,376 g/g của rong Laminaria japonica [52]

Theo Wei N thành phần hóa học của rong biển sau thủy phân được trình bày trong bảng 1.3 [98]

Bảng 1 3 Thành phần hóa học rong biển và đường tạo thành bởi thủy phân của các loài

rong biển

Thành

phần loài

Ngành rong

Thành phần Polysaccharide

Carbohydrate tổng số (%w/w)

Đường dịch thủy phân (%w/w)

Hiệu suất thủy phân (%)

Các loại đường dịch thủy phân

Glucose, Galactose

Gelidium

Gelidium

Glucose, Mannitol

1.2.3.1 Thủy phân bằng axit

Theo tổng quan của Wei N., dưới tác động của axit các polysaccharide của rong biển sẽ

bị cắt nhỏ thành các oligo hoặc monosaccharid Các ion H+

của axit tác động trực tiếp đến polysaccharide tại các liên kết mắt xích nối các monosacchadid tạo ra các oligo hoặc monosaccharid Quá trình thủy phân rong của axit tạo ra hỗn hợp dung dịch đường cần cho quá trình lên men ethanol [98]

Theo nghiên cứu của Kalpana rong Kappahycus alvarezii được thủy phân theo tỷ lệ 50 g

rong/l với axit sunfuric 0,9N tương đương 5% v/v trong 1 giờ tại 100 o

C [49], theo nghiên cứu

của Wang thủy phân rong Gracilaria salicornia trong điều kiện thủy phân bằng axit sunfuric

2%, trong 30 phút ở nhiệt độ 120 oC, hiệu suất của quá trình thủy phân 4,3g glucose/kg rong

tươi [96], theo tác giả Karunakaran rong Eucheuma sp.và Hypnea sp được thủy phân bởi axit

sunfuric 1% tại nhiệt độ 100 oC trong 3 giờ với nồng độ chất khô 20g/l, dung dịch đường sau thủy phân thu được dịch đường có nồng độ 11,1 g/l Theo nghiên cứu Michul Yoon đã sử dụng kỹ thuật xử lý mẫu bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma đã mang lại hiệu quả tích cực

cho công nghệ sản xuất cồn Thành phần loài được sử dụng trong nghiên cứu này là Undaria

sp., đây là loài có sinh khối vô cùng lớn được nuôi trồng và khai thác tự nhiên tại Hàn Quốc Mẫu rong biển sau khi thu hoạch ngoài tự nhiên sẽ được xử lý với tia Gamma với liều chiếu 0,

10, 50, 100, 200 và 500 kGy, sau đó thủy phân trong axit sunfuric 1% w/v ở nhiệt độ 121 o

C

trong 3 giờ Sau quá trình thủy phân hỗn hợp rong sẽ được trung hòa với CaCO3 rồi lên men với nấm men Hàm lượng glucose thu được vào khoảng 72- 204 g/kg đường tổng số [62] Theo nghiên cứu của Mohammad loại gỗ mền cây Vân Sam theo tỷ lệ gỗ phối trộn 1/3 rồi thủy phân bằng axit sunfuric có nồng độ 10g/l ở nhiệt độ 228 o

C trong 11 phút, sau đó lọc thu dịch đường Tuy nhiên hỗn dịch này chứa 5,7g/l furfural và 7,3 g/l HMF (5-hydroxylmethyl furfural) làm cho quá trình lên men khó diễn ra [63] Theo Lynd gỗ được xay nhỏ về kích thước 10 mm sau đó được thủy phân trong axit 75% v/v tại nhiệt độ 50 o

C, rồi pha loãng nồng độ axit xuống 20-30% v/v và tiếp tục thủy phân trong 1 giờ để tạo ra hỗn hợp đường glucose và xylose và bã gỗ, sau đó thu hồi đường và tiếp tục thủy phân bã lần hai Trong quá trình thủy phân này các loại đường tạo thành là 70% glucose và 30% xylose [57].Theo nghiên cứu của Pattana Laopaiboon bã mía được thủy phân bằng axit sunfuric 3%v/v trong 2 giờ ở 120 o

C để tạo ra dịch đường sử dụng cho lên men axit lactic [73]

Như vậy từ các nghiên cứu trên cho thấy, các sinh khối khác nhau điều kiện thủy phân khác nhau, với đối tượng rong biển thường được thủy phân bằng axit sunfuric có nồng độ 1-5%v/v, nhiệt độ 100 - 120 oC thời gian từ 1-3 giờ Vì vậy trong nghiên cứu này để thủy phân được nguyên liệu rong lục chúng tôi khảo sát nồng độ axit sunfuric từ 1-4% v/v, nhiệt độ 90-

130 oC, thời gian 20-90 phút

1.2.3.2 Thủy phân bằng enzyme

Hiện nay quá trình thủy phân sinh khối bằng enzyme được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu, để thực hiện được quá trình này sinh khối cần được tiền xử lý rồi bố sung chế phẩm enzyme thực hiện đường hóa Trong đó phương pháp tiền xử lý và đường hóa của mỗi loại sinh khối là khác nhau

Nhóm nghiên cứu đề tài Biomass do Phan Đình Tuấn trường đại học Bách Khoa TP.HCM phụ trách đã nghiên cứu công nghệ xử lý các phế phẩm trong sản xuất nông nghiệp như rơm, rạ, trấu nhằm sản xuất ethanol Kết quả của nghiên cứu này cho thấy, quá trình thủy phân nguyên liệu theo phương pháp nổ hơi rồi thủy phân với enzyme cellulase ở nhiệt

độ 50 oC, pH 4.8 thu được 200g glucose từ 1 kg rơm rạ [19]

Theo tác giả Nguyễn Thị Minh Phương đã tiến hành nghiên cứu tiền xử lý rơm rạ để nâng cao hiệu suất thủy phân bằng enzyme cho sản xuất etanol sinh học Nguyên liệu được tiền xử lý NaOH 5% w/w rơm khô và gia nhiệt 100 o

C trong 2 giờ, sau đó thu được 56% bã cellulose được thủy phân bằng tổ hợp enzyme (Cellic® CTec2 và Cellic® HTec tỷ lệ 4:1) với hoạt độ sử dụng 16,25 U/g Thực hiện quá trình thủy phân trong 94,2 giờ, quá trình này thu được lượng đường khử (có hàm lượng glucose 33,3%; xylose 13,4%, galactose 4% và arabinose 1,3%) đạt 49,2% so với rơm rạ[15]

Cùng hướng sản xuất bioethanol từ bã thải nông nghiệp, nhóm nghiên cứu của tác giả

Vũ Nguyên Thành đã tiến hành đề tài: Nghiên cứu công nghệ và hệ thống thiết bị sản xuất cồn nhiên liệu từ phụ phẩm nông nghiệp (BIOMASS) Kết quả đề tài đã thu được một số kết quả khả quan về enzyme thủy phân hemicellulose, giống nấm men có khả năng lên men các loại đường từ quá trình thủy phân Nguyên liệu mà tác giả nghiên cứu là bã mía đã được xay nhỏ về kích thước 6 mm, tiền xử lý với sunfuric 0,75%, nhiệt độ 121 o

C trong 1 giờ và tiếp tục xử lý với NaOH 1,5% trong 1 giờ thu được 88,9% cellulose tương đương 55 g cellulose/100g bã mía Sau đó cellulose vô định hình được đường hóa và lên men đồng thời ở nồng độ chất khô 15% [23]

Một nghiên cứu khác của tác giả Tô Kim Anh đã tiến hành đề tài: Nghiên cứu tạo enzyme tái tổ hợp thủy phânlignocelluloses phục vụ sản xuất cồn nhiên liệu Nguyên liệu lignocelluloses sử dụng cho nghiên cứu này được thu nhận từ bã mía Bã mía có kích thước < 5mm, độ ẩm 5%, cellulose 47% Nguyên liệu được tiền xử lý NaOH 0,1g/1g bã mía, và gia nhiệt 121 o

C trong 1 giờ, sau đó thu cellulose mang thủy phân bằng tổ hợp enzyme nồng độ 5U endoglucanase, 10U CMCase exoglucanase, 30U betaglucosidase theo tỷ lệ chất khô 1/15 Thực hiện quá trình thủy phân tại pH 4,8, nhiệt độ 50 oC trong 48h, khuấy 150 v/phút Kết thúc thủy phân sử dụng enzyme laccase với tỉ lệ 70 U/g bã mía phá hủy phenol Kết quả nghiên cứu này thu được 330g glucose/kg bã mía, rồi lên men thu được 120 g ethanol/kg bã mía

Theo tác giả Nguyễn Minh Hải đã nghiên cứu tối ưu hóa tiền xử lý bã rong

Chaetomorpha sp bằng sunfuric để sử dụng trong sản xuấtethanol sinh học Trong nghiên

cứu này tác giả sử dụng bã thải rong Chaetomorpha sp Rong Chaetomorpha sp được chiết

trong NaOH 0,75% w/v, tỷ lệ rong 1/20, chiết ở 50 oC trong 1 giờ sau đó ly tâm thu dịch nổi protein, phần bã được sấy khô sử dụng lên men ethanol Bã được sấy về độ ẩm 4% sau đó bã rong được được phối trộn tỷ lệ 1/10 rồi xử lý với axit 1,75% w/v tại nhiệt độ 120 o

C trong 34 phút, sau đó trung hòa với Ca(OH)2 lúc này hàm lượng đường thu được là 20,7 g/l rồi bổ sung enzyme Cellic Ctec2 nồng độ 20 FPU/g và Novozyme 188 nồng độ 4 CBU/g và nấm men tiến hành đường hóa và lên men đồng thời thu được hàm lượng cồn 1,94 % v/v [13] Quá trình thủy phân sinh khối rong biển bằng enzyme như sinh khối lignocellulose gồm hai bước tiền xử lý và đường hóa Tiền xử lý rong nhằm đảm bảo khả năng tiếp cận của enzyme đến các liên kết của các polysaccharide Quá trình tiền xử lý sinh khối rong biển phụ thuộc vào cấu trúc sinh học của mỗi loại rong Quá trình tiền xử lý được sử dụng trong nghiên

cứu của tác giả Leilei và cs đã tiền xử lý bã rong nâu Laminaria japonica trong điều kiện axit

sufurid nồng độ 0,1 % w/v, 121 oC, thời gian 1 giờ [37] Theo nghiên cứu của Isa và cs rong

lục Ulva sp được tiền xử lý ở nhiệt độ 121 oC trong 20 phút [44], theo tác giả Nadja và cs

rong lục Chaetomorpha linum được tiền xử lý theo nhiều phương pháp, như tiền xử lý nhiệt

cao 190-200 oC trong 5 phút, nổ hơi ở áp suất 1,9 Mpa và chiếu plasma trong 48 giờ

Sau quá trình tiền xử lý, rong biển được thủy phân bởi nhóm enzyme hydrolase là phức

hệ enzyme cellulase, laminariase, galactase được thu nhận từ vi sinh vật Trong số những vi

sinh vật có khả năng thủy phân sinh khối rong biển, nấm mốc Trichoderma reesei được quan tâm nhiều hơn cả Nấm mốc Trichoderma reesei có khả năng sinh một loạt các enzyme phân

hủy cellulose, laminaran, caragenan, agar thành đường và các cấu thành khác [98] Theo Kim

và cs nhóm phức hệ enzyme này tác động đặc hiệu đến các polysaccharide rong biển và cắt tại các vị trí đặc hiệu tạo ra các sản phẩm olygosaccharid và các monosaccharid (glucose, manose, lanimarin, rhamnose…) Đây là các loại đường đơn cần cho quá trình lên men ethanol của vi sinh vật [52] Một số enzyme được sử dụng thủy phân rong biển như nghiên

cứu của Yanagisawa và cs sử dụng enzyme Meicelase do Nhật sản xuất từ Trichoderma

viride, có hoạt tính cellulase là 73,3U/g và cellobiase 227 U/g, enzyme này thủy phân tinh

bột, cellulose, cellobiose, beta glucan trong rong Ulva pertusa Theo nghiên cứu của Nitin và

cs sử dụng các enzyme Viscozyme L, Cellulase 22086 và 22128 của công ty Novolzyme để

thủy phân các polysacchrid của rong Ulva fasciata, kết quả thủy phân thu được 88,2% đường

[69] Theo nghiên cứu của Nadja và cs sử dụng enzyme Cellulast 1,5L của công ty

Novozyme, để thủy phân các polysacchrid của rong Chaetomorpha linum Như vậy các

nghiên cứu thủy phân rong lục chủ yếu sử dụng enzyme có hoạt tính cellulase dùng cho thủy phân

Hiện nay trên thị trường có nhiều loại chế phẩm enzyme sử dụng cho nghiên cứu thủy phân sinh khối lignocellulose Theo nghiên cứu Phan Đình Tuấn thủy phân rơm rạ bằng chế phẩm Cellusoft L của hãng Novozyme; theo nghiên cứu của Vũ Nguyên Thành thủy phân rơm rạ bằng chế phẩm cellulast 1,5 L của hãng Novozyme; theo nghiên cứu của Samsuiri thủy phân rơm rạ bằng chế phẩm Meicellase của hãng Meijii, Seika; theo nghiên cứu của Geddes thủy phân rơm rạ bằng chế phẩm Biocellulase W của hãng Novozyme; theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Minh Phương thủy phân rơm rạ bằng chế phẩm Cellic® CTec2 và

Cellic® HTec2 của hãng Novozyme; Nguyễn Minh Hải thủy phân bã rong Chaetomorpha

sp.sử dụng chế phẩm Cellic® CTec2 và Novozyme 188 [13] Bản chất các chế phẩm này chứa các loại enzyme endoglucanse, exoglucanase, beta glucosidase, xylanase thủy phân

cellulose, hemicellulose, xylan Trong nghiên cứu thủy phân rong Ch.linum, chúng tôi chọn

chế phẩm Viscozyme L của công ty Novozyme và Cellulase mã số C2605-50ml của công ty

trên và Viscozyme L có chứa hệ enzyme rộng hơn như cellulase, glucanase, xylanase, glucoamylase, galactosidase

1.2.3.3 Ảnh hư ng các yếu tố đến quá trình thủy phân

a Ảnh hưởng của nồng độ axit và nồng độ enzyme

Trong quá trình thủy phân rong biển bằng axit, hàm lượng axit bổ sung có vai trò rất quan trọng Hàm lượng axit quá bé quá trình thủy phân cho hiệu suất thấp, thời gian thủy phân kéo dài, tiêu tốn nhiều nhiên liệu phục vụ cho thủy phân Ngược hàm lượng axit lớn, thời gian thủy phân nhanh, hiệu suất thủy phân cao, nhưng mau hỏng thiết bị, tiêu tốn nhiều hóa chất trung hòa hoặc vận hành và thiết bị tách axit, ngoài ra còn tạo nhiều sản phẩm phụ ức chế quá trình lên men

Các dạng axit sử dụng thủy phân sinh khối rong có tính oxi hóa mạnh (HCl, H2SO4, HCHO….) nhưng đa phần trong các nghiên cứu thủy phân sinh khối rong biển theo tổng quan của Wei N thường sử dụng axit sunfuric [98]

Enzyme là sản phẩm sinh học có khả năng thủy phân các loại cơ chất mang tính đặc hiệu Trong nghiên cứu này rong biển là nguồn cơ chất cần được thủy phân, các loại polysaccharide rong biển có tính đa dạng, thành phần polysaccharide gồm có agar, ulvan, agilnate, fucoidan, cellulose, tinh bột… mỗi loại polyme chịu tác động trực tiếp của các enzyme như cellulase, beta-glucanase, glucosidase, alginatase, fucoidanase, ulvanase…trong

đó nồng độ các enzyme sử dụng thủy phân luôn luôn được nghiên cứu chi tiết Nồng độ enzyme thủy phân cao quá trình thủy phân diễn ra nhanh và hiệu suất cao và ngược lại, nhưng

để quá trình thủy phân diễn ra hiệu quả cần phải bổ sung enzyme một cách hợp lý để tránh dư thừa gây lãng phí enyme Nồng độ enzyme trong các nghiên cứu thủy phân rong biển thường

sử dụng nồng độ từ 15-50 U/g cơ chất [98,100] Trong đó nồng độ enzyme thủy phân rong lục

của các nghiên cứu khác nhau, theo nghiên cứu Isa 2009 rong Ulva sp thủy phân với enzyme

cellulase có tên thương phẩm Acerimonium hoạt độ 322 U/g, nồng độ enzyme sử dụng là

1-2% w/w rong nguyên liệu [44] Theo nghiên cứu của Nitin rong Ulva fasiata thủy phân với

enzyme Viscozyme L và cellulase, nồng độ enzyme sử dụng là 0,4 ml enzyme/g rong nguyên

liệu [69] Theo nghiên cứu của Yanagisawa rong Ulva pertusa thủy phân với enzyme

Micelase, nồng độ enzyme sử dụng là 1ml enzyme/ 20g rong nguyên liệu [100]

b Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nguồn sinh khối rong biển chứa nhiều polysaccharide có cấu tạo phức tạp, vì vậy để chuyển hóa các polyme này thành phân tử đơn giản đòi hỏi cần xúc tác nhiệt trong quá trình thủy phân Trong đó nhiệt độ thủy phân cao thời gian thủy phân ngắn, và ngược lại Trong quá trình thủy phân rong biển, rong đỏ và rong nâu dễ bị thủy phân hơn rong lục, vì hàm

lượng cellulose trong rong nâu và đỏ thấp hơn nhiều so với cellulose của rong lục Trong

nghiên cứu của Wang nhiệt độ thủy phân rong đỏ Gracilaria salicornia là 121 o

C trong 30

phút [96], và theo nghiên cứu của Minchul Yoon nhiệt độ thủy phân rong nâu Laminaria

japonica là 121 oC trong 3 giờ [62] là thủy phân hoàn toàn Nhưng đối với rong lục, theo nghiên cứu của Isa ở nhiệt độ 121 oC trong thời gian 20 phút chỉ mới tiền xử lý nguyên liệu cho thủy phân bằng enzyme, nghiên cứu của Nitin 2013 cũng chỉ ra ở nhiệt độ 121 o

C trong

thời gian 1 giờ cho tiền xử lý rong Ulva fasiata, đối với rong Ch linum tiền xử lý ở nhiệt cao

180-200 oC trong 10 phút [65] Vì vậy để thủy phân rong lục hiệu quả ở nhiệt độ thích hợp cần khảo sát hai yếu tố ảnh hưởng là nồng độ axit và thời gian thủy phân

Trong thủy phân bằng enzyme nhiệt độ thủy phân đóng vai trò quan trọng, nếu thủy phân cơ chất trong điều kiện nhiệt độ thấp hiệu suất thủy phân kém, nguyên nhân các loại polysaccharide luôn có độ nhớt cao, tại nhiệt độ thấp độ nhớt tăng quá trình khuấy đảo khó, enzyme khó tiếp cận với cơ chất dẫn đến hoạt độ enzyme hoạt động không như mong muốn,

vì vậy cần có điều chỉnh nhiệt hợp lý để enzyme thuận lợi trong tiếp cận cơ chất và sử dụng các loại enzyme chịu nhiệt để có thể nâng cao hiệu suất thủy phân toàn diện Nhưng cũng cần phải chú ý tránh nâng nhiệt độ quá cao sẽ gây ra hiện tượng phá hủy enzyme và lúc này cơ chất chịu tác động thủy phân bởi nhiệt chứ không phải enzyme gây ra hao phí enzyme, hao phí nhiệt mà hiệu suất lại không cao Quá trình sử dụng nhiệt trong các nghiên cứu thủy phân

rong biển bằng enzyme, theo nghiên cứu của Nitin thủy phân rong Ulav faciata là 45 o

C [69],

theo nghiên cứu của Nadja thủy phân rong Ch.linum là 50 o

C [65], và theo các nghiên cứu khác, nhiệt độ thủy phân nguyên liệu cellulose từ gỗ mền, rơm rạ, bã mía trong khoảng 30-

40oC [20,23,60]

c Ảnh hường của thời gian thủy phân

Thời gian cũng góp phần quan trọng trong quá trình thủy phân, thời gian thủy phân ngắn khi điều kiện thủy phân có nồng độ axit cao và nhiệt độ cao, thời gian dài khi điều kiện thủy phân có nồng độ axit thấp và nhiệt độ thấp Ba yếu tố này có quan hệ ràng buộc, thường trong nghiên cứu và sản xuất các tác giả thường cố rút ngắn thời gian thủy phân để tránh hao tốn nhiên liệu vận hành thiết bị, giảm thiểu tạo sản phẩm phụ và gây hỏng thiết bị Theo các tác giả Wei N và Wang thời gian thủy phân sinh khối rong biển bằng axit thường diễn ra 20-

60 phút [98,96]

Thời gian thủy phân bằng enzyme kéo dài hơn thủy phân bằng axit vì enzyme tiếp xúc

cơ chất và cắt các liên kết một cách chậm rãi Thời gian thủy phân sinh khối rong biển theo nghiên cứu của nhiều tác giả thường 30-48 giờ Khoảng thời gian này là dài nên khả năng nhiễm tạp là rất cao, vì vậy khi thủy phân bằng enzyme cần phải thực hiện các thao tác chuẩn,

và tiến hành các khảo sát đường hóa lên men đồng thời để thu được các sản phẩm như mong muốn [60,62,100,75]

d Ảnh hưởng của nồng độ nguyên liệu

Khối lượng nguyên liệu bổ sung trong quá trình thủy phân có ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất thủy phân Trong nghiên cứu thủy phân rong biển, nồng độ rong biển khi sử dụng cho thủy phân thường không cao vì các polysaccharide của rong biển có độ trương nở lớn ảnh

hưởng đến hoạt động của axit và enzyme Theo nghiên cứu của Nitin nồng độ rong lục Ulva

faciata sử dụng thủy phân là 50 g/lit [69] Theo nghiên cứu của Nadja nồng độ rong lục Ch linum sử dụng thủy phân là 100 g/lit [65] Theo nghiên cứu của Isa nồng độ rong lục Ch linum sử dụng thủy phân là 50 g/lit

e Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân

Trong thủy phân bằng axit pH phụ thuộc nhiều vào nồng độ axit bổ sung ban đầu vì vậy tất cả các đặc tính của yếu tố pH tương tự như của yếu tố nồng độ axit, còn đối với thủy phân bằng enzyme pH là yếu tố quan trọng quyết định đến thủy phân Yếu tố này chịu ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý và đệm bổ sung, hai quá trình này giúp ổn định pH trong quá trình

thủy phân Theo nghiên cứu của Wang thủy phân rong Gracilaria salicornia bằng enzyme cellulase (MP Biomedicals, LLC) có pH 5.0 [96], theo Nitin thủy phân rong Ulva faciata

bằng enzyme Viscozyme L và Cellulase 22086 của Sigma có pH 4.8 [69], theo Nadja thủy

phân rong Ch.linum được thủy phân bằng enzyme Cellulast 1,5L của công ty Novolzyme có

pH 4.8 [65], và theo các nghiên cứu khác, pH thủy phân nguyên liệu cellulose từ gỗ mền, rơm

rạ, bã mía trong khoảng 4.5-6 [20,23,60]

Điều kiện thủy phân của một số đối tượng rong biển

Sinh khối rong đỏ Gracilaria salicornia được tiền xử lý trong axit sunfuricloãng 2% ở

nhiệt độ 120 oC trong 30 phút sau đó được đường hóa và lên men nhờ enzyme thủy phân và vi sinh vật [96]

Sinh khối rong nâu Laminaria japonica và Sargassum fulvellum được tiền xử lý trong

axit sunfuric0,1-0,3 N ở nhiệt độ 120 oC trong 20 phút, sau đó được thủy phân trong các loại enzyme Celluclast 1.5L, Viscozyme L, Novoprime 959 [50]

Sinh khối rong lục có kết cấu vỏ tế bào bền vững hơn rong nâu và rong đỏ, nguyên nhân sản phẩm cellulose được tổng hợp từ rong lục cao hơn các loại rong khác, do vậy quá trình tiền xử lý cho thủy phân bằng enzyme phức tạp hơn

Rong lục Ch linum được tiền xử lý bằng nhiều phương pháp như là xử lý ở nhiệt độ cao

180, 190, 200 oC trong 10 phút; phương pháp thứ hai rong Ch linum được gây nổ bởi áp suất

hơi (1,9 Mpa) ở nhiệt độ 200-210 oC trong 10 phút; phương pháp thứ ba rong xử lý với bước sóng plasma trong thời gian (20-60 phút), điều kiện bước sóng (ø: 7 cm, length: 2 cm) [65] Sinh khối rong lục chứa nhiều dạng polysacchrid ( cellulose, tinh bột, ulvan, agar…) Vì vậy quá trình thủy phân sinh khối rong lục bằng enzyme tương đối phức tạp Một giống vi sinh vật thường chỉ có khả năng sinh một hoặc một vài loại enzyme thủy phân polysaccharide,

do vậy để có thể thu nhận enzyme đặc hiệu thủy phân sinh khối rong lục là điều rất khó Cho nên phương pháp kết hợp dùng nhiều giống vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme là điều kiện rất khả quan để thủy phân sinh khối này Nhóm phức hệ enzyme này tác động đặc hiệu đến các polysaccharide bao gồm (celluose, hemicellulose, xylan, ulvan, agar, tinh bột), các polysaccharide này sẽ bị enzyme cắt tại các vị trí đặt hiệu tạo ra các sản phẩm olygosaccharid

và các monosaccharid (glucose, rhamnose, xylose, galactose) Đây là các loại đường đơn cần cho quá trình lên men ethanol của vi sinh vật

Vì vậy cần tiến hành nghiên cứu để tìm ra điều kiện thủy phân thích hợp với từng đối tượng rong cụ thể

1.2.4 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong biển

Các loại sinh khối sau khi được thủy phân bằng axit hoặc chế phẩm enzyme sẽ thu được dịch thủy phân, sau đó dịch thủy phân được lên men ethanol với các nấm men khác nhau Quá trình lên men này phụ thuộc vào thành phần của dịch lên men và chất lượng của các chủng nấm men

Theo nghiên cứu của Phan Đình Tuấn 1kg rơm rạ được đường hóa lên men đồng thời

sẽ thu được 110 g ethanol Theo nghiên cứu Nguyễn Thị Minh Phương dịch thủy phân rơm rạ

có hàm lượng glucose 33,3%, xylose 13,4%, galactose 4% và arabinose 1,3% lên men thu được 165 g ethanol/kg rơm khô [15] Theo Vũ Nguyên Thành đường hóa lên men đồng thời cellulose vô định hình từ bã mía ở nồng độ chất khô 15% để tạo ra độ cồn 5-6% tương đương

39 - 47 g ethanol [23] Theo Tô Kim Anh thực hiện quá trình lên men từ 330g glucose/kg bã mía, thu được 120 g ethanol/kg bã mía [20] Theo Nguyễn Minh Hải và cs đã nghiên cứu bã

rong Chaetomorpha sp sau khi sử lý được thực hiện đường hóa và lên men đồng thời ở nồng

độ cơ chất 10% w/v, nhiệt độ 35 o

C, pH 5,0 trong 48 giờ với chế phẩm nấm men Lallemand

của Đan Mạch chứa chủng Saccharomyces cerevisiae, kết quả thu được ethanol 1,94% v/v, đạt hiệu suất lên men 80% tương ứng 153g ethanol/kg bã Chaetomorpha sp.[13]

Quá trình lên men dịch thủy phân từ rong biển cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu,

theo nghiên cứu của Wang sản xuất cồn sinh học từ loài Gracilaria salicornia, dịch thủy phân được lên men với Escherichia coli, đây là loại vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng lên men nguồn

cơ chất galactose, cho hiệu suất lên men 79,1gethanol/kg rong khô [96].Một nghiên cứu khác

của Ge Le sản xuất cồn từ bã thải rong Laminaria japonica sau khi sản xuất aginate, bã thải được đường hóa rồi lên men bằng chủng Saccharose cerevisiae Kết quả thu được sau thủy

phân 277,5 g glucose/kg bã thải khô và lên men thu được 122 g ethanol/ kg bã thãi [37]

Theo nghiên cứu của Horn sản xuất ethanol từ hai loài rong Laminaria hyperborea và

Ascophyllum nodosum, rong được thủy phân bằng enzyme sau đó lên men với hai chủng Zymobacter palmae, Pichia angophorae, kết quả lên men thu được 430g ethanol/kg đường

laminaran [41] Theo nhóm nghiên cứu của tác giả Nag-Jong Kim thuộc trung tâm hóa học và

kỹ thuật sinh học phân tử đã tái tổ hợp gene mã hóa vào chủng E coli tạo ra chủng giống có tên khoa học E.coli K11 để tổng hợp ethanol từ nhiều loại đường glucose, mannose, galactose

và mannitol Chủng vi sinh vật này đã được tiến hành lên men thử nghiệm với nguồn cơ chất

là hỗn hợp dung dịch đường được thủy phân bằng enzyme từ nguồn sinh khối của các loại

rong Ulva lactuca, Gelidium amansii, Laminaria japonica và Sargassum fulvellum Trong đó hiệu suất lên men sinh ethanol với nguồn cơ chất từ rong Laminaria japonica là cho hiệu suất

cao nhất, hàm lượng ethanol được xác định 400g ethanol/kg đường laminaran [66] Ngoài ra,

theo nghiên cứu của Lee S.M sử dụng dịch thủy phân rong Laminariajaponica chứa đường manitol, laminaran được lên men với bốn chủng vi sinh vật gồm: Enterobacter sp., Panotoea

agglomerans, Eruinia tasmaniensis, Candida lasitancae Trong đó chủng Candida lasitancae

lên men cho hàm lượng ethanol 30g/kg rong [55]

Theo tác giả Isa đã chọn rong Ulva sp cho sản xuất ethanol, rong Ulva sp thủy phân với chế phẩm enzyme rồi lên men với nấm men Saccharomyces cerevisiae IR-2 thu được 150 g

ethanol/ kg rong [44]

Đầu năm 2011 nhóm nghiên cứu của Yanagisawa đã thủy phân rong Ulva pertusa rồi lên men với Saccharomyces cerevisiae IAM 4178 thu được 185 g ethanol /kg rong[100]

Một nhóm nghiên cứu của phòng công nghệ sinh học thuộc trường cao đẳng

Vivekanandha, đã nghiên cứu sản xuất cồn từ rong Eucheuma sp và Hypnea sp Mẫu rong được thủy phân bởi axit sunfuric sau đó lên men với nấm men Saccharomyces cerevisiae Kết

quả sau lên men thu được 200 g ethanol/ kg rong [50]

Theo nghiên cứu của tác giả Kalpana, nghiên cứu sản xuất ethanol từ rong Kappahycus

alvarezii Rong Kappahycus alvarezii sau khi được thủy phân với axit sunfuric được lên men

với nấm men Saccharomyces cerevisiae (NCIM 3523), kết quả thu được 218 g ethanol/kg

rong[49].

Theo nghiên cứu của Nadja đã tiến hành tiền xử lý rong Chaetomorpha linum ở nhiệt độ

cao 190-200 oC, nổ hơi ở áp suất cao và chiếu plasma trong Sau đó đường hóa và lên men

đồng thời trong 200 giờ Kết quả của nghiên cứu này đã thu được 180 g ethanol/kg rong khô [65]

Trong quá trình lên men rong biển và các sinh khối khác, các tác giả sử dụng các hướng nghiên cứu khác nhau gồm có lên men từ dịch thủy phân bằng axit, lên men dịch thủy phân bằng enzyme và quá trình đường hóa lên men đồng thời Có sự khác nhau của quá trình đường hóa và lên men đồng thời (SSF) với quá trình lên men dịch thủy phân bằng enzyme (HeF) và dịch thủy phân bằng axit (HaF) Quá trình SSF cần có thời gian đường hóa ban đầu

để trong dịch có một lượng dinh dưỡng nhất định đủ đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm men trong giai đoạn ban đầu của quá trình lên men và sau đó quá trình đường hóa và lên men điễn ra đồng thời Mỗi phương pháp lên men thích hợp với từng nguyên liệu khác nhau, trong đó nguyên liệu rong đỏ, rong nâu thường được đường hóa bằng axit rồi lên men [37,50,96], nguyên liệu rong lục và rơm rạ, bã mía, gỗ mền được đường hóa bằng enzyme rồi lên men hoặc đường hóa và lên men đồng thời [15,23,58, 100,65] Như vậy có thể thấy các nguyên liệu giàu cellulose, các tác giả thường tiếp cận theo hai phương pháp đường hóa bằng enzyme rồi lên men hoặc đường hóa và lên men đồng thời

1.2.4.1 Nấm men

Rong biển giàu carbohydrate nên được sử dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học Theo nghiên cứu của Kim và Adam, quá trình thủy phân chuyển đổi carbohydrate của rong biển thành đường lên men giúp cho vi sinh vật dễ dàng sử dụng để sản xuất ethanol Trong các

nhóm vi sinh vật sinh ethanol, nấm men Saccharomyces cerevisiae (S cerevisiae) vẫn là vi sinh vật có ứng dụng rộng rãi nhất Nấm men S cerevisiae có thể lên men nhiều đường đơn như glucose, galactose, manose, đường đôi như sucrose, maltose S cerevisiae là một loại

nấm men sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình lên men ethanol, đã được trình bày trong nhiều nghiên cứu trước đây cho sản xuất ethanol sinh học từ sinh khối rong biển [25,52] Nghiên cứu của Adam sử dụng enzyme laminarinase để thủy phân laminaran trong rong

Saccharina latissima thành glucose, rồi lên men để sản xuất ethanol từ S cerevisiae[24]

Nghiên cứu của tác giả Kim đã sản xuất 7,0-9,8 g/l ethanol từ 50 g/l dịch đường được thủy

phân bằng axit của rong Laminaria japonica và lên men với nấm men S cerevisiae, hàm lượng ethanol tạo thành là tương đối thấp vì S cerevisiae không thể lên men đường mannitol,

trong khi đó dịch thủy phân của rong này chứa đến 81 % manitol [52] Theo nghiên cứu của

Horn, mannitol khó lên men và chỉ có một vài sinh vật có thể sử dụng nó, chủng Zymobacter

palmae đã được phát hiện là có khả năng phát triển trong môi trường mannitol trong điều

kiện oxy thấp và sản xuất ethanol với hàm lượng 0,38g ethanol/g manitol [42] Một nghiên

cứu khác phát hiện ra chủng Pichia angophorae có thể lên men ethanol đồng thời mannitol

và cả laminaran từ dich thủy phân rong nâu, hàm lượng ethanol tối đa là 0,43 g ethanol/g cơ

chất [42] Theo nghiên cứu của Park, chủng Brettanomyces custersii đã được phát hiện là phù hợp cho quá trình lên men galactose hơn S cerevisiae Nghiên cứu này cho thấy chủng

Brettanomycescustersii KCTC 18154P đã lên men dịch thủy phân từ rong đỏ Gracilaria amansii, thành phần chính của dịch thủy phân là galactose và một số sản phẩm biến đổi từ

đường 5 carbon như 5 - hydroxymethyl -2- furaldehyde (5 HMF) và các axit hữu cơ, kết quả

lên men của Brettanomycescustersii thu được 11,8 g ethanol/ 90 g cơ chất đã được thủy phân

hoàn toàn và thu được 27,6 g ethanol/ 72,2 g cơ chất khi đường hóa lên men đồng thời [71] Một trong những khó khăn khi lên men dịch thủy phân sinh khối rong lục là rất ít vi sinh vật có khả năng lên men rhamnose và arabinose, xylose (chiếm 20-30% lượng đường

dịch thủy phân rong lục) Các chủng nấm men S cerevisiae đều không có khả năng này Chính vì những lý do đó, hiện nay có nhiều nhóm nghiên cứu đang tập trung vào cải thiện S

cerevisiae theo hướng chuyển các gene để có thể lên men arabinose, rhamnose, xylose [40,

98]

Một hướng nghiên cứu khác cũng được thực hiện khá tích cực là tạo chủng E coli có

khả năng lên men đồng thời nhiều loại đường và đã thu được nhiều kết quả khả quan, tuy

nhiên việc ứng dụng các chủng E Coli tái tổ hợp còn vấp phải những khó khăn như: dải pH hoạt động rất hẹp và ở vùng trung tính (pH 6-8) độ an toàn của E.coli đối với con người và môi trường, cũng như khả năng sử dụng sinh khối của E coli sau khi lên men ít được nghiên

cứu Một số loại vi sinh vật khác cũng được nghiên cứu nhằm ứng dụng trong lên men sinh

ethanol như Clostridium thermocellum, Neurospora crassa, Zygosaccharomyces rouxii tuy

nhiên những vi sinh vật này có hạn chế là khả năng tích lũy ethanol rất thấp

Bên cạnh ethanol, n- butanol cũng được sản xuất từ dịch thủy phân rong biển Theo tác

giả Potts, Clostridium beijerinckii và Clostridium saccharoperbutylacetonicum là vi khuẩn sinh butanol, được sử dụng để lên men dịch thủy phân rong lục Ulva lactuca Quá trình thủy phân sinh khối Ulva lactuca bằng axit đã tạo ra hỗn hợp đường (27% glucose, 57%

arabinose, và xylose 16%) và lên men dung dịch này thu được 0,29 g butanol/ 1g đường [94]

Bảng 1 4 Vi sinh vật lên men ethanol/butanol từ sinh khốirong biển

Vi sinh vật lên men Thành phần

loài rong biển

Chaetomorpha linum

Glucose, galactose

[98]

Zymobacter palmae Laminaria

[42]

Brettanomyces custersii Gelidium

amansii

Galactose, glucose

Giống biến đổi

Saccharomyces cerevisiae Rong đỏ Galactose, lên

men kết hợp galactose và cellobiose

1.2.4.2 Các yếu tố ảnh hư ng tới quá trình lên men ethanol

a Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men ethanol

Nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp tới hoạt động của tế bào nấm men Mỗi loại nấm men,

có một khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng Đối với nấm men

Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu là 28 – 320C Tuy nhiên, nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp hơn thì khả năng lên men sẽ cao, khả năng chuyển hoá đường thành rượu triệt để hơn, ngoài

ra hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn nhưng thời gian lên men dài hơn Khi lên men ở nhiệt độ trên 32 o

C có thể gây ra ảnh hưởng xấu như tạo nhiều este, aldehyt và cồn dễ bị tiêu hao do bốc hơi mạnh cùng với CO2 Ngoài ra khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ dễ bị nhiễm khuẩn và nấm men dại Khi nhiệt độ môi trường lên tới 40 o

C, nấm men sẽ ngừng hoạt động Tuy vậy có nghiên cứu cho thấy lên men ở nhiệt độ 32-35 o

C giúp tăng đồng nhất các chất trong dịch thủy phân và làm giảm độ nhớt tạo điều kiện thuận lợi cho các hoạt động nấm men, điều này thường được tiến hành trong đường hóa và lên men đồng thời của nguyên liệu

rong biển [86] Trong nghiên cứu tác giả Nitin lên men dịch thủy phân rong lục Ulva faciata với nấm men S serevisiae ở nhiệt độ 28 o

C [69], theo nghiên cứu của Wang dịch thủy phân

rong đỏ Gracilaria salicornia được lên men với nấm men S serevisiae ở nhiệt độ 30 o

C [96],

tại nhiệt độ này tác giả Lee S.M sử dụng lên men dịch thủy phân rong nâu Laminaria

japonica với nấm men Candida tropicalis Nghiên cứu của Nadja nhiệt độ lên men dịch thủy

phân rong Chaetomorpha linum là 32 o

C với nấm men S serevisiae [65]

Giữa nhiệt độ và oxy có sự liên quan chặt chẽ với nhau Nấm men thường sinh trưởng mạnh trong thời gian đầu, trong thời gian này có một lượng oxy hòa tan và nhiệt độ thích hợp là 25- 30 0

C

b Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men ethanol

pH có ảnh hưởng tới hoạt động của nấm men Các ion H+

làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào nấm men, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu của các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men Trong điều kiện lên men rượu, nấm men

Saccharomyces có pH tối ưu để tạo ethanol nằm trong khoảng 4,5- 5,0 Với khoảng pH này,

nấm men sẽ sinh trưởng và phát triển mạnh Nếu pH tăng sẽ làm tăng khả năng nhiễm tạp, tạo ra nhiều glyxerin do đó làm giảm hiệu suất lên men [10] Theo nghiên cứu của Ge Lee và

cs lên men dịch thủy phân bã rong nâu Laminaria japonica sử dụng pH 4.8 [37] Theo nghiên cứu của Nadja lên men dịch thủy phân rong Chaetomorpha linum sử dụng pH 4.8

[65]

c Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới quá trình lên men ethanol

Nồng độ cơ chất thích hợp cho đa số nấm men dùng trong sản xuất rượu là 15 đến 18% Nồng độ cao thì áp suất thẩm thấu sẽ lớn, do đó ảnh hưởng xấu tới hiệu quả lên men, lên men sẽ kéo dài, đường sót lại trong giấm chín sẽ tăng Nếu lên men ở nồng độ đường thấp cũng không có lợi vì tổn thất do sử dụng để nấm men sinh trưởng và phát triển sẽ tăng Ví dụ khi lên men dịch đường có nồng độ 16,9%, tổn thất đường do

sử dụng để nấm men sinh trưởng và phát triển chiếm 6% so với lượng đường có trong dung dịch; nếu nồng độ đường là 8,6% thì tổn thất do nấm men sinh trưởng và phát triển chiếm tới 9,84% Mặt khác, lên men ở nồng độ thấp sẽ làm giảm năng suất của thiết

bị, tốn nhiều hơi khi chưng cất và làm tăng tỉ lệ tổn thất rượu trong bã hèm và nước thải [10,61,86] Trong nghiên cứu lên men ethanol từ rong biển, nồng độ đường của dịch lên men phụ thuộc vào nồng độ chất khô sử dụng cho thủy phân Các nghiên cứu cho thấy rong biển có tính trương nở nên khó nâng cao được nồng độ đường trong dịch lên men

Cụ thể theo nghiên cứu của tác giả Nadja lên men rong Ch linum sử dụng tỷ lệ rong cho thủy

phân là 100g/l nhưng nồng độ đường thực tế tạo thành chỉ là 55 g/l [65], theo nghiên cứu của

Nguyễn Minh Hải lên men bã rong Chaetomorpha sp sử dụng tỷ lệ rong cho thủy phân là 10% w/v có nồng độ đường thực tế là 69 g/l [13] Theo nghiên cứu của Isa lên men rong Ulva

spp sử dụng tỷ lệ rong cho thủy phân là 100g/l nhưng nồng độ đường thực tế tạo thành chỉ là

45 g/l [44], lên men rong Ulva pertusa sử dụng tỷ lệ rong cho thủy phân là 100g/l nhưng

nồng độ đường thực tế tạo thành chỉ là 43 g/l [69]

d Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới quá trình lên men ethanol

Nitơ rất cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men Thông thường trong dịch thủy phân một số nguyên liệu như rơm rạ, bã mía có hàm lượng nitơ không đảm bảo cho phát triển của nấm men Do vậy phải bổ sung nguồn nitơ từ ngoài vào dưới dạng (NH4)2SO4 hoặc (NH4)2CO để tăng cường khả năng sinh sản của tế bào nấm men [10,61,86]

e Ảnh hưởng của nồng độ nấm men tới quá trình lên men ethanol

Số lượng tế bào nấm men có trong dịch lên men càng thấp thì thời gian lên men sẽ kéo dài và dễ bị nhiễm khuẩn Ngược lại, số lượng tế bào nấm men có trong dịch lên men cao thì thời gian lên men sẽ ngắn hạn chế được khả năng nhiễm khuẩn do sự áp đảo của nấm men Tuy nhiên nếu lượng men giống quá cao sẽ gây ảnh hưởng không tốt tới quá trình lên men [10,23,61]

f Ảnh hưởng của chất sát trùng tới quá trình lên men ethanol

Quá trình lên men thường diễn ra trong một khoảng thời gian khá dài, khả năng bị nhiễm khuẩn rất cao Chính vì vậy người ta thường bổ sung thêm chất sát trùng để ngăn ngừa

và hạn chế sự nhiễm tạp Các chất sát trùng có tác dụng diệt tạp khuẩn nhưng bên cạnh đó nó

cũng gây ức chế hoạt động của tế bào nấm men, song với một hàm lượng nhất định thì nó có thể hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn mà không gây ảnh hưởng xấu đến tế bào nấm men

Có thể dùng nhiều hóa chất để sát trùng như: tween, flousilicat natri, formalin…Ở các nhà máy rượu hiện nay thường sử dụng flousilicat natri để sát trùng với liều lượng 0,2 o

/oo[23,58,86]

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT ETHANOL TỪ NGUYÊN LIỆU

RONG BIỂN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.3.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol từ nguyên liệu rong biển trên thế giới

Hiện nay trên thế giới nhiều quốc gia đang tập trung nghiên cứu sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu rong biển, nhưng nguồn nguyên liệu này của mỗi nước là khác nhau do

phụ thuộc vào đặc tính phân bố thành phần loài và tình hình kỹ thuật của mỗi quốc gia

Tại Trung Quốc theo nghiên cứu của Wang sản xuất cồn sinh học từ loài Gracilaria

salicornia Sinh khối của loài Gracilaria salicornia được thủy phân trong điều kiện axit

sunfuric 2%, trong 30 phút ở nhiệt độ 120o C, hiệu suất của quá trình thủy phân 4,3 g

glucose/kg rong tươi Ngoài ra sinh khối Gracilaria salicornia còn được thủy phân bằng

enzyme cellulase và có hiệu suất 13,8 g (glucose/kg rong tươi) cao hơn nhiều so với thủy

phân bằng axit loãng Sau khi thủy phân dung dịch đường được lên men với Escherichia coli,

đây là loại vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng lên men nguồn cơ chất galactose, cho hiệu suất lên men 79,1g ethanol/kg rong khô (100,2 ml ethanol/ kg rong khô) [96]

Một nghiên cứu khác của Ge Le sản xuất cồn từ bã thải rong Laminaria japonica sau khi

sản xuất aginate Bã thải được tiền xử lý bằng axit sunfuric sau đó được thủy phân bằng

enzyme cellulase và cellobiase rồi lên men bằng chủng Saccharose cerevisiae Điều kiện tiền

xử lý bằng axit sunfuric với nồng độ 0,1%(w/v) trong thời gian 1 giờ và thủy phân bằng enzyme tại điều kiện (500

C, pH 4.8, 48h) và lên men ở 300C trong 36 giờ Kết quả thu được sau thủy phân 277,5 g glucose/kg bã thải khô và hiệu suất lên men là 0,143 L ethanol/ kg bã thải [37]

Theo nghiên cứu của Horn sản xuất ethanol từ hai loài rong Laminaria hyperborea và

Ascophyllum nodosum, rong được tiền xử lý bằng axit sunfuric sau đó được thủy phân bằng

enzyme β-(1-3)-glucanase, sau đó lên men với hai chủng Zymobacter palmae, Pichia

angophorae Điều kiện tiền xử lý bằng axit sunfuric với nồng độ 0,3%(w/v) trong thời gian 1

giờ và thủy phân bằng enzyme tại điều kiện (450

C, pH 4.8, 45h) và lên men ở 270C trong 72giờ Hiệu suất lên men 0,43g ethanol/g cơ chất (0,54L/kg cơ chất) [41]

Hàn Quốc là đất nước có nền công nghệ sinh học phát triển Vì vậy Hàn Quốc đã ứng dụng nhiều kỹ thuật mới và hiện đại vào sản xuất ethanol Nhóm tác giả Michul Yoon đã sử

dụng kỹ thuật xử lý mẫu bằng phương pháp chiếu xạ tia gamma đã mang lại hiệu quả tích cực

cho công nghệ sản xuất cồn Thành phần loài được sử dụng trong nghiên cứu này là Undaria

sp., đây là loài có sinh khối vô cùng lớn được nuôi trồng và khai thác tự nhiên tại Hàn Quốc

Mẫu rong biển sau khi thu hoạch ngoài tự nhiên sẽ được xử lý với tia Gamma với liều chiếu 0,

10, 50, 100, 200 và 500 kGy, sau đó thủy phân trong axit sunfuric 1%w/v tại 121 o

C trong 3 giờ Sau quá trình thủy phân hỗn hợp rong sẽ được trung hòa với CaCO3 rồi lên men với nấm men Hàm lượng glucose thu được vào khoảng 72 -204g/kg đường tổng số [62]

Với sự phát triển của kỹ thuật gene, Hàn Quốc đã thành công trong công nghệ tái tổ hợp Theo nhóm nghiên cứu của tác giả Nag-Jong Kim thuộc trung tâm hóa học và kỹ thuật sinh

học phân tử đã tái tổ hợp gene mã hóa vào chủng E coli tạo ra chủng giống có tên khoa học

E.coli K11 để tổng hợp ethanol từ nhiều loại đường glucose, mannose, galactose, và mannitol

Chủng vi sinh vật này đã được tiến hành lên men thử nghiệm với nguồn cơ chất là hỗn hợp

dung dịch đường được thủy phân bằng enzyme từ nguồn sinh khối của các loại rong Ulva

lactuca, Gelidium amansii, Laminaria japonica, and Sargassum fulvellum Trong đó hiệu suất

lên men sinh ethanol với nguồn cơ chất từ rong Laminaria japonica là cho hiệu suất cao nhất,

hàm lượng ethanol được xác định 0,4g ethanol/g cơ chất (506 ml ethanol/ kg)[66]

Ngoài ra, theo nghiên cứu của Lee sử dụng rong nâu Laminaria japonica cho sản xuất

ethanol, trong rong nâu chứa nhiều loại đường khác nhau, nhiều nhất là manitol, laminaran Rong này sau khi thủy phân trong HCl 1-5% (w axit/w rong) ở 121oC tạo ra lượng đường

20g/l, sau đó lên men với bốn chủng vi sinh vật gồm: Enterobacter sp, Panotoea

agglomerans, Eruinia tasmaniensis, Candida lasitancae Trong đó chủng Candida lasitancae

lên men với đường manitol cho hiệu suất cồn cao nhất 2,59 g ethanol/l sau 96 giờ lên men Ngoài ra alginate sau khi được thủy phân bằng enzyme alginatelyase cũng được lên men với

chủng Eruinia tasmaniensis, Candida lasitancae đạt hiệu suất 2,0 g/l[55]

Nhật Bản cũng sử dụng rong lục để nghiên cứu sản xuất ethanol Theo tác giả Isa mẫu

rong được thu rãi rác tại Việt Nam, Thái Lan, Nhật bao gồm các chi Enteromorpha,

Chaetomorpha, Cladophora, Caulerpa, Ulva rồi xác định hàm lượng carbohydrate tổng số, và

hàm lượng glucose của từng loài Sau khi khảo sát, nhóm tác giả đã chọn rong Ulva spp cho

sản xuất ethanol, các tác giả đã sử dụng tiền xử lý rong Ulva ở 120 oC trong 20 phút rồi bổ sung 1% v/w enzyme cellulase có tên thương mại Acremonium hoạt độ 322 FPU/g, nồng độ polysaccarid 5% w/v thủy phân trong 72 giờ ở 50 oC thu được 95% glucose = 4,7 g/ 100ml và

tiếp tục lên men với nấm men Saccharomyces cerevisiae IR-2 trong 32 giờ ở 30 oC thu được 2

g ethanol/100ml [44]

Đầu năm 2011 nhóm nghiên cứu của Yanagisawa của viện khoa học kỹ thuật Tokyo

Nhật Bản đã đưa ra kỹ thuật sản xuất cồn từ rong Ulva pertusa (Kjellman) Quá trình thủy

phân các polysaccharide của các loại rong này được thực hiện theo tỷ lệ 75g khô/l rồi tiền xử

lý với nhiệt 0,1 M citric, 121oC trong 20 phút, sau đó rong được thủy phân bởi enzyme Meicelase là enzyme có cellulase 73,3 U/g và cellobiase 227 U/g của công ty (Avicel, Merck, Germany) liều dùng thủy phân 20g rong/g enzyme trong 120 giờ pH=5.5, nhiệt độ 50 o

C Kết quả thủy phân thu được 43g glucose/l rồi lên men với Saccharomyces cerevisiae IAM 4178

thu được 18.5 g/l [100]

Trong những năm gần đây Ấn Độ đặc biệt chú trọng đến việc phát triển nhiên liệu sinh học từ nguồn sinh khối thực vật nhằm giải quyết vấn đề nhiên liệu cho quốc gia Các nguồn sinh khối đã được nhà nước Ấn Độ chú trọng phát triển bao gồm cây Jatropha, các cây họ dầu

cọ, sắn, mía đường và cả rong biển Tuy nguồn sinh khối rong biển ứng dụng trong sản xuất ethanol vừa mới được nghiên cứu ứng dụng nhưng cũng đã thu được một số kết quả bước đầu Một nhóm nghiên cứu thuộc phòng công nghệ sinh học thuộc trường cao đẳng Vivekanandha,

đã nghiên cứu sản xuất cồn từ rong Eucheuma sp và Hypnea sp Mẫu rong được thủy phân

bởi axit sunfuric 1% tại nhiệt độ 100oC trong 3 giờ theo nồng độ chất khô 20g/l, dung dịch đường sau thủy phân sẽ được trung hòa bằng BaCO3 sau đó lên men với nấm men

Saccharomyces cerevisiae Kết quả sau lên men cho thấy 1 gram rong sẽ tạo thành 200mg

ethanol [50]

Theo nghiên cứu của tác giả Kalpana, nghiên cứu sản xuất ethanol từ rong Kappahycus

alvarezii Đây là loài rong đỏ được nuôi trồng phổ biến có sinh khối lớn, có hàm lượng

carbohydrate cao với thành phần chính là polysaccharide carrageenan Rong Kappahycus

alvarezii sau khi được thủy phân theo tỷ lệ 50 g/l với axit sunfuric 0,9N trong 1 giờ tại 100 oC

được lên men với mấm men Saccharomyces cerevisiae (NCIM 3523), kết quả thu được 2 %

v/v ethanol [49].

Theo nghiên cứu của Nadja và cs đã tiến hành nhiều phương pháp tiền thủy phân rong

lục Chaetomorpha linum từ đó lên men đồng thời Các tác giả đã sử dụng các phương pháp

như tiền xử lý nhiệt cao 190-200 oC trong 5 phút, nổ hơi ở áp xuất 1,9 Mpa, và chiếu plasma trong 48 giờ Sau đó các tác giả này bổ sung enzyme Celluclast 1.5 L vơi liều 15 FPU/g, nồng

độ rong thủy phân là 10g/100ml rồi thủy phân tại 50 oC trong 24 giờ sau đó hạ nhiệt độ về 32

độ và bổ sung 20 FPU/g và 2 g/l nấm men đã chuẩn bị trước rồi lên men trong 200 giờ Kết quả của nghiên cứu này đã thu được 15-18 g ethanol/100 g rong khô [65]

Trên thế giới nhiều quốc gia đang tập trung nghiên cứu sản xuất ethanol từ nguồn sinh khối rong biển, số lượng các dự án nghiên cứu ngày một gia tăng và quy mô ngày một lớn

Tại Nhật, dự án Sunrise [26] sản xuất bioethanol từ rong biển Sargassum được nuôi

trồng ở vùng biển Nhật Bản Kế hoạch của họ bắt đầu vào năm 2012, phát triển công nghệ nuôi rong biển vào năm 2016, và thiết lập một quy trình sản xuất khoảng năm 2020

Tại Hàn Quốc, dự án 275 triệu USD trong 10 năm để sản xuất 400 triệu gallon vào năm

2020 xấp xỉ 13% nhu cầu tiêu thụ trong nước Dự án sẽ nuôi trồng rong biển trên diện tích 8.600 ha

Dự án giữa Indonesia và Hàn Quốc phát triển nhiên liệu sinh học dựa trên các nguồn nguyên liệu rong biển của Indonesia và sử dụng công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học của Hàn Quốc Tương tự một dự án giữa chính phủ Philippin và Viện Kỹ thuật công nghệ Hàn Quốc, đầu tư 5 triệu USD để trồng 250 ha rong biển và sản xuất ethanol từ công nghệ Hàn Quốc [78]

Dự án Sea Gardens Project của trường University of Costa Rica với tài trợ của World Bank

để nuôi trồng rong biển sản xuất bioethanol [78]

Dự án Biomara, phối hợp giữa Hiệp hội Khoa học Biển Scotland và Liên minh châu Âu với sự điều hành của 2 chính phủ Ailen và Scotland, với mục tiêu sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ thứ ba từ sinh khối tảo Đã đầu tư 8 triệu USD vào năm 2009, để đánh giá tiềm năng rong biển và chọn dòng microalgae để sản xuất quy mô công nghiệp [78]

Tại Na Uy, dự án sản xuất ethanol và các sản phẩm lipids, proteins, iodine từ rong biển theo quỹ tài trợ của BAL’s R&D bắt đầu từ cuối năm 2010

Tại Chile, dự án sản xuất ethanol từ rong biển của Chile giữa Bio-Architecture Lab (BAL) với Công ty dầu khí ENAP và trường Đại học Los Angeles Đã đầu tư 5 triệu USD từ năm 2010 để sản xuất 165 triệu lít ethanol vào năm 2012

1.3.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol từ nguyên liệu rong biển ở Việt Nam

Việt Nam vấn đề nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối tảo là hướng phát triển mới Hiện tại đã có một số phòng thí nghiệm tiến hành nghiên cứu nhiên liệu sinh học từ tảo Phòng nghiên cứu tảo của Viện Công nghệ Sinh học nghiên cứu diesel sinh học được sản xuất từ sinh khối vi tảo biển của Việt Nam Vi tảo được tác giả sử dụng cho nghiên cứu là

Schizochytrium mangrovei PQ6 [2,1]

Theo Hoàng Kim Anh bước đầu đã khảo sát được thành phần hóa học rong

Chaetomorpha sp đồng bằng sông Cửu Long và định hướng sử dụng protein sản xuất thức

ăn chăn nuôi và sử dụng bã thải nghiên cứu sản xuất ethanol [3]

Theo kết quả nghiên cứu của đề tài “Nghiên cứu đánh giá tiềm năng rong biển Việt Nam sử dụng làm nguyên liệu sản xuất ethanol nhiên liệu” của tác giả Lê Như Hậu, nguồn sinh khối rong lục được thống kê như sau:

Bảng 1 5 Diện tích và sản lƣợng tại thời điểm khảo sát (2009) và dự kiến đến năm 2015

Loài

Diện tích (ha)

Sản lượng (tấn khô) Diện tích (ha)

Sản lượng (tấn khô)

là nhóm Chaetomorpha, Cladophora, Enteromorpha có năng suất thu hoạch 18-27

tấn/ha/năm Diện tích nuôi các đối tượng rong lục có thể sử dụng bất kỳ nguồn nước ngập mặn ven biển như các ao hoang, đầm ngập mặn, ao xử lý nước, kênh dẫn nước, đặc biệt có thể phát triển tốt vùng ngập mặn đồng bằng sông Cửu Long, đồng bằng ven biển sông Hồng, các vùng ven và cửa biển các tỉnh miền trung Theo bảng 1.5, thành phần polysaccharid của rong lục chủ yếu là các sản phẩm quang hợp như tinh bột và cellulose nên khi thủy phân tạo

ra đường glucose dễ lên men ethanol Sự phân bố rộng và thích nghi nhiều loại môi trường và thành phần hóa học dễ lên men chỉ ra rong lục là nguyên liệu thích hợp cho nghiên cứu sản xuất ethanol

Trong khi đó nguyên liệu rong đỏ ở Việt Nam có rong Kappaphycus đã được nuôi

trồng nhưng chỉ phát triển tốt tại các vùng Nam Trung Bộ năng suất thu hoạch đạt 12 tấn/ha

và giá thành nguyên liệu này cao 20.000-25.000 VNĐ/ kg nên không thích hợp cho sản xuất

ethanol chỉ thích hợp cho sản xuất carragenan Rong đỏ Gracilaria mặc dù có thể phát triển

nhiều nơi từ Nam Trung Bộ ra đến Vịnh Bắc Bộ nhưng khả năng sinh trưởng chậm hơn rong

lục năng suất thu hoạch thấp 15 tấn/ha/năm và rong Gracilaria là nguyên liệu chính cho sản

xuất agar Theo Trần Thị Thanh Vân rong đỏ có thành phần polysacharid chính là agar và carragenan [22] Sản phẩm thủy phân là galactose lên men được ethanol nhưng chậm hơn so với glucose Giá thành nguyên liệu cao, năng suất thấp, thời gian lên men kéo dài, rong đỏ gặp nhiều hạn chế trong sản xuất ethanol hơn rong lục

Nguyên liệu rong nâu ở nước ta mô hình nuôi trồng vẫn chưa được triển khai, nên nguyên liệu này chủ yếu khai thác tự nhiên và đối tượng khai thác chính là rong mơ

Sargassum, vùng biển khai thác nguyên liệu này chủ yếu một số tỉnh Nam Trung bộ, năng

xuất khai thác nhỏ lẻ, giá thành cao 12.000-15.000 VNĐ/kg Theo Trần Thị Thanh Vân thành phần polysaccharid chủ yếu là alginate 70-80% tạo ra sản phẩm thủy phân là axit gluronic và manuronic [21] Hai loại đường rất khó lên men ethanol, nên rong nâu thích hợp là nguyên liệu cho sản xuất alginat, thực phẩm chức năng hơn là nguyên liệu cho sản xuất ethanol Như vậy, rong lục có nguồn sinh khối dồi dào, có thành phần hóa học thích hợp cho sản xuất ethanol, không cạnh tranh lương thực và chất đốt, vì vậy rong lục là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất nhiên liệu sinh học Để cung ứng nhu cầu nhiên liệu, Quyết định 177/2007/QĐ-TTg của Thủ tướng Chính phủ ngày 20/11/2007 đã ký thực hiện chương trình KH&CN trọng điểm cấp nhà nước giai đoạn 2011-2015 về Đề án phát triển NLSH đến năm

2015, tầm nhìn đến năm 2025 Xuất phát từ những phân tích trên, cho thấy rằng cần đưa ra được công nghệ sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu rong biển phong phú của Việt nam nhằm góp phần tăng nguồn nhiên liệu sinh học thay thế nhiên liệu hóa thạch ngày càng cạn

kiệt, chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu xác định các thông số công nghệ

xử lý rong lục Việt Nam và lên men ethanol góp phần phát triển cồn nhiên liệu”

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Rong lục

Rong lục được thu ở các tỉnh ven biển Thanh Hóa, Thái Bình, Ninh Bình, Quảng Ngãi, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bến Tre, Cà Mau trong khoảng thời gian từ năm 2011 đến năm 2013, sau đó được định danh và lưu giữ mẫu tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang

Rong Chaetomorpha linum, Chi Chaetomorpha, Ngành Chlorophyta, Lớp

Ulvophyceae, Bộ Cladophorales, Họ Cladophoraceae Rong được sấy khô đến độ ẩm 13% sử dụng cho nghiên cứu

2.1.2 Chế phẩm Enzyme

Viscozyme L

Tên thương phẩm Viscozyme L (Vis.) có mã số (V2010-50ml) được thu nhận từ giống

nấm Aspergillus sp sản xuất bởi công ty Novozyme được phân phối bởi công ty hóa chất

Sigma Enzym này tác động đặc hiệu đến các polysaccharide bao gồm (celluose, hemicellulose, β-glucan, pectin, tinh bột)

Viscozyme L là enzyme hoạt động vùng pH 4.0-6.0 và hoạt động tốt pH 5.0, ở nhiệt độ 40-50oC

Cellulase

Tên thương phẩm Cellulase (Cel.) có mã số (C2605-50ml) được thu nhận từ giống nấm

Aspergillus sp sản xuất bởi công ty Novozyme được phân phối bởi công ty hóa chất Sigma

Enzyme này tác động đặc hiệu đến các polysaccharide bao gồm (celluose, hemicellulose, xylan)

Cellulase là enzyme hoạt động vùng pH 4.0-5.5 tốt pH 4.8-5.0, ở nhiệt độ 40-50o

C

2.1.3 Chế phẩm nấm men

Chế phẩm Thermosacc Active Dry Yeats hãng sản xuất Lallemand là nấm men

Saccharomyces cerevisiae, một loại nấm men khô được sử dụng trong sản xuất ethanol từ

nguồn nguyên liệu tinh bột và nguyên liệu giàu cellulose Số lượng tế bào ≥ 2.5 ×1010

tế bào/g Điều kiện hoạt động thích hợp ở pH =4.5-5 có thể chịu pH 3.5, nhiệt độ 27-32o

C và

có thể chịu được nhiệt độ lên đến 40o

C

Chế phẩm Red Ethanol là nấm men Saccharomyces cerevisiae của hãng Fermentis,

Pháp được sử dụng trong sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu tinh bột và nguyên liệu giàu

cellulose Số lượng tế bào 2 ×1010 tế bào/g, hoạt động tốt ở pH =4.2-4.5, nhiệt độ 27-30 oC có thể chịu nhiệt lên đến 40 o

C

Saccharomyces cerevisiae được sản xuất tại công ty sản xuất Cồn Cây Cày Khánh Hòa

(SacCCC), nấm men ở dạng khô Số lượng tế bào 2,5 ×1010

tế bào/g Đây là nấm men sử dụng lên men từ nguyên liệu sắn trong sản xuất ethanol Hoạt động tốt ở pH =4.5-5.5, nhiệt

độ 27-32o

C

Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 sưu tầm tại Viện Sinh học Nhiệt đới

(SacSHNĐ) được giữ giống trong ống thạch nghiêng, môi trường giữ giống Hansen, sử dụng

lên men tạo ethanol từ nguồn sinh khối rong lục Hoạt động tốt ở pH =4.5-5.5, nhiệt độ 25-30

o

C

Chế phẩm Turbo Yeast là nấm men Saccharomyces cerevisiae do hãng Fermtech

Wholasale của Anh sản xuất được sưu tầm tại Đại học Bách Khoa TP HCM (SacBKHCM) được giữ giống trong ống thạch nghiêng, môi trường giữ giống Hansen, sử dụng lên men nguồn sinh khối rơm rạ Hoạt động tốt ở pH =4.5-5.5, nhiệt độ 28-32oC có thể chịu được nhiệt độ 38 o

2.2.1.1 Xác định độ ẩm theo phương pháp sấy đến trọng lượng không đổi [29]

Nguyên tắc: Rong biển được xay nhỏ về kích thước d = 2-4 mm Sấy trong tủ sấy đã đặt nhiệt độ tiêu chuẩn Độ ẩm được tính toán dựa vào khối lượng mất đi trong quá trình sấy Tính kết quả

m1 - khối lượng mẫu trước khi sấy, g;

m2 - khối lượng mẫu sau khi sấy, g

2.2.1.2 Xác định tro [29]

Nguyên tắc : Rong biển được xay nhỏ về kích thước d = 2-4 mm Tro hóa trong lò

nung đã đặt nhiệt độ tiêu chuẩn Tro được tính toán dựa vào khối lượng sót lại trong quá trình

X: Hàm lượng tro tính theo (%)

a: Khối lượng chén nung và tro (g)

b: Khối lượng chén (g)

c: Khối lượng mẫu có chứa tro (g)

2.2.1.3 Xác định hàm lượng nitơ và protein theo phương pháp Kjeldahl [29]

Nguyên tắc: Định lượng nitơ tổng được thực hiện trên bộ chưng cất Kjeldahl Trước

tiên mẫu rong lục được vô cơ hóa bằng sunfuric đặc ở nhiệt độ cao và chất xúc tác CuSO4:

K2SO4 tỷ lệ 1:3 Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng H2SO4 tạo thành NH3; NH3 tạo thành sẽ kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4

- Đuổi ammoniac ra khỏi dung dịch bằng NaOH:

6,25 là hệ số chuyển đổi nito thành protein

2.2.1.4 Xác định hàm lượng lipid bằng máy soxhlet [29]

Nguyên tắc: Rong được nghiền nhỏ sấy khô đến khối lượng không đổi Cân rong cho

vào túi giấy, cho túi vào bộ soxhlet Dùng dung môi hữu cơ chiết lipid ra khỏi rong Dung môi được sử dụng để chiết lipid là cloroform và metylic với tỷ lệ 2:1 (2CH3Cl : CH3OH) Quá trình chiết lipid được thực hiện trên máy trong 10 giờ

2.2.1.5 Xác định thành phần môi trường lên men

Nito tổng số, phospho tổng số, lưu huỳnh tổng số được xác định bằng phương pháp so màu theo Samira và cs (2009) [82]

Nito tổng số

Nguyên tắc: NH3/NH4+ + dd Nestler (HgCl2 + KI + KOH) → NH2Hg2IO (ioduadimercua amonium màu vàng) + KCL + H2O Hỗn hợp dung dịch phản ứng Nito với thuốc thử Nestler sẽ đo màu tại bước sóng 420 nm, sau đó đối chiếu các mẫu chuẫn tính ra kết quả hàm lượng nito tổng

Phospho tổng số

Nguyên tắc: Amoni molybdat và kali tartrate trong môi trường axit + dung dịch phốt

pho sẽ tạo thành phức tạp antimon-phospho-molybdate sau đó hỗn hợp này bị khử bởi axit ascorbic chuyển thành màu xanh, phổ màu là tỷ lệ thuận với nồng độ phốt pho Hỗn hợp dung dịch phản ứng phót pho sẽ đo màu tại bước sóng 580 nm

Lưu huỳnh tổng số

Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng Ba2+

+ SO42- -> BaSO4 tạo thành kết tủa trắng đục

Tỷ lệ SO4

tăng dần khi màu đục dần Hỗn hợp dung dịch phản ứng lưu huỳnh sẽ đo màu tại

bước sóng 370 nm

Xác định các nguyên tố kim loại: Kali, natri, magnessium, sắt theo phương phát xạ nguyên

tử AAS (Atomic Absorption Spectrophotometric) theo S Rjiba Kitit và cs (2010) [76] Thiết

bị đo máy quang phổ hấp thụ nguyên tử - AAS cùng các bộ phận đi kèm: Thermo Elemental – Model Solaar M6 Dual Zeeman Atomic Absorption

Nguyên tắc: Các nguyên tố kim loại được tro hóa ở 800oC rồi nguyên tử hóa 1200 o

C, khi đó các nguyên tố sẽ phát xạ và máy AAS sẽ xác định được nguyên tố và hàm lượng các nguyên tố

2.2.1.7 Xác định carbohydrate của rong lục và đường trong dịch thủy phân

Xác định hàm lượng carbohydrate mẫu rong lục theo nguyên tắc quy đổi tính theo đường tổng số

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa dung dịch đường

với thuốc thử phenol sunfurid Cường độ màu của hổn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định Dựa theo đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử phenol sunfuaric sẽ tính được lượng đường khử của mẫu phân tích [53,80]

Dụng cụ và hóa chất: Dung dịch phenol 95%; dung dịch sunfuric đậm đặc; dung dịch

glucose hoặc galactose tinh khiết; Ống nessler 15 ml có nắp đậy, cốc thủy tinh đựng ống nessler

Tiến hành: Chuẩn bị mẫu tạo ra dung dịch đường khử dùng để so màu

Đ i với nguyên liệu rong lục: cân 0,5 g rong lục có kích thước d= 0,2-0,4 mm cho vào ống

thủy tinh có nắp vặn, bổ sung 10 ml axit sunfuric 30%v/v vặn chặt nắp cho thủy phân trong 3 giờ

ở nhiệt độ 110oC bằng bộ phá mẫu Thermo Reactor ET 108, kết thúc thủy phân mang dịch đi ly tâm 5000 vòng/10 phút tách bã, sau đó pha loãng dịch chuẩn bị cho phân tích

Đ i với dịch sau thủy phân: rong lục được thủy phân bằng axit hoặc được thủy phân

bằng chế phẩm enzyme thu được trong quá trình nghiên cứu mang ly tâm 5000 vòng/10 phút tách bã, sau đó pha loãng dịch chuẩn bị cho phân tích

Chuẩn bị dung dịch đường chuẩn: Dùng dung dịch Galactose hoặc Glucose pha các nồng độ: 20; 40; 60; 80; 100; 120µg/ml

Xác định lượng đường: Lấy 0,5 ml mẫu đã pha loảng + 0,5 ml dung dịch phenol 95% + 2,5 ml H2SO4 đậm đặc cho vào ống nesler khác Lắc đều hỗn dịch trong10 phút, sau đó để yên 30 phút Rồi đem đo ở bước sóng 490nm

Tính kết quả: Lập biểu đồ đường chuẩn từ các kết quả đo được của mẫu chuẩn, rút ra

phương trình tuyến tính của mẫu chuẩn, thay thế chỉ số OD của mẫu phân tích vào phương trình tuyến tính từ đó tính được hàm lượng đường của mổi mẫu

Đ đ

M  m   n V

MĐ – khối lượng đường cần xác định, g;

mđ- lượng đường trong mẫu đo, µg;

n - hệ số pha loãng địch;

V - số thể tích dịch đo, ml

2.2.1.8 Xác định thành phần polysaccharide của rong lục

Xử lý nguyên liệu: Cân 10g bột rong có kích thước 0,2-0,4 mm (A) cho vào bình chứa

200ml nước cất, giữ cho rong ngậm nước trong 30 phút Sau đó gia nhiệt 90o

đến 3 giờ

Xác định hàm lƣợng cellulose [64]

Nguyên tắc: Dựa trên độ bền cơ học của cellulose với nhiệt thấp, rong nguyên liệu sẽ

được chiết bằng nước cất trong thời gian 3 giờ, các polysaccharide sẽ thoát ra chỉ còn sót lại

cellulose và tro Vì vậy ta có thể dễ dàng thu nhận cellulose

Thiết bị: Rong nguyên liệu, bộ chưng cất thủy, cốc đông 1 lít, nhiệt kế 100 OC, tủ sấy, lò nung