VIRUS CÚM VÀ CÁC VIRUS KHÁC GÂY NHIỄM ĐƯỜNG HÔ HẤP

 KN NP: bao quanh RNA virus, xuất hiện trong tế bào nhiễm virus  phát hiện KT kháng type virus cúm A, B, C bằng phản ứng kết hợp bổ thể CF..  KN NA : glycoprotein trên bề mặt virion,

Lý thuyết Vi sinh 7

VIRUS CÚM VÀ CÁC VIRUS KHÁC GÂY NHIỄM

1 VIRUS CÚM

MỤC TIÊU HỌC TẬP

1 Nêu được cách phân loại, phân type virus cúm

2 Trình bày được đặc điểm kháng nguyên của virus cúm

3 Nêu quy trình nhân lên của virus cúm trong tế bào

4 Hiểu và trình bày phương thức lây truyền và ổ chứa virus cúm

5 Nêu các loại vắc-xin cúm

6 Kể tên các thuốc kháng virus cúm dùng trong điều trị và giải

thích cơ chế tác dụng của thuốc

7 Liệt kê các phương pháp phân lập virus cúm

8 Nêu các phương pháp hiện đang sử dụng trong chẩn đoán

bệnh nhiễm virus cúm

NỘI DUNG BÀI GIẢNG

1.1 PHÂN LOẠI VIRUS

─ Họ Orthomyxoviridae, (bắt nguồn từ gốc Hy Lạp Orthos = trực

tiếp, myxa = tuyến nhày) là những virus tấn công trực tiếp và

tuyến đường hô hấp

─ Có 5 type virus (A, B, C, Isa và Thogoto) dựa trên epitope của

KN Nucleoprotein (NP) hoặc M (Matrix)

─ Chỉ có type virus cúm A là có phân type, dựa trên KN ngưng

kết hồng cầu (HA) và KN có hoạt tính enzyme neuraminidase (NA), bao gồm:

 16 phân type HA: H1 – H16.

 9 phân type NA: N1 – N9.

─ Giới hạn vật chủ của phân type cúm A rất khác nhau:

 Chim: tất cả phân type HA và NA

 Động vật: ngựa (H3, H7 và N7, N8), lợn (H1, H3 và N1, N2).

 Người: H1, H2, H3 và N1, N2 H5 đã gây bệnh cho người nhưng ít

gặp và chưa có bằng chứng về sự lây truyền từ người sang người.

1.2 CẤU TRÚC VIRUS

─ Virus cúm rất đa dạng: hình cầu, hình trứng

(đường kính 80-120nm), hoặc hình sợi (dài đến

2000nm).

─ Hạt virus cúm A/B có vỏ (từ màng tế bào vật chủ),

có gai glycoprotein (là HA và NA, tỷ lệ HA:NA =

4:1), virus cúm C chỉ có 1 gai glycoprotein.

─ RNA sợi đơn, cực âm, phân đoạn (A/B = 8 phân

đoạn, C = 7 phân đoạn), dài 10-15kb, mã hóa cho

7 protein cấu trúc (PB1, PB2, PA, HA, NA, NP, M1)

và 3 protein không cấu trúc (NS1, NS2, M2: cúm A hoặc NB: cúm B).

Neuraminidase NA1-9

RNA genome virus cúm chứa 8 đoạn RNA

Và mã hóa 10 protein thiết yếu

PB2 PB1 PA HA NA NP M NS

RNA Protein

PB2, PB1, PB1-F2 PA

HA NA NP M1, M2 NS1, NEP

1.3 CHỨC NĂNG CỦA THÀNH PHẦN

CẤU TẠO

─ Protein PB1, PB2, PA (tổng hợp từ phân đoạn 1-3): protein có

hoạt tính enzyme polymerase

─ Protein HA (tổng hợp từ phân đoạn 4): protein Hemagglutinin,

gây ngƣng kết hồng cầu, đƣợc acylat hóa ở vùng giáp ranh với

vỏ ngoài virus và có đầu N liên kết glycan ở một số vị trí nhấtđịnh

─ Protein NP (tổng hợp từ phân đoạn 5)

─ Protein NA (tổng hợp từ phân đoạn 6): protein Neuraminidase

có hoạt tính enzyme sialidase

─ Protein M1, M2 (tổng hợp từ phân đoạn 7): protein nền

(matrix)

─ Protein NS1, NS2 (tổng hợp từ phân đoạn 8): protein không

cấu trúc NS1, NS2

1.4 TÍNH CHẤT KHÁNG NGUYÊN

Virus cúm có 2 loại kháng nguyên đặc hiệu: type và phân type:

─ KN đặc hiệu type : KN NP và màng (M1).

 KN NP: bao quanh RNA virus, xuất hiện trong tế bào nhiễm virus  phát hiện

KT kháng type virus cúm (A, B, C) bằng phản ứng kết hợp bổ thể (CF) NP là

KN đích của CTL CD8  tạo MD kháng virus.

 KN M1 : giữ tính ổn định cho virion, kiểm soát hoạt tính phiên mã, có vai trò

trong lắp ráp protein để hình thành virion  xác định type virus cúm bằng CF hoặc khuếch tán MD hai chiều.

─ KN đặc hiệu phân type : KN HA và NA.

 KN HA : glycoprotein gắn lên thụ thể acid neuraminic ở bề mặt tế bào vật chủ

 xâm nhập vào tế bào  giải phóng RNP vào bào tương Sự phân cắt HA nhờ enzyme phân cắt protein quyết định độc lực virus KN HA tạo đáp ứng MD sinh KT HI, đồng thời cũng là KT trung hòa virus.

 KN NA : glycoprotein trên bề mặt virion, có tính KN và hoạt tính enzyme  cắt

các thụ thể gắn HA trên phân tử mucin tế bào biểu mô để virus xâm nhập nhanh chóng, đồng thời giải phóng virion mới tổng hợp ra khỏi tế bào vật chủ.

1.4 TÍNH CHẤT KHÁNG NGUYÊN (tt)

─ Sự thay đổi KN HA và NA của virus cúm  tạo điều kiện cho virus

lưu hành trong quần thể người và không thể dự báo được

─ Sự trôi KN (antigenic drift): thay đổi KN từ từ, là kết quả tích lũy

dần các đột biến điểm tại gen mã hóa cho HA và NA (0,5-1%/năm)

do áp lực chọn lọc của sự tăng cấp độ MD trong quần thể người,

có chu kỳ 2-3 năm Tạo chủng virus gây dịch có đột biến tại 2

hoặc nhiều vùng của HA XẢY RA Ở CẢ VIRUS CÖM A VÀ B

─ Sự trượt KN (antigenic shift): thay đổi cơ bản về KN, tạo tổ hợp

gene mới (trong HA), xảy ra do đồng nhiễm virus cúm người và cúm gia cầm trên một tế bào cảm nhiễm hoặc trực tiếp lây truyền

từ loài này sang loài khác Tạo điều kiện lan truyền trong cộng

đồng người và gây đại dịch CHỈ XẢY RA Ở VIRUS CÖM A

DANH PHÁP

Theo Tổ chức Y tế Thế giới , virus cúm sau phân lập được

đặt tên theo thứ tự là:

─ Chủng virus cúm phân lập từ động vật: type huyết

thanh/loài nhiễm/nơi phân lập/số hiệu chủng/thời gian phân lập/loại hình phân type theo KN HA và NA.

Ví dụ: A/chicken/Vietnam/HD1/2004(H5N1)

─ Chủng virus cúm phân lập từ người : type huyết

thanh/nơi phân lập/số hiệu chủng/thời gian phân lập/loại hình phân type theo KN HA và NA.

Ví dụ: A/Taiwan/T1773/2009(H1N1)

1.5 QUÁ TRÌNH NHÂN LÊN CỦA

VIRUS CÚM

Ngoại bào

Bào tương nhân

phóng thích (neuraminidase)

nẩy chồi

sắp xếp tổng hợp

protein

mRNA synthesis

cRNA synthesis

replication RNP export

Cởi vỏ và phóng thích RNP virus cúm:

Vai trò chủ yếu của protein M2

Ẩm bào của hạt virus

M2

AAAAAAAAAAAAAA(n)

Influenza virus transcription and replication

cRNA (+ve sense)

RNA replication

vRNA (-ve sense)

Spiced viral mRNA

TÍNH ĐỀ KHÁNG CỦA VIRUS

─ Khả năng lây nhiễm của virus cúm bị phá hủy bằng:

 Nhiệt: 560C – 30 phút,

 Chiếu tia cực tím hay bức xạ gamma

 Hóa chất: diethyl ete 20% - 18 giờ - 40C, formalin 1/4000,

Triton X100 1%, natri deoxycholat 1%, natri dodecyl sulfat (SDS) 0,1%

─ Hiệu giá virus giảm: bảo quản -200C – một thời gian,

đông tan băng nhiều lần.

─ Bảo quản tốt virus cúm bằng cách:

 Cho thêm gelatin/albumin bào thai bê và cất ở -700C

 Đông khô và cất ở 40C

TÍNH ĐỘC LỰC CỦA VIRUS

─ Phụ thuộc chủ yếu vào 2 KN HA và NA.

─ Khả năng phân cắt phân tử HA thành 2 tiểu phần HA-1

và HA-2 nhờ protease  quyết định độc lực virus cúm A Khả năng này phụ thuộc acid amin mang tính kiềm tại vị trí phân cắt là arginin (R) và lysin (K).

Ví dụ: vị trí cắt HA virus cúm gia cầm độc lực thấp (trước 06/1994) có 2 phân tử arginin ( R ET R ), còn ở virus cúm gia cầm độc lực cao (sau 12/1994) có 5 arginin và 2 lysin ( R E RRRKKR )

─ Nhờ hoạt tính enzyme của NA  phá vỡ mối liên kết

giữa acid sialic trên bề mặt tế bào và HA  giải phóng virus ra khỏi tế bào và xâm nhập tế bào khác.

2 TÍNH CHẤT GÂY BỆNH CỦA VIRUS

2.1 TÍNH CHẤT GÂY MIỄN DỊCH

─ Virus phát triển ở tế bào biểu mô đường hô hấp, phá

hủy nhung mao (hàng rào bảo vệ đầu tiên) + bão cytokin

 bệnh nặng (có thể tử vong).

─ Đồng nhiễm virus cúm và vi khuẩn (S aureus) làm tăng

tốc độ gây nhiễm tế bào chủ.

─ Virus bị loại khỏi đường hô hấp trước hết do interferon

và CTL CD8

─ Đáp ứng MD dịch thể hình thành (IgA, M, G) kháng đặc

hiệu HA (ngăn cản virus xâm nhập tế bào chủ) và NA

(ngăn cản giải phóng virus khỏi tế bào chủ).

2 TÍNH CHẤT GÂY BỆNH CỦA VIRUS (tt)

2.2 ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG :

─ Giai đoạn ủ bệnh: 1-6 ngày, lượng virus và sự lan tỏa vào

tế bào màng nhày tăng dần.

─ Giai đoạn khởi phát :

 Xuất hiện đột ngột, dấu hiệu nhiễm trùng đường hô hấp

(tương tự như virus á cúm, hô hấp hợp bào)

 Sốt 38-390C, thành cơn hay liên tục cả ngày, ớn lạnh, mệt

mỏi, đau đầu, mỏi toàn thân (vùng lưng và cẳng chân), đau quanh hốc mắt, mắt, đỏ mặt,

 Triệu chứng viêm long đường hô hấp: ho, sổ mũi, hắt hơi

 Triệu chứng đường tiêu hóa (ở trẻ em): tiêu chảy, đau

bụng

3 DỊCH TỄ HỌC

3.1 PHƯƠNG THỨC LÂY TRUYỀN

─ Từ người sang người theo 2 đường chính:

 Đường hô hấp: nước bọt và dịch tiết BN khi nói, ho, khạc,

hắt hơi tạo giọt khí hoặc khí dung

 Đường tiếp xúc: dịch tiết hô hấp và chất thải chứa virus  ô

nhiễm bề mặt phòng bệnh, gia đình, đồ dùng cá nhân  tayngười tiếp xúc  xâm nhập niêm mạc (miệng, mũi, mắt)

─ Virus cúm nhân lên ở đường hô hấp trên và dưới

 Mạnh nhất trong 1-2 ngày đầu sau lây nhiễm

 Giảm chậm trong ngày 6-8

 Còn tồn tại trong vòng 13 ngày sau

3 DỊCH TỄ HỌC (tt)

3.2 Ổ CHỨA: Virus cúm A có hệ vật chủ rộng rãi: gia cầm hoang dại, vịt,

thủy cầm; người; lợn, ngựa, động vật biển (cá voi, sư tử biển, hải cẩu), chồn, động vật nhai lại (nai, tuần lộc) Còn virus cúm B chỉ có ở người.

3.3 CÚM MÙA-ĐẠI DỊCH

─ Virus cúm A và B đều cùng lưu hành trong năm nhưng chỉ có 1 type

hoặc phân type trội hơn ở mỗi mùa cúm Biến chủng virus cúm xuất

hiện cuối mùa là dự báo cho chủng trội vào năm sau.

─ Dịch và đại dịch xuất hiện khi có thay đổi KN virus  vượt qua hàng

rào MD do nhiễm bệnh hoặc tiêm ngừa.

3.4 TÍNH CẢM NHIỄM

─ Mọi người đều có thể nhiễm và mắc bệnh cúm.

 Người lớn: nhiễm virus  không triệu chứng hoặc viêm phổi hoặc tử vong.

 Trẻ em: tỷ lệ mắc cao hơn (25% dân số).

─ Tỷ lệ tử vong tăng cao ở người cao tuổi.

4 CHẨN ĐOÁN PHÒNG THÍ NGHIỆM

─ LẤY MẪU BỆNH PHẨM ĐỂ CHẨN ĐOÁN

─ CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN

4.1 LẤY MẪU BỆNH PHẨM ĐỂ CHẨN ĐOÁN

4.1.1 BỆNH PHẨM (BP) ĐỂ PHÂN LẬP VIRUS,

PHÁT HIỆN KN HAY VẬT LIỆU DI TRUYỀN:

─ Lấy BP ngoáy họng theo quy trình chuẩn, trong giai

đoạn sớm, cho vào môi trường vận chuyển  chuyển lạnh (40C) về PTN.

─ Có thể bảo quản ở 40C (trong 5 ngày) hoặc -700C.

4.1 LẤY MẪU BỆNH PHẨM ĐỂ CHẨN ĐOÁN (tt)

4.1.2 BP CHO CHẨN ĐOÁN HUYẾT THANH:

─ Lấy máu giai đoạn cấp càng sớm càng tốt Máu

giai đoạn hồi phục lấy sau 14-28 ngày.

─ Lấy máu  co cục máu (nhiệt độ phòng 250C, 1-2

giờ)  tủ lạnh 40C qua đêm  ly tâm tách huyết thanh  bảo quản -200C đến khi xét nghiệm.

─ Máu kép giúp xác định hiệu giá kháng thể và đánh

giá sự gia tăng kháng thể.

4.2 PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN

4.2.1 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LOẠI VIRUS:

─ Cấy BP vào khoang ối và khoang niệu của phôi

gà (9 ngày tuổi, 3 phôi/1 BP) hoặc tế bào

4.2 PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN (tt)

4.2.1 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LOẠI VIRUS (tt):

─ Xác định hiệu giá HA:

 Dịch ối: dùng hồng cầu gà,

 Âm tính  cấy truyền tiếp

 Nhiễm trùng  xử lý kháng sinh và cấy truyền tiếp

 Dương tính: nếu <1:8  cấy truyền tiếp; nếu >1:8  chia nhỏ,

bảo quản -70 0 C, làm HI để xác định type và phân type

 Dịch tế bào: dùng hồng cầu chuột lang ở ngày 3, 5 và 10,

 Âm tính  loại hồng cầu, thay môi trường, nuôi tiếp

 Nhiễm trùng  phân lập lại

 Dương tính: (1) bổ sung gelatin  bảo quản -70 0 C; (2) chia nhỏ

làm ELISA: Dương tính H1, H3 hoặc B; Âm tính  làm lại ELISA

 nếu vẫn âm tính thì nhuộm tiêu bản phát hiện paramyxovirus

4.2 PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN (tt)

4.2.2 PHÁT HIỆN VẬT LIỆU DI TRUYỀN VIRUS:

─ Dùng kỹ thuật RT-PCR hoặc real-time RT-PCR.

─ Tách chiết RNA toàn phần từ BP  tổng hợp

cDNA (nhờ Rtase)  PCR với mồi đặc hiệu.

─ Mồi phát hiện type virus cúm (A, B): thiết kế trên

gene M và NP

─ Mồi phát hiện phân type virus cúm A: thiết kế

trên gene HA và NA.

 KN: sản xuất bằng nhiễm virus cúm vào thế bào nuôi (thận bào thai

bê)  phá tế bào  thu KN nội bào chứa KN NP.

─ Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI):

 Quan trọng nhất, dùng trong chẩn đoán huyết thanh học-xác định

phân type virus cúm A-đánh giá hiệu lực vắc-xin cúm Sử dụng hồng cầu gà, chuột lang hoặc người nhóm máu O.

 KN: HA virus cúm toàn phần không cần tinh chế (dịch niệu tươi, cô

đặc hay đông khô)

─ Phản ứng ức chế enzyme neuraminidase (NI): xác định phân

type virus cúm A

 Thuốc hạ nhiệt và giảm đau (nếu cần) nhƣ

paracetamol Tránh dùng aspirin  hội chứng Reye (hiếm gặp nhƣng tử vong cao).

 Kháng sinh không có tác dụng NGOẠI TRỪ có biến

chứng nhiễm trùng phổi do vi khuẩn.

5 ĐIỀU TRỊ VÀ PHÒNG BỆNH (tt)

5.1 ĐIỀU TRỊ (tt):

─ Thuốc kháng virus: là thuốc ức chế neuraminidase và ức chế

protein M2 Thuốc ức chế neuraminidase ƣa dùng hiện nay do độc tính thấp và hiệu quả cao hơn

Zanamivir (Relenza), ngăn chặn virus lan tỏa trong mô, điều trịhiệu quả cúm A và B, giảm triệu chứng cúm và biến chứng do cúm Mức độ dùng thuốc tăng  tỷ lệ kháng thuốc tăng

kênh dẫn truyền ion của virus  ngăn virus lây nhiễm tế bào

Có hiệu quả kháng virus cúm A nếu điều trị sớm (không tácdụng với virus cúm B) Mức độ kháng thuốc cao (91% mẫucúm H3N2 phân lập ở Hoa kỳ năm 2005 kháng 2 thuốc trên)

Zanamivir Oseltamivir 1990’s

Existing targets for anti-influenza therapy

NA

viral entry HA inhibitors

Transcription/ Replication of the viral genome polymerase

inhibitors

5 ĐIỀU TRỊ VÀ PHÒNG BỆNH (tt)

5.2 PHÕNG NGỪA: có 2 biện pháp

5.2.1 MD bằng vắc-xin:

─ Phòng ngừa cả virus cúm A và B.

─ Vấn đề lưu tâm: virus cúm thay đổi liên tục và hiệu lực vắc-xin phụ

thuộc vào sự phù hợp giữa chủng sản xuất vắc-xin và chủng virus cúm đang lưu hành.

5.2.2 Kiểm soát sự lây lan của bệnh:

─ Giữ gìn vệ sinh cá nhân tốt (rửa tay đúng cách), tránh khạc nhổ, ho,

hắt hơi, xỉ mũi bừa bãi Đeo khẩu trang Tránh hút thuốc.

─ Vệ sinh bề mặt vật thể bị nhiễm trùng bằng: cồn y tế, phối hợp với

hợp chất ammonium hóa trị 4, chất tẩy rửa (bệnh viện), chlorin pha loãng (gia đình).

─ Cách ly: khi mới có 1 số lượng nhỏ người nhiễm cúm.

VẮC-XIN PHÒNG BỆNH

─ Hầu hết vắc-xin cúm mùa đang sử dụng trên thế

giới hiện nay được sản xuất trên trứng gà có phôi.

─ Vắc-xin cúm mùa sản xuất từ 3 chủng chọn lọc cho

từng mùa, gồm 2 chủng type A (H1N1 và H3N2) và

1 chủng type B Mỗi liều vắc-xin chứa 15g kháng

nguyên HA của mỗi chủng được chọn

─ Chủng được chọn để sản xuất vắc-xin hàng năm do

mang lưới giám sát cúm toàn cầu của TCYTTG

(thành lập năm 1952, gồm 4 trung tâm điều phối của TCYTTG và 112 viện nghiên cứu trên 83 nước)

quyết định.

VẮC-XIN PHÒNG BỆNH (tt)

A CÁC VẮC-XIN CÖM HIỆN HÀNH

A.1 VẮC-XIN CÖM BẤT HOẠT TINH CHẾ

(inactivated purified vaccine) gồm:

─ Vắc-xin virus toàn phần: cấy virus vào xoang niệu

trứng gà có phôi  cô đặc virus, tinh chế virus (ly tâm phân vùng)  bất hoạt virus (formaldehyd hoặc propiolacton)

─ Split vaccin: tương tự như trên nhưng hạt virus

được phá vỡ bằng chất tẩy rửa.

─ Vắc-xin dưới đơn vị: chứa KN HA và NA.

VẮC-XIN PHÒNG BỆNH (tt)

A CÁC VẮC-XIN CÖM HIỆN HÀNH

A.2 VẮC-XIN SỐNG GIẢM ĐỘC LỰC gồm:

(từ 2003) và ở Liên xô (trước đây)

nền (A/Ann Arbor/6/60(H2N2) và B/Ann Arbor/1/66): các đột biếnbền vững trên gene PA, PB1, PB2 tạo chủng nền phát triển tốt ở

250C nhưng giảm độc lực ở 370C Gene HA và NA của chủng

cúm hiện hành được chèn vào chủng nền  tạo chủng vắc-xin

 Ưu điểm: sử dụng qua đường mũi bằng khí dung  tao đáp ứng MD tại

chỗ, MD qua trung gian tế bào  có MD chéo và thời gian MD lâu dài.

 Nhược điểm: có an toàn đối với người suy giảm MD? Có đột biến

ngược thành chủng hoang dại?

VẮC-XIN PHÒNG BỆNH (tt)

B NĂNG LỰC SẢN XUẤT VẮC-XIN CÚM

─ Thế giới: 300 triệu liều vắc-xin tam liên (H1N1,

H3N2 và B) mỗi năm.

─ Từ 9 nước: Öc, Canada, Pháp, Đức, Ý, Nhật, Hà

lan, Anh, và Hoa kỳ.

─ 4-5 triệu liều vắc-xin cúm sống giảm độc lực, còn lại

là vắc-xin bất hoạt.

CÓ ĐẠI DỊCH XẢY RA.

VẮC-XIN PHÒNG BỆNH (tt)

C NGHIÊN CỨU MỚI VỀ SẢN XUẤT VẮC-XIN CÚM

C.1 TRÊN NUÔI TẾ BÀO:

─ Sử dụng dòng tế bào Vero và MDCK, thay cho công nghệ

trứng gà có phôi

─ Lợi thế: nâng cao sản lượng vắc-xin, giảm công lao động, dễ

tự động hóa Nhưng còn đang nghiên cứu

C.2 THEO CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN NGƯỢC:

─ Dùng công nghệ sinh học phân tử

─ Tạo chủng vắc-xin từ chủng virus cúm gốc đã giảm độc lực và

nhân lên tốt trên trứng gà có phối như A/PR8/34(H1N1) theonguyên lý 6+2 (6 plasmid mang 6 gene PA-PB1-PB2-NP-NS1-

M của chủng nền và 2 plasmid mang 2 gene HA-NA của

chủng lưu hành)