Phân tích quá trình phát triển tính kháng của côn trùng mục tiêu khi phát triển cây trồng chuyển gen kháng sâu sử dụng các gen có nguồn gốc từ vi khuẩn BT (bacillus thuringiensis)

Tính kháng a, khái niệm Là khả năng loại bỏ hoặc khắc phục hoàn toàn, hoặc ở mức độ nào đó ảnh hưởng của tác nhân gây bệnh hoặc các yếu tố gây hại b, Thuyết đối gen và quy luật tiến hóa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

AN TOÀN SINH HỌC

Chuyên đề: Phân tích quá trình phát triển tính kháng của côn trùng mục tiêu

khi phát triển cây trồng chuyển gen kháng sâu sử dụng các gen có nguồn gốc

từ vi khuẩn BT (Bacillus thuringiensis)

Giảng viên hướng dẫn:

Danh sách thành viên nhóm 5:

PHẦN I BẢN WORD

A, PHẦN MỞ ĐẦU

 Từ năm 1996, các loại cây trồng biến đổi gen để có khả năng tạo ra các loại protein từ vi khuẩn mà gây độc cho một loại côn trùng nào đó, nhưng vẫn an toàn cho con người Chúng được trồng hơn 200 triệu ha trên toàn thế giới Phổ biến

hiện nay là các loại “cây trồng Bt”, “Bt” xuất phát từ tên của một loài vi khuẩn Bacillus thuringiensis, với các khả năng tạo ra các loại protein có thể tiêu

diệt hầu hết mọi loại côn trùng, cho phép nông dân tiết kiệm tiền và giảm ảnh hưởng đến môi trường từ việc giảm việc phun các thuốc diệt côn trùng.

 Tuy nhiên, bởi vì côn trùng có thể phát triển các khả năng kháng các chất độc, vì

thế cần nhiều chiến lược mới để đảm bảo các cây trồng Bt vẫn còn hiệu quả Một nghiên cứu được đăng trên tạp chí Economic Entomology tháng 12, nghiên cứu

thực hiện phân tích dữ liệu kháng bệnh của các loại côn trùng trên 5 châu lục và

có thể rút ra các vấn đề yếu kém đang tồn tại và chiến lược nhằm có thể dự đoán, kiểm soát các loại côn trùng kháng các loại cây trồng Bt.

B, NỘI DUNG

I, Tính kháng và công nghệ cây Bt

1 Tính kháng

a, khái niệm

Là khả năng loại bỏ hoặc khắc phục hoàn toàn, hoặc ở mức độ nào đó ảnh hưởng của tác nhân gây bệnh hoặc các yếu tố gây hại

b, Thuyết đối gen và quy luật tiến hóa

 Đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây kí chủ có một gen tương ứng qui định tính gây bệnh trong ký sinh

 Đối với mỗi gen qui định tính kháng trong cây ký chủ có một gen tương ứng qui định tính không độc trong ký sing và 2 gen này tương tác đặc hiệu với nhau

 Cả gen kháng của ký chủ và gen không độc của ký sinh đều phải được biểu hiện để tạo ra tính kháng

2 Công nghệ cây Bt

a, Khái niệm Bt

Bacillus thuringiensis (viết tắt: Bt) là vi khuẩn Gram dương, và cũng là loài vi

khuẩn đất điển hình được phân lập ở vùng Thuringia, Đức Bt có khả năng tổng

hợp protein gây tệ liệt ấu trùng của một số loài côn trùng gây hại, trong đó có sâu đục quả bông, các loài sâu đục thân ngô châu Á và Châu Âu Chúng đều là sâu hại thực vật phổ biến, có khả năng gây ra những sự tàn phá nghiêm trọng (theo Wikipedia)

Protein Cry từ vi khuẩn BT là một nhóm đa dạng của các protein có hoạt tính chống lại côn trùng đặc hiệu khác nhau – Lepidoptera( bộ cánh phấn), Coleoptera( bộ cánh cứng) , Diptera ( ruồi) và cũng chống lại loài không xương sống khác như giun tròn Khi hình thành bào tử, vi khuẩn BT có khả năng tổng hợp và kết tinh protein độc

tố này phía bên ngoài (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)

 Hình dạng tinh thể phụ thuộc vào gen mã hóa protein đó Có thể là hình 2 chóp( protein dietj côn trùng cánh vảy), dạng vô định hình ( protein diệt côn trùng 2 cánh), hình chữ nhật hoặc lập phương… Ngày nay BT được chia ra hơn 50 nhóm và 200 thành viên khác nhau ( theo http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ )

- Các loại độc tố do BT sinh ra: Ngoại độc tố α (α - extoxin)

- Ngoại độc tố β (β–exotoxin)

- Ngoại độc tố γ (γ - extoxin)

- Nội độc tố δ (δ- extoxin)

- Người ta quan tâm đến nội độc tố vì nó quyết định đến hoạt tính diệt côn trùng của vi khuẩn

Bào tử Bt và tinh thể độc tố

 Bào tử ( spore ) và tinh thể độc ( Crystal)

ở Bacillus thuringiensis ( trái ) và Bacillus sphaericus ( phải)

 Gen mã hóa cho loại protein này gọi là gen Cry

b, Công nghệ Bt là gì?

 Công nghệ Bt truyền thống

Bt có thể được nuôi cấu dễ dàng nhờ quá trình lên men Vì vậy, Bt đã được sử dụng rộng rãi làm thuốc diệt côn trùng từ hơn 40 năm nay ở nhiêu nơi trênthế giới Đặc biệt, Bt đã đem lại những lợi ích to lớn cho các nông trại hữu cơ vì chúng được coi là một trong rất ít thuốc trừ sâu đạt tiêu chuẩn hữu cơ Tùy thuộc vào cấu trúc (dạng hạt hay dạng dịch) mà thuốc diệt côn trùng

Bt được phun hay rắc

Tuy nhiên, vẫn tồn tại một số hạn chế nhất định đối với cả hai trường hợp ứng dụng này như thuốc diệt côn trùng Bt rất khó tiếp xúc với côn trùng đích ẩn sâu dưới lá, đất Những bất lợi này hoàn toàn được loại trừ nhờ công nghệ sinh học hiện đại

 Công nghệ Bt hiện đại

Các nhà khoa học đã tiến hành chuyển gen Bt mã hóa cho protein tinh thể độc tố từ vi khuẩn Bt vào thực vật Cây trồng được chuyển gen Bt này sẽ có khả năng tự kháng lại sâu hại đích Các protein sản sinh trong thực vật không bị rửa trôi hay bị phân huỷ dưới ánh nắng mặt trời.Vì vậy, bất kể trong điều kiện sinh thái, khí hậu thế nào thì cây trồng vẫn được bảo vệ khỏi sự tấn công của sâu đục thân, hay đục quả

c, Cơ chế tác động của protein Bt

Cơ chế : trước hết côn trùng hay sâu hại ăn tinh thể vào ruột, do tác dụng của môi trường PH cao, tinh thể được hòa tan và thủy phân tiền độc tố diệt côn trùng có trọng lượng phân tử khoảng 130kDa hoặc 70 kDa thành δ- extoxin Các độc tố này bám dinh trên các thượng bì của ruột nhờ các thụ thể có trên màng tế bào để phá hủy tế bào Vật chủ không thể ăn và tiêu hóa, chết trong một khoảng thời gian ngắn sau đó

Bt Cry còn được gọi là “chất độc hình thành lỗ rỗng tế bào” Các độc tố α-xoắn ốc, trong đó khu vực α-xoắn hình thành các lỗ chân lông xuyên màng, hoặc các độc tố β-barrel chèn vào màng bằng cách hình thành một β- barrel từ mỗi monomer

 Tùy thuộc loại sâu, côn trùng, các loại protein Cry khác nhau dẫn đến các thụ thể và con đường dẫn đến cái chết của tế bào là khác nhau Nhưng được nghiên cứu nhiều nhất là Cry 1 và Cry 3

 Ví dụ: các thụ thể gắn kết trong ấu trùng bướm: Cry1A, ít nhất bốn liên kết protein khác nhau đã được nghiên cứu khác nhau, một protein cadherin-như

(CADR), một glycosylphosphatidyl-inositol (GPI)-neo aminopeptidase-N (APN),một phosphatase kiềm GPI-neo (ALP) và 270 kDa glycoconjugate

3 Cơ chế kháng của côn trùng

 Ngày càng có nhiều trường hợp kháng cây BT được phát hiên

 Protein độc tố Cry bắt buộc phải có “thụ thể đặc hiệu” mới có thể bám dinh trên

bề mặt màng tế bào và gây chết tế bào

 Dựa vào đặc điểm này, côn trùng đích đã phát triển tính kháng

a, Kháng do chuyển hóa

Trong cơ chế này khi phân tử hóa chất diệt xâm nhập vào cơ thể, dưới tác dụng của các enzyme khác nhau trong cơ thể kháng thuốc nó sẽ bị phân giải theo nhiều con đường khác nhau như: oxy hóa, thủy phân, hydro hóa, khử clo, ankyl hóa… trở thành chất không độc

Cơ chế kháng thuốc ở muỗi

Cơ chế này tạo ra một mức độ kháng mạnh mẽ nhất của muỗi đối với từng loại hóa chất Sự kháng là kết quả của sự thay đổi về mặt cấu trúc enzym làm tang khả năng giải độc của nó hoặc tăng số lượng enzym dẫn đến tăng sự đào thải độc tố hóa chất diệt côn trùng ra khỏi cơ thể chúng

Các ví dụ về các cơ chế kháng hóa sinh ở cấp độ phân tử

A Đột biến ở một axit amin trong vùng trải trên màng IIS6 của gen trên kênh vận chuyển Na+

B Nhân tố điều hòa ( phía trên trình tự mã hóa )

C Đơn vị siêu sao chép A2-B2 Esterase

b, Kháng do tính thẩm thấu

Là cơ chế mà trong đó hóa chất diệt không bị phân hủy trực tiếp, song tính kháng hình thành là do giảm khả năng thấm Nhiều loại hóa chất diệt côn trùng thâm nhập vào cơ thể côn trùng qua lớp biểu bì.Những thay đổi của lớp biểu bì của côn trùng làm giảm tốc

độ thẩm thấu của hóa chất diệt côn trùng gây nên sự kháng đối với một số hóa chất diệt Đơn thuần tính thấm giảm chỉ gây ra sự kháng ở mức độ thấp

c, Kháng do biến đổi vị trí đích

Sự kháng này gây ra bởi sự biến đổi vị trí đích tác động của hóa chất diệt côn trùng Sự biến đổi đó đã được quan sát thấy ở các enzym và cơ quan cảm nhận thần kinh, đó là điểm đích của một số lớp hóa chất diệt côn trùng Có 3 hình thức kháng hóa chất diệt côn trùng bằng cách thay đổi vị trí nhạy cảm

Cơ chế tác động gây chết muỗi của 4 nhóm hóa chất

d, Kháng do thay đổi thụ thể GABA

Cơ chế này do sự thay đổi một nucleotit trong một bộ ba mã hóa của gen tổng hợp nên thụ thể, qua đó làm giảm độ nhạy của thụ cảm thể đối với hiệu lực độc của hóa chất diệt côn trùng

Cấu trúc của GABA

e, kháng tập tính

Đó là sự thay đỏi của côn trùng trong tập tính né tránh được liều chết của hóa chất Những thay đổi bao gồm sự giảm xu hướng bay vào vùng sử dụng hóa chất hay tránh xa khỏi bề mặt có hóa chất Tuy nhiên, sự kháng này cũng hiếm khi được đề cập đến và giống như hậu quả thay đổi gây ra trực tiếp bởi sự có mặt của hóa chất diệt côn trùng

f, Kháng đa tính

Là hiện tượng kháng có hai hoặc nhiều cơ chế kháng trong cùng một cá thể côn trùng

Cơ chế này đang phát triển rất nhanh, nó được tạo ra trong quá trình áp dụng liên tiếp lớp hóa chất này sau lớp hóa chất kia của các chương trình

II, Quá trình phát triển của tính kháng

1, Nguyên nhân hình thành tính kháng

- Đột biến, di chuyền và chọn lọc tự nhiên

- Có thể các cây Bt không mang đầy đủ nguồn Bt protein và có thể là điều kiện xuất hiện các loại côn trùng có tính kháng Cây BT thế hệ đầu tiên chỉ mang 1 loại protein BT nên lượng độc tố không cao và không hiệu quả khi tiêu diệt côn trùng Tạo điều kiên đột biến

- Khoảng cách giữa các khu vực cây trồng BT với cây bình thường không đảm bảo, côn trùng hay sâu bệnh vẫn có nơi cư trú…

Giống không đảm bảo chất lượng Phương pháp canh tác không đúng quy trình

3, Tốc độ phát triển tính kháng phụ thuộc vào các yếu tố

a, Cường độ của yếu tố tác động sự chọn lọc

Hay nói khác đi tùy thuộc vào liều lượng, số lần sử dụng thuốc và tỷ lệ sâu chết.Nếu liều lượng cao, sự chọn lọc phát huy hết tác dụng trong từng thế hệ được xử lý thuốc thì sự xuất hiện tính kháng thuốc sẽ xẩy ra rất nhanh, chỉ sau vài thế hệ

b, Loài thuốc sử dụng

Các kết quả nghiên cứu cho thấy tính kháng của côn trùng đối với các loài thuốc khác nhau có thể khác nhau Fritzsche (1967) ghi nhận rằng loài nhện đỏ Panonychus citri thể

hiện tính kháng với thiophosphoric ester chỉ sau 3 đến 5 thế hệ tiếp xúc với thuốc, nhưng với hợp chất diphenyl thì tính kháng chỉ thể hiện sau 7 đến 12 thế hệ tiếp xúc với thuốc

c, Đặc điểm sinh vật học của côn trùng

Yếu tố nầy rất quan trọng, vì ở những loài côn trùng có chu kỳ sinh trưởng ngắn, nhiều thế hệ trong năm, khả năng sinh sản cao thì khả năng thể hiện tính kháng càng sớm, mật

số cá thể kháng sẽ được tích luỹ nhiều hơn, nhanh hơn

III, Sự kiện côn trùng mục tiêu chống Bt

1, Tính kháng của sâu bướm bắp cải looper

Trong những trường hợp bình thường, các độc tố Bt Cry1Ac tác động tới một con sâu bướm, protein Cry1 liên kết với một loại enzyme được gọi là APN 1 dọc theo thành ruột của côn trùng, nơi mà các chất độc phá hủy niêm mạc ruột và gây chết

tuy nhiên, thông qua một cơ chế di truyền làm thay đổi một thụ độc tố trong đường ruột của côn trùng.Các thụ thể thuộc về một nhóm của các enzym tiêu hóa được gọi là

aminopeptidase N (APN)

Để bù đắp cho sự mất mát của enzyme APN 1, hoạt động của APN 6 đẩy lên cao, và cho phép các côn trùng có thể thực hiện một quá trình tiêu hóa bình thường, nơi Bt không còn liên kết với các ruột“

(Nghiên cứu được tài trợ bởi Bộ Quốc Viện Thực phẩm và Nông nghiệp Nông nghiệp Mỹ.)http://www.news.cornell.edu

2, Tính kháng của 1 quần thể sâu đục thân ngô Châu Á

 12/2013 -Một quần thể sâu đục thân ngô Á Châu (Asian corn borer) có tính kháng lại rất cao đối với Cry1Ab (hơn 100 lần) so với quần thể nhiễm đã biểu hiện mức độ cao tính kháng chéo đối với Cry1Ah (gấp 131 lần), nhưng không kháng chéo với Cry1le Điều này cho thấy rằng tính kháng chéo này là do một

sự thay đổi những thụ cảm của độc tố Cry có trong ruột non của côn trùng sâu đục thân

 Một nghiên cứu khác thuộc Viện Hàn lâm khoa học Nông nghiệp Trung Quốc và các cộng sự nhằm xác định những proteins có trong các khoang màng diêm bàn chải của ruột non trên cả hai loài sâu đục thân nhiễm độc tố và kháng độc tố, tương tác với các Bt proteins được biotin hóa (Cry1Ab, Cry1Ah, và Cry1Ie) Trắc nghiệm này xảy ra trên cả ấu trùng kháng và nhiễm độc tố cry Kết quả cho thấy: những “biotinylated Bt proteins” có phản ứng tương tác mạnh hơn với những protein trong ấu trùng kháng so với ấu trùng nhiễm Điều ấy khẳng định rằng có sự gia tăng đáng kể “V-type proton ATPase catalytic subunit A” và các protein chống sốc nhiệt HSP70 trong ấu trùng kháng Sự tương tác của Cry1Ie với “V-type proton ATPase catalytic subunit A” trong ấu trùng nhiễm chứa được tìm thấy

Cấu trúc V-type proton ATPase catalytic subunit A

IV, Một số chiến lược quản lý và biện pháp hạn chế tính kháng thuốc của sâu

1, Chiến lược quản lý

 Phát triển nhiều thế hệ cây BT mang nhiều loại protein BT hơn, tính hiệu quả cao hơn Các công ty đang phát triển các thế hệ cây BT mang nhiều gen độc tố kháng sâu bệnh hơn nữa trên 1 cây ( đặc biệt là cây bông)

 Nguyên cứu quá trình kiểm soạt biểu hiên gen kháng của sâu bệnh hại

 Đào tạo cho nông dân nắm được phương pháp canh tác thích hợp nhằm ngăn chặn hoặc làm chậm lại sự lan tràn của côn trùng có tính kháng

 Các phương pháp như cày sâu, luân canh, vệ sinh đồng ruộng hoặc cũng có thể chăn thả gia súc trên các cánh đồng đã thu hoạch

 Quản lý canh tác cây BT hợp lý, tăng cường biện pháp khảo sát tính kháng của sâu bệnh

2, Một số biện pháp hạn chế tính kháng thuốc của sâu

- Dùng thuốc hợp lý và đúng kỹ thuật để đảm bảo hiệu quả diệt sâu cao nhất và giảm bớt

số lần dùng thuốc Khi dùng thuốc cần đảm bảo đúng nồng độ và liều lượng để diệt được nhiều sâu nhất, giảm đến tối thiểu số sâu không chết sẽ trở nên quen thuốc và sau

đó sẽ hình thành cả một thế hệ sâu kháng thuốc.Kết hợp dùng thuốc với các biện pháp phòng trừ khác để góp phần giảm số lần và lượng thuốc dùng

- Áp dụng chiến lược luân phiên thay thế các loại thuốc sử dụng giữa các lần dùng thuốc, không nên liên tục sử dụng nhiều lần một loại thuốc Chủ yếu là thay đổi các loại thuốc

có gốc hóa học khác nhau và cách tác động khác nhau.Có trường hợp sâu đã quen với một loại thuốc mới, khi sử dụng trở lại loại thuốc cũ lại có hiệu quả cao

- Chú ý sử dụng những loại thuốc ít có khả năng gây tính kháng thuốc Phần lớn các loại thuốc hóa học tác động trực tiếp đến hệ thần kinh đều dễ gây tính kháng thuốc hơn các thuốc sinh học Nhóm thuốc vi sinh ít gây tính kháng thuốc nhất

- Dùng thuốc hỗn hợp với dầu khoáng hoặc dầu thực vật vừa làm tăng hiệu quả diệt sâu vừa làm chậm tốc độ phát sinh tính kháng thuốc Hỗn hợp với dầu cũng giảm một phần lượng thuốc hóa học sử dụng để hạn chế ô nhiễm

Tính kháng thuốc là một trở ngại lớn trong việc phòng trừ sâu hại, vì vậy cần chú ý áp dụng các biện pháp hạn chế tính kháng thuốc của sâu, trong đó áp dụng chiến lược luân phiên thay đổi loại thuốc là biện pháp dễ áp dụng và có hiệu quả rõ

V, Kết luận

 Cây trồng BT ngày càng được phổ biến rộng rãi và mang lại lợi ích không hề nhỏ

 Bên cạnh đó, tính kháng của sâu bệnh côn trùng hại là một yếu tố tự nhiên mà có ảnh hưởng lớn tới thành công và hiệu quả của cây trồng BT

 Chính vì thế, những biện pháp quản lý tính kháng BT của sâu bệnh luôn phải được triển khai chặt chẽ và nghiêm ngặt Nghiên cứu và cải tiến công nghệ BT mới Cần có những biện pháp thích hợp để kìm hãm tính kháng đó