2016 ĐHQG Chẩn đoán in vitro bằng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ

MỤC ĐÍCH  Định lượng các hormone và các chất có trong huyết thanh, huyết tương, dịch sinh học  Nghiên cứu bệnh miễn dịch  Nghiên cứu đánh giá tình trạng dinh dưỡng  Nghiên cứu ung th

CHẨN ĐOÁN IN VITRO BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ

MỤC ĐÍCH

 Định lượng các hormone và các chất có trong huyết thanh,

huyết tương, dịch sinh học

 Nghiên cứu bệnh miễn dịch

 Nghiên cứu đánh giá tình trạng dinh dưỡng

 Nghiên cứu ung thư

NGUYÊN LÝ

I. Kỹ thuật miễn dịch: Dựa mối tương tác đặc hiệu thuận-

nghịch giữa kháng nguyên (Ag) với kháng thể (Ab)

+ Nhóm kỹ thuật miễn dịch quan sát trực tiếp (lên bông, kết

tủa, ngưng kết, cố định bổ thể, trung hòa)

+ Nhóm kỹ thuật miễn dịch dùng chất đánh dấu

 Biến phản ứng không quan sát được thành một phản ứng

có thể quan sát & nhận định kết quả

 Tăng độ nhạy, độ đặc hiệu, độ chính xác

 Tăng khẳ năng tự động hóa

 Có thể áp dụng trên cơ thể sống

 Miễn dịch huỳnh quang (immunofluorometric assay)

 Miễn dịch hóa phát quang ( immunochemiluminometric assay)

2 Chất đánh dấu là đồng vị phóng xạ

 Đồng vị phóng xạ (RIA, IRMA: Radioimmunoassay., Immunoradiometric assay.)

NGUYÊN LÝ ĐỊNH LƯỢNG MDPX

 Định nghĩa: MDPX là kỹ thuật vi phân tích trong đó các

đồng vị phóng xạ được dùng vào XN để xác định nồng độ các chất trên các mẫu là dịch sinh học

 Rosalyn S Yalow & SolomonA Berson dùng đồng vị

phóng xạ đánh dấu trên Insuline để nghiên cứu thời gian tồn lưu của Insulin tuần hoàn trong máu; Vitamin B12… được giải Nobel năm 1977

 Ưu điểm: Đơn giản có thể triển khai các cơ sơ, giá thành

rẻ, độ đặc hiệu & độ nhạy rất cao, có thể xác định được các chất có nồng độ cực thấp trong huyết thanh, dịch sinh học, huyết tương… (10-17 – 10-18 )

 Tiêu chuẩn vàng để đánh giá các kỹ thuật khác

THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA XN MDPX

 Kháng thể (Ab) đặc hiệu với chất cần định lƣợng đƣợc sản xuất bằng gây miễn dịch cho động vật or công nghệ sinh học

 Kháng nguyên (Ag - chất cần định lƣợng) có trong dịch sinh học

 Chất đánh dấu (Tracer) là đồng vị gắn vào kháng nguyên (Ag*) ( RIA); hoặc vào kháng thể Ab* (IRMA); nó là thành phần cấu trúc nên chất gắn

 Chất phóng xạ có hoạt tính riêng cao, gắn đặc hiệu vào phân tử Ab or Ag, thời gian bán rã không ngắn, phát ra bức

xạ gamma đơn thuần nhƣ125I

 Hệ thống tách: Tách riêng các phức hợp và chất tự do bằng chất hấp thụ phase rắn:Than hoạt TS Nguyễn văn Kính 6

 Bằng chất kết tủa hóa học: PEG – 6000; Kết tủa miễn dịch: thêm Ab thứ hai làm tăng trọng lượng Ag-Ab được dùng nhiều vì rút ngắn thời gian, không bị ảnh hưởng nồng độ mẫu thử, dùng được cho Ab có ái lực thấp or Ag đặc hiệu thấp

 Hệ thống pha rắn: Ab thứ nhất bắt giữ gắn sẵn thành ống or gắn nên bề mặt hạt nhỏ cellulose, sepharose or hạt cellulose

từ ( ly tâm)

 Chất đánh dấu, Kháng thể, PH và nhiệt độ phản ứng là hằng định, chất cần định lượng là thay đổi

 Các ống huyết thanh chuẩn (Std), huyết thanh giám sát (CS)

1 Nguyên Lý chung: RIA

Ag

Ag* + Ab ↔ Ag – Ab, Ag*TS Nguyễn văn Kính - Ab, Ag* or Ag 7

NGUYÊN LÝ ĐỊNH LƯỢNG MDPX

 Ag trong chất cần định lƣợng cao thì Ag* - Ab thấp, ngƣợc

lại Ag thấp thì Ag* - Ab sẽ cao

 Mẫu thử thực hiện trong điều kiện nhƣ nhau ( thời gian ủ,

khối lƣợng mẫu, nhiệt độ, thời gian, tốc độ quay ly tâm và PH)

 Đồ thị chuẩn:

B/T Cpm

0 Cx Nồng độ

B/T%

Cpm

Thiết bị: Micropipet (100 – 1000μl), máy lắc (200-350 RPm), máy trộn, giá ống nghiệm, máy đếm gammacounter

VD Quy trình FT4 : Thuốc thử & mẫu bệnh phẩm để ở nhiệt độ phòng 20’, đánh số ống, trộn thuốc thử…

Ống Toatal (T) S 1 -S 6 P 1 -P n CS Standard 100μl

Mẫu B/n 100μl

Đệm ủ 1000μl 1000μl 1000μl

Lắc đều trong 30 phút ở nhiệt độ phòng

Gạn nước, úp ngược 2 phút trên giấy thấm

125 I-Tracer 1000μl 1000μl 1000μl 1000μl

Lắc ngang 60 phút 200-350 v/p ở nhiệt độ phòng

Gạn nước, úp ngược 2 phút trên giấy thấm

Đo hoạt độ phóng xạ 60 s/ống

2 NGUYÊN LÝ IRMA: Ab* + Ag Ab* - Ag, Ab*

- Ab* - Ag tỉ lệ thuận với nồng độ chất cần định lƣợng

- Ab đơn dòng làm pha rắn bắt giữ, Ab* , hai Ab & Ab* quyết định trên vị trí gắn của Ag Ab - Ag – Ab* , hạn chế phản ứng chéo, có độ nhạy cao & hạn chế sản xuất Ag tinh khiết giá thành cao để tạo Ab Nhƣng chất cần định lƣợng phải

có trọng lƣợng phân tử lớn để có hai vị trí gắn của hai Ab, Ab* , Các huyết thanh chuẩn và HT giám sát

Cx B/T%

Cpm

Ống

nghiệm

Mẫu chuẩn

& bệnh phẩm

18 – 25

0 c , rửa 2 lần với đệm

125 I - tracer ủ 16 –

20 giờ

ở nhiệt

độ phòng

18 -25

0 C, rửa 2 lần với đệm

Đếm trên máy gamm acount

3 Kỹ thuật MDPX kháng thể kẹp

* Nguyên lý: Ủ Ag trong bệnh phẩm với Ab đơn dòng; Ab gắn với 1 vị trí đặc hiệu của Ag thành phức hợp Ab – Ag ; rửa

loại bỏ những Ag & Ab tự do

 Gắn Ab* với phức hợp Ab – Ag tạo phức hợp: Ab*- Ag –

Hiệu ứng móc đáp ứng hai pha (Hook Effect

 Xuất hiện không đáp ứng ở phase hai: Phức hợp Ab – Ag

có hạn gắn Ab* xác định, phức hợp Ab – Ag - Ab* không tương thích với Ag trong mẫu có nồng độ cao quá

 Kết quả Cpm trong mẫu không phản ánh đúng được nồng

độ chất cần định lượng, kết quả thực sự cao bị nhận định sai lầm là thấp

 Khắc phục: Pha loãng mẫu thử XN ở nồng độ khác nhau

 Làm mẫu thử theo hai giai đoạn: phase bắt giữ, phản ứng

ĐÁNH GIÁ ĐỘ TIN CẬY CỦA PHƯƠNG PHÁP

 Sai số:

- Chủ quan

- Khách quan: Hóa chất, thiết bị

 Kiểm tra: tính CV% của hai ống, Standard của lần XN Các lần XN khác nhau

 Kểm tra nội bộ: huyết thanh người bình thường, huyết thanh bệnh nhân, phân 3 loại : thấp, trung bình, cao

 Làm n= 10 mean ± 2SD

KHÁC NHAU GiỮA RIA & IRMA

 RIA: Cạnh tranh giữa Ag cần định lượng với Ag* với Ab

(lượng nhất định thiếu) Chất đánh dấu là Ag

 IRMA: Không có cạnh tranh, Ag cần định lượng gắn với Ab

dư thừa xác định Chất đánh dấu là Ab*

 Độ nhạy: IRMA 10 -34 mol/l > RIA 10 -17 mol/l

 Độ đặc hiệu: IRMA > RIA vì dùng Ab đơn dòng

 Có thể định lượng được các phân tử sinh học ở miền nồng

độ rất thấp pg…

 Kỹ thuật đơn giản, kết quả ổn định ít bị chi phối về nhiệt độ

 Cần Lab thích hợp, độ độc hại phóng xạ cũng tương đương như độc hại của hóa chất TS Nguyễn văn Kính 15

ỨNG DỤNG

 Định lượng các nội tiết tố liên quan đến tuyến giáp

 Bệnh tuyến giáp: lâm sàng & XN phong phú, nhiều phương pháp để chẩn đoán, theo dõi & tiên lượng bệnh tuyến giáp trong đó MDPX là đặc biệt quan trọng vì định lượng được nồng độ hormone tuyến giáp, nội tiết tố liên quan (Thyroid – related hormones)

 Bệnh cường giáp (Hyperthyroidism) hầu hết T3, T4 or

FT3, FT4 , TRAb (TSH receptor antibody) tăng & TSH giảm

 Nhiễm độc giáp do T3 or do T4 hai hormone này không tăng song hành

 Suy giáp đa số T3 ,T4 thấp do liên bào t/g giảm or mất khả năng tổng hợp và TSH tăng cao

 Một số yếu tố ảnh hưởng đến T3 ,T4 như bệnh gan, thận, thai nghén & một số thuốc tránh thai, an thần…

 Một số hội chứng quan trọng thường gặp

- Cường giáp( Hyperthyroidism), Graves – Basedow: T3

+ T4 tăng: phụ nữ nhiều tuổi, dùng thuốc chứa iot, tâm thần… + Bất thường về liên kết hormone: T3, T4 giảm điều trị

hormone không hiệu quả

- Suy giáp: Hầu hết FT3, FT4 giảm TSH tăng

- Bướu cổ địa phương T3, T4 bình thường or tăng nhẹ

Tóm lại: Bệnh lý tuyến giáp nên chỉ định ít nhất 2 XN, chú ý đến TSH (IRMA)

+ Định lượng kháng thể kháng receptor của TSH TRAb ý

nghĩa trong theo dõi điều trị

+ Định lượng một số loại hormone:

 GH: theo dõi bệnh to đầu chi, lùn do …tuyến yên, chứng khống lồ

 PTH: hormone tuyến cận giáp Chuyển hóa calci,

 Cortisol, Insuline, Calcitonin, Plolactin, ACTH…

 Các chất dấu ấn ung thƣ: là đại phân tử, sự có mặt của chúng liên quan đến sự có mặt hoặc phát triển của khối u ác tính Chúng hình thành từ trong or trên tế bào K or kích thích

TB phân chia không kiểm soát

 Dấu ấn ung thƣ tiết vào máu ngoại vi ở nồng độ có thể phát hiện đƣợc khi TB chuyển thành ác tính

 Cho phép kết luận vị trí xuất phát của khối U

 Kỹ thuật IRMA sử dụng trong XN theo dõi diễn tiến, đánh

giá hiệu quả & tiên lượng

 AFP: Glycoprotein , W= 70.000 daltons, hình thành trong

gan, dạ dày, ruột bào thai AFP đạt đỉnh tuần 12 – 16 của thai kỳ và giảm khi sinh Chăm sóc tiền sản Giám sát K gan nguyên phát, đánh giá đáp ứng điều trị

 CEA: Glycoprotein , W= 180.000 daltons, là KN ung thư

phôi thai được sản xuất trong đời sống phôi và bào thai CEA kìm hãm sau sinh, không thấy trong huyết thanh người lớn bình thường, KN giải tỏa ở các tế bào một số K đang phát triển Cao trong ung thư biểu mô tuyến đại trực tràng Giám sát tiến triển & đáp ứng điều trị b/n K đại trực tràng

 PSA: Glycoprotein , W= 34.000 daltons Có trong ống

ngoại tiết của tiền liệt tuyến Giám sát diễn tiến & đáp ứng điều trị K TLT Giám sát B/N phì đại TLT độ đặc hiệu 90%

Là chỉ tiêu XN sàng lọc K TLT ở nam tuổi > 50

 Tg: Glycoprotein của tuyến giáp.Trong K giáp biệt hóa Tg

là chất chỉ điểm sự tồn tại của mô giáp Tg + WBS có giá trị sau điều trị K giáp 80 – 85 % Tg + WBS phù hợp LS Sau điều trị I-131 Tg < 2 ng/ml 15 – 20% Tg & WBS không tương đồng Tg > 5 - 10ng/ml là điều trị Nồng độ Tg tăng cao khi có di căn xa

 CÂU HỎI

1. Nguyên lý của phương pháp miễn dịch phóng xạ

2. Ưu điểm của kỹ thuật RIA & IRMA

3. Sự giống nhau & khác nhau giữa RIA & IRMA

4. Những yếu tố làm ảnh hưởng đến kết quả XN

5. Nêu ứng dụng của phương pháp miễn dịch phóng xạ

trong chẩn đoán bệnh tuyến giáp & các dấu ấn chỉ điểm khối u trong một số bệnh ung thư thường gặp

TS Nguyễn văn Kính 23

TRÂN TRỌNG CẢM ƠN