Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tiền liệt tuyến EPCA bằng công nghệ gen

Do đó, với mong muốn góp phần nghiên cứu nhằm đƣa kháng thể vào ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị ung thƣ tiền liệt tuyến chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận gen mã hóa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN KIM HOÀN

NGHIÊN CỨU THU NHẬN GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN UNG THƯ TIỀN LIỆT TUYẾN EPCA BẰNG CÔNG

NGHỆ GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Kim Hoàn

NGHIÊN CỨU THU NHẬN GEN MÃ HÓA KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN UNG THƯ TIỀN LIỆT TUYẾN EPCA BẰNG CÔNG

Hà Nội - 2012

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 2

1.1 TUYẾN TIỀN LIỆT VÀ BỆNH UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT 2

1.1.1 Giới thiệu chung về tuyến tiền liệt 2

1.1.2 Bệnh ung thư tuyến tiền liệt 4

1.1.2.1 Khái niệm về ung thư tuyến tiền liệt 5

1.1.2.2 Nguyên nhân gây bệnh 5

1.1.2.3 Triệu chứng 5

1.1.2.4 Các kĩ thuật chẩn đoán bệnh 6

1.1.3 Các phương pháp điều trị ung thư tiền liệt tuyến 9

1.1.3.1 Điều trị phẫu thuật 9

1.1.3.2 Phương pháp xạ trị 10

1.1.3.3 Hormone điều trị UTTLT 10

1.1.3.4 Liệu pháp lạnh 11

1.1.3.5 Phương pháp xạ trị 12

1.1.3.6 Phương pháp sử dụng thảo dược hay các phương thuốc 13

1.2 KHÁNG NGUYÊN 13

1.2.1 Khái niệm 13

1.2.2 Kháng nguyên EPCA 13

1.3 KHÁNG THỂ 14

1.3.1 Cấu trúc 14

1.3.2 Mảnh kháng thể 16

1.3.3 Kháng thể tái tổ hợp 18

1.3.4 Kháng thể đặc hiệu các loại kháng nguyên 19

1.3.4.1 Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư 19

1.3.4.2 Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên cụm biệt hóa 20

1.3.4.3 Kháng thể đặc hiệu các thụ thể bề mặt tế bào 20

1.3.4.4 Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên tế bào gốc 21

1.3.4.5 Kháng t hể đặc hiệu các yếu tố phát triển 21

1.3.4.6 Kháng thể đặc hiệu cytokine 21

1.3.4.7 Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên virus 22

1.3.5 Các phương pháp tạo kháng thể 22

1.3.5.1 Phương pháp tạo dòng tế bào lai hybridoma 22

1.3.5.2 Phương pháp tái tổ hợp 23

1.3.5.3 Phương pháp phage display 25

1.4 THƯ VIỆN KHÁNG THỂ BỘC LỘ TRÊN THỰC KHUẨN THẾ 25

1.4.1 Giới thiệu chung 25

1.4.2 Thực khuẩn thế M13 27

1.4.2.1 Cấu tạo 27

1.4.2.2 Chu kì sống 29

1.4.2.3 Vector tách dòng phagemid 30

1.4.3 Các kiểu thư viện kháng thể thực khuẩn thể 31

1.4.3.1 Thư viện tự nhiên 31

1.4.3.2 Thư viện sau miễn dịch 32

1.4.3.3 Thư viện tổng hợp 33

1.4.4 Tạo thư viện kháng thể bộc lộ trên thực khuẩn thể 34

1.4.5 Sàng lọc thư viện kháng thể bộc lộ trên thực khuẩn thể 36

1.4.5.1 Khuếch đại thư viện và tạo phage 36

1.4.5.2 Cho phage tiếp xúc với đích 36

1.4.5.3 Rửa và tách 38

1.4.5.4 Tái xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ 38

CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1 VẬT LIỆU 39

2.1.1 Sinh phẩm 39

2.1.2 Hóa chất 39

2.1.3 Trang thiết bị 39

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.2.1 Phương pháp nhân bản gen bằng kĩ thuật PCR 40

2.2.2 Phương pháp cắt và gắn DNA 41

2.2.3 Phương pháp tế bào khả biến E.coli TG1 42

2.2.4 Phương pháp biến nạp 42

2.2.5 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 43

2.2.6 Phương pháp giữ chủng 43

2.2.7 Phương pháp điện di trên gel agarose 43

2.2.8 Xác định trình tự DNA 44

2.2.9 Chuẩn bị thư viện phage 45

2.2.10 Bộc lộ mảnh kháng thể scFv trên phage M13 46

2.2.11 Phương pháp ELISA 46

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49

3.1 Kết quả nhân bản gen mã hóa mảnh kháng thể scFv bằng PCR 49

3.2 Kết quả tạo vector tái tổ hợp pHEN2-scFv 50

3.3 Chọn dòng phagemid tái tổ hợp mang gen scFv đặc hiệu UTTLT 52

3.4 Xác định trình tự gen scFv trong phagemid tái tổ hợp 54

3.5 Kết quả bộc lộ mảnh kháng thể scFv trên phage M13 55

3.6 Kết quả phản ứng ELISA 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

KẾT LUẬN 61

KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

Kháng thể scFv là chuỗi hợp nhất giữa một vùng biến thiên trên chuỗi nặng (VH)

và một vùng biến thiên trên chuỗi nhẹ (VL) của kháng thể nhờ chuỗi peptide ngắn

(10-25 axit amin) Với cấu trúc này, scFv vẫn giữ đƣợc các đặc trƣng của kháng thể nhƣ ban đầu, mặc dù đã loại bỏ các vùng hằng định và có thêm sự xuất hiện chuỗi peptide làm cầu nối giữa vùng VH và VC

Kháng thể phage-scFv không những có độ bền cao, tạo ra lƣợng lớn với chi phí thấp mà còn có những ƣu điểm tuyệt vời mà không có một loại kháng thể nào có đƣợc, đó là có sự kết hợp giữa kiểu gen và kiểu hình ngay trong một phân tử kháng thể

Do đó, với mong muốn góp phần nghiên cứu nhằm đƣa kháng thể vào ứng dụng

trong chẩn đoán và điều trị ung thƣ tiền liệt tuyến chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên

cứu thu nhận gen mã hóa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thƣ tiền liệt tuyến EPCA bằng công nghệ gen.”

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 TUYẾN TIỀN LIỆT VÀ BỆNH UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT 1.1.1 Giới thiệu chung về tuyến tiền liệt

Tuyến tiền liệt là một cơ quan nằm ở bụng dưới hay cổ bàng quang (hình 1) Là tuyến bao quanh đoạn đầu niệu đạo Tuyến tiền liệt là một khối hình nón mà đáy ở trên, đỉnh ở dưới Tuyến rộng 4cm, cao 3cm và dày 2,5cm, nặng trung bình 15-20g và thường to lên theo tuổi (hình 2) [1]

Hình 1 : Vị trí tuyến tiền liệt ở nam giới

Tuyến tiền liệt tiết ra chất dịch có màu trắng sữa, mang tính kiềm và chứa acid citric, calcium, acid phosphat, enzyme làm đông vón và profibrinolysin Trong thời gian phóng tinh, các túi của tuyến tiền liệt co bóp cùng với co bóp của ống dẫn tinh để đẩy dịch tiết của nó gộp với dịch từ ống dẫn tinh làm tăng thể tích tinh dịch Dịch tiết của nó có tính kiềm sẽ trung hòa bớt độ acid trong tinh dịch (độ acid do sự hiện diện của các sản phẩm trao đổi chất của tinh trùng), vì vậy mà giúp tinh trùng đạt được khả năng vận động và thụ tinh ở mức tối ưu

Một chức năng khác của tuyến tiền liệt là giúp kiểm soát nước tiểu bằng cách tạo

áp lực trực tiếp đối với phần niệu đạo mà tuyến tiền liệt bao quanh [5,3,2]

Hình 2: Hình dạng tuyến tiền liệt

Những rối loạn của tuyến tiền liệt có thể là sự tăng kích thước gọi là phì đại tuyến tiền liệt, viêm tuyến tiền liệt và ung thư tuyến tiền liệt

 Phì đại tuyến tiền liệt:

Đây là bệnh rất thường gặp ở những người sau tuổi 45, trong đó phì đại lành tính là thường gặp hơn cả, mặc dù lành tính nhưng lại ảnh hưởng rất nhiều đến chất lượng cuộc sống (hình 3)

Khi mới sinh tuyến tiền liệt có kích

thước bằng hạt đậu Hà Lan Tuyến này

tiếp tục lớn cho đến khi 20 tuổi cũng là

lúc nó đạt đến kích thước trưởng thành

bình thường Đến 45 tuổi, tuyến tiền

liệt lại tiếp tục lớn thêm, chèn ép niệu

đạo và dòng nước tiểu, ảnh hưởng đến

khả năng tiểu tiện [13,21]

 Viêm tuyến tiền liệt: Đây là

bệnh khá phổ biến ở thanh niên, có

phân ra cấp và mạn tính Viêm tuyến tiền liệt mạn tính biểu hiện chủ yếu là cảm giác khó chịu vùng bụng dưới, đau vùng dưới thắt lưng, đi tiểu nhiều lần

 Ung thư tuyến tiền liệt : Đây là bệnh ngày càng phổ biến với tỉ lệ bị mắc bệnh

tăng cao ở các nước (hình 4) [8]

Hình 4: Bệnh ung thư tuyến tiền liệt

1.1.2 Bệnh ung thư tiền liệt tuyến

Ung thư tiền liệt tuyến (UTTLT) là loại ung thư phổ biến ở nước ta cũng như các nước trên thế giới Bệnh chiếm 10% trong số các ung thư ở nam giới, ở các nước tiên tiến tỷ lệ này là 15% và là nguyên nhân tử vong thứ hai của bệnh ung thư, sau ung thư phổi Theo thống kê, hàng năm ở Mỹ có đến 132.000 người Mỹ bị UTTLT, và khoảng 34.000 người tử vong vì căn bệnh này

Tỷ lệ mắc bệnh rất khác nhau ở các sắc dân Theo thống kê của Mỹ, tỷ lệ UTTLT

ở đàn ông người da đen là 181 người trên 100.000 dân, tức là cao gấp 4,5 lần so với đàn ông người gốc Việt Nam (40 trên 100.000 dân) Đàn ông người da trắng cũng có

tỷ lệ mắc bệnh cao hơn người Việt Nam, nhưng thấp hơn người Mỹ da đen (khoảng

135 trên 100.000 dân) Tỷ lệ mắc bệnh UTTLT cũng tăng theo độ tuổi Chẳng hạn như đàn ông ở độ tuổi 70 trở lên, cứ 100.000 người thì có 402 người Việt Nam, hay

1265 người Mỹ da trắng, hay 958 người Nhật, hay 504 người Trung Quốc mắc bệnh UTTLT [20]

1.1.2.1 Khái niệm về ung thư tuyến tiền liệt

Ung thư tuyến tiền liệt là khối u ác tính phát triển từ tế bào của tuyến tiền liệt Khối u thường phát triển chậm và kéo dài trong nhiều năm Trong suốt thời gian này, khối u thường có rất ít hoặc không có biểu hiện triệu chứng bất thường khi khám bệnh Tuy nhiên, khi ung thư tiến triển, khối u lớn lên và xâm lấn sang mô xung quanh (lan rộng tại chỗ) Hơn nữa, ung thư cũng có thể di căn (lan xa hơn) đến các vùng khác của cơ thể như xương, phổi, gan Triệu chứng ở những nơi di căn kết hợp với triệu chứng của UTTLT [8]

1.1.2.2 Nguyên nhân gây bệnh

Nguyên nhân gây ra UTTLT vẫn chưa được nghiên cứu rõ, UTTLT không liên quan đến phì đại tuyến tiền liệt lành tính Các yếu tố nguy cơ bị UTTLT bao gồm: lớn tuổi, di truyền, ảnh hưởng của nội tiết tố cũng như chất độc trong môi trường, hóa chất và các sản phẩm công nghiệp

Nguy cơ bị UTTLT tăng theo tuổi Vì vậy UTTLT hiếm gặp ở người dưới 40 tuổi, trong khi nó lại rất thường gặp ở đàn ông trên 80 tuổi Một số nghiên cứu cho thấy rằng 50-80% đàn ông trên 80 tuổi bị UTTLT

Yếu tố môi trường như hút thuốc lá, ăn nhiều mỡ bão hòa sẽ làm tăng nguy cơ bị UTTLT Tất cả những chất hay độc tố trong môi trường hay từ chất thải của ngành công nghiệp nặng có thể khởi phát bệnh UTTLT

1.1.2.3 Triệu chứng

Vào giai đoạn sớm, UTTLT thường không gây ra triệu chứng trong suốt vài năm UTTLT thường được phát hiện bởi những bất thường trong xét nghiệm máu (xét

nghiệm chất PSA) hoặc sờ thấy khối cứng ở tiền liệt tuyến

Trước tiên, theo thông lệ bác sỹ sẽ dùng ngón tay trỏ đưa vào trực tràng, qua đó

sờ thấy được tuyến tiền liệt (tuyến tiền liệt nằm trước trực tràng) Khi khối ung thư lớn gây chèn ép vào niệu đạo làm cho người bệnh khó đi tiểu, tiểu lắt nhắt, phải rặn Người bệnh có thể có cảm giác tiểu rát, tiểu ra máu Nếu khối ung thư tiếp tục phát

triển có thể gây bí tiểu hoàn toàn, làm cho người bệnh đau vùng bụng dưới, bàng quang căng to vì không thể đi tiểu được

Về sau, khối UTTLT xâm lấn sang các cơ quan lân cận, hay đi xa hơn đến các hạch bạch huyết vùng chậu Khi đó ung thư có thể lan xa hơn (còn gọi là di căn) đến các vùng khác của cơ thể Bác sỹ khám trực tràng đôi khi cũng có thể phát hiện được

sự xâm lấn tại chỗ sang các mô lân cận Ung thư này sờ thấy cứng, không di động UTTLT thường di căn đến các đốt sống thắt lưng thấp hay xương chậu, là nguyên nhân gây ra đau lưng hay đau vùng chậu Ung thư có thể lan đến gan, phổi Di căn ung thư đến gan gây ra đau bụng và vàng da Ung thư di căn đến phổi gây ra đau ngực

và ho

1.1.2.4 Các kỹ thuật chuẩn đoán bệnh

Tầm soát UTTLT là việc cần được làm thường xuyên và cách đều nhằm phát hiện UTTLT giai đoạn sớm Nếu kết quả tầm soát bình thường thì coi như hiện tại không mắc bệnh, nếu kết quả bất thường thì nghi ngờ có bệnh và cần làm thêm một số xét nghiệm khác để chẩn đoán Khi có một hoặc hai xét nghiệm tầm soát có bất thường thì UTTLT được nghi ngờ đầu tiên Các thăm khám tầm soát này bao gồm:

 Thăm khám tuyến tiền liệt bằng ngón tay qua ngả trực tràng: Qua ngả trực tràng,

người thăm khám có thể sờ thấy bề mặt sau chiếm đến 75% diện tích chung của tuyến, nằm phần cuối của ruột già Qua đó có thể sờ thấy khối u to ra, mật độ không đều, chỗ cứng chỗ mềm rất dễ phát hiện [7]

 Siêu âm nội trực tràng: để tìm chính xác độ lớn, vị trí khối u giúp bác sỹ chích

sinh thiết và tế bào tuyến để khám nghiệm cơ thể bệnh lý học [7]

 Xét nghiệm PSA (kháng nguyên đặc hiệu của tiền liệt tuyến): Đây là xét nghiệm

đơn giản, dễ thực hiện và tương đối chính xác

PSA là một enzyme glucỏpotein, được tiết ra duy nhất của biểu mô tuyến tiền liệt,

có trọng lượng phân tử khoảng 30.000, chứa 240 axit amin với 7% carbonhydrat, có

vai trò làm loãng tinh dịch Đây là kháng nguyên đặc hiệu của tuyến tiền liệt, trong bệnh nhân bị UTTLT thì nồng độ PSA thường tăng cao và tỷ lệ với thể tích khối ung

thư Tuy nhiên không chỉ đặc hiệu riêng với UTTLT, nồng độ PSA còn tăng khi bị viêm tuyến tiền liệt

Xét nghiệm dùng để phát hiện lượng PSA, tuy nhiên PSA có giá trị như một xét nghiệm tầm soát UTTLT Vì vậy các bác sỹ thường khuyên những người đàn ông trên 50 tuối nên đi làm xét nghiệm PSA mỗi năm một lần để phát hiện sớm bệnh UTTLT Ở những người có nguy cơ UTTLT bác sỹ khuyên nên bắt đầu làm xét nghiệm PSA sớm hơn ngay ở tuổi 40

1.1.2.5 Các giai đoạn của ung thư tiền liệt tuyến

Việc phân chia giai đoạn của UTTLT dựa vào mức độ lan rộng của ung thư UTTLT được đánh giá dựa vào sinh thiết, thêm vào đó là đánh giá ung thư đã di căn hay chưa, bằng cách sinh thiết các cơ quan lân cận như trực tràng, bàng quang, hay các hạch vùng chậu Thêm vào đó cần làm thêm các xét nghiệm chuẩn đoán bằng hình ảnh, chẳng hạn chụp phim xương để xác định ung thư có di căn đến xương hay không Ngoài ra có thể chụp CT Scan, MRI để xác định xem ung thư dưới mô hay cơ quan như bàng quang hay trực tràng, hay một nơi nào khác của cơ thể như gan hoặc phổi Tóm lại, các bác sỹ chia giai đoạn UTTLT trước tiên là dựa trên kết quả sinh thiết tuyến tiền liệt và có thể là trên các mẫu sinh thiết khác, và chụp phim Để chia giai đoạn ung thư, các bác sỹ sẽ dùng những chữ in hoa và số khác nhau để xác định kích thước khối ung thư, và mức độ lan rộng của ung thư Việc phân chia giai đoạn ung thư giúp tiên lượng bệnh và chọn lựa phương pháp điều trị thích hợp

Có hai hệ thống chính được sử dụng để phân chia giai đoạn ung thư:

Theo hội ung thư Mỹ về sắp xếp giai đoạn thì UTTLT chia thành 4 giai đoạn A,

B, C, D:

 Giai đoạn A: Ung thư còn rất nhỏ không thể sờ được khi bác sỹ khám bệnh,

cũng không thể thấy được khi làm các xét nghiệm chuẩn đoán hình ảnh, tổn thương này chỉ có thể phát hiện khi quan sát dưới kính hiển vi

 Giai đoạn B: Khối u lớn hơn, có thể sờ thấy được nhưng chỉ nằm khu trú ở tiền

liệt tuyến

 Giai đoạn C: Khối ung thư ăn lan ra các cơ quan lân cận

 Giai đoạn D1: Ung thư lan ra gần ở hạch chậu

 Giai đoạn D2: Ung thư lan xa hơn (di căn) đến gan, phổi vv

Hình 5: Các giai đoạn của bệnh UTTLT

Gđ T1: Khối u rất nhỏ, chỉ quan sát được dưới kính hiển vi

Gđ T2: Khối u lớn hơn, có thể sờ thấy được nhưng chỉ nằm khu trú ở tuyến

Gđ T3: Ung thư lan ra khỏi bao của tuyến tiền liệt

Gđ T4: Ung thư lan ra mô xung quanh

Một hệ thống khác phân chia giai đoạn UTTLT gọi là u, hạch, di căn Theo cách chia này, T1 và T2 tương đương với 2 giai đoạn A và B như hệ thống phân loại ở trên T3 được mô tả là ung thư lan ra khỏi bao của tiền liệt tuyến và T4 là ung thư lan ra các mô xung quanh [7]

1.1.3 Các phương pháp điều trị bệnh UTTLT

Để quyết định điều trị cho bệnh nhân, bác sỹ sẽ xếp loại UTTLT như còn tại chỗ, u lớn nhưng chưa lan ra hay di căn Chọn lựa điều trị tùy theo mức độ lan ra của ung thư, nếu ung thư khu trú tại chỗ điều trị bao gồm: phẫu thuật, xạ trị, hormone liệu pháp, đông lạnh và các biện pháp này có thể kết hợp với nhau Còn đối với các trường hợp UTTLT đã di căn thường không điều trị được Điều trị UTTLT di căn bao gồm:

hormone liệu pháp, hóa trị, tuy nhiên vẫn chỉ là tạm thời Mục tiêu của điều trị tạm thời là làm cho khối u chậm phát triển, giảm triệu chứng cho người bệnh

1.1.3.1 Điều trị phẫu thuật UTTLT

Điều trị phẫu thuật UTTLT thường là phẫu thuật cắt bỏ tận gốc, tức là lấy đi toàn bộ tuyến tiền liệt Phẫu thuật này được làm ở khoảng 36% bệnh nhân bị UTTLT còn khu trú tại chỗ Tai biến xảy ra khi mổ ung thư là tai biến lúc gây mê, chảy máu chỗ mổ, liệt dương chiếm tỷ lệ 30 – 70%, tiểu không tự chủ chiếm 3 – 10% bệnh nhân

Những tiến bộ gần đây giúp làm giảm biến chứng của phẫu thuật cắt bỏ tận gốc Các tiến bộ này xuất phát từ việc hiểu rõ hơn về chìa khóa giải phẫu, sinh lý năng lực tình dục và tiểu tiện Đặc biệt các kỹ thuật cắt tiền liệt tuyến mới đây giúp làm giảm tỷ

lệ liệt dương và tiểu không kiểm soát

Nếu sau mổ mà bệnh nhân bị liệt dương có thể điều trị bằng sildenafil (Viagra) viên uống, hoặc chích thuốc alprostadil (Caverject) vào dương vật bằng phương pháp bơm hoặc dùng dụng cụ tác động lên dương vật (dương vật giả) Nếu không kiểm soát thường hồi phục theo thời gian, đặc biệt là luyện tập và dùng thuốc để kiểm soát són tiểu Tuy nhiên, đôi lúc tiểu không kiểm soát đòi hỏi phải cấy ghép loại cơ vòng nhân tạo quanh niệu đạo

1.1.3.2 Phương pháp xạ trị

Mục tiêu của xạ trị là nhằm phá hủy các tế bào ung thư và ngăn không cho chúng phát triển hay tiêu diệt chúng Vì tế bào ung thư phân chia nhanh cho nên nó sẽ bị tổn thương hơn các tế bào xung quanh Các thử nghiệm lâm sàng đã hướng tới việc dùng tia xạ để điều trị UTTLT còn khu trú Thử nghiệm này cho thấy rằng xạ trị mang lại kết quả sống sót sau 10 năm tương đương với phương pháp mổ Tiểu không kiểm soát

và liệt dương xảy ra do xạ trị sẽ thấp hơn phương pháp mổ Nhưng nguy cơ tái phát ung thư sau xạ trị có thể xảy ra Khoảng 30% bệnh nhân bị UTTLT khu trú tại chỗ được điều trị bằng xạ trị Xạ trị có thể là xạ trị ngoài trong thời gian 6 – 7 tuần hoặc có thể là xạ trị trong, tức là cắm chất phóng xạ trực tiếp vào tiền liệt tuyến

Phương pháp xạ trị ngoài là dùng tia X có năng lượng cao chiếu thẳng trực tiếp vào khối ung thư, còn xạ trị trong là dùng kim cắm xuyên qua khối u tuyến tiền liệt ung thư dưới hướng dẫn của siêu âm Về mặt lý thuyết, lợi ích của xạ trị trong hơn xạ trị ngoài ở chỗ tia xạ của xạ trị trong phóng thẳng vào khối ung thư làm giảm tối thiểu thương tổn cho các mô và cơ quan lân cận

1.1.3.3 Hormone điều trị UTTTL

Hormone nam còn gọi là testosterone, hormone này kích thích tế bào tiền liệt tuyến bị ung thư làm u to thêm ra Bình thường, testosterone được tinh hoàn sản xuất trong đáp ứng với hormone khác là LH-RH (luteinizing hormone – releasing hormone), còn gọi là hormone hướng sinh dục Hormone này được sản xuất trong não vào máu đến tinh hoàn và nó kích thích tinh hoàn sản xuất và phóng thích testosterone Điều trị bằng hormone cũng được kể đến như là biện pháp làm giảm lượng testosterone trong máu, cũng có thể bằng mổ hoặc bằng thuốc Điều trị phẫu thuật tinh hoàn là phương pháp làm giảm hormone Phẫu thuật này là cắt bỏ tận gốc nơi sản xuất ra testosterone của cơ thể Điều trị bằng hormmone bao gồm dùng một hoặc hai loại thuốc Một loại thuốc được chọn lựa là thuốc kháng LH-RH Thuốc này

có tác dụng cạnh tranh với LH-RH từ não Một loại thuốc khác cũng được chọn lựa, là loại thuốc có tác dụng kháng androgenic, là thuốc kháng nội tiết tố nam Thuốc này ức chế tác dụng của testosterone tại tuyến tiền liệt

Ngày nay, đàn ông thường lựa chọn phương pháp điều trị bằng nội tiết tố hơn là phẫu thuật Cả hai phương pháp điều trị bằng hormone này đều có tác dụng loại bỏ sự kích thích tế bào ung thư của testosterone Tuy nhiên, một số u tuyến tiền liệt không đáp ứng với các hình thức điều trị này Đó là các dạng UTTLT không phụ thuộc androgen (nội tiết tố nam) Tác dụng phụ chủ yếu của các phương pháp điều trị hormone do mất đi nội tiết tố nam là làm vú người đàn ông to ra và liệt dương

Thường phương pháp điều trị bằng hormone dành cho những bệnh nhân bị UTTLT đã tiến triển xa hoặc ung thư đã di căn Đôi khi người bệnh chỉ bị UTTLT còn khu trú nhưng vẫn điều trị bằng phương pháp hormone vì người bệnh có thêm những bệnh nặng khác phối hợp, hay đơn giản hơn là người bệnh từ chối mổ hay xạ trị Điều

trị bằng hormone thường áp dụng cho ít hơn 10% bệnh nhân bị UTTLT còn khu trú, chỉ là tạm thời và mục đích là kiểm soát bệnh hơn là chữa bệnh

1.1.3.4 Liệu pháp “lạnh”

Liệu pháp “lạnh” là một trong những phương pháp chữa trị mới mẻ đang được thử nghiệm dùng trong chữa trị UTTLT giai đoạn sớm Với phương pháp này tế bào ung thư sẽ được tiêu diệt bằng cách bị đông cứng lại Sự đông cứng sẽ xảy ra khi tiêm trực tiếp vào tuyến tiền liệt một dung dịch lạnh (ví dụ như nitơ hay argon ở thể lỏng) Quá trình trên được thực hiện dưới sự hướng dẫn của siêu âm

Hiện nay, phương pháp “lạnh” đang được khuyến cáo sử dụng cho những bệnh nhân UTTLT giai đoạn còn khu trú mà vì một lý do nào đó không thể thực hiện được bất kỳ một phương pháp chữa trị nào khác Tuy nhiên, hiệu quả của phương pháp này còn chưa được chứng minh cụ thể Đôi khi dung dịch tiêm vào lại không tiêu diệt được hết tế bào ác tính Hơn nữa, phương pháp này còn “âm thầm” gây những tổn thương lên bàng quang và niệu đạo Những tổn thương này có thể gây tắc nghẽn niệu

đạo, rò niệu đạo hoặc gây nhiễm trùng trầm trọng

1.1.3.5 Phương pháp hóa trị

Hóa trị là phương pháp điều trị bằng thuốc, mà ở đây là những thuốc chống ung thư Đây được coi như là một phương pháp điều

trị tạm thời dành cho những trường hợp bệnh đã

tiến triển xa, không thể điều trị có hiệu quả Các

thuốc này làm khối u phát triển chậm hơn và làm

giảm các triệu chứng của bệnh nhân Thường

không áp dụng hóa trị cho UTTLT giai đoạn còn

khu trú bởi còn nhiều phương pháp khác tốt hơn

Hóa trị thường dùng trong trường hợp UTTLT đã

di căn xa, tế bào ung thư đã xâm nhập đến những

nơi khác trong cơ thể và không đáp ứng với

những phương pháp điều trị khác Hình 6: Thuốc hóa trị Abiraterone

Những tác dụng thường thấy của hóa trị là mệt mỏi, buồn nôn, rụng tóc và gây suy tủy Đối với suy tủy thì lần lượt sẽ làm giảm hồng cầu (gây thiếu máu), giảm bạch cầu (dễ nhiễm trùng) và giảm tiểu cầu (dễ chảy máu)

1.1.3.6 Phương pháp sử dụng thảo dược hay các phương thuốc điều trị thay thế khác

Những thuốc điều trị thay thế như dùng thảo dược, chế độ ăn uống kèm theo, châm cứu Vấn đề đáng quan tâm là trong phương pháp dùng thảo dược, những thành phần của thuốc không được tiêu chuẩn hóa Hơn nữa, cơ chế của các loại thảo dược cũng như tác dụng lâu dài của nó còn chưa được biết rõ

1.2 KHÁNG NGUYÊN

1.2.1 Khái niệm

Kháng nguyên (antigen) được định nghĩa là một chất tương tác với các phân tử kháng thể và thụ thể trên các tế bào lympho Một chất gây miễn dịch là một kháng nguyên được cơ thể nhận biết như một chất ngoại lai và kích thích phản ứng miễn dịch thích ứng

1.2.2 Kháng nguyên EPCA ( Early Prostate Canner Antigen)

EPCA là một protein có trong chất nền của nhân tế bào Điều đặc biệt là EPCA được biểu hiện mạnh trong các mô ung thư và các mô bình thường sát kề mô ung thư

ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt, nhưng lại không biểu hiện ở mô tuyến tiền liệt của người không bị ung thư, do vậy xác định chỉ thị EPCA sẽ làm giảm nguy cơ các trường hợp âm tính giả khi sinh thiết EPCA có khối lượng phân tử khoảng 40kDa và điểm đẳng điện khoảng 6,73 Sử dụng kháng nguyên EPCA có thể phát hiện mầm bệnh ở bệnh nhân sớm hơn 1-2 năm trước khi có biểu hiện về hình thái ung thư tuyến tiền liệt Các kháng thể kháng EPCA có hiệu quả như một yếu tố góp phần nghiên cứu bệnh lý của các mẫu sinh thiết tiền liệt tuyến để phát hiện ung thư tuyến tiền liệt sớm hơn so với làm sinh thiết nhiều lần, cũng như có tiềm năng giới hạn số lần làm sinh

thiết ở một bệnh nhân [26]

EPCA nhuộm màu cả các tế bào ung thư và tế bào bình thường ở những người

bị bệnh ung thư tuyến tiền liệt EPCA chủ yếu nhuộm màu bên ngoài nhân tế bào tuyến tiền liệt, đặc biệt là tế bào chất và màng tế bào

EPCA có thể được sử dụng để tiên lượng sự xuất hiện của ung thư tuyến tiền liệt và giám sát sự phát triển của ung thư tuyến tiền liệt Mức độ EPCA biểu hiện ở ung thư tuyến tiền liệt xâm lấn cao hơn so với ở ung thư tuyến tiền liệt không xâm lấn Nó nhuộm màu trong mô tuyến tiền liệt, các hạch bạch huyết và ống dẫn tinh của bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt di căn Đáng chú ý, EPCA nhuộm màu cả các mô lân cận bình thường và các mô bình thường trong tuyến tiền liệt của người bị ung thư tuyến tiền liệt [52] Tuy nhiên, EPCA không được phát hiện trong tuyến tiền liệt của những người không bị ung thư tuyến tiền liệt Vì vậy, các phưng pháp phát hiện sử dụng EPCA như một dấu ấn sinh học ung thư tuyến tiền liệt làm giảm rủi ro các báo cáo sinh thiết âm tính giả

1.3 KHÁNG THỂ

1.3.1 Cấu trúc

Kháng thể là một sản phẩm đặc hiệu được hệ miễn dịch tổng hợp giúp cơ thể tấn công các tác nhân gây bệnh Các kháng thể là các immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho B, các tương bào (biệt hoá từ lympho B) tổng hợp và tiết ra giúp hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hoá các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus [4]

Kháng thể đơn dòng là những kháng thể đồng nhất với nhau về bản chất được tổng hợp từ một dòng tế bào lympho B, tế bào huyết thanh trong phản ứng đối với sự tồn tại các kháng nguyên trong cơ thể Nghĩa là kháng thể đơn dòng là tập hợp các kháng thể đồng nhất cùng nhận biết và gắn kết với một epitope (hay còn gọi là quyết định kháng nguyên là vị trí cấu trúc trên một phân tử kháng nguyên có thể phản ứng với một kiểu cấu trúc hóa học của phân tử kháng thể hoặc phân tử thụ thể) Ngược lại, các kháng thể đa dòng là tập hợp nhiều loại kháng thể không đồng nhất và nhận biết các epitope khác nhau [4]

Những hiểu biết cơ bản về cấu trúc kháng thể là cần thiết cho việc tách dòng thành công các gen mã hóa kháng thể Cấu trúc cơ bản của tất cả các kháng thể đều bao gồm một cặp chuỗi nặng và một cặp chuỗi nhẹ giống hệt nhau đƣợc gắn với nhau bằng cầu disulfide và liên kết không cộng hóa trị Cả phân tử có cấu trúc đối xứng

Chuỗi nhẹ

Có trọng lƣợng phân tử 25kDa,

chứa khoảng 211 – 221 axit amin Có

hai loại chuỗi nhẹ là kappa (Қ) và

lambda (λ) Mỗi phân tử Ig chỉ chứa

hoặc hai chuỗi nhẹ Қ hoặc hai chuỗi

nhẹ λ mà không bao giờ chứa cả hai

loại Mỗi chuỗi nhẹ của Ig chứa hai

vùng axit amin: vùng biến đổi (VL)

nằm ở đầu phía đầu amin (-NH2) của

CH1, CH2, CH3 Hai vùng biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ nằm kề nhau tạo thành

vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratop do vậy đảm bảo tính đa dạng của phân tử

kháng thể [6]

Bảng 1: Đặc điểm của các mảnh kháng thể

M¶nh

kh¸ng thÓ

KÝch th-íc (kDa)

Sè

ScFv 25-30 1 Vïng VH vµ VL nèi víi nhau b»ng mét

linker dµi 15 axit amin

Fv 25 1 Gi÷a VH vµ VL kh«ng cã ®o¹n nèi

Hình 8: Cấu trúc chung của một số loại kháng thể

Trong quá trình nghiên cứu về tác dụng của kháng thể đơn dòng các nhà khoa học nhận thấy rằng mảnh Fv, Fab hay (Fab)2 vẫn giữ tính đặc hiệu epitope nhưng có khả năng xâm nhập mô tốt hơn và thời gian bán thải ngắn hơn so với phân tử kháng thể đơn dòng hoàn chỉnh nên có ưu điểm nhất định trong thâm nhập khối u và trong trường hợp gắn đặc hiệu bề mặt tiểu cầu [39]

Mảnh Fv có thể được tạo ra bằng cách dùng enzyme đặc hiệu cắt kháng thể đơn dòng nhưng theo phương pháp này liên kết giữa VH và VL lỏng lẻo nên khả năng gắn kháng nguyên kém Chính vì vậy cấu trúc biến đổi đơn chuỗi (Single chain variable fragment- scFv) đã ra đời, và được coi là ABAF đơn giản nhất Trong phân tử scFv,

VH và VL được nối với nhau qua một chuỗi peptide khoảng 15-18 acid amin gọi là linker Linker cần đủ dài để tạo khoảng cách giữa hai chuỗi và không ảnh hưởng đến

sự hoàn thiện cấu trúc không gian của VH, VL, linker được sử dụng phổ biến nhất là (GGGGS)3 [23] scFv được tạo ra thông qua kĩ thuật tái tổ hợp các đoạn gene mã hoá

VH, linker, VL, sau đó đưa vào hệ biểu hiện để cho ra sản phẩm là một chuỗi peptide duy nhất

Các biến thể của cấu trúc biến đổi đơn chuỗi :

Thành công của kĩ thuật tạo scFv đã mở đầu cho sự ra đời nhiều ABAF khác như Fab, minibody (scFv- CH3), diabody ( dimer scFv), scFv- Fc Các dạng này có thể

có một vùng gắn KN (monovalent binding) hoặc 2 vùng gắn KN (bivalent binding) [10]

Trong số các ABAF, dạng gần với cấu trúc của phân tử kháng thể hoàn chỉnh nhất là dạng scFv-Fc có hai vùng gắn KN Phần Fc trong scFv-Fc thường có nguồn gốc từ người, do đó khi vào cơ thể scFv-Fc có đầy đủ khả năng như một phân tử kháng thể hoàn chỉnh để gây các phản ứng miễn dịch cần đến phần Fc (như ADCC, CDC, CDCC…) mà scFv không thể gây ra được

Nguyên tắc chung để tạo ABAF gồm có hai bước là sử dụng kĩ thuật tái tổ hợp DNA để tạo ra đoạn gene mã hoá, sau đó biểu hiện đoạn gene tái tổ hợp trong hệ biểu hiện phù hợp, do đó một số tài liệu còn gọi chúng là các cấu trúc kháng thể tái tổ hợp (recombinant antibody fragment) [42,12]

1.3.3 Kháng thể tái tổ hợp

Kháng thể tái tổ hợp là thuốc thử cần thiết cho nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị [25] Nhu cầu sử dụng kháng thể trong nghiên cứu khoa học, trong chẩn đoán và điều trị bệnh ngày càng lớn, đặc biệt là các kháng thể đặc hiệu có nguồn gốc từ người, nhưng nguồn kháng thể người thường khó kiếm được Vì vậy, phương pháp chung để thu nhận được các kháng thể là từ động vật gây miễn dịch và sau đó nhân tính hoá để hạn chế tối đa phản ứng miễn dịch khi sử dụng

Nhằm làm tăng hiệu quả điều trị của các kháng thể đơn dòng, các nhà khoa học

đã kết hợp các gen từ các nguồn tế bào lympho B khác nhau (từ chuột, người) để tạo các gen tái tổ hợp mã hoá các kháng thể đơn dòng có vùng gắn kết kháng nguyên đồng nhất, gắn kết với cùng một vị trí của kháng nguyên

Các kháng thể đơn dòng có thể là kháng thể đơn dòng chuột, kháng thể đơn dòng người, kháng thể đơn khỉ, kháng thể đơn dòng nhân hoá Các kháng thể đơn dòng sản xuất theo phương pháp Kohler và Milstein năm 1975 [29] có ứng dụng rất lớn trong nghiên cứu khoa học để xác định sự tương tác giữa các phân tử, xác định

các quyết định kháng nguyên Tuy nhiên, khi ứng dụng trong điều trị lại gặp những trở ngại về tính hiệu quả do chúng nhanh chóng bị trung hoà (cơ thể người bệnh sinh kháng thể kháng lại nó, gọi tắt là hiện tượng HAMA) Để khắc phục vấn đề này, các nhà khoa học đã sử dụng kỹ thuật gen để: (1) tạo kháng thể đơn dòng dạng ghép; (2) sản xuất kháng thể có bản chất của người hoàn toàn

Kháng thể đơn dòng dạng ghép (Chimeric monoclonal antibody) là kháng thể

mang vùng biến đổi có nguồn gốc của chuột và vùng hằng định có nguồn gốc của người Kháng thể đơn dòng dạng ghép làm tăng hiệu quả điều trị và giảm hiện tượng HAMA Trên thực tế đã có 5 kháng thể đơn dòng dạng ghép đã được bán trên thị trường ở nhiều nước để điều trị miễn dịch và ung thư Các kháng thể hoàn toàn có bản chất của người mới được nghiên cứu trong những năm gần đây và đang trong giai đoạn thử nghiệm

1.3.4 Kháng thể đặc hiệu các loại kháng nguyên

Phản ứng kháng nguyên - kháng thể rất đặc hiệu, vì vậy để thu nhận được các kháng thể đặc hiệu kháng nguyên đích ta cần hiểu rõ mối tương tác kháng nguyên - kháng thể, xác định nét đặc trưng của kháng thể đối với các kháng nguyên có nguồn gốc, bản chất khác nhau [4]

1.3.4.1 Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư

Rất nhiều ung thư biểu hiện phân tử trên bề mặt tế bào đặc hiệu, nghĩa là chúng không biểu hiện hoặc biểu hiện với số lượng rất nhỏ trên các tế bào soma bình thường Vai trò của các kháng nguyên này trong hình thành hoặc phát triển khối u vẫn cần phải nghiên cứu làm sáng tỏ Tuy nhiên, chức năng sinh học của những kháng nguyên này là đích để chẩn đoán và điều trị đã được xác định vì:

tổn thương đối với các tế bào bình thường Nhiều kháng thể đầu đã được sử dụng

có hiệu quả trong chẩn đoán và điều trị ung thư

Để tạo các kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư, động vật được gây miễn dịch với các tế bào mang kháng nguyên đích hoặc với các kháng nguyên tinh sạch Các kháng thể đơn dòng xuất hiện trong động vật gây miễn dịch hoặc với các kháng nguyên tinh sạch Các kháng thể đơn dòng xuất hiện trong động vật gây miễn dịch được sàng lọc dựa trên hoạt tính gắn kết với các tế bào ung thư và kiểm tra hoạt tính diệt tế bào [4]

1.3.4.2 Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên cụm biệt hóa ( CD)

Kháng nguyên cụm biệt hóa là những chỉ thị trên bề mặt tế bào lympho, chúng được sử dụng để phân biệt các dòng tế bào, các trạng thái phát triển và các cụm chức năng, chúng chỉ có thể nhận diện bằng các kháng thể đơn dòng và được đánh số, chẳng hạn CD1, CD2, CD3 vv

1.3.4.3 Kháng thể đặc hiệu các thụ thể bề mặt tế bào

Các thụ thể trên bề mặt tế bào là các glycoprotein được cắm vào hoặc gắn kết với màng tế bào huyết tương, hướng ra ngoài môi trường và có vị trí gắn kết cho các ligand đặc hiệu

Ligand gắn với thụ thể tế bào tạo ra các tín hiệu sinh học và nó được lan truyền

từ ngoài vào trong tế bào làm xuất hiện các phản ứng của tế bào như tăng sinh, biệt hóa, chết theo chương trình vv Các thụ thể trên bề mặt tế bào truyền các tín hiệu ligand rất khác nhau chẳng hạn các nhóm thụ thể, hoạt hóa một enzyme Tạo kháng thể đặc hiệu với các thụ thể trên bề mặt tế bào là một thách thức lớn vì hầu hết chúng

có số lượng quá ít không đủ để gây miễn dịch, ngoại trừ việc biểu hiện các gen tái tổ hợp Nhiều thụ thể xuyên qua màng tế bào vài lần theo dạng hình sin và không thể biểu hiện như những đoạn tái tổ hợp hòa tan

1.3.4.4 Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên tế bào gốc

Tế bào gốc có tiềm năng biệt hóa và phát triển thành các dạng tế bào khác nhau trong cơ thể động vật Đáp ứng một phần cho hệ thống sửa chữa của cơ thể, về lí thuyết tế bào gốc có thể phân chia không giới hạn để bổ sung các tế bào khác Tế bào gốc phôi người thường được thu nhận từ phôi 5-7 ngày tuổi có tiềm năng phát triển

thành tất cả các dạng tế bào Gần đây, nhiều dạng tế bào gốc đã được phân lập và xác định đặc tính Các tế bào này là một quần thể tế bào hiếm mà chúng có thể hình thành khối u mới với tất cả các dạng tế bào đặc trưng cho khối u khởi nguyên Những tế bào này có khản năng tự đổi mới và phân chia không đối xứng Tách được những tế bào gốc khối u có ý nghĩa rất lớn trong việc nghiên cứu làm sáng tỏ hoàn toàn quá trình di căn và tìm ra loại thuốc điều trị mới đặc hiệu cho ung thư [4]

1.3.4.5 Kháng thể đặc hiệu các yếu tố phát triển

Các yếu tố phát triển và biệt hóa là dạng hòa tan, nó cảm ứng tế bào phân chia

hoặc biệt hóa thông qua cơ chế sử dụng các thụ thể Các yếu tố phát triển và biệt hóa kiểm soát các quá trình sinh lý và bệnh lý cơ bản như quá trình phát triển phôi, tạo

mạch và hình thành các khối u

Khi tạo kháng thể đặc hiệu các yếu tố phát triển hoặc biệt hóa, hoạt tính trung hòa

thường được đặt ra Do vậy các kháng thể đơn dòng đặc hiệu các yếu tố này được tiến hành theo phương pháp gây miễn dịch chuẩn và kỹ thuật dung hợp, sau đó các kháng

thể có khả năng trung hòa được chọn lọc để ứng dụng cho phép thử hoạt tính

1.3.4.6 Kháng thể đặc hiệu cytokine

Các cytokine thường là các protein nhỏ hòa tan điều hòa các phản ứng viêm nhiễm và phản ứng miễn dịch thông qua cơ chế với trung gian là các thụ thể Lớp các chất miễn dịch này bao gồm các interleukin, các yếu tố kích thích quần thể, các yếu tố hoại tử khối u, yếu tố phát triển biến đổi các interpheron và các chemokine Interpheron có thể kích thích phản ứng miễn dịch kháng virus và interpheron-α tái tổ hợp đã được sử dụng khá hữu hiệu trong điều trị viêm gan B và C Các cytokine khác, chẳng hạn yếu tố gây hoại tử α là đích của các kháng thể đơn dòng điều trị nhiễm khuẩn mới

1.3.4.7 Kháng thể đặc hiệu kháng nguyên virus

Các virus là những nguồn lây nhiễm có thể gây ra những bệnh nguy hiểm đe dọa tới sức khỏe cộng đồng như cúm, viêm gan, AIDS và một số bệnh ung thư Virus có cấu tạo hạt với kích thước rất nhỏ trong đó DNA và RNA được bao bọc bởi lớp vỏ capsid Các kháng nguyên của virus nhô lên trên lớp vỏ capsid đóng vai trò quan

trọng trong việc tiếp cận, dung hợp và xâm nhiễm DNA hoặc RNA của mình vào tế bào chủ

Phản ứng miễn dịch có bản chất kháng thể hình thành là lớp bảo vệ đầu tiên giúp

tế bào chủ tránh khỏi sự xâm nhiễm của virus Các kháng thể đặc hiệu kháng nguyên tái tổ hợp là công cụ vô giá trong nghiên cứu virus và trong một số trường hợp có thể

sử dụng để tạo miễn dịch thụ động, điều trị bệnh do virus

1.3.5 Các phương pháp tạo kháng thể

Nhu cầu sử dụng kháng thể trong nghiên cứu khoa học, trong chẩn đoán và điều trị bệnh ngày càng lớn, đặc biệt là các kháng thể đặc hiệu có nguồn gốc của người Vì vậy, phương pháp chung để nhận được các kháng thể là từ động vật gây miễn dịch và sau đó nhân tính hóa để hạn chế tối đa phản ứng miễn dịch khi sử dụng

1.3.5.1 Phương pháp tạo dòng tế bào lai hybridoma

Đáp ứng miễn dịch dịch thể của cơ thể được hình thành khi có kháng nguyên xâm nhập và cảm ứng tạo ra các loại kháng thể Các kháng thể trong huyết thanh của động vật gây miễn dịch với kháng nguyên đích sau khi tinh sạch được sử dụng như một công cụ nghiên cứu rất hiệu quả và đôi khi được sử dụng trực tiếp trong điều trị Tuy nhiên các kháng thể đa dòng có tính đặc hiệu không cao, vì đó là tập hợp các kháng thể nhận biết các epitope khác nhau của kháng nguyên đích Vì vậy, việc tìm ra phương pháp tạo kháng thể đơn dòng của Kohler và Milstein đã đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu thu nhận các kháng thể đơn dòng với tính đặc hiệu cao

Phương pháp thu nhận kháng thể đơn dòng của Kohler và Milstein (1975) bao gồm các bước:

- Gây miễn dịch cho chuột bằng kháng nguyên đích

- Tạo tế bào lai bằng cách dung hợp tế bào lympho B (đã hoạt hóa bằng kháng nguyên đích là kháng nguyên đã sử dụng để gây miễn dịch) được tách từ lách chuột với tế bào myeloma của chuột

- Chọn lọc các tế bào lai có khả năng sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên đích

Sử dụng dòng tế bào lai chọn được để sản xuất kháng thể đơn dòng bằng cách tạo báng ở chuột hoặc nuôi cấy tế bào trong môi trường đặc biệt [30]

Kháng thể đơn dòng chuột : Là một kháng thể có nguồn gốc hoàn toàn từ chuột, được tạo ra theo phương pháp của Kohler và Milstein

Kháng thể đơn dòng ghép: Là kháng thể mang vùng biến đổi có nguồn gốc của chuột và vùng hằng định có nguồn gốc của người

Kháng thể đơn dòng nhân hóa: Là kháng thể mang vùng quyết định tính bổ trợ có nguồn gốc từ chuột, phần còn lại của vùng biến đổi và vùng hằng định

Kháng thể đơn dòng người: Là kháng thể đơn dòng hoàn toàn có nguồn gốc

từ người Các gen mã hóa vùng biến đổi có nguồn gốc từ người đươc chuyển vào chuột và thực khuẩn thể để sản xuất kháng thể đơn dòng người [22] Các kháng thể đơn dòng sản xuất theo phương pháp Kohler và Milstein có ứng dụng rất lớn trong nghiên cứu khoa học để xác định sự tương tác giữa các phân tử, xác định các quyết định kháng nguyên vv Tuy nhiên, khi ứng dụng trong điều trị lại gặp những trở ngại về tính hiệu quả do chúng nhanh chóng bị trung hòa Phần lớn các kháng thể đơn dòng được thử nghiệm vào giai đoạn 1980-1987 có bản chất hoàn toàn của chuột đều không thành công, ứng dụng thử nghiệm lâm sàng đối với các kháng thể dạng này đã giảm mạnh và hoàn toàn chấm dứt vào năm 2003 Vì vậy, để khắc

phục vấn đề này các nhà khoa học đã sử dụng kĩ thuật gen để tạo kháng thể đơn dòng dạng ghép và sản xuất kháng thể có bản chất của người hoàn toàn

Kháng thể dạng ghép đã làm tăng hiệu quả điều trị và làm giảm hiện tượng HAMA Trên thực tế, có 5 kháng thể đơn dòng dạng ghép đã được bán trên thị trường

ở nhiều nước để điều trị miễn dịch và ung thư, các kháng thể hoàn toàn có bản chất của người mới được nghiên cứu trong những năm gần đâu và đang trong giai đoạn thử nghiệm

Các đoạn kháng thể tái tổ hợp nhỏ, ví dụ các đoạn kháng thể đơn trị ( Fab, scFv)

và các dạng tổ hợp khác nhau đang được xem là những dược phẩm đáng tin cậy Các

tổ hợp này vẫn giữ được tính đặc hiệu hướng đích của toàn bộ phân tử kháng thể nhưng được sản xuất với giá thành rẻ hơn và có những đặc tính quý, độc nhất vô nhị với việc chẩn đoán và điều trị Các đoạn kháng thể được gắn với các tác nhân đa trị, nhiều đặc tính, gắn với các phần hoạt tính mạnh và được biến đổi để làm tăng hiệu quả trong điều trị

Các kháng thể đơn dòng gắn thêm phần độc tố được sử dụng trong điều trị ung thư rất khả quan vì chúng mang phần độc tố tế bào đến đúng tế bào đích mà không gây tổn hại đến các tế bào bình thường [14]

1.3.5.3 Phương pháp phage display

Kĩ thuật biểu lộ trên phage do G.Smith trình bày năm 1985 là kĩ thuật biểu hiện các phân tử peptide hoặc protein trong đó có cả các phân tử kháng thể được biểu lộ trên bề mặt thực khuẩn thể hình sợi Kĩ thuật này được sử dụng để nhận diện và nghiên cứu đặc tính tương tác của chuỗi polypeptide tái tổ hợp biểu lộ trên bề mặt thực khuẩn thể với các phân tử đích gắn kết với chúng (các ligand), xác định vị trí liên kết của kháng thể và thụ thể, nâng cao ái lực của các chuỗi polypeptide đối với các ligand của chúng Hai khám phá quan trọng giúp cho việc phát triển kĩ thuật phage display là:

- DNA ngoại lai gắn vào gen III của thực khuẩn thể hình sợi được biểu hiện như một protein liên kết và được bộc lộ trên bề mặt thực khuẩn thể

- Sự biểu hiện thành công các đoạn kháng thể chức năng trong khoang gian màng

của vi khuẩn E Coli

1.4 THƯ VIỆN KHÁNG THỂ BỘC LỘ TRÊN THỰC KHUẨN THỂ

1.4.1 Giới thiệu chung

Trước đây, cách gây miễn dịch ở động vật theo kỹ thuật tế bào lai đã từng được

sử dụng để tạo ra kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên (có tính đa dạng cao)

Những tiến bộ trong sinh học phân tử đã cho phép sử dụng vi khuẩn Escherichia coli

trong việc sản xuất kháng thể tái tổ hợp Với kích thước giới hạn các mảnh kháng thể như Fab, Fv, scFv không chỉ được biểu hiện trên bề mặt tê bào vi khuẩn mà còn được bộc lộ trên bề mặt thực khuẩn thể (phage) bằng cách dung hợp với protein vỏ phage [15,16]

Khái niệm phage display lần đầu tiên được giới thiệu vào năm 1985 liên quan đến sự bộc lộ các mảnh peptid nhỏ trên bề mặt phage Các mảnh peptid này được bộc

lộ như một protein dung hợp với vỏ phụ (pIII) được mã hóa trong hệ gen của thực khuẩn thể Sự liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình của phage là cơ sở của kỹ thuật phage display Khi gen mã hóa các mảnh VH và VL của kháng thể được nối với gen

mã hóa protein vỏ pIII của thực khuẩn thể trong hệ gen, thì ở dạng phage hoàn chỉnh kháng thể đơn dòng dạng đơn chuỗi (scFv) sẽ được bộc lộ trên bề mặt phage cùng với protein vỏ ở dạng tự nhiên có hoạt tính Kể từ đó, nhiều tập hợp scFv, Fab, peptid được tạo ra bằng cách bộc lộ trên phage Thông thường, một thư viện kháng thể lý tưởng gồm khoảng 109

– 1011 dòng khác nhau và thường sau 3 vòng sàng lọc, kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên đích chiếm tỉ lệ cao trong quần thể Ngày nay, các mảnh kháng thể người được bộc lộ trên phage được đặc biệt quan tâm bởi khả năng ứng dụng trong liệu pháp y học Các mảnh kháng thể bộc lộ trên phage thường được dùng nhiều nhất là scFv và Fab [9] Thư viện Fab tổng hợp và thư viện Fab tự nhiên đều được sử dụng để tạo ra các mảnh kháng thể đối với sự đa dạng của kháng nguyên [19,36] Việc biểu hiện mảnh scFv ít có ảnh hưởng độc đối với tế bào hơn là việc biểu hiện phân tử Fab [51], vì vậy nhiều nhà khoa học lựa chọn thư viện scFv hơn là thư viện Fab trong nghiên cứu của mình Tuy nhiên gần đây thư viện phage display với một đoạn kháng thể chuỗi nặng VH (sdAb) được tạo ra và cho thấy nhiều ưu điểm

Biểu hiện trong E.coli có nhiều ưu điểm hơn so với biểu hiện trong tế bào nhân chuẩn Đầu tiên, biểu hiện trong E.coli đảm bảo đủ số phân tử scFv cho quá trình sàng

lọc và hình thành đặc tính đúng của kháng thể Nhiều protein tiết của sinh vật nhân chuẩn như kháng thể đòi hỏi liên kết disulphide để đảm bảo sự ổn định của phân tử kháng thể cũng như điều kiện thích hợp cho quá trình cuộn gập phân tử kháng thể,

chẳng hạn môi trường oxy hóa trong gian bào của E.coli nơi thực khuẩn thể dạng sợi

lắp ráp

Phần virus trong kỹ thuật này thường dùng thực khuẩn thể dạng sợi M13 và họ hàng của nó, các peptide và protein cũng được biểu hiện và gắn trên bề mặt của thực khuẩn thể [31,38,46]

1.4.2 Thực khuẩn thể M13 (Phage M13)

Phage hình sợi là một nhóm virus gây nhiễm vi khuẩn lớn, chúng gây nhiễm nhiều vi khuẩn Gram âm khác nhau Đặc điểm chung của chúng là hệ gen mạch vòng đơn được bao bọc bởi lớp vỏ dài dạng ống, tương đối linh động và được cấu tạo bởi hàng nghìn bản sao của một loại protein chủ yếu và một vài loại protein thứ yếu phân

bố ở hai đầu ống [4]

Hệ gen của phage hình sợi nhỏ, có khoảng hơn 10 gen phân bố sát nhau và một vùng không mã hóa (vùng IG) chứa trình tự cần thiết cho sự nhân bản và đóng gói của phage Không giống với các virus gây nhiễm vi khuẩn khác, phage hình sợi được tổng hợp và giải phóng ra khỏi tế bào vi khuẩn chủ mà không làm tan tế bào chủ Hầu hết các thông tin về phage hình sợi đều nhận được từ các nghiên cứu về phage f1, M13, fd

và một phần nhỏ từ phage Ike Các phage f1, M13, fd đã được sử dụng để biểu lộ các chuỗi polypeptide Hệ gen của các phage hình sợi có sự tương đồng với nhau hơn 98% và các sản phẩm gen của chúng có thể thay thế cho nhau và vì vậy các phage này được gọi chung là phage Ff [4]

1.4.2.1 Cấu tạo

Cấu trúc của virion M13 đã được nghiên cứu kỹ (hình 9) M13 kiểu dại thường

có đường kính 65 Å và dài 9300 Å Virion chứa bộ gen DNA mạch đơn có độ lớn

6407 bp mã hóa cho 10 loại protein [52], trong đó có 5 loại protein cấu trúc [49] Hệ gen của virus được bao gói trong 2700 bản sao protein vỏ chính là pVIII Các phân tử pVIII, gồm 50 gốc axit amin, sắp xếp theo kiểu phủ lên nhau, tạo thành góc xiên khoảng 200 dọc theo trục chính giống như lớp vảy cá, hình dạng xoắn theo chiều từ phải sang trái Các sợi được kết giữ với nhau bằng tương tác giữa các miền kỵ nước của các tiểu đơn vị liền kề nhau và chúng tách rời nhau khi có mặt của chloroform Ngoại trừ 5 gốc đầu N bộc lộ lên trên bề mặt, phân tử pVIII hình thành xoắn α sợi đơn, liên tục Có 4 gốc mang điện tích dương phía đầu cacboxyl nằm sát mặt trong của ống vỏ và tương tác với các phân tử photphat của ssDNA phage

Các phân tử pVIII được tổng hợp dưới dạng tiền chất với trình tự tín hiệu khoảng 23 axit amin được cắt bỏ trong quá trình hiệu chỉnh thành protein trưởng thành [4] Phân tử pVIII được phân tách thành 3 vùng với chức năng riêng biệt:

+ Vùng tích điện âm ở đầu –NH2 chứa các gốc axit amin có tính axit và hình thành bề mặt ngoài ưa nước

+ Vùng tích điện dương tại đầu –COOH nằm vào phía trong ống protein của hạt virus ngay sát với DNA tích điện âm

+ Vùng kỵ nước tạo ra tương tác kỵ nước giữa các phân tử pVIII giúp cho việc tạo hình dáng và sự bền của các hạt phage

Hệ gen của phage được định hướng trong hạt phage Sự định hướng của nó được xác định bởi tín hiệu đóng gói (PS), định vị tại vùng không mã hóa IG của hệ gen Tín hiệu đóng gói (PS) mặc dù không hoàn chỉnh nhưng lại có cấu trúc kẹp tóc khá ổn định, được sắp xếp tại đầu pVII-pIX của hạt phage và là một yếu tố quan trọng, cần thiết cho việc đóng gói của ssDNA mạch vòng trong hạt phage

Ngoài các protein vỏ, M13 còn tạo ra 6 protein khác là pII, pX, pV, pI, pIV, pXI (bảng 2) [27] Chiều dài của virion phụ thuộc vào chiều dài bộ gen: bộ gen dài hơn sẽ tạo ra phage dài hơn và ngược lại

giới tớnh F của E.coli [41] Sau đú phage chuyển bộ gen của nú vào tế bào chủ và cỏc

protein vỏ gắn với màng vi khuẩn [35] Bờn trong vi khuẩn, bộ gen của phage chuyển thành DNA mạch kộp (dsDNA) nhờ cỏc enzyme của vi khuẩn và bắt đầu tổng hợp 11 protein của M13 (hỡnh 10)

Bảng 2: Các protein không đóng vai

trò cấu trúc của M13 pII 410 axit amin

Tái bản DNA

pX 111 axit amin Tái bản DNA

pV 87 axit amin Gắn ssDNA

pI 348 axit amin Lắp ráp pIV 405 axit amin Lắp ráp pXI 108 axit amin Lắp ráp

Hình 10: Chu kỳ sống của thực khuẩn thể M13 trong tế bào E.coli

Khi các protein của phage và bộ gen DNA mạch đơn tích lũy đủ trong vi khuẩn

bị nhiễm quá trình lắp ráp virion bắt đầu Các protein cấu trúc pVIII, pVII, pIX, và pIII đồng thời gắn với màng trong vi khuẩn và chờ đợi bộ gen ADN mạch đơn tái bản Khi đủ nồng độ, pV bọc bộ gen mạch đơn mới tổng hợp của phage và ngăn cản sự chuyển hóa của nó thành DNA mạch kép [17,31] Sau đó virion lắp ráp và đƣợc đẩy

ra khỏi vi khuẩn [27] Một chú ý quan trọng là thực khuẩn thể M13 không sinh tan nên tế bào chủ không bị chết sau khi nhiễm [27]

1.4.2.3 Vector tách dòng phagemid

Thực khuẩn thể M13 có 2 dạng DNA Một là dạng sợi đơn (ssDNA), dạng này

dễ dàng thu đƣợc từ thực khuẩn thể và đƣợc sử dụng để xác định trình tự Dạng thứ hai là dạng sợi kép (dsDNA – dạng sao chép giống plasmid), dạng này có thể đƣợc phân lập từ vi khuẩn chủ bị xâm nhiễm và đƣợc sử dụng để tách dòng mảnh gen đích Phagemid – một loại vector phổ biến dùng trong kỹ thuật phage display là một dạng lai của thực khuẩn thể (phage) và plasmid Các phagemid đƣợc thiết kế có chứa thêm

vùng khởi đầu sao chép cho cả thực khuẩn thể M13 và E.coli, tích hợp với vị trí tách

dòng đa điểm cắt và có thêm cả gen kháng kháng sinh [32] Tuy nhiên, chúng thiếu tất

cả các gen cấu trúc và phi cấu trúc khác mà cần thiết cho quá trình tạo phage hoàn