Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân giống cho loài lan kim tuyến (anoectochilus setaceus blume) trong giai đoạn vườn ươm

Để hoàn thiện được quy trình nhân giống cây Lan kim tuyến thì vấn đề chọn giá thể cho cây con sinh trưởng và phát triển tốt giai đoạn sau nuôi cấy in vitro là rất quan trọng.. Trên cơ

- -

LỤC MINH CHÂU

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIỆN PHÁP KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG

CHO LOÀI LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus setaceus Blume)

TRONG GIAI ĐOẠN VƯỜN ƯƠM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành: Lâm Nghiệp

Khoa : Lâm Nghiệp

Khóa học : 2012 – 2016

Thái Nguyên, năm 2016

- -

LỤC MINH CHÂU

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ BIỆN PHÁP KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG

CHO LOÀI LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus setaceus Blume)

TRONG GIAI ĐOẠN VƯỜN ƯƠM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành: Lâm Nghiệp

Lớp : K44-LN

Khoa : Lâm Nghiệp

Khóa học : 2012 – 2016

Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Trần Thị Thu Hà

Thái Nguyên, năm 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này

là trung thực và không sao chép Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Một lần nữa, tôi xin khẳng định về sự trung thực của lời cam kết trên

Thái Nguyên, tháng 06 năm 2016

Xác nhận của giáo viên hướng dẫn Người viết cam đoan

Đồng ý cho bảo vệ kết quả trước

Hội đồng khoa học

Xác nhận của giáo viên chấm phản biện

Giáo viên chấm phản biện xác nhận sinh viên đã sửa sai sót

sau khi hội đồng chấm yêu cầu

(ký, ghi rõ họ tên)

LỜI CẢM ƠN

Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm

khoa Lâm Nghiệp em đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu một số biện pháp

kỹ thuật nhân giống cho loài Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus

Blume) trong giai đoạn vườn ươm’’

Qua thời gian thực tập tại Viện Nghiên Cứu và Phát triển Lâm Nghiêp đến nay em đã hoàn thành đề tài Để đạt được kết quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Lâm Nghiệp cùng với các thầy cô trong khoa đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giảng viên PGS.TS Trần Thị Thu Hà đã tận tình hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ qúy báu của cán bộ Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên và giúp đỡ tạo điều kiện về mặt vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu

Mặc dù bản thân đã rất cố gắng nhưng đề tài của em không thể tránh những thiếu sót Em rất mong nhận được sự đóng góp của thầy cô và các bạn

để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn

Thái Nguyên, ngày…… tháng…… năm…2016

Sinh viên thực hiện

Lục Minh Châu

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vii

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT viii

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2.1 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa của đề tài 3

1.4.1 Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học 3

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Giới thiệu chung về cây Lan kim tuyến 4

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 4

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của loài cây Lan kim tuyến 5

2.1.3 Đặc điểm phân bố 6

2.1.4 Tình hình nghiên cứu về cây Lan kim tuyến trong nước và trên thế giới 7

2.2 Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật 11

2.2.1 Khái niệm 11

2.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

2.2.3 Điều kiện và môi trường nuôi cấy 13

2.3 Phương pháp nhân giống in vitro cây Lan kim tuyến 14

2.3.1 Chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy 14

2.3.2 Tái sinh mẫu 14

2.3.3 Nhân giống 14

2.3.4 Tạo cây hoàn chỉnh in vitro 15

2.3.5 Chuyển cây ra vườn ươm 15

2.4 Giá thể cho cây con giai đoạn sau in vitro 15

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG , NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 17

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 17

3 2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 17

3.3 Trang thiết bị, dụng cụ 17

3.4 Nội dung nghiên cứu 17

3.5 Phương pháp nghiên cứu 18

3.5.1 Phương pháp nghiên cứu 18

3.5.2 Phương pháp xử lý giá thể 20

3.5.3 Phương pháp xử lý số liệu 21

PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Ảnh hưởng thời gian cảm ứng ánh sáng tự nhiên đến tỷ lệ sống và sinh trưởng sau giai đoạn in vitro 22

4.2 Ảnh hưởng giá thể đối với tỷ lệ sống và khả năng sinh trưởng của cây con sau giai đoạn in vitro 24

4.3 Ảnh hưởng của chế độ dinh dưỡng và chu kỳ bón phân thích hợp cho cây con trên các giá thể sau in vitro 28

4.3.1.Ảnh hưởng của phân bón đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây sau giai đoạn in vitro 29

4.3.2 Ảnh hưởng của chế độ bón phân đến khả năng sinh trưởng và

phát triển của cây sau giai đoạn in vitro 31

4.4 Nghiên cứu cường độ chiếu sáng thích hợp cho cây Lan kim tuyến giai đoạn vườn ươm 32

4.5 Ảnh hưởng sâu bệnh hại đến cây Lan kim tuyến giai đoạn vườn ươm 34

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 4.1 Ảnh hưởng thời gian cảm ứng ánh sáng tự nhiên đến tỷ lệ sống

và sinh trưởng sau giai đoạn in vitro 22

Bảng 4.2 Kết quả ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ cây sống của cây sau

trồng 60 ngày 24

Bảng 4.3 Kết quả ảnh hưởng của giá thể đến sinh trưởng và phát triển

của cây sau trồng 60 ngày 26

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của chế độ dinh dưỡng đến sinh trưởng cây con

trên các giá thể khác nhau sau in vitro (sau 30 ngày) 29

Bảng 4.5 Kết quả nghiên cứu chu kỳ bón phân thích hợp cho cây con

trên các giá thể sau in vitro (sau 30 ngày) 31

Bảng 4.6 Kết quả nghiên cứu cường độ chiếu sáng thích hợp cho cây

Lan kim tuyến giai đoạn vườn ươm (sau 30 ngày) 33

Bảng 4.7 Kết quả nghiên cứu một số sâu bệnh hại đến cây Lan kim

tuyến trên các giá thể giai đoạn vườn ươm 34

Comment [N1]: Xem lai tên các bảng biểu đầy

đủ

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Trang

Hình 4.1 Biểu đồ ảnh hưởng thời gian cảm ứng ánh sáng tự nhiên đến tỷ

lệ sống và sinh trưởng sau giai đoạn in vitro 23

Hình 4.2 Cây Lan kim tuyến giai đoạn cảm ứng ánh sáng 14 ngày 24

Hình 4.3 Lan kim tuyến trồng trên giá thể đất 27

Hình 4.4 Lan kim tuyến trồng trên giá thể xơ dừa 27

Hình 4.5 Lan kim tuyến trồng trên giá thể xở dừa+than củi+đất 28

Hình 4.6 Lan kim tuyến trồng trên giá thể xơ dừa+bột dớn+đất 28

Hình 4.7 Ảnh cây Lan kim tuyến trồng trên giá thể đất + phân ủ hoai + mùn cưa ủ hoai 28

Hình 4.8 Biểu đồ ảnh hưởng của chế độ dinh dưỡng đến sinh trưởng cây con trên các giá thể khác nhau sau in vitro 29

Hình 4.9 Cây Lan kim tuyến không phun dinh dưỡng 30

Hình 4.10 Cây Lan kim tuyến phun phân đầu trâu 501 30

Hình 4.11 Cây Lan kim tuyến phun phân NPK 30

Hình 4.12 Cây Lan kim tuyến phun dung dịch MS/2 30

Hình 4.13 Biểu đồ kết quả nghiên cứu chu kỳ bón phân thích hợp cho cây con trên các giá thể sau in vitro 31

Hình 4.14 Ảnh cây Lan Kim tuyến chu kỳ bón phân 7 ngày và 28 ngày 32

Hình 4.15 Biểu đồ Kết quả nghiên cứu cường độ chiếu sáng thích hợp cho cây Lan kim tuyến giai đoạn vườn ươm 33

Hình 4.16 Cây Lan kim tuyến bị bệnh nấm và thối thân 34

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) thuộc họ Phong

lan (Orchidaceae), phân bố ở một số tỉnh miền núi Phía Bắc Việt Nam, Phía nam Trung Quốc và quần đảo Nam Thái Bình Dương dưới các tán rừng ẩm với độ cao 500 – 1.600 m

Lan kim tuyến được biết đến như một thảo dược quý có thể chữa được nhiều bệnh và còn tăng cường sức khỏe con người Theo y học cổ truyền Trung Hoa, Lan kim tuyến được dùng để điều trị bệnh tiểu đường, làm tan khối u, giảm lipase trong máu và chữa viêm gan Nghiên cứu về Trung y tuyên bố năm 1924: toàn thân cây thuốc được dùng để tăng cường sức khỏe, chủ trị bệnh phổi, di tinh, xuất tinh sớm, yếu gan, yếu tỳ và các vết thương do rắn cắn; ngoài ra Lan kim tuyến còn có tác dụng bổ máu, giải nhiệt [12] Ngày nay, Y học hiện đại đã phân tích và xác định được Lan kim tuyến chứa các thành phần hoạt chất có dược tính cực kì quan trọng bao gồm: Flavonoid, steroid, trierpenoids, acid amin và các loại khoáng đa vi lượng khác có thể chữa các bệnh như: trị lao phổi, ho do viêm phế quản, chấn thương, viêm dạ dày mãn tính, suy nhược thần kinh, làm khí huyết lưu thông, kháng khuẩn, đau bụng, đau ngực, viêm thận, sốt cao, đắp vết thương do bị rắn cắn… [12], [17]

Lan kim tuyến không chỉ là nguồn thảo dược quý mà còn có giá kinh tế cao Vì vậy loài cây này đã bị khai thác quá mức và đang có nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên Hiện nay, Lan kim tuyến được đưa vào danh mục các loài đang nguy cấp thuộc nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại và được xếp vào nhóm thực vật rừng đang nguy cấp (EN A1 a,c,d) trong Sách Đỏ Việt Nam 2007 [2], [3]

Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp – Trường Đại học Nông

Lâm - Đại học Thái Nguyên đã nghiên cứu thành công nhân giống in vitro Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) Để hoàn thiện được quy trình

nhân giống cây Lan kim tuyến thì vấn đề chọn giá thể cho cây con sinh

trưởng và phát triển tốt giai đoạn sau nuôi cấy in vitro là rất quan trọng Trên

cơ sở đó tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân giống cho loài Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) trong giai đoạn vườn ươm’’.tại Viện Nghiên cứu và Phát triển lâm nghiêp – Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên

1.2 Mục đích và mục tiêu của đề tài

1.2.1 Mục đích nghiên cứu

Xác định được ảnh hưởng của giá thể, liều lượng dinh dưỡng, cường

độ ánh sáng, một số sâu bệnh hại cho cây Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) giai đoạn sau in vitro để hoàn thiện quy trình nhân giống

bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào góp phần bảo tồn và phát triển loài Lan kim tuyến

1.3 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định thời gian cảm ứng ánh sáng tự nhiên đảm bảo cây có tỷ lệ

sống cao và sinh trưởng tốt sau giai đoạn in vitro

- Xác định được giá thể thích hợp cho cây con sau giai đoạn in vitro với

tỉ lệ cây sống cao, sinh trưởng tốt và phát triển tốt

- Xác định chế độ dinh dưỡng và chu kỳ bón phân thích hợp cho cây

con trên các giá thể sau in vitro

- Xác định cường độ chiếu sáng thích hợp cho cây Lan kim tuyến giai đoạn vườn ươm

- Xác định ảnh hưởng của một số sâu bệnh hại đến cây Lan kim tuyến trong quá trình sinh trưởng và phát triển giai đoạn vườn ươm

1.4 Ý nghĩa của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học

- Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp hoàn thiện được quy trình nhân

giống Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) bằng phương pháp nuôi

cấy mô tế bào thực vật phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

- Giúp sinh viên củng cố lại những kiến thức đã học , có điều kiện ứng dụng các kiến thức đã học vào thực tiễn sản xuất Từ đó giúp sinh viên trau dồi, tích lũy được kiến thức thông qua thực tiễn

- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài bước đầu đã đề xuất được một số kỹ thuật trồng và chăm sóc cây Lan kim tuyến trong giai đoạn vườn ươm góp phần hoàn thiện quy trình nhân giống cây lan kim tuyến Lựa chọn được giá thể thích hợp sẽ rút ngắn thời gian sản xuất cây giống trong giai đoạn vườn ươm, giảm chi phí,

hạ giá thành cây giống

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây Lan kim tuyến

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại

2.1.1.1 Nguồn gốc

Lan (Orchidologia) bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp cổ đại Theo Phrastus (370-285 trước công nguyên) là người đầu tiên dùng danh từ orchis trong tác

phẩn “Nghiên cứu về thực vật” để chỉ một loài lan [11]

Lobelius (1539-1616) trong nghiên cứu về thực vật và đã nêu ra những nhận xét về cây cỏ và xếp thành các họ đơn giản trong đó có họ lan [11]

Đến năm 1753, Linnaeus đã dùng danh từ orchis trong cuốn thảo mộc

Specles Platarum để chỉ các loài lan Năm 1836, John Lindely dùng danh từ

orchis dịch danh chung cho các loài lan Còn chữ orchis dùng để chỉ một loài

địa lan ở Châu Âu [11]

Ngày nay, các loài lan đã được xếp thành một họ trong hệ thống phân

loại chung gọi là Orchidaceae, lan rừng đã xác định được khoảng 750 giống

và hơn 25.000 loài và có hơn 30.000 loài lan lai (Phan Thúc Huân), 2005, [5]

2.1.1.2 Phân loại

Theo hệ thống thực vật lan Kim Tuyến được phân loại như sau:

Giới (regnum) : Plantae

Ngành (Phylum) : Magnoliophyta

Lớp (Class) : Liliospida

Bộ (ordo) : Asparagales

Họ (Family) : Orchidaceae

Chi (genus) : Anoectochilus

Loài (species) : roxburghii

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của loài cây Lan kim tuyến

2.1.2.1 Đặc điểm nhận dạng

Lan kim tuyến thuộc cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài trên mặt đất mọng nước và có nhiều long mềm, mang 2-4 lá mọc xòe sát mặt đất Lá hình trứng, gần tròn ở gốc, chóp hơi nhọn và mũi ngắn, cỡ 3-4 x 2-3cm, có màu khác nhau với dạng gân thường nhạt hơn (màu lục sẫm với mạng gân màu lục nhạt hay màu nâu đỏ với màu gân màu vàng lục hay hông) cuống lá dài 2-3cm [2]

2.1.2.2 Đặc điểm thân rễ

Thân rễ nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài Chiều dài thân rễ từ 5-12cm, trung bình là 7,87cm Đường kính thân rễ từ 3-4mm, trung bình là 3,17mm Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,03 lóng Chiều dài của lóng từ 1-6cm, trung bình là 1,99cm Thân rễ thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thường nhẵn, không phủ lông [6]

2.1.2.3 Đặc điểm của rễ

Rễ được mọc ra từ các mấu trên thân rễ Đôi khi rễ cũng được hình thành

từ thân khí sinh Rễ thường đâm thẳng xuống đất Thông thường mỗi mấu chỉ

có một rễ, đôi khi có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân rễ Số lượng và kích thước rễ cũng thay đổi tuỳ theo cá thể Số rễ trên một cây thường từ 3-10 rễ, trung bình là 5,4 rễ Chiều dài của rễ thay đổi từ 0,5-8cm,

rễ dài nhất trung bình là 6,07cm và ngắn nhất trung bình là 1,22cm, chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,82cm [6]

2.1.2.4 Đặc điểm của lá

Lá mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất Lá hình trứng, gần tròn

ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3-4cm, trung bình là 4,03cm và rộng từ 2-3cm, trung bình là 3,12cm Lá có màu nâu đỏ ở mặt trên

và phủ lông mịn như nhung Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá mặt dưới không rõ Cuống lá dài 0,6-1,2cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía

ở bẹ lá Bẹ lá nổi rõ và nhẵn Số lá trên một cây thay đổi từ 2-6, thông thường

có 4 lá Kích thước của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thường có kích thước khác nhau rõ rệt [6]

2.1.2.5 Đặc điểm của hoa

Cụm hoa dài 10-15cm, mang 4-10 hoa mọc thưa Lá bắc hình trứng, hoa thường màu trắng, dài 2,5-3cm, các mảnh bao hoa dài khoảng 6mm, môi dài 1,5cm, ở mỗi bên gốc mang 6-8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu, hốc chứa mật dài 7mm, bầu dài 1,3cm màu lục có nhiều lông mềm [2], [6]

2.1.3 Đặc điểm phân bố

Lan kim tuyến thường mọc ở dưới tán rừng nguyên sinh, hầu hết là nguyên thủy, rậm thường xanh, nhiệt đới, trên sườn núi đá granit, riclit, phiến sét, ở độ cao 500-1600m rải rác thành từng nhóm vài ba cây trên đất ẩm rất giàu mùn và lá cây rụng [2]

Ở Việt Nam, Lan kim kuyến có phổ phân bố khá rộng bao gồm: Lào Cai (Sa Pa, Liêm Phá), Hà Tĩnh, Quảng Trị, Kom Tum, Lâm Đồng, Đắk Lăk Trên thế giới: Ấn Độ, Nhật Bản, Butan, Trung Quốc, Mi-an-ma, Thái Lan, Lào, Cam-pu-chi-a, Ma-lay-xi-a, In-đô-nê-xi-a [2]

Chi lan Anoectochilus có khoảng 30-40 loài phổ biến rộng khắp các

vùng nhiệt đới từ Ấn Độ thông qua dãy Hymalaya tới các dãy núi ở Đông Nam Á, Nhật Bản, In-đô-nê-xi-a và một số đảo ở Thái Bình Dương bao gồm

cả Đài Loan [2]

2.1.4 Tình hình nghiên cứu về cây Lan kim tuyến trong nước và trên thế giới

2.1.4.1 Tình hình nghiên cứu về cây Lan kim tuyến trong nước

Hiện nay, việc áp dụng Công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật trong công tác nhân giống cây trồng nông - lâm nghiệp, cây dược liệu, cây cảnh ngày càng rộng rãi và đã thành công ở một số loài Đối với các loài cây thuốc, cây cảnh thuộc họ Lan việc áp dụng công nghệ nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô - tế bào nhằm tạo ra số lượng cây lớn có đặc điểm di truyền tốt đang được các nhà nghiên cứu và sản xuất quan tâm Sau đây là một số công trình nghiên cứu đã được công bố:

Năm 2003, tác giả Nguyễn Quang Thạch và cộng sự ở trường Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống và nuôi trồng Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis) cho thấy: Môi trường thích hợp tạo vật liệu khởi đầu từ cơ quan sinh dưỡng là VW + 100 ml/l ND + 2 mg/l IBA + 0,3 mg/l Kinetin + 10g/l đường, môi trường thích hợp tạo nguồn vật liệu khởi đầu từ hạt là VW + 100 ml/l ND+ 1g/l pepton + 10g/l đường + dịch nghiền khoai tây/cà rốt, môi trường tốt nhất cho phát sinh protocorm từ lát mỏng tế bào là VW + 100 ml/l ND + 0,5 mg/l 2,4D + 0,3 mg/l Kinetin + 10g/l đường, còn môi trường VW + 100 ml/l ND + 1g/l pepton + 10 g/l đường + 30g khoai tây+ 30g cà rốt là môi trường tốt nhất để nhân nhanh chồi và giá thể rong biển là loại giá thể thích hợp cho việc tạo ra cây và nuôi trồng lan Hồ Điệp [9]

Năm 2005, Nguyễn Quang Thạch và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu

xây dựng quy trình kỹ thuật sau In vitro cho cây địa lan kết quả nghiên cứu

cho thấy: để đảm bảo cho cây sinh trưởng phát triển tốt ngoài vườn ươm, cây địa lan in vitro phải đạt được khối lượng ≥ 1,0 gam, giá thể dớn biển thích hợp nhất để ra cây in vitro, sau 3 tháng trồng ở vườn ươm cấp I chuyển cây sang trồng ở vườn ươm cấp II với giá thể thích hợp nhất là dương xỉ

Tại Trung tâm công nghệ sinh học thực vật – Viện di truyền nông nghiệp

đã tiến hành đề tài nghiên cứu nhân giống hoa phong lan và địa lan bằng kỹ thuật nuôi cấy mô Trung tâm đã xây dựng được quy trình nhân giống phong lan và địa lan, cây con được tạo ra có chất lượng tốt (cây mập, khoẻ, rễ phát triển rất tốt, tỷ lệ sống khi đưa cây ra tự nhiên là 90%) [9]

Năm 2007, Nguyễn Thị Hồng Gấm và các cộng sự đã tiến hành Nghiên

cứu kỹ thuật nhân giống Lan Ngọc Điểm Tai Trâu (Rhychostylis gigantea)

bằng phương pháp nuôi cấy trong ống nghiệm đạt kết quả tốt Khử trùng quả lan trong 3 phút bởi cồn 70% + 5phút HgCl2 0,1% Tỷ lệ mẫu sạch là 90% Môi trường gieo hạt tốt nhất: Knudson + 30 g/l đường+ 100 g/l khoai tây + 100ml/l nước dừa +7 g/l agar + 0,3 mg/l Kinetin Tỷ lệ phôi hạt nảy mầm: 100% Môi trường nhân nhanh thể chồi: Knudson + 30 g/l đường+ 100 g/l khoai tây + 100ml/l nước dừa +7 g/l agar + 0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l IAA + 0,3mg/l NAA Hệ số nhân chồi: 4,25 Thể chồi có chất lượng tốt, có khả năng tái sinh thành chồi tốt Môi trường tái sinh chồi: Knudson cải tiến + 30 g/l đường+ 100 g/l khoai tây + 100ml/l nước dừa +7 g/l agar + 0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l IAA + 0,3mg/l NAA Tỷ lệ thể chồi tái sinh thành chồi: 91,67 % Chồi có chất lượng tốt Môi trường kéo dài chồi: Knudson cải tiến + 30 g/l đường + 100 g/l khoai tây + 100 ml/l nước dừa + 7 g/l agar + 0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l IAA + 0,3mg/l NAA + 0,2mg/l GA3 Môi trường ra rễ: Knudson cải tiến + 30g/l đường +100g/l khoai tây + 100ml/l nước dừa + 7 g/l agar + 0,1 mg/l NAA Tỷ 5 lệ cây ra rễ: 93,3% Rễ dài nhất (0,79cm sau 4 tuần và 1,43 cm sau 8 tuần) [7]

Cách huấn luyện cây: Để bình cây ở nhà kính huấn luyện trong 2 tuần, rửa sạch cây, để cây ở chỗ ẩm mát trong 5 ngày rồi mới trồng lên giá thể Tỷ

lệ cây sống: 90% sau 4 tuần, 80% sau 8 và 10 tuần trồng Cách chăm sóc cây con sau khi trồng lên giá thể phù hợp nhất: Chậu cây con được che bằng lưới đen giảm cường độ chiếu sáng còn 20%, mỗi ngày tưới phun sương 1lần [7]

Năm 2009, Phùng Văn Phê và cộng sự đã đưa ra kết quả nghiên cứu về

đặc điểm hình thái và phân bố của loài lan kim tuyến Anoectochilus setaceus

ở vườn Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc Về hình thái, Lan kim tuyến là cây thân cỏ, có thân rễ mọc dài, thân trên đất mọng nước mang 2-6 lá mọc cách Thân khí sinh và thân rễ thường nhẵn, không phủ lông, màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ Hoa tự chùm mọc ở đầu ngọn thân, trục hoa dài từ 10-

20 cm, thường phủ lông màu nâu đỏ, mang từ 4-10 hoa Mùa hoa nở tháng 10-12 Mùa quả chín tháng 12-3 năm sau Về phân bố, Lan kim tuyến tập trung ở kiểu rừng kín lá rộng thường xanh, nơi đất giàu mùn, độ ẩm và độ xốp cao, thoáng khí Có thể gặp Lan kim tuyến ở ven các khe suối, dưới tán rừng nơi ẩm ướt Tại Vườn quốc gia Tam Đảo, Lan kim tuyến được phát hiện có khu phân bố hẹp và số lượng đang bị suy giảm rất nghiêm trọng [7]

Năm 2010, Phùng Văn Phê và cs đã chứng minh rằng thể chồi loài Lan

kim tuyến - Anoectochilus roxborghii 8 tuần tuổi từ phôi hạt chín và chồi từ

thể chồi cao từ 2-3cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trường Knud

bổ sung BAP 0,5mg/l + Kinetin 0,3mg/l + NAA 0,3mg/l + ND 100ml/l + dịch chiết khoai tây 100g/l + sucrose 20g/l + agar 7g/l + AC 0,5g/l [7]

Năm 2012, Nguyễn Quang Thạch và cs đã nghiên cứu thành công quy

trình nhân nhanh in vitro loài Lan kim tuyến - Anoectochilus setaceus Môi

trường thích hợp nhất để nhân nhanh thể chồi và mắt đốt ngang thân là môi trường Knud + BAP 0,5mg/l + Kinetin 0,3mg/l + αNAA 0,3mg/l + sucrose 20g/l + than hoạt tính 0,5g/l + agar 7g/l cho hệ số nhân chồi là 6,55 chồi/mẫu

Các chồi có chiều cao từ 3-4cm được sử dụng để ra rễ in vitro Tỷ lệ ra rễ là

100% và số rễ/chồi (4,21 rễ/chồi) đạt cao nhất trên môi trường có bổ sung 1mg/l αNAA [9]

2.1.4.2 Tình hình nghiên cứu về cây lan Kim tuyến trên thế giới

Ngày nay, nghiên cứu nhân giống hữu tính các loài họ Lan bằng gieo hạt đã nhiễm nấm cộng sinh trên môi trường dinh dưỡng được thực hiện thành

công ở nhiều nước như Trung Quốc, Mỹ, Pháp Nghiên cứu nhân giống In vitro cây họ Lan phải nói đến Knudson người Mỹ công bố năm 1946, đã mở

ra công nghệ sinh học môi trường Lan Nhờ vậy đã tạo ra được khối lượng

cây lớn đồng nhất trong thời gian ngắn Ngày nay, nhân giống vô tính In vitro

đã thành công đối với nhiều chi thuộc họ Lan (Orchidaceae) như Kiếm lan

(Cymbidium), Hoàng thảo (Dendrobium), Kiều lan (Calanthe), v.v Đối với loài Lan kim tuyến (Anoectochilus formosanus Hayata) được tác giả Nguyễn Văn Kiệt thực hiện nghiên cứu nhân giống In vitro thành công tại Trường Đại học tổng hợp Quốc gia Hàn Quốc Đối với loài Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) đã được nghiên cứu chủ yếu tại Trung Quốc một cách toàn

diện cả về đặc điểm hình thái, sinh thái, công dụng, kỹ thuật nhân giống, khả năng trồng, thành phần hoá học và tác dụng sinh học [16]

Năm 2001, Yih-Juh Shiau và cs đã tối ưu hóa một phương pháp bảo tồn

Anoectochilus formosanus Hayata bằng cách tiến hành thụ phấn chéo và nuôi

cấy hạt nảy mầm Thành công của thụ phấn và đậu quả được tìm thấy là phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây đực và cây cái Số quả đậu được sau thụ phấn đạt 86,7% Những hạt 7 tuần tuổi được nuôi cấy trên môi trường1/2

MS bổ sung thêm 0,2% than hoạt tính và 8% chuối trong 4 tháng Cây nảy mầm được nuôi cấy ở môi trường ½ MS chứa BA 2mg/l trong bình nón 125ml trong thời gian 2 tháng Trước khi tiến hành thụ phấn trong ống nghiệm, cây phải có thân rễ phát triển tốt và chồi được nuôi cấy trên môi trường 1/2 MS chứa 0,2% than hoạt tính, 8% chuối, BA 2mg/l và NAA 0,5mg/l [21]

Năm 2004, Nguyễn Văn Kiệt cũng đã đưa ra quy trình nhân giống in vitro thành công cho loài Lan kim tuyến - Anoectochilus formosanus với vật

liệu ban đầu là từ chồi đỉnh tại đại học Chungbuk, Hàn Quốc Môi trường tạo vật liệu khởi đầu là H3 (Hyponex: 6,5N-4,5P-19K1g/l + 20N-20P-20K1g/l) + peptone 2g/l) Môi trường nhân nhanh là: H3 + BAP 1mg/l (hoặc 1-2mg/l TDZ) + than hoạt tính 1% [16]

Năm 2011, Lazarus Agus Sukamto và cs đã so sánh sự khác nhau giữa

Anoectochilus setaceus và Anoectochilus formosanus khi sử dụng TDZ trong nuôi cấy in vitro, họ đã tìm ra môi trường nuôi cấy A setaceus tốt nhất với TDZ là 0,1 mg/l, A formosanus với TDZ là 0,5 mg/l Số lá cao nhất của A.setaceus với TDZ 0,001 mg/l, còn A formosanus với hàm lượng TDZ là 0,005mg/l Số chồi được tạo ra trên môi trường TDZ đối với loài A setaceus

là 0,01mg/l còn với A formosanus là 0,05mg/l Số rễ cao nhất của A setaceus trên TDZ là 0,001 mg/l trong khi của A formosanus là 0,005mg/l [17]

Năm 2012, N Ahamed Sherif và cs khi nghiên cứu về loài

Anoectochilus elatus Lindley đã chỉ ra rằng số chồi tốt nhất được quan sát ở

nồng độ TDZ 3,0mg/l và chiều dài chồi đạt cao nhất ở nồng độ KIN 3,5mg/l

(với mắt đốt thân), ở 0,01mg/l đối với chồi đỉnh Anoectochilus elatus Lindley

ra rễ 100% ở môi trường có bổ sung than hoạt tính 0,3g/l [18]

2.2 Khái niệm và cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật

2.2.1 Khái niệm

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những

tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp

để tạo ra những khối tế bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm [1]

2.2.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.2.1 Tính toàn năng của tế bào thực vật

Nguyên lí cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế bào thực vật Mỗi tế bào bất kì của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ

lượng thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể Trong điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Tính toàn năng của tế bào là cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Hiện nay, người ta đã thực hiện được khả năng tạo ra một cơ thể hoàn chỉnh từ một

tế bào riêng rẽ [1], [4]

2.2.2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào

mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau Quá trình phân hóa tế bào

tế bào phôi sinh tế bào dãn tế bào chuyên hóa

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa,

ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào làm quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa

2.2.3 Điều kiện và môi trường nuôi cấy

2.2.3.1 Auxin

Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non, đặc biệt là lá đang phát triển và vùng đỉnh chồi Từ nhũng vùng này auxin được chuyển xuống các phần phía dưới của cây có vai trò quan trọng đối với sự phân chia tế bào và ra

rễ Chất auxin tự nhiên dễ thấy nhiều ở thực vật là indol axetic acid (IAA), ngoài ra còn IBA và NAA

2.2.3.3 Gibberelin

Gibberelin được phát hiện bởi nhà nghiên cứu người Nhật Bản Kurosawa (1920) nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm G Fujikuroi gây ra Hiện nay có trên 50 loại gibberelin khác nhau được ký hiệu theo thứ tự là A1, A2, A3 … trong đó A3 có hoạt tính mạnh nhất Gibberelin tồn tại trong thực vật, tham gia vào các quá trình sinh trưởng và phát triển trong sự tương tác với các chất điều hòa sinh trưởng khác

2.3 Phương pháp nhân giống in vitro cây Lan kim tuyến

2.3.1 Chọn mẫu và khử trùng mẫu cấy

Tách các vảy ra từ cây, bóc lần các lá già cho đến khi xuất hiện các mầm chồi bên mang đỉnh sinh trưởng Cắt bỏ gốc của mỗi mầm, sau đó khử trùng bằng cách ngâm trong cồn 70° trong 30 giây, rửa sạch bằng nước cất vô trùng ngâm trong dung dịch Ca(OCl)2 2% trong 25 phút, việc khử trùng được tiến hành trong tủ cấy Mô được rửa lại với nước cất vô trùng 4 - 5 lần Mỗi mầm được đặt trong đĩa petri vô trùng và cẩn thận tách các lá non Sau mỗi lần tách, nhúng mầm vào cồn 70° trong 1 giây và rửa với nước cất vô trùng Chuyển sang một đĩa petri vô trùng khác, tách các lá mầm bằng dao nhọn vô trùng Dùng kìm nhọn tách các lớp lá, cắt đỉnh sinh trưởng ra khỏi mô và cấy vào môi trường nhân giống ban đầu

2.3.2.Tái sinh mẫu

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh có định hướng sự phát triển của

mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ các hợp chất điều hòa sinh trưởng như auxin/cytokinin đưa vào môi trường nuôi cấy cũng như tuổi sinh lý của mẫu

Nhiệt độ lý tưởng để nhân giống Lan là 22°C - 26°C và tuỳ vào mỗi loài

Sau 4-8 tuần, đỉnh sinh trưởng chuyển sang màu xanh lục và tạo ra các khối tròn gọi là thể chồi Thể chồi được lấy ra khỏi môi trường cấy ban đầu, dùng dao nhọn cắt làm 4-6 miếng tuỳ kích thước của chồi Lát cắt được chuyển vào môi trường duy trì (môi trường phát triển chồi) Mỗi đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển ra một thể chồi mới sau khoảng 4 tuần, có thể cắt tiếp và cấy chuyền sang môi trường mới

2.3.4 Tạo cây hoàn chỉnh in vitro

Khi đạt đến số cây giống cần thiết, ta chuyển thể chồi sang môi trường tạo rễ (môi trường có lượng auxin tăng lên để kích thích ra rễ) Sau 3 -4 tháng, các thể chồi sẽ phát triển thành cây con

2.3.5 Chuyển cây ra vườn ươm

Cây con cao 5-7 cm và có từ 3-4 lá sau cảm ứng khoảng 2, 3 tuần có thể chuyển ra trồng, sau trồng khoảng một tuần mới được bón phân, lúc này cây

đã có đủ sức chống chọi với bệnh tật

2.4 Giá thể cho cây con giai đoạn sau in vitro

Mỗi loại lan cần một giá thể trồng khác nhau và mỗi giá thể lại cần một cách tưới bón thích hợp Ví dụ loại phong lan không thể dùng những giá thể cho địa lan hay ngược lại Sau đây là một vài công thức khá thông dụng, đem lại tỷ lệ cây sống cao, sinh trưởng và phát triển tốt

Đất mục dưới tán rừng giàu mùn và chất dinh dưỡng, tơi xốp, có khả năng giữ và thoát nước tốt rất phù hợp với sự sinh trưởng và phát triển các loài thực vật nói chung và đặc biệt loài Lan kim tuyến nói riêng [5]

Giá thể rễ cây dương xỉ thích hợp với nhiều loài lan, trong đó có Lankim tuyến, giá thể này có ưu điểm mau khô, lâu bền, nhẹ thích hợp với những rổ treo Trước đem trồng có thể xử lý như sau:

Rễ dương xỉ khô, xé nhỏ ngâm trong nước 30 phút cho ngấm no nước rồi đong vào chậu, cố trồng, ấn cho giá thể chặt vừa phải [5]

Sơ dừa dùng để lót đáy chậu hay rổ treo hoặc trồng những loại lan cần ráo nước Khuyết điểm của loại giá thể này mau khô và nhẹ cho nên chậu hay

bị đổ Vỏ dừa cắt nhỏ có hai loại vừa và nhỏ Ưu điểm là ngấm nước lâu hơn

và giữ được độ ẩm lâu hơn, nhưng phần đông các loại sơ dừa đều có nhiều mẫu ở trong, nên cần phải ngâm nước trong vài ngày, xả cho sạch rồi mới trồng được [5]

Than trồng lan không phải là thứ than đốt lò đã làm sẵn từng viên Than phải đốt từ củi dùng cho việc trồng trọt Than có ưu điểm lâu bền từ 5-6 năm mới phải thay chậu và chỉ dùng một cỡ cho đủ thứ cây lớn nhỏ Sên không vỏ không ưa sống trong than [5]

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Cây Lan kim tuyến con được lấy từ các kết quả

nghiên cứu giai đoạn nhân in vitro tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm

nghiệp – Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống, động thái tăng trưởng chiều cao, số lá, số nhánh, số rễ của cây Chế độ dinh dưỡng, cường độ ánh sáng và một số loài sâu bệnh hại đến cây Lan kim tuyến giai

đoạn sau in vitro

3 2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

- Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại nhà lưới và vườn ươm của Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp - Đại học Nông Lâm – Đại học Thái Nguyên

- Thời gian: 12/2015 – 4/2016

3.3 Trang thiết bị, dụng cụ

- Giá thể: Đất, xơ dừa, bột dớn, than củi, mùn cưa (hoai mục)

- Phân bón: Phân chuồng ủ hoai, phân vô cơ

- Dụng cụ: thước đo, máy ảnh

3.4 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Ảnh hưởng thời gian cảm ứng ánh sáng tự nhiên đến tỷ lệ

sống và sinh trưởng sau giai đoạn in vitro

Nội dung 2: Ảnh hưởng giá thể đối với tỷ lệ sống và khả năng sinh

trưởng cây con sau giai đoạn in vitro

Nội dung 3: Ảnh hưởng chế độ dinh dưỡng và chu kỳ bón phân thích

hợp cho cây con trên các giá thể sau in vitro

Nội dung 4: Xác định cường độ chiếu sáng thích hợp cho cây Lan kim tuyến giai đoạn vườn ươm

Nội dung 5: Ảnh hưởng của sâu bệnh hại đến cây Lan kim tuyến giai đoạn vườn ươm

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp nghiên cứu

* Phương pháp bố trí thí nghiệm

- Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại trồng 30 cây

- Phương pháp theo dõi: Quan sát hàng ngày, theo dõi và đánh giá sau

10 ngày, 20 ngày, 30 ngày, 40 ngày

- Các chỉ tiêu theo dõi được tính toán theo công thức sau:

+ Tỷ lệ cây sống (%)= (∑số cây sống/∑số cây đem trồng) x 100% + Động thái tăng trưởng chiều cao cây: đo chiều cao thân cây, tính từ mặt đất tới đỉnh sinh trưởng của cây, sau trồng 20 ngày đo lần 1, sau đó 10 ngày đo 1 lần, đơn vị tính là (cm)

+ Động thái ra lá, nhánh: quan sát bằng mắt, đếm số lá trên thân chính, mỗi ô thí nghiệm đếm 5 cây, sau trồng 20 ngày đếm lần 1, sau đó cứ 10 ngày đếm 1 lần Đơn vị tính là (lá)

+ Tỷ lệ ra rễ: (∑số cây ra rễ/∑số cây đem trồng) x 100%

+ Tỷ lệ sâu bệnh (%)= (∑số cây bị bệnh/∑số cây đem trồng) x 100%

Nội dung 1: Ảnh hưởng thời gian cảm ứng ánh sáng tự nhiên đến tỷ lệ

sống và sinh trưởng sau giai đoạn in vitro

Đây là giai đoạn quan trọng để huấn luyện cây con thích nghi với sự thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước khi chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang

tự dưỡng hoàn toàn

Trong quá trình nghiên cứu tôi sử dụng cây con in vitro có từ 5 - 6 lá,

chiều cao trung bình từ 5 – 6 cm

Chuyển các bình Lan kim tuyến ra rễ ra ngoài ánh sáng tự nhiên, chỉ cảm ứng ánh sáng có cường độ chiếu sáng thấp (trong nhà lưới) theo các công thức

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng thời gian cảm ứng ánh sáng tự nhiên đến tỷ

lệ sống và sinh trưởng sau giai đoạn in vitro

Cảm ứng 0 ngày (ĐC)

Cảm ứng 7 ngày

Cảm ứng 14 ngày

Cảm ứng 21 ngày

Sau đó tiến hành trồng các cây con này ra giá thể đã chuẩn bị sẵn

Nội dung 2: Ảnh hưởng giá thể đối với tỷ lệ sống và khả năng sinh

trưởng cây con sau giai đoạn in vitro

Thí nghiệm2: Nghiên cứu giá thể thích hợp cho cây con sau giai đoạn

in vitro cho tỉ lệ cây sống cao, sinh trưởng tốt và phát triển tốt

CT1: đất (đối chứng)

CT2: xơ dừa

CT3: xơ dừa + than củi + đất (1:1:0,5)

CT4: xơ dừa + bột dớn + đất (1:1:0,5)

CT5: đất + phân ủ hoai + mùn cưa ủ hoai (2:1:1)

Hình 3.1 Sơ đồ thí nghiệm bố trí kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn

Có 5 CT (1, 2, 3, 4, 5); 3 lần nhắc lại (t=5; r=3; n=5*3=15); xung quanh các ô là dải bảo vệ

Tiến hành ra cây trong nhà lưới Sử dụng chậu trồng có kích thước (20x30), có chứa giá thể dày từ 7- 9cm với mật độ 30 cây cho 1 loại giá thể

Số ô thí nghiệm n=15; mỗi công thức gồm 2 hàng; mỗi hàng 3 chậu, mỗi chậu trồng 5 cây

- Mùn cưa: xử lý vôi bột, ủ đống

- Than củi: ngâm nước

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến động thái tăng trưởng chiều cao, ra lá, ra nhánh, ra rễ của cây con sau giai đoạn in vitro

Nội dung 3: Ảnh hưởng chế độ dinh dưỡng và chu kỳ bón phân thích

hợp cho cây con trên các giá thể sau in vitro

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của liều lượng phân bón đến đặc điểm hình thái giống của cây Lan kim tuyến

Cây Lan kim tuyến trên giá thể tốt nhất ở thí nghiệm 2 được sử dụng để tiến hành thí nghiệm, mỗi công thức 30 cây, các thí nghiệm được

bố trí như sau:

CT 1 ( ĐC): Không phun dinh dưỡng

CT 2: Phân đầu trâu 501 liều lượng 0,5g/l (A1)

CT 3: Phân NPK (30:10:10) liều lượng 0,5g/l (A2)

CT 4: Dung dịch MS/2 liều lượng 0,5g/l (A3)

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của chu kỳ bón phân đến đặc điểm hình thái giống của cây Lan kim tuyến

Tôi thực hiện thí nghiệm chu kỳ bón phân dựa trên kết quả tốt nhất của thí nghiệm 4 Thí nghiệm được bố trí như sau:

CT1: Phun dinh dưỡng 1 tuần/lần

CT2: Phun dinh dưỡng 2 tuần/lần

CT3: Phun dinh dưỡng 3 tuần/lần

CT4: Phun dinh dưỡng 4 tuần/lần

Thực hiện phun dinh dưỡng trên giá thể kết hợp với tưới nước giữ ẩm Quan sát và tiến hành đo đếm các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển của cây sau

15 ngày và 30 ngày

Nội dung 4: Xác định mức che bóng thích hợp cho cây Lan kim tuyến

giai đoạn vườn ươm