Nghiên cứu xác định hàm lượng canxi trong huyết thanh phục vụ chuẩn đoán bệnh còi xương ở trẻ em

Trẻ em tuổi mẫu giáo, học sinh cấp I, thường có biểu hiện mệt mỏi, biếng ăn, gầy yếu, thường chóng mặt, đổ mồ hôi, có những trẻ em ngủ không yên giấc, đó chính là biểu hiện bệnh còi xươn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin được gửi tới TS Vũ Đức Lợi lời biết ơn chân thành và

sâu sắc nhất Thầy là người đã trực tiếp giao đề tài và tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình thực hiện đề tài giúp tôi hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị và các bạn trong Phòng phân tích Viện Hóa Học –Viện KHCN Việt Nam đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn BS,TS Nguyễn Gia Bình, Bệnh viện Quân đội 108, BS Phạm Anh Hoa, Bệnh viện Nhi Trung ương, đã giúp đỡ nhiệt tình trong khâu lấy mẫu và bảo quản mẫu Tôi cũng xin chân thành cảm ơn đơn vị cơ quan nơi tôi công tác đã tạo điều kiện để tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này

Cuối cùng tôi xin được cảm ơn những người thân yêu nhất của tôi, đã luôn động viên, cổ vũ để tôi hoàn thành tốt luận văn của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 05 năm 2013

Học viên

Hà Công Khanh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu

và kết của nghiên cứu nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công

bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Tác giả

Hà Công Khanh

XÁC NHẬN XÁC NHẬN

CỦA KHOA HÓA HỌC CỦA CHỦ TỊCH HĐ CHẤM LUẬN VĂN

TS Nguyễn Thị Hiền Lan PGS TS Lê Hữu Thiềng

MỤC LỤC

Trang

Trang bìa phụ

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục i

Danh các mục bảng ii

Danh mục các hình iii

Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt iv

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1.Khái niệm về còi xương[9] 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Triệu chứng của bệnh còi xương 3

1.1.3 Những yếu tố nguy cơ của bệnh còi xương[9] 5

1.1.3.1 Thiếu ánh sáng mặt trời 5

1.1.3.2 Chế độ ăn uống của trẻ 7

1.1.3.3 Sữa mẹ 10

1.1.3.4 Tình trạng Vitamin D của người mẹ 11

1.1.3.5 Tình trạng dinh dưỡng của trẻ 12

1.1.3.6 Nhiễm sắc tố da 13

1.1.3.7 Bệnh nhiễm khuẩn 13

1.1.3.8 Yếu tố chủng tộc 14

1.1.3.9 Một số yếu tố khác 14

1.1.4 Tổng hợp kết qủa của thế giới nghiên cứu về bệnh còi xương[9] 16

1.2 Nguyên tố Canxi 19

1.2.1 Khái niệm hoá học 19

1.2.2 Nguồn lương thực và nhu cầu 20

1.2.3 Hàm lượng canxi trong cơ thể 21

1.2.4 Chu trình của Canxi 21

1.2.5 Vai trò của Canxi 22

1.2.6 Ảnh hưởng do thừa và thiếu Canxi 22

1.3 Các phương pháp phân tích Canxi 23

1.3.1 Phương pháp xác định Ca2+ tự do 23

1.3.1.1 Phương pháp vi điện cực chọn lọc ion Ca2+ 23

1.3.1.2 Phương pháp phát quang sinh học 24

1.3.1.3 Phương pháp tác nhân tạo phức với quá trình hấp thụ hoặc huỳnh quang phụ thuộc vào Ca2+ 24

1.3.2 Phương pháp xác định tổng Canxi 25

1.3.2.1 Phương pháp phổ electron và phổ mất năng lượng electron 25

1.3.2.2 Phương pháp phát xạ tia X bởi proton(PIXE) 26

1.3.2.3 Phương pháp dùng hiển vi điện tử ion 26

1.3.1.4.Phương pháp sắc kí lỏng 27

1.3.2.5 Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử 27

1.4 Các phương pháp xử lý mẫu huyết thanh 28

1.4.1 Kỹ thuật vô cơ hoá khô 29

1.4.2 Kỹ thuật vô cơ hoá ướt ở áp suất khí quyển 30

1.4.3 Vô cơ hoá mẫu trong lò vi sóng áp suất cao 30

1.4.4 Kỹ thuật pha loãng và thay đổi thành phần nền 31

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu 32

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 32

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 34

2.2 Lấy mẫu và bảo quản mẫu 35

2.3 Trang thiết bị và hoá chất 35

2.3.1 Trang thiết bị 35

2.3.2 Hoá chất và dụng cụ 35

2.3.2.1 Hóa chất 35

2.3.2.2 Dụng cụ 36

2.4 Phương pháp xử lý số liệu[10] 36

2.5 Phương pháp phổ hấp thụ AAS[5] 38

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 43

3.1 Xây dựng quy trình phân tích Canxi 43

3.1.1 Khảo sát các điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử của Canxi 43

3.1.1.1 Lựa chọn kỹ thuật nguyên tử hóa 43

3.1.1.2 Khảo sát chọn bước sóng hấp thụ 43

3.1.1.3 Khảo sát khe đo 44

3.1.1.4 Khảo sát cường độ dòng đèn catot rỗng 45

3.1.2.Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến phép đo Canxi 47

3.1.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Natri 47

3.1.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Kali 48

3.1.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Magiê 49

3.1.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của photpho 51

3.1.2.5 Nghiên cứu loại trừ ảnh hưởng của photpho 52

3.1.3 Xây dựng đường chuẩn xác định Canxi trong huyết thanh 53

3.1.4 Đánh giá phương pháp phân tích 55

3.1.4.1 Giới hạn phát hiện của phương pháp 55

3.1.4.2 Độ chính xác của phương pháp 56

3.1.4.3 Độ lặp lại của phương pháp 56

3.3 Kết quả nghiên cứu 57

3.3.1 Kết quả nghiên cứu trên mẫu đối chứng 57

3.3.2 Kết quả nghiên cứu trên bệnh nhân còi xương 59

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

KẾT LUẬN 61

KIẾN NGHỊ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

DANH CÁC MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Sự thay đổi theo mùa và địa dư của nồng độ 25-OH-D trong huyết

thanh.( ng/ml) 6

Bảng 1.2: Nhu cầu Canxi cho cơ thể 20

Bảng 2.1: Bảng quy hoạch thực nghiệm phân tích phương sai một yếu tố 37

Bảng 2.2: Phân tích phương sai một yếu tố 37

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát bước sóng đặc trưng của Canxi 44

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát khe đo đặc trưng đo Canxi 45

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát cường độ dòng đèn catot rỗng của Canxi 46

Bảng 3.4: Các thông số tối ưu đo phổ của Canxi 47

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của Na đến độ hấp thụ của Canxi 47

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của K đến độ hấp thụ của Canxi 49

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của Mg đến độ hấp thụ của Canxi 50

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của photpho đến độ hấp thụ của Canxi 51

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của LaCl3 đến độ hấp thụ của Canxi 52

Bảng 3.10: Kết quả đo Canxi để dựng đường chuẩn của Canxi 54

Bảng 3.11: Kết quả phân tích mẫu chuẩn Canxi nồng độ 0,25 mg/l trong nền LaCl3 0,1% 55

Bảng 3.12: Kết quả phân tích mẫu chuẩn Canxi 56

Bảng 3.13: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phép đo Canxi 57

Bảng 3.14: Kết qủa phân tích hàm lượng Canxi trong huyết thanh nhóm đối chứng 58

Bảng 3.15: Kết qủa phân tích hàm lượng Canxi trong huyết thanh nhóm bệnh còi xương 60

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Sinh bệnh học của còi xương và nhuyễn xương do thiếu Canxi 9

Hình 1.2: Hậu quả của thiếu Vitamin D ở người mẹ, theo Elidrissy 12

Hình 1.3: Bệnh sinh của bệnh còi xương dinh dưỡng ở trẻ 15

Hình 2.1: Đường chuẩn phổ hấp thụ AAS 40

Hình 2.2: Sơ đồ cấu tạo nguyên tắc máy đo phổ hấp thụ nguyên tử 42

Hình 3.1 : Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của Natri đến độ hấp thụ của Canxi 48 Hình 3.2 : Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của K đến độ hấp thụ của Canxi 49

Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của Mg đến độ hấp thụ của Canxi 50

Hình 3.4: Đồ thị ảnh hưởng của LaCl3 đến phép đo Canxi 53

Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của Canxi 54

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 25 - 0H -D 3 : 25-hydroxyvitamin D 3

2 1,25 - (0H) 2 D 3 :1,25-dihydroxyl vitamin D 3

3 AAS : Atomic Absorption Spectrometry

4 ICP-MS : Inductively Coupled Plasma – Mass Spectrometry

5 F-AAS : Atomic Absorption Spectrometry

6 HCL : Hollow Cathode Lamp

7 EDL : Electrodeless Discharge Lamp

8 EPMA : Electron probe micro-analyzer.

9 EDTA : Ethylendiamin teraaxetic Acid

Mắc bệnh còi xương trẻ sẽ chậm lớn, chậm biết đi, chậm mọc răng, đầu xương bẹp, xương ngực nhô ra, trẻ quấy khóc, thóp lâu kín, rụng tóc sau gáy, ngủ không yên giấc, hay ra mồ hôi ở vùng đầu khi ngủ kể cả mùa đông Nếu nặng thì xương chậu biến dạng, hẹp lại, chân vòng kiềng hoặc hình chữ

X Trẻ em quá bụ bẫm cũng có thể còi xương vì nhu cầu Canxi cao hơn trẻ bình thường

Nguyên nhân bệnh còi xương chủ yếu do thiếu Vitamin D và chế độ ăn thiếu Canxi Vitamin D giúp tăng cường hấp thu Canxi Canxi là thành phần cấu tạo xương Khi thiếu Canxi xương sẽ xốp, mô liên kết biến đổi, quá trình này xảy ra ở trẻ em gây nên tình trạng còi xương

Trên thế giới tỷ lệ trẻ em bị mắc bệnh còi xương vẫn rất cao đặc biệt là ở các nước nghèo và kém phát triển

Ở Việt Nam, tỷ lệ này cũng còn khá cao đặc biệt trẻ em ở các tỉnh miền núi, hải đảo, các vùng khó khăn Một nghiên cứu gần đây được tiến hành trên

1263 trẻ em từ 1 – 36 tháng tuổi ở 9 xã thuộc 6 tỉnh miền núi phía Bắc bao gồm Thái Nguyên, Hà Giang, Lạng Sơn, Sơn La, Hòa Bình và Lai Châu, với các dân tộc đặc thù cho khu vực này là Sán Dìu, Mông, Tày, Thái, Giấy, Mường, Kinh, nhằm xác định tỷ lệ mắc bệnh còi xương ở trẻ em Phương pháp nghiên cứu điều tra ngang, chọn ngẫu nhiên Kết quả: Tỷ lệ còi xương ở trẻ em 1- 36 tháng tuổi ở

vùng miền núi phía Bắc là 14,4%, cao nhất ở trẻ 7-18 tháng tuổi và giảm dần theo tuổi lớn lên của trẻ Tỷ lệ còi xương ở dân tộc Mông (18,3%) và Tày (17,6%) cao hơn một cách có ý nghĩa so với dân tộc Kinh (11,2%) Tỷ lệ còi xương ở trẻ suy dinh dưỡng (20,6%) cao hơn đáng kể so với trẻ không suy dinh dưỡng (9,4%) Do đó phát hiện sớm và phòng chống bệnh còi xương ở trẻ em là một vấn đề cần được cả xã hội quan tâm

Vì những lí do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài luận văn “ Nghiên cứu xác định hàm lượng Canxi trong huyết thanh phục vụ chẩn đoán bệnh còi xương ở trẻ em ” góp phần điều trị và bổ sung dinh dưỡng hợp lí cho trẻ

Nội dung nghiên cứu chính của luận văn gồm những phần sau:

- Nghiên cứu các điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử của Canxi

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của Canxi

- Nghiên cứu và lựa chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp để định lượng Canxi trong huyết thanh

- Xây dựng quy trình phân tích chính xác hàm lượng Canxi trong huyết thanh bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử

- Đánh giá phương pháp

- Phân tích, đánh giá hàm lượng Canxi trong huyết thanh của nhóm đối chứng và trẻ mắc bệnh còi xương

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1.Khái niệm về còi xương

1.1.1 Khái niệm[9]

Còi xương là một bệnh thường gặp ở trẻ em và đã được biết đến từ lâụ không những trong y giới mà cả trong quảng đại nhân dân Bệnh còi xương do thiếu vitamin D làm cho chuyển hóa Canxi, Photpho bị rối loạn gây nên những tổn thương xương Trước đây ta cho rằng bệnh còi xương là do thiếu Vitamin D Những năm 1960 ở Trung Quốc dấy lên phong trào bổ sung Vitamin D nhằm phòng chống chứng bệnh còi xương, nhưng hơn 30 năm đã trôi qua, bệnh còi xương ở Trung Quốc không giảm được là bao mà hiện tượng ngộ độc Vitamin D xảy ra khá nhiều, những năm gần đây ta mới biết do chưa hiểu đúng về căn bệnh còi xương Thực ra, bệnh còi xương không những do thiếu Vitamin D mà quan trọng hơn cả là do thiếu Canxi Phòng chống bệnh còi xương là phải bổ sung đủ lượng canxi cho nhu cầu của cơ thể Hiện nay giáo trình của khoa nhi đã đổi tên gọi “ chứng bệnh thiếu Vitamin D” thành “ Chứng bệnh suy dinh dưỡng ”, đồng thời nhấn mạnh: Phòng chống bệnh còi xương là phải bắt đầu từ nhận thức tầm quan trọng của bổ sung Canxi

Chúng ta cần phân biệt: Bệnh còi xương và bệnh còi cọc

Trẻ còi cọc: Trẻ bị suy dinh dưỡng, có số đo về cân nặng và chiều cao đều thấp hơn trẻ bình thường, cũng có thể kèm còi xương hoặc không

Bệnh còi xương: Có thể gặp ở cả những đứa trẻ rất bụ bẫm, do nhu cầu về Canxi, Photpho cao hơn trẻ bình thường

1.1.2 Triệu chứng của bệnh còi xương[9]

Những biểu hiện thường thấy của bệnh còi xương:

Trẻ em đầu bị dị dạng, hói vùng chẩm, chậm mọc răng, chậm biết đi, nhô xương ức, lõm xương sườn, chân vòng kiềng, chân chữ bát Trẻ em khóc đêm,

bị giật mình, hay cáu gắt, bứt rứt không yên, đổ mồ hôi, nhất là lúc bú hay khóc, càng khóc thì càng đổ nhiều mồ hôi, thực ra đó là biểu hiện điển hình của chứng còi xương, trẻ còi xương thần kinh không ổn định Đó là do trẻ thiếu canxi, dẫn đến thần kinh trung ương hưng phấn quá mà có những biểu hiện bất ổn Trẻ em tuổi mẫu giáo, học sinh cấp I, thường có biểu hiện mệt mỏi, biếng ăn, gầy yếu, thường chóng mặt, đổ mồ hôi, có những trẻ em ngủ không yên giấc, đó chính là biểu hiện bệnh còi xương ở thiếu niên nhi đồng, vì sau một thời gian bị thiếu canxi thì chân tay các cháu mỏi, cơ tim co bóp kém cũng dẫn đến mệt mỏi, chóng mặt, cơ trơn của hệ tiêu hoá co bóp yếu nên trẻ chán ăn, những trẻ này thường có hình dạng đầu to, bụng to, có những trẻ xuất hiện hiện tượng nhức mỏi đầu gối, khi đi bộ thì đau tăng lên, có những trẻ khi đi nhanh hoặc chạy thì

bị ngã Tất cả những biểu hiện trên đều là đặc trưng của bệnh còi xương ở tuổi thiếu niên nhi đồng

Trẻ em ở tuổi 9-16 vẫn có nguy cơ bị bệnh còi xương Biểu hiện của bệnh còi xương ở lứa tuổi này là hình thể không có hình nét đặc trưng của tuổi thanh thiếu niên, người bệnh luôn uể oải, lười biếng, nhiều mồ hôi, bứt rứt, hay cáu, ngủ không yên giấc…

Do trẻ thiếu nhiều Canxi, suốt ngày ở trường học thời gian hoạt động ngoài trời quá ít, thiếu ánh nắng, bữa ăn sáng, bữa ăn trưa thiếu chu đáo, do đó

cơ thể thiếu Canxi trầm trọng Chúng ta cần chú ý bổ sung Canxi cho trẻ Nhu cầu phát triển cơ thể của tuổi thiếu niên nhi đồng lúc cao điểm cần 1000 mg-

1200 mg Canxi mỗi ngày mà lượng Canxi hấp thụ qua thức ăn hàng ngày chỉ đạt

400 mg/ngày (mức cao nhất), nếu không kịp thời bổ sung Canxi cho con em chúng ta thì chắc chắn bộ xương kém rắn chắc

1.1.3 Những yếu tố nguy cơ của bệnh còi xương

1.1.3.1 Thiếu ánh sáng mặt trời

- Yếu tố địa dư:

Yếu tố địa lý và khí hậu ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc bệnh còi xương Bệnh thường xảy ra và có tỷ lệ mắc cao vào những tháng mùa đông Zhou[38] cho thấy, ờ miền Bắc Trung Quốc, tỷ lệ còi xương cao hơn và bệnh cấp tính hơn vào những tháng mùa đông, nhưng thấp hơn ở các tháng mùa hè Còn ở miền Nam Trung Quốc, nơi mà thời tiết ít ảnh hưởng đến hoạt động ngoài trời thì tỉ lệ mắc bệnh theo mùa khác nhau không rõ ràng Nghiên cứu của Ghai[23] ở Ấn Độ cho thấy, tỷ lệ mắc bệnh còi xương dinh dưỡng trong những cộng đồng khác nhau phụ thuộc vào tình trạng địa lý Ánh sáng mặt trời không những thiếu mà chất lượng của nó cũng thay đổi do góc chiếu của các tia mặt trời đến bề mặt trái đất ở những vĩ độ khác nhau

Web đã chứng minh là tiếp xúc với ánh sáng mặt trời ở Boston (42 vĩ độ Bắc) trong suốt thời gian từ tháng 11 đến tháng 2 và Edmonton, Canada (52 vĩ

độ Bắc) từ tháng 10 đến tháng 3 thì không có hiệu quả chút nào trong việc tổng hợp vitamin D ở da bởi vì không có bức xạ cực tím với dải sóng từ 295 đến 310

nm trong khoảng thời gian này Người ta cũng nhận thấy trẻ em sống trong vùng

vĩ độ Bắc dễ bị còi xương vào mùa đông khi so sánh với mùa xuân, mùa hạ và mùa thu Sự thay đổi nồng độ 25 - OH-D trong huyết thanh theo mùa và địa dư

đã được chứng minh bởi một số tác giả trên thế giới ( Bảng 1.1)

Bảng 1.1: Sự thay đổi theo mùa và địa dư của nồng độ 25-OH-D

trong huyết thanh.( ng/ml)

- Phong tục tập quán, tôn giáo

Tỷ lệ còi xương ở các nước ôn đới còn cao do thiếu ánh sáng mặt trời đã được nhiều tác giả ghi nhận Nhưng ngay cả các nước có khí hậu nhiệt đới, giàu ánh nắng mặt trời tỷ lệ còi xương cũng rất cao Người ta cho rằng mặc dù được thiên nhiên ưu đãi như vậy nhưng do sự thiếu hiểu biết kết hợp với điều kiện sống thấp kém và phong tục tập quán lạc hậu đã làm hạn chế sử dụng ánh sáng mặt trời để phòng và điều trị còi xương Ở Ấn Độ, người Hindu và người theo đạo Hồi dùng mạng che cho trẻ nhũ nhi, trẻ em gái và phụ nữ đã góp phần làm tăng tỷ lệ mắc bệnh còi xương ở trẻ em và nhuyễn xương ở người lớn Tương

tự, Elzouki cho rằng tỷ lệ còi xương ở trẻ em Libi cao là do bà mẹ đã dùng mạng che kín đầu, mặt và toàn thân đứa trẻ, không cho trẻ tiếp xúc với ánh sáng mặt

trời Trang phục của người phụ nữ và phong tục che kín đứa trẻ cho đến khi trẻ được 4 tháng tuổi ở vùng Riyadh (Arâp Seut) cũng như phong tục kiêng cữ sau

đẻ đều làm hạn chế tiếp xúc của da với ánh và tạo điều kiện cho bệnh còi xương

phát triển Theo Rykin tới 72,2 % trẻ dưới 1 tuổi bị còi xương là do thiếu tiếp

xúc với ánh sáng mặt trời

- Môi trường sống:

Nhà ở chật chội, không có sân chơi, thiếu ánh sáng mặt trời là yếu tố trong bệnh sinh của còi xương ở Koet cùng những căn hộ tập thể hoặc nhà đất truyền thống, tình trạng đô thị hóa, đó là các bà mẹ và đứa trẻ luôn ở trong nhà không

có cơ hội tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng mặt trời là những yếu tố gây bệnh còi xương ở Arập seut

Còi xương xẩy ra chủ yếu ở những nơi mà điều kiện kinh tế xã hội thấp kém, tình trạng đông đúc, chật chội trong các khu nhà ổ chuột ở thành phố cũng đã được Bhattacharyya[17], Ekanem và Lawson[26] ghi nhận Trái lại, ở Trung Quốc, tỷ lệ còi xương ở nông thôn cao hơn so với ở thành thị, mặc dù ở thành thị nhà cao tầng và ô nhiễm không khí nhiều hơn đã được Zhou[38] giải thích là

do người dân thành thị được học hành nhiều hơn, nên biết cách sử dụng ánh sáng mặt trời tốt hơn và họ cũng có điều kiện hơn trong việc sử dụng các chế phẩm giầu vitamin D Tình trạng ô nhiễm môi trường, đặc biệt là ô nhiễm không khí do bụi và khói ở các thành phố lớn làm tăng tỷ lệ mắc bệnh còi xương cũng

được nêu ra ở Ấn Độ, Trung Quốc, Hồng Kông và Mỹ

1.1.3.2 Chế độ ăn uống của trẻ

Chế độ ăn uống gây nên còi xương là chế độ ăn thiếu Vitamin D, ít Canxi

và tỷ lệ canxi/phospho thấp, nhiều phytat, oxalat và chất xơ hoặc không bổ xung vitamin D vào chế độ ăn cho trẻ đặc biệt là khi trẻ còn bú Oginni cho rằng, còi xương ở Nigeria phần lớn là do thiếu canxi và Vitamin D Tương tự, Okonofua nghiên cứu 11 trẻ em Nigeria bị còi xương thấy rằng lượng canxi

cung cấp cho trẻ đều thấp hơn so với nhu cầu bình thường và chỉ cần điều trị bằng Canxigluconate thì còi xương cũng hồi phục cả về lâm sàng, sinh hoá và x.quang Tác giả cho rằng, còi xương ở trẻ em Nigeria không phải do thiếu Vitamin D mà là thiếu canxi Markestad và Kooh[25] khi nghiên cứu nồng độ chất chuyển hoá của Vitamin D trong huyết thanh ở bệnh nhân còi xương có cân nặng lúc đẻ thấp đều cho rằng thiếu hụt muối khoáng canxi và phospho là nguyên nhân gây nên còi xương ở những trẻ này Davidovits cũng thông báo một trẻ 4 tuổi bị còi xương do chế độ ăn thiếu canxi trong một thời gian dài vì

dị ứng với sữa bò và các chế phẩm sữa khác Rudolf cho rằng thực phẩm mà chứa nhiều Vitamin D thì cũng chứa nhiều canxi vì thế còi xương có thể còn do các yếu tố khác chứ không chỉ đơn thuẩn là thiếu Vitamin D Tsai và Aiken[12] nhận xét, còi xương ở trẻ đẻ non chủ yếu là do thiếu canxi và phospho Chính vì vậy mà các tác giả cho rằng, nồng độ canxi và phospho huyết thanh là những chỉ

số dự đoán còi xương và việc bổ xung canxi và phospho cho những trẻ này là rất cần thiết để phòng còi xương Còi xương do thiếu canxi cũng được Kooh[25],

Cooke[21], Lawson[26], Chan[20] đề cập đến Trong khi đó, Mc Intosh lại thất bại trong việc bổ xung muối khoáng canxi và phosphat để làm giảm tỷ lệ mắc

bệnh còi xương ở trẻ đẻ non Pettior thì cho rằng thiếu canxi không những làm nặng thêm bệnh xương chuyển hoá của trẻ có cân nặng lúc đẻ thấp, mà còn là nguyên nhân gây còi xương ở trẻ nhũ nhi mặc dù cung cấp đủ Vitamin D Tác giả đã gây được còi xương thực nghiệm trên khỉ đầu chó bằng chế độ ăn thiếu Canxi và nêu ra giả thuyết về sinh bệnh học của còi xương do thiếu Canxi như sau (Hình 1.1):

Canxi trong chế độ ăn thấp

Hấp thu Canxi giảm không đáp ứng đủ nhu cầu

Giảm Canxi ion

Tăng bài tiết PTH

Canxi niệu đổi xương

Tăng bài tiết PO4 niệu Tăng Photphat

kiềm

Giảm PO4 máu

Tăng 1,25 (OH)2D

Loãng xương Thiếu hụt khoáng hóa

Còi xương và nhuyễn xương

Hình 1.1: Sinh bệnh học của còi xương và nhuyễn xương do thiếu Canxi [9]

Gần đây, Quments và cộng sự nghiên cứu trên động vật cho thấy cung cấp

canxi thiếu làm tăng tốc độ tiêu thụ vitamin D cho nên nếu cung cấp Vitamin D

không thoả đáng thì sẽ xảy ra tình trạng thiếu Vitamin D Tỷ lệ còi xương cao trong số trẻ em châu Á nhập cư ở Anh đã được một số tác giả cho là do tập quán

ăn uống Đó là chế độ ăn chủ yếu là bột mì, ngũ cốc, nhiều axit phytic và chất

xơ, như vậy sẽ ảnh hưởng tới hấp thu Canxi

Còi xương ở những trẻ ăn chay cũng được nói đến trong nghiên cứu của Dwyer, Hellebostad, Lentze, và Ward Các tác giả đều cho là do chế độ ăn chay thiếu Vitamin D, thiếu canxi, tỷ lệ canxi/phospho thấp và nhiều phytat, oxalat cũng như chất xơ

1.1.3.3 Sữa mẹ

Tuy lượng vitamin D trong sữa mẹ thấp nhưng chủ yếu ở dạng tan trong nước Sữa mẹ có đủ lượng canxi và phospho cho khoáng hoá và phát triển xương cho nên những trẻ được bú sữa mẹ ít có nguy cơ bị còi xương, Nguyễn Văn Sơn, Đào Ngọc Diễn, Lê Nam Trà[8] cho thấy, thiếu và mất sữa mẹ là một trong các yếu tố nguy cơ của bệnh còi xương dinh dưỡng ở trẻ dưới 3 tuổi Tình trạng cai sữa sớm và không bổ sung Vitamin D là nguyên nhân còi xương dinh dưỡng của trẻ em châu Á định cư ở Anh cũng được Ward nhận xét Tại Ấn Độ,

tỷ lệ còi xương rất cao ở những trẻ được bú sữa mẹ, do nồng dộ Vitamin D trong sữa của các bà mẹ rất thấp Lapatsanis nhận thấy, tỷ lệ còi xương ở trẻ bú mẹ ít hơn hẳn so với trẻ bú chai mà không được bổ xung thêm Vitamin D Tuy nhiên, nếu trẻ chỉ dựa vào nguồn Vitamin D duy nhất từ sữa mẹ thì chưa đủ để phòng chống còi xương bởi lẽ lượng Vitamin D trong sữa mẹ rất ít (30 - 60 đơn vị/lít) Markestad nhận thấy mặc dù được bổ sung 600 - 1000 đơn vị Vitamin D một ngày và lượng 25-OH-D trong huyết thanh người mẹ bình thường nhưng những trẻ bú mẹ hoàn toàn vẫn bị mất Vitamin D dự trữ rất nhanh chóng vào mùa đông

ở Na uy Như vậy tác dụng chống còi xương của sữa mẹ chỉ có tính chất tương đối Cho nên mặc dù trẻ được bú sữa mẹ nhưng nếu không tiếp xúc đủ với ánh sáng mặt trời hoặc không được bổ sung thêm Vitamin D thì vẫn có thể bị còi

xương Lubani, Gessner, Ghai[23] cũng nhận thấy còi xương vẫn xẩy ra ở trẻ bú

mẹ do cả mẹ và con không được bổ sung thêm Vitamin D

1.1.3.4 Tình trạng Vitamin D của người mẹ

Nhiều tài liệu cho rằng nguyên nhân còi xương dinh dưỡng ở trẻ em là do tình trạng thiếu Vitamin D của người mẹ trong thời gian mang thai, 25- OH-D là dạng chủ yếu của Vitamin D trong máu qua được rau thai và nồng độ 25-OH-D trong máu dây rốn bẳng khoảng 75-80% nồng độ trong máụ người mẹ Nồng độ 25-OH-D trong máu dây rốn có mối tương quan tuyến tính với nồng độ 25-OH-

D trong máu người mẹ Belton nghiên cứu ở Anh và Ghai nghiên cứu ở Ấn Độ cũng đều cho rằng, thiếu Vitamin D ở người mẹ là nguyên nhân còi xương ở trẻ

em Tác giả cho rằng, thiếu Vitamin D ở người mẹ trong thời kỳ mang thai dẫn đến dự trữ Vitamin D của trẻ kém Sau đẻ, trẻ không có khả năng duy trì nồng

độ Canxi máu bình thường và hậu quả là giảm Canxi máu ở trẻ sơ sinh, hoặc biểu hiện muộn hơn tuỳ thuộc vào nồng độ Vitamin D trong sữa mẹ và sự tiếp xúc với ánh sáng mặt trời

Fraser cho rằng tình trạng vitamin D của những trẻ bú mẹ được xác định bởi tình trạng Vitamin D của bà mẹ trong thời gian mang thai chứ không phải thời gian cho bú Delvin bổ sung mỗi ngày 1000 đơn vị vitamin D3 cho các bà

mẹ có thai trong 3 tháng cuối đã làm cân bằng canxi nội môi của trẻ sơ sinh và làm tăng nồng độ 25-OH-D trong máu người mẹ

Garabedian thấy rằng một trong các yếu tố làm tăng tỷ lệ còi xương ở Pháp và Algerri là tình trạng Vitamin D của người mẹ thấp Theo nghiên cứu của Zhou[38], tỷ lệ còi xương bẩm sinh ở Trung Quốc từ 5-30% mà nguyên nhân chủ yếu là do thiếu Vitamin D ở người mẹ

Tương tự Ahmed cho rằng thiếu Vitamin D ở người mẹ là nguyên nhân chủ yếu của còi xương ở trẻ em Nauy Elidrissy[22] đưa ra sơ đồ giải thích hậu quả của thiếu Vitamin D ở người mẹ như sau.( hình 1.2)

Thiếu Vitamin D ở người mẹ

Trẻ sinh ra có dự trữ Vitamin D kém

- Sữa mẹ nghèo Vitamin D Mẹ ít tiếp xúc với ánh sáng

trong thời gian cho con bú

- Không tiếp xúc với ánh

sáng mặt trời

- Co giật hạ Canxi máu - Biến đổi xương

- Biến đổi xương tối thiểu

của vấn đề Walter và Bhattacharyya[17] cho rằng sự phát triển vẫn xẩy ra ở trẻ suy dinh dưỡng thậm chí ở cả trẻ suy dinh dưỡng nặng

Lawson[26] nghiên cứu bệnh nguyên của còi xương ở trẻ em Ai Cập thấy rằng, tất cả trẻ còi xương đều có kèm theo suy dinh dưỡng biểu hiện bằng cân nặng theo tuổi và chiểu cao theo tuổi giảm Còi xương ở trẻ suy dinh dưỡng cũng rất phổ biến ở Ấn Độ, Ethiopia, Nam Phi, Liby và Aicập Akanem nhận thấy, một trong các lý do làm cho tỷ lệ còi xương ở Calabar, Nigeria thấp là tình trạng dinh dưỡng của trẻ dược cải thiện bởi các thực phẩm sẵn có của địa phương

Ở Việt Nam, Lê Nam Trà, Đào Ngọc Diễn, Lê Thị Hải và cộng sự đã nêu mối liên quan giữa còi xương và suy dinh dưỡng Nguyễn Văn Sơn, Đào Ngọc Diễn, Lê Nam Trà[8] nhận xét suy dinh dưỡng là một trong các yếu tố nguy cơ của còi xương

1.1.3.6 Nhiễm sắc tố da

Nhiễm sắc tố da là sự thích nghi của con người để phòng chống bỏng nắng mặt trời ở vùng nhiệt đới Khả năng tổng hợp vitamin D của da giảm ở những trẻ nhiễm sắc tố da đã được Clemens nghiên cứu Beadle cho thấy, khả năng tổng hợp vitamin D ở da của trẻ da đen chỉ bằng 40% ở trẻ da trắng Specker nhận thấy nồng độ vitamin D3, vitamin D2, và 25-0H- D3 trong sữa các

bà mẹ da đen thấp hơn ở các bà mẹ da trắng Oliveri cũng có nhận xét, tỷ lệ mắc bệnh còi xương dinh dưỡng khác nhau ở các địa dư là do màu sắc da, vị trí địa

lý, tình trạng kinh tế và các biện pháp phòng bệnh khác nhau Còi xương phổ biến ở trẻ da đen cũng được Bhimma[18], và Chan[23] nhận xét

1.1.3.7 Bệnh nhiễm khuẩn

Còi xương và nhiễm khuẩn đặc biệt là nhiễm khuẩn đường hô hấp và tiêu hoá thường đi đôi với nhau Mariam cho thấy trong số 20 bệnh nhân còi xương nặng đều có biểu hiện viêm phổi nặng và đây là lý do làm tăng tỷ lệ tử vong của trẻ Nghiên cứu bệnh nguyên còi xương ở trẻ em Ai cập, Lawson[26] thấy 100% trẻ còi xương có kèm theo tiêu chảy hoặc nhiễm trùng hô hấp Lubani, Muhe, và

Zhou[38] cũng có nhận xét tương tự và cho rằng muốn giảm tỷ lệ mắc bệnh nhiễm khuẩn hô hấp thì phải phòng và chống bệnh còi xương Nguyễn Văn Sơn, Đào Ngọc Diễn, Lê Nam Trà[8] cũng nhận thấy, viêm phổi và còi xương có mối liên quan rất chặt chẽ và viêm phổi thường là lý do để trẻ đến viện chứ không phải là còi xương

1.1.3.8 Yếu tố chủng tộc

Yếu tố chủng tộc cũng được để cập tới trong bệnh sinh của bệnh còi xương dinh dưỡng Bhattacharrya[17] cho rằng, nếu tỷ lệ còi xương cao ở người theo đạo Hồi và người Hindu không phải do yếu tố môi trường và phong tục sống thì chỉ có thể giải thích được là do nhạy cảm về gen đối với bệnh này ElKholy nhấn mạnh đến yếu tố gen trong còi xương dinh dưỡng vì thế trẻ trai mắc bệnh nhiều hơn trẻ gái, tỷ lệ còi xương cao ở trẻ có nhóm máu A và tỷ lệ men phosphatase kiềm thường tăng cao ở trẻ trai Doxiadis cũng có nhận xét tương tự Tuy nhiên, Rashid khi nghiên cứu tình trạng Vitamin D của người châu Á định cư ở Pakistan và Specker khi nghiên cứu ảnh hưởng của chủng tộc

và chế độ ăn đến nồng độ Vitamin D và 25-OH-D trong sữa người thì cho rằng, yếu tố môi trường và chế độ ăn ảnh hưởng đến tình trạng Vitamin D chứ không phải yếu tố gen Eugster nghiên cứu còi xương ở Minnesota cũng cho nhận xét còi xương thiếu Vitamin D là do không bổ sung Vitamin D chứ không phải do chủng tộc

1.1.3.9 Một số yếu tố khác

Tình trạng kém hấp thu do bệnh tiêu chẩy, nhiễm ký sinh trùng đường ruột, thiếu axit mật cũng đóng góp vào yếu tố bệnh nguyên của còi xương Fonseca còn nêu lên vấn đề thiếu Vitamin D sau phẫu thuật cắt dây thần kinh phế vị Tác giả cho rằng tình trạng thiếu Vitamin D ở đây là do giảm cung cấp Vitamin D bởi chế độ ăn và tình trạng kém hấp thu Vitamin D do thay đổi chức năng của tụy ngoại tiết và mật sau cắt dây thần kinh phế vị

Như vậy, bệnh sinh của còi xương dinh dưỡng khá phức tạp và có sự phối hợp của nhiều yếu tố Có thể tóm tắt bệnh sinh của còi xương dinh dưỡng bằng

sơ đồ sau (hình 1.3)

Chế độ ăn Chế độ ăn Chế độ ăn nhiều xơ, Kém hấp thu

thiếu Vitamin D thiếu Canxi phytate, oxalate (tiêu chảy, giun…)

Lắng đọng Canxi ở xương kém

Mất canxi ở xương

Hình 1.3: Bệnh sinh của bệnh còi xương dinh dưỡng ở trẻ[9]

Kém hấp thu Canxi ở ruột

Còi xương với hình ảnh X quang đặc thù

Phosphatase kiềm có thể không tăng

Đáp ứng với Vitamin D thay đổi

Cần bổ sung Canxi

1.1.4 Tổng hợp kết qủa của thế giới nghiên cứu về bệnh còi xương

500 năm trước công nguyên, một nhà sử học Hy Lạp là Herodotus là người đầu tiên mô tả những thay đổi chất lượng của xương khi nghiên cứu xương sọ của người Iran và người Ai cập ở chiến trường và nhận thấy xương sọ người Ai Cập cứng trong khi đó xương sọ người Iran thì mềm Khoảng 100 năm sau công nguyên Somus đã có những mô tả đầu tiên về còi xương và cho đây là bệnh của người sống ở thành phố Gaudius Galnus (130-210 sau công nguyên) đã mô tả những biến dạng về xương đặc biệt là xương lồng ngực và xương chi ở những đứa trẻ bụ bẫm

Năm 1630, nhà giải phẫu và chỉnh hình người Anh Glisson (1597 - 1677) đã xuất bản một cuốn sách nhan đề "De Rachitide Sive Morbo Puerili" mô tả về lâm sàng và giải phẫu bệnh còi xương, được xem là công trình kinh điển về bệnh này và lẩn đầu tiên đưa ra thuật ngữ "Rachitis" mà ngày nay gọi là bệnh còi xương Vào giữa thế kỷ XVII, Daniel Whisller đã mô tả các triệu chứng lâm sàng của bệnh còi xương Năm 1822, khi quan sát thấy tỷ lệ mắc bệnh còi xương của những đứa trẻ sống ở vùng thành thị cao hơn so với ở vùng nông thôn Sniadecki cho rằng tiếp xúc với ánh sáng mặt trời là yếu tố quan trọng để phòng bệnh còi xương Vào cuối thế kỷ XIX còi xương rất phổ biến ở các thành phố công nghiệp ở châu Âu

Đầu năm 1884, Kassowitz đã lưu ý tới yếu tố mùa của bệnh Tác giả nhận thấy về mùa đông và xuân thì tỷ lệ bệnh còi xương tăng lên trong khi đó bệnh lại giảm về mùa hè - thu Năm 1885, Pommer xác lập bệnh học của còi xương qua những nghiên cứu về mô học Năm 1890 Palam đã khám phá ra còi xương

là kết quả của thiếu ánh sáng mặt trời và tỷ lệ mắc bệnh ở các vùng khác nhau là

do lượng ánh sáng mặt trời ở những vĩ độ khác nhau Tác giả còn cho rằng, yếu

tố quan trọng trong ánh sáng mặt trời là hoạt động hoá học của những tia mặt

trời hơn là sức nóng của nó và đề nghị sử dụng biện pháp tắm nắng để phòng và điều trị còi xương

Những năm đầu của thế kỷ XX, một vài giả thuyết đã đề cập đến bệnh nguyên của còi xương Edleisen, Kooh[25] nhìn nhận còi xương là bệnh nhiễm khuẩn trong khi đó Siegert và Sambon cho còi xương là bệnh di truyền

Năm 1909, Schmor đã chứng minh bệnh còi xương thay đổi theo mùa, tỷ lệ mắc bệnh cao nhất vào giữa tháng 11 và tháng 5 Tác giả cũng nghiên cứu cấu trúc mô học của còi xương và mở ra con đường cho nghiên cứu thực nghiệm xa hơn Năm 1914 Funk đã thông báo còi xương có thể do thiếu các chất nào đó trong chế độ ăn Tuy nhiên, phải đến năm 1918 Meilanby mới gây được thực nghiệm còi xương bằng một chế độ ăn thiếu "yếu tố phụ" Tác giả cho rằng "yếu

tố phụ" này có nhiều trong sữa mẹ, dầu gan cá Tuyết, nhưng có rất ít trong sữa

đã tiệt khuẩn và trong ngũ cốc

Năm 1919, Ủy ban nghiên cứu Y học Anh tuyên bố rằng còi xương là bệnh

do thiếu hụt một chất chống còi xương trong chế độ ăn Cũng trong thời gian này Iversen và Lenstrup đã mô tả những thay đổi nồng độ Phospho và Canxi trong máu bệnh nhân còi xương

Tỷ lệ còi xương vẫn tiếp tục tăng cao ở đầu thế kỷ XX và đặc biệt là trong và sau chiến tranh thế giới lần thứ nhất

Về điều trị ngay từ thế kỷ XVI, Darle - Percival (1782), Guerin(1838), Lesne

và Trousseau đã sử dụng dầu gan cá Moru để điều trị bệnh còi xương Mellanby sau này cho rằng tác dụng chống còi xương của dầu gan cá Moru là do trong đó

có chứa một loại vitamin mà lúc bấy giờ người ta cũng chỉ mới biết được Vitamin A, cho nên tác giả cũng cho rằng vitamin A có tác dụng chống còi xương Báo cáo đầu tiên về sử dụng bức xạ cực tím trong điều trị còi xương là của Huldschinsky năm 1919 Mãi cho đến năm 1922 Mc Collum và cộng sự mới chứng minh được rằng tác dụng chống còi xương của dầu gan cá không phải do

vitamin A, mà do một vitamin khác, tác giả đặt tên cho nó là vitamin D Do việc phát hiện ra vitamin D người ta đã có một sự thống nhất trong việc điều trị còi xương bằng chế độ ăn uống và ánh sáng mà trước đó đã không kết hợp được Ngoài dầu cá, Hess, Steenbock và Black còn thấy các thức ăn khác có thể chống được bệnh còi xương sau khi chúng được chiếu tia cực tím và thậm chí nếu chiếu tia cực tím trên da thì chính cơ thể tạo ra được một chất chống bệnh còi xương Năm 1927, Windaus đã tách được các chế phẩm Ergosterol tinh khiết có tác dụng chống còi xương Năm 1930, Bourdillon đã tách được vitamin D tinh thể nguyên chất Windaus đã tìm ra cấu trúc hoá học của vitamin D2 và vitamin

D3 vào năm 1936 Năm 1968, Blunt đã cô lập được chất chuyển hoá của vitamin

D3 ở trong máu và xác định cấu trúc của nó là 25-hydroxyvitamin D3(25-0H-D3) Đây là sản phẩm chuvển hoá đầu tiên của Vitamin D và cũng là tiền thân của các dạng Vitamin D hoạt tính khác Năm 1968, Haussler là người đầu tiên phát hiện ra một chất chuyển hoá đa cực hơn là 25-0H-D3 và coi đây là dạng hoạt tính tổ chức của vitamin D Chất chuyên hoá đó sau này được tách ra từ ruột gà

và được Holick xác định là 1,25–dihyđroxyl vitamin D3(1,25-(0H)2 D3) vào năm

1971 Năm 1972 Deluca và cộng sự đã tổng hợp được 1,25-dihydroxyl vitamin

D3 (1,25- (0H)2D3) Năm 1973, Holick và cộng sự tổng hợp được dihydroxyl vitamin D Từ đó cho tới nay có nhiều công trình nghiên cứu về cấu trúc hoá học cũng như tác dụng sinh học của các chất chuyển hoá của Vitamin D trong bệnh còi xương

Tuy nhiên vào những năm 30 của thế kỷ XX người ta lại nhận thấy ở một số trẻ mặc dầu được điều trị bằng Vitamin D nhưng bệnh còi xương vẫn tiến triển Những công trình đầu tiên vể còi xương kháng Vitamin D đã được Bomschauer, Stearns, Wilson, Shelling, Mc Cune và Halberstman công bố, nhưng còn có tính chất lẻ tẻ từng trường hợp Cho đến năm 1937, khi Albright, Butler và Bloomberg công bố về bệnh còi xương giảm phospho máu có tính chất gia đình

thì thuật ngữ bệnh còi xương kháng Vitamin D mới được dùng rộng rãi Cũng trong thời gian này một loạt các nghiên cứu của Van Crefeld, Arons(1957), Salter(1958), Royer(1960) đã nêu ra một loại còi xương khác với còi xương kháng Vitamin D giảm phospho máu có tính chất gia đình bởi các triệu chứng lâm sàng sinh học cũng như đáp ứng điều trị Nhờ nghiên cứu của Prader, Illig

và Heierli (1961) mà còi xương giả thiếu vitamin D được xác định rõ như là một dạng mới của còi xương kháng Vitamin D có tính chất gia đình

Rối loạn chức năng các bộ phận trong bệnh còi xương cũng được Flechter (1910), Apert (1928), Detoni (1933), Debre (1934), Fanconi (1936), Albright (1935), Lowe (1952) nghiên cứu và các tác giả cho rằng nguyên nhân các bệnh còi xương kháng vitamin D là do bộ phận đích không cảm thụ hoặc kháng lại vitamin D Vì vậy một số thuật ngữ khác dùng để chỉ các bệnh còi xương kháng vitamin D như bệnh còi xương thận, còi xương ruột, còi xương mật ra đời Sau này, nhờ những thành tựu nghiên cứu về chuyển hoá Vitamin D mà nhiểu cơ chế bệnh sinh của các bệnh còi xương

Ở Việt Nam cũng có rất nhiều công trình nghiên cứu về bệnh còi xương như các tác giả Lê Nam Trà, Đào Ngọc Diễn, Nguyễn Công Khanh, Lê Thị Hải, Đặng Phương Kiệt, Nguyễn Văn Sơn[8], [9], [11],… đã nêu ra được các vấn đề liên quan của bệnh đặc biệt đã đưa ra được mối liên hệ giữa hàm lượng Canxi trong cơ thể và bệnh còi xương

1.2 Nguyên tố Canxi

1.2.1 Khái niệm hoá học[7]

Canxi là khoáng tố cần thiết cho hoạt động sự sống của cơ thể con người,

là nguồn trao đổi chất của cơ thể Hoạt động sự sống của con người như sự truyền dẫn của vật chất thần kinh, nhịp đập của tim, co rút của cơ, khớp đùi, lưng đau… đều là đang tiêu hao Canxi

1.2.2 Nguồn lương thực và nhu cầu[7]

Canxi có trong hầu hết các loại thực phẩm với hàm lượng khác nhau, nhưng một phần đáng kể nguyên tố này có thể được đưa vào cơ thể qua đường nước uống đun sôi Thực phẩm chứa nhiều canxi nhất là sữa, các loại đậu tương, pho mai trắng, đậu phụ, các loài rau xanh sẫm, cá, các loài thuỷ hải sản, xương các loại động vật, sau đó trong các loại xơ

Nhu cầu canxi mỗi ngày ở người trưởng thành khoảng 800 – 1000mg, người cao tuổi khoảng 1000 – 1200mg Nhu cầu Canxi của cơ thể là không giống nhau

và phụ thuộc vào độ tuổi, giới tính Mang thai, cơ thể phát triển, tuổi già làm tăng nhu cầu Canxi của con người

Bảng 1.2: Nhu cầu Canxi cho cơ thể

70 tuổi lượng Canxi giảm là 50%, dẫn đến thiếu Canxi trong cơ thể

Hiện nay, mọi người đã nhận rõ một thực tế đáng quan tâm là: cơ thể thiếu chất Canxi đang là hiện tượng rất phổ biến

Kết quả điều tra cho thấy:

Lượng Canxi hấp thụ của dân chúng vùng kinh tế phát triển khá là:

Vậy mỗi ngày lượng Canxi cần cho mỗi người là bao nhiêu ?

Theo tổ chức y tế thế giới WHO:

Trẻ em dưới 7 tuổi: 1000mg/ngày

Người lớn: 800mg/ngày

Phụ nữ có thai và người cao tuổi: 1200mg/ngày – 1500mg/ngày

Vậy là người dân thiếu trên 50% lượng Canxi cần thiết cho nhu cầu của cơ thể

1.2.3 Hàm lƣợng canxi trong cơ thể[7]

Tổng lượng Canxi trong cơ thể người chiếm khoảng 1,5% thể trọng, 99% Canxi trong cơ thể tập trung trong xương và răng Ngoài ra, 1% còn lại chứa trong máu và trong các tổ chức dưới dạng Canxi tự do hoặc kết hợp, có tác dụng cực kỳ quan trọng đối với việc duy trì tính ứng phó nhanh nhạy của thần kinh và cơ bắp, sự dính kết của các tế bào, sự truyền dẫn xung động thần kinh, nhịp đập của tim Ngoài ra, Canxi còn tham dự vào quá trình làm đông máu Trong cơ thể người khi thiếu Canxi sẽ kéo dài thời gian đông máu, trường hợp bị thương sẽ chảy máu không dứt, vì không đông lại để bịt kín

miệng vết thương

1.2.4 Chu trình của Canxi[7]

Bộ xương của cơ thể đóng vai trò như một “ngân hàng” Canxi Cơ thể liên tục lấy Canxi từ xương để đưa vào máu rồi từ đó “luân chuyển” khắp cơ thể nhằm bảo đảm vận hành các chức năng thiết yếu của mình Khi chúng ta ăn một

miếng pho mai, uống một ly sữa hoặc dùng một viên thuốc bổ sung Canxi, Canxi sẽ được đưa vào đường tiêu hóa và được hấp thu với sự tham gia của Vitamin D Từ ruột Canxi vào máu một phần được sử dụng cho các chức năng

cơ thể như đã nói ở trên, phần còn lại sẽ được “gửi” vào xương Ở trạng thái cân bằng, mỗi ngày cơ thể chúng ta rút Canxi khỏi xương bằng với lượng Canxi được gửi vào đó Như vậy khối xương được giữ ổn định cùng với dòng Canxi liên tục ra vào

1.2.5 Vai trò của Canxi[7]

Canxi giúp phân chia tế bào, điều hòa co và dãn cơ, giữ cho tim đập và não bộ làm việc Ngoài ra, Canxi tham gia kiểm soát huyết áp, và là yếu tố cần thiết trong sự đông máu cho cơ thể Protein và dưỡng chất từ bên ngoài vào bên trong tế bào để được sử dụng cũng cần sự tham gia của Canxi Các nghiên cứu gần đây cho thấy, Canxi có thể bảo vệ quả tim khỏi bị thiếu máu nuôi, và thậm chí có thể ngăn ngừa một số loại ung thư Chính vì vai trò thiết yếu của Canxi trong hoạt động sống của cơ thể như vậy, cơ thể bằng mọi cách phải duy trì lượng Canxi trong máu ổn định để từ đó cung cấp cho những nơi có nhu cầu Do

đó, nếu bạn không cung cấp đủ Canxi thỏa mãn nhu cầu cơ thể từ bên ngoài qua đường ăn uống, cơ thể bạn sẽ rút Canxi từ một kho Canxi, đó là xương

1.2.6 Ảnh hưởng do thừa và thiếu Canxi[7]

Ở mỗi giai đoạn tuổi tác thì triệu chứng thiếu Canxi biểu hiện khác nhau Phụ nữ sau khi mang bầu, thai nhi trong tử cung rất cần canxi cho sự phát triển, sinh trưởng, lượng Canxi cần cho mỗi ngày là 1500mg Nếu lượng Canxi bổ sung không đủ, thai nhi biểu hiện các triệu chứng mềm xương, bà mẹ đang trong thời kỳ cho con bú mỗi ngày cần hấp thụ đủ 2000mg Canxi, để cung cấp cho sự phát triển bình thường của thai nhi Trẻ em thiếu Canxi sẽ biểu hiện sự phát triển của xương bị trở ngại, cơ thể nhỏ, thấp, chân đi vòng kiềng hoặc khoèo tréo chân Người lớn thiếu Canxi thường biểu hiện bằng triệu chứng cơ bắp bụng

chân dưới bị chuột rút, chân tay bị co quắp Người già thiếu Canxi thường biểu hiện bằng triệu chứng loãng xương, dễ phát sinh chất xương tăng sinh

Có mấy nguyên nhân sau dẫn tới cơ thể bị thiếu Canxi:

Một là lượng Canxi chứa trong đồ ăn thức uống 3 bữa trong ngày quá ít,

cung cấp không đủ

Hai là hàm lượng Canxi trong thực phẩm tuy khá cao, nhưng do

thành phần thực vật trong thực phẩm cao, chất béo cao, protein lại hơi thấp, ảnh hưởng tới quá trình hấp thụ Canxi

Ba là với người mắc các chứng bệnh tiêu chảy mãn tính, rò mật, tiêu hóa

kém, hấp thụ Canxi sẽ kém

Khi cơ thể hấp thu quá nhiều Canxi, thận sẽ phải làm việc nhiều để thải lượng dư thừa, lâu ngày sẽ gây sỏi thận, khớp vai, canxi hóa động mạch, nhất là đối với phụ nữ mang thai Thai phụ thừa Canxi và Vitamin D làm cho thai nhi có khả năng bị thừa Canxi trong máu, sau khi ra đời, thóp kín quá sớm, xương hàm rộng và nhô ra, động mạch chủ bị thu hẹp, vừa không có lợi cho sức khoẻ, vừa ảnh hưởng đến vẻ đẹp sắc mặt của đời sau Lượng Canxi thừa lắng đọng ở bánh rau , làm giảm sự trao đổi chất với thai nhi, khiến thai kém phát triển Người mẹ uống quá nhiều Canxi còn có thể bị sỏi đường tiết niệu, đặc biệt là sỏi thận

1.3 Các phương pháp phân tích Canxi

1.3.1 Phương pháp xác định Ca 2+ tự do

1.3.1.1 Phương pháp vi điện cực chọn lọc ion Ca 2+

Các điện cực chọn lọc ion với lớp màng chọn lọc ion tại đầu điện cực được chế tạo từ một micropipet (đường kính ngoài 0,1 – 1 µm) Màng chọn lọc Ca2+

được chế tạo từ gel polyvinyl clorua có chứa tác nhân tạo phức chọn lọc với

Ca2+ tan trong gel polyme Một tác nhân tạo phức thường được sử dụng là “ETH 1001” và sử dụng thêm một điện cực so sánh tương tự Để tiến hành các phép đo bên trong điện cực, điện cực so sánh phải được chế tạo từ một micropipet bên

trong chứa gel chất điện giải Thông thường các điện cực chọn lọc ion và điện cực so sánh được kết nối thông qua một vi điện cực hai khoang Toàn bộ hệ thống có đưa vào trong tế bào bề ngang là 30 – 50 µm sử dụng một máy vi thao tác Vi điện cực Ca2+

sẽ được sử dụng để xác định các nồng độ Ca2+ tới khoảng

10-8 M Tuy nhiên, một nhược điểm của kỹ thuật này là thời gian phản hồi chậm, thường trong vài giây hoặc vài phút, khiến cho quá trình xác định nhanh những chuyển biến nồng độ rất khó theo dõi

1.3.1.2 Phương pháp phát quang sinh học

Một vài cơ quan sinh vật sống có thể phát ra ánh sáng Hệ thống phát sáng như trong sứa (Aequorea) là một protein gọi là aequorin (Mr ≈ 20 kDa) Ánh sáng phát ra khi trạng thái có năng lượng cao có chứa nhóm giả (coelenterazine) trở về trạng thái cơ bản trong một phản ứng hóa học được kích thích bởi ion

Ca2+ Nếu nồng độ Ca2+

nhỏ hơn ~ 0,3 µM thì quá trình phát xạ yếu nhưng trong khoảng nồng độ 0,5 – 10 µM thì quá trình phát xạ là một hàm phụ thuộc vào nồng độ ([Ca2+

]2,5) Phản hồi với quá trình chuyển biến nồng độ Ca2+

rất nhanh ( tại nhiệt độ phòng) và ánh sáng phát xạ có thể đo được chính xác cho dù ở mức

độ yếu bằng thiết bị khuếch đại hình ảnh hoặc bộ đếm photon Để xác định nồng

độ Ca2+

trong tế bào, aequorin được bơm vào

1.3.1.3 Phương pháp tác nhân tạo phức với quá trình hấp thụ hoặc huỳnh

Năm 1980 R Y Tsien đã phát minh quá trình tổng hợp và các tính chất phổ của một vài phẩm nhuộm tetracarboxylat mới có ái lực mạnh và độ chọn lọc cao với Ca2+ Tất cả các thuốc thử này đều có vùng hấp thụ UV cao và phụ thuộc vào việc Ca2+

có ở dạng liên kết hay không, một vài loại khác có huỳnh quang phụ thuộc vào nồng độ Ca2+

Các phức này có thể được tế bào hấp thụ thành dạng tetraeste vào trong tế bào, sau đó nhanh chóng bị thủy phân do tác dụng của enzim để trả lại các anion có liên kết với Ca2+

Các phức huỳnh quang

tetracarboxylat có độ chọn lọc tốt với Ca2+

như “BAPTA”, “Quin-2”, “Fura-2” Các phức này rất thích hợp cho việc xác định các nồng độ Ca2+ trong khoảng 1

µM tới 10 nM trong sự có mặt của 1 mM Mg2+ và 100 mM Na+ và K+

Ngược phổ phát xạ của Fura -2 có các đỉnh peak trong vùng 505 – 510 nm, ít khi dịch chuyển khi Ca2+

ở dạng liên kết, phổ hấp thụ dịch chuyển sang vùng bước sóng ngắn Khi nghiên cứu xác định nồng độ Ca2+ tự do cần có so sánh tại bước sóng kích thích 350 nm và 385 nm, sau đó đo tỉ lệ cường độ huỳnh quang tại ~ 510 nm

1.3.2 Phương pháp xác định tổng Canxi

Hàm lượng tổng Ca trong mẫu sinh học có thể xác định được bằng nhiều phương pháp khác nhau như Phương pháp phổ electron và phổ mất năng lượng

electron, Phương pháp phát xạ tia X bởi proton, phương pháp chuẩn độ, phương

pháp sắc ký ion Tuy nhiên, phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử là lựa chọn tốt nhất

1.3.2.1 Phương pháp phổ electron và phổ mất năng lượng electron

Khi một chùm electron trong một kính hiển vi electron chiếu tới bề mặt mỏng mẫu, một số nguyên tử trong mẫu sẽ bị kích thích hoặc ion hóa, và khi trở lại trạng thái ban đầu sẽ phát xạ các chùm tia X Phát xạ tia X tại các bước sóng khác nhau có thể đo được bằng đầu dò nhạy năng lượng photon Đây chính là cơ

sở của phương pháp phân tích hiển vi tia X kích thích electron (EPMA) Các electron đi xuyên qua mẫu, cho các hình ảnh truyền qua trên kính hiển vi electron, mất năng lượng phụ thuộc vào bản chất (tới một mức độ nào đó, trạng thái hóa học) và sự phân bố của các nguyên tố khác nhau Kết quả của các hiện tượng này là cơ sở của phương pháp phổ mất năng lượng electron (EELS)

Kỹ thuật EPMA được áp dụng để xác định Ca trong các mẫu sinh học, đặc biệt là các mẫu mô mà không cần phân hủy mẫu Thông thường mẫu được làm

lạnh nhanh và cắt bản mỏng tại nhiệt độ thấp (-130 °C) để bảo toàn vị trí in vivo

của các ion và phân tử khuếch tán Độ phân giải là 10 nm hoặc tốt hơn với các vùng mẫu khô lạnh bề dày ≥ 100 nm Giới hạn phát hiện là xấp xỉ 0,3 mmol

Ca/kg mẫu khô (10 ppm) Nồng độ Ca của mitochondria và endoplasmic

reticulum trong tế bào gan của chuột được xác định bằng EPMA

EELS có ưu điểm là độ phân giải không gian cao hơn EPMA, 1 tới 2,5 nm Tuy nhiên EELS ít được áp dụng hơn so với EPMA do hai nhược điểm chính là ảnh hưởng nền lớn và nhạy với bề dày của mẫu

1.3.2.2 Phương pháp phát xạ tia X bởi proton(PIXE)

Mẫu phân tích được chiếu chùm proton có năng lượng cao (1 tới 4 MeV) sẽ phát xạ các tia X đặc trưng giống như trong EPMA Ưu điểm của phương pháp này là các proton có xu hướng tương tác với nguyên tử do vậy kích thích nguyên

tử phát xạ tia X Do đó độ nhạy xác định từng nguyên tố trong phương pháp PIXE cao hơn so với EPMA và EELS

Phương pháp PIXE cho phép xác định đồng thời nhiều nguyên tố trong cùng một mẫu Tuy nhiên các ứng dụng trong phân tích sinh học còn khá hạn chế

1.3.2.3 Phương pháp dùng hiển vi điện tử ion

Kính hiển vi điện tử là một kỹ thuật có khả năng xác định tất cả các nguyên

tố ở mức độ ppm Cơ sở của phương pháp này là làm đông cứng mẫu, phân cắt lạnh, làm khô lạnh và đặt trên một nền dẫn điện trong khoang chân không, đặt dưới tác động của chùm ion (ví dụ D2

+

hoặc Ar+) Các ion này sẽ tách bỏ 2 hoặc

3 lớp nguyên tử bề mặt mẫu bằng kỹ thuật tương tác bắn phá Một phần các nguyên tử được giải phóng có thể tồn tại ở dạng ion Các dòng ion thứ cấp này

sẽ được gia tốc trong thiết bị phổ khối, sau đó chúng được phân tách dựa theo tỉ

lệ khối lượng/điện tích Thiết bị quang ion được thiết kế để bảo toàn độ phân giải không gian của các ion thứ cấp phát xạ và hình ảnh của nguyên tố trong

1.3.1.4.Phương pháp sắc kí lỏng

Người ta đã xác định hàm lượng Canxi trong huyết thanh bằng phương pháp sắc kí lỏng Dưới các điều kiện cột và thành phần pha động và nhiệt độ thích hợp, các ion sẽ chuyển động dọc theo cột sắc kí và thiết lập trạng thái cân bằng Tại các giá trị pH khác nhau, các ion này sẽ tách ra khỏi nhau Nồng độ của Canxi trong huyết thanh được xác định bằng phương pháp phân tích dòng chảy sử dụng detector đo quang với chất chỉ thị Erio đen T Bằng phương pháp này người ta đã xác định được nồng độ các ion ở bước sóng 520 nm tại các giá trị pH là 10,1 và 10,5 Kết quả thu được với độ lệch chuẩn là ±2% và có thể phân tích tới 120 mẫu/giờ, rất thích hợp cho phân tích mẫu hàng loạt Các nhà khoa học Nhật Bản[34] đã dùng phương pháp trao đổi ion và sắc kí ion để phân tích hàm lượng Canxi trong protein ở dạng tự do và dạng liên kết Với chất chỉ thị EDTA ở pH 6,5 và dùng detector dẫn điện Các phương pháp này còn được dùng để xác định nồng độ Canxi trong máu, sữa và trứng Người ta thấy rằng phương pháp này đều cho kết quả tốt, trong đó bằng phương pháp sắc kí trao đổi ion cho độ lệch chuẩn với Na là 0,9%; với K là 1,0%; với Ca là 0,05% và với

Mg là 0,1%

1.3.2.5 Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử

Phương pháp hấp thụ nguyên tử ngọn lửa cũng được sử dụng rất rộng rãi

để xác định nồng độ Canxi trong huyết thanh[35],[37] Bằng sự kích thích của ngọn lửa, các nguyên tố sẽ hấp thu năng lượng ứng với các bước sóng thích hợp

mà nó có thể phát ra trong quá trình phát xạ Phương pháp này có thể phân tích được rất nhiều nguyên tố ở dạng tự do và dạng liên kết Theo [28], phương pháp sắc kí trao đổi ion được dùng để xác định hàm lượng tổng của các nguyên tố K,

Ca, Mg trong huyết thanh và so sánh hiệu quả với phương pháp phát xạ nguyên

tử và phương pháp hấp thụ nguyên tử Người ta thấy rằng phương pháp này cho kết quả tốt, độ lệch chuẩn với Canxi là 1,3%

Như vậy để phân tích hàm lượng Canxi trong huyết thanh có thể lựa chọn rất nhiều phương pháp khác nhau Với mỗi phương pháp đều có những ưu điểm

và nhược điểm riêng Các phương pháp trao đổi ion, sắc kí, phân tích dòng chảy….có thể cho độ chọn lọc cao, thời gian phân tích ngắn và xác định được hàng loạt mẫu nhưng chúng thường chỉ xác định được nồng độ các nguyên tố ở dạng tự do vì thế độ chính xác không lớn hơn nữa giá thành còn cao Phương pháp hấp thụ nguyên tử có thể áp dụng cho nhiều nguyên tố khác nhau, xác định được tổng hàm lượng các nguyên tố ở cả dạng tự do và dạng liên kết, có thể phân tích hàng loạt mẫu trong thời gian ngắn và giá thành hợp lí Nồng độ của các nguyên tố cần phân tích trong huyết thanh là rất nhỏ nên cần chọn phương pháp phân tích có giới hạn định lượng càng nhỏ càng tốt, phương pháp hấp thụ nguyên tử thoả mãn được điều kiện này và cũng cho độ chính xác cao

1.4 Các phương pháp xử lý mẫu huyết thanh

Để xác định hàm lượng canxi trong các mẫu sinh học, nhiều kỹ thuật phân tích cần phải vô cơ hoá mẫu trước khi phân tích Một số phương pháp ôxy hoá

đã được nghiên cứu, phần lớn sử dụng các axit có tính ôxy hoá hoặc persulfat Tuy nhiên việc đánh giá hiệu quả của quá trình ôxy hoá vẫn ít được thực hiện

Để quá trình ôxy hoá triệt để, người ta thường sử dụng tác nhân ôxy hoá là hỗn hợp các axit sulfuric và nitric, hoặc hỗn hợp axit sulphuric, nitric và percloric hay hydro peroxit Tro hoá khô với magie oxit hay magie nitrat đã được áp dụng hiệu quả trong phân tích các mẫu sinh học khác nhau[3], [1], [36]

Các phương pháp xử lý mẫu được chia làm 3 nhóm chính: tro hóa khô trong các lò nung ở nhiệt độ cao, vô cơ hóa ướt ở áp suất khí quyển và vô cơ hoá trong lò vi sóng ở áp suất cao [1], [27] Quá trình ôxy hoá vẫn ít được thực hiện

Để quá trình ôxy hoá triệt để, người ta thường sử dụng tác nhân ôxy hoá là hỗn hợp các axit sulfuric và nitric, hoặc hỗn hợp axit sulphuric, nitric và percloric

hay hydro peroxit Tro hoá khô với magie oxit hay magie nitrat đã được áp dụng hiệu quả trong phân tích các mẫu sinh học khác nhau

1.4.1 Kỹ thuật vô cơ hoá khô

Nguyên tắc: Vô cơ hoá khô là kỹ thuật nung để xử lý mẫu trong lò nung

ở một nhiệt độ thích hợp, song thực chất đây chỉ là bước đầu tiên của quá trình

xử lý mẫu vì sau khi nung tro mẫu phải được hòa tan (xử lý tiếp) bằng dung dịch muối hay axit phù hợp để chuyển các chất phân tích vào dạng dung dịch Việc tro hoá thường được bổ xung thêm chất phụ gia bảo vệ hay chất chảy để làm giảm nhiệt độ nóng chảy của mẫu và bảo vệ các nguyên tố phân tích không bị mất trong quá trình xử lý mẫu [1], [3], [6]

Trong quá trình nung xử lý mẫu có thể có các quá trình vật lý và hoá học sau đây xảy ra:

- Sự bay hơi làm mất nước hấp thụ và nước kết dính trong chất mẫu

- Tro hoá, đốt cháy các chất hữu cơ của mẫu

- Phá vỡ cấu trúc ban đầu của mẫu

- Chuyển dạng các hợp chất phức tạp của mẫu về dạng đơn giản (từ dạng hữu

cơ sang vô cơ)

- Quá trình ôxy hoá khử thay đổi hoá trị của nguyên tố trong mẫu

- Giải phóng ra một số khí như CO, CO2, SO2,

- Có một số tương tác hoá học của các chất với nhau, tương tác với chất phụ gia thêm vào, tạo thành các chất lúc đầu không có

Đối với phân tích hàm lượng các kim loại không bay hơi trong các mẫu có hàm lượng hữu cơ cao, tro hoá khô là một phương pháp tương đối đơn giản để phá vỡ các chất hữu cơ và không tốn nhiều thời gian Nhược điểm chính của kỹ thuật này là khả năng mất một số nguyên tố phân tích do sự bay hơi hay nhiễm bẩn mẫu bởi bụi trong không khí và sự hấp phụ chất lên chén đựng mẫu [3] Nhiều tác giả đã đã sử dụng kỹ thuật tro hoá khô để xử lý mẫu sinh học nhằm xác