Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất ở lào

Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn... Trên thế giới, 70% các chủng vi khuẩn gây bệnh trong bệnh viện đã kháng lại ít nhất một loài kháng sinh thường dùng trong

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Keo Phommavong

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG

XẠ KHUẨN PHÂN LẬP TỪ ĐẤT Ở LÀO

Chuyên ngành: Sinh ho ̣c thực nghiê ̣m Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội - 2016

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Thầy

giáo PGS.TS Nguyễn Quang Huy Thầy đã tâ ̣n tình hướng dẫn và ta ̣o mo ̣i điều

kiê ̣n tốt nhất , giúp em có thêm nhiều kỹ năng và kiến thức quý báu trong quá trình thực hiê ̣n đề tài luâ ̣n văn

Em xin chân thành cảm ơn toàn thể các Thầy, Cô trong khoa Sinh học , Trường Đa ̣i ho ̣c Khoa ho ̣c Tự nhiên , ĐHQGHN đã giảng da ̣y , truyền đa ̣t cho em những kiến thức bổ ích trong suốt hai năm ho ̣c qua

Em xin chân thành cảm ơn tới TS Lê Hồng Điệp, Bộ môn Sinh lý thực vâ ̣t

và Hóa sinh , Khoa Sinh ho ̣c cùng các thầy , cô, anh chi ̣ và ba ̣n bè trong Khoa, Trường Đa ̣i ho ̣c Khoa ho ̣c Tự nhiên đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiê ̣n luâ ̣n văn này

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và ba ̣n bè đã luôn ở bên đô ̣ng viên, tạo động lực giúp em trưởng thành hơn trong suốt thời gian ho ̣c tâ ̣p và nghiên cứu khoa ho ̣c

Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm 2016

Học viên

Keo Phommavong

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Chất kháng sinh được phát hiê ̣n [8, 38] 16

Bảng 2.1 Các địa điểm lấy mẫu đất 25

Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật kiểm định 26

Bảng 3.1 Sự phân bố của khuẩn la ̣c xa ̣ khuẩn 36

Bảng 3.2 Hình thái của khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập được 37

Bảng 3.3 Số lươ ̣ng sự phân bố của xa ̣ khuẩn theo nhóm màu 39

Bảng 3.4 Họat tính kháng sinh của các chủng xạ khuẩn 41

Bảng 3.5 HTKS của xa ̣ khuẩn theo nhóm màu 42

Bảng 3.6 Khả năng hoạt tính của các chủng XK với nhóm vi khuẩn 43

Bảng 3.7 HTKS của các chủng XK trên môi trường tha ̣ch 44

Bảng 3.8 HTKS của di ̣ch lên men của chủng XK trên môi trường di ̣ch thể 46

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl với khả năng kháng VSVKĐ của 3 chủng

49

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ với khả năng kháng VSVKĐ của 3 chủng 52

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của pH với khả năng kháng VSVKĐ của 3 chủng 53

Bảng 3.12 Hoạt tính enzyme của 3 chủng xạ khuẩn 55

Bảng 3.13 Hoạt tính enzyme ở các nhiệt độ khác nhau của chủng L 4 56

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1 Khuẩn la ̣c xa ̣ khuẩn [71] 6

Hình 1.2 Khuẩn ty xạ khuẩn [73] 7

Hình 1.3 Bào tử xạ khuẩn [70] 8

Hình 1.4 Hình thái vi khuẩn S aureus [72] 9

Hình 1.5 Hình thái vi khuẩn E coli [72] 11

Hình 1.6 Hình thái vi khuẩn B subtilis [72] 12

Hình 1.7 Hình thái vi khuẩn B cereus [73] 14

Hình 1.8 Mô ̣t số thuốc kháng sinh du ̣ng trong y ho ̣c nguồn gốc từ xa ̣ khuẩn [73] 20

Hình 1.9 Mô ̣t số kháng sinh du ̣ng bảo vê ̣ thực vâ ̣t nguồn gốc từ xa ̣ khuẩn [74] 21

Hình 1.10 Mô ̣t số thuốc kháng sinh du ̣ng trong chăn nuôi nguồn gốc từ xa ̣ khuẩn [75] 21

Hình 1.11 Mô ̣t số thuốc k háng sinh dụng trong bảo vệ thực phẩm nguồn gốc từ xa ̣ khuẩn [75] 21

Hình 2.1 Hình mẫu đất thu thâ ̣p ta ̣i Lào 25

Hình 3.1 Khuẩn la ̣c xa ̣ khuẩn mo ̣c trên đĩa môi trường SCA và GI 38

Hình 3.2 Khuẩn la ̣c xa ̣ khuẩn theo nhóm màu 40

Hình 3.3 Mô ̣t số chủng xa ̣ khuẩn thuần khiết 40

Hình 3.4 HTKS của chủng XK trên môi trường tha ̣ch 45

Hình 3.5 HTKS chủng XK trên môi trường di ̣ch thể 47

Hình 3.6 Hình thái khuẩn lạc và hệ sợi khuẩn ty phóng đại 40X dưới kính hiển vi của chủng L4 47

Hình 3.7 Hình thái khuẩn lạc và hệ sợi khuẩn ty phóng đại 40X dưới kí nh hiển vi của chủng C3 48

Hình 3.8 Hình thái khuẩn lạc và hệ sợi khuẩn ty phóng đại 40X dưới kính hiển vi của chủng T9 49 Hình 3.9 Ảnh hưởng của các nồng độ NaCl với khả năng kháng VSVKĐ của chủng

Hình 3.10 Ảnh hưởng của các nồng độ NaCl với khả năng kháng VSVKĐ của chủng L4 51 Hình 3.11 Ảnh hưởng của các nồng độ NaCl với khả năng kháng VSVKĐ của chủng T9 51 Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ với khả năng kháng VSVKĐ của 3 chủng XK53 Hình 3.13 Ảnh hưởng của pH với khả năng kháng VSVKĐ của 3 chủng 54 Hình 3.14 Hoạt tính enzyme của 3 chủng XK 55 Hình 3.15 Hoạt tính chịu nhiệt enzyme của chủng L 4 56 Hình 3.16 Vị trí phân loại của chủng T9 dựa vào trình tự gen rARN 16S với các

loài có quan hệ họ hàng gần 58

NHƢ̃NG CHƢ̃ VIẾT TẮT

Chƣ̃ viết tắt: Chƣ̃ viết đầy đủ

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

3 Mục tiêu nghiên cứu 2

4 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1 Giớ i thiê ̣u về xa ̣ khuẩn 3

1.1 Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 3

1.2 Đặc điểm sinh học-hình thái của xạ khuẩn 4

1.2.1 Cấu tạo tế bào của xa ̣ khuẩn 4

1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn 5

1.2.3 Khuẩn lạc của xa ̣ khuẩn 6

1.2.4 Khuẩn ty củ a xa ̣ khuẩn 7

1.2.5 Sự hình thành bào tử của xa ̣ khuẩn 8

1.3 Sơ lược về vi khuẩn kiểm định 9

1.3.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 9

1.3.2 Vi khuẩn Escherichia coli 10

1.3.3 Vi khuẩn Bacillus subtilis 12

1.3.4 Vi khuẩn Bacillus cereus 13

1.4 Đại cương về chất kháng sinh 14

1.4.1 Chất kháng sinh 14

1.4.2 Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn 15

1.4.3 Sự hình thành chất kháng sinh ở xa ̣ khuẩn 16

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 18

1.5.1 Điều kiện nuôi cấy 18

1.5.2 Thành phần muôi trường nuôi cấy 18

1.6 Sự ứng du ̣ng chất kháng sinh từ xa ̣ khuẩn 19

1.6.1 Ứng dụng trong y học 19

1.6.2 Ứng dụng trong bảo vệ thực vật 20

1.6.3 Ứng dụng trong chăn nuôi 21

1.6.4 Ứng dụng trong bảo vệ thực phẩm 22

1.7 Các phương pháp phân loại xạ khuẩn 22

1.7.1 Phương pháp phân loa ̣i xa ̣ khuẩn theo phương pháp truyền thống 22

1.7.2 Phương pháp phân loa ̣i xa ̣ khuẩn theo phương pháp hiê ̣n đa ̣i 23

1.8 Khả năng sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật 23

1.8.1 Ứu thế của vi sinh vật để sinh tổng hợp enzyme 23

1.8.2 Một số enzyme có nguồn gốc từ xa ̣ khuẩn 24

CHƯƠNG 2-NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2 Vật liê ̣u nghiên cứu 25

2.1 Mẫu đất 25

2.2 Vi sinh vật kiểm đi ̣nh 26

2.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 26

2.3.1 Hóa chất 26

2.3.2 Dụng cụ và thiết bị 26

2.4 Các môi trường dùng nghiên cứu 27

2.4.1 Môi trườ ng phân lâ ̣p xa ̣ khuẩn 27

2.4.2 Môi trườ ng xác đi ̣nh hoa ̣t tính kháng vi sinh vâ ̣t gây bê ̣nh 28

2.4.3 Môi trườ ng kiểm tra khả năng sinh enzyme ngoa ̣i bào 28

2.5 Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu 28

2.5.1 Phương pháp lấy mẫu đất 28

2.5.2 Phương pháp phân lâ ̣p xa ̣ khuẩn 29

2.5.2.1 Phương pháp phân lâ ̣p xa ̣ khuẩn theo Vinogradski 29

2.5.3 Phương pháp thuần khiết và bảo quản giống 30

2.5.4 Phương pháp quan sát hình thái hê ̣ sợi xa ̣ khuẩn 30

2.5.5 Phương pháp lên men xa ̣ khuẩn 30

2.5.6.1 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh 30

2.5.6.2 Phương pháp đu ̣c lỗ 31

2.5.7 Phương pháp xác đi ̣nh khả năng tiết enzyme ngoa ̣i bào 32

2.5.8 Phương pháp xác đi ̣nh khả năng chi ̣u nhiê ̣t của enzyme 33

2.5.9 Phương pháp tối ưu mô ̣t số điều kiê ̣n ảnh hưởng tới sự sinh tổng hơ ̣p 34

chất kháng vi sinh vâ ̣t gâ ̣y bê ̣nh của các chủng xa ̣ khuẩn 34

2.5.10 Phương pháp đi ̣nh danh các chủng xa ̣ khuẩn 34

2.5.11 Phương pháp xử lý số liê ̣u 35

CHƯƠNG 3-KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3 Kết quả phân lâ ̣p và tuyển cho ̣n các chủng xa ̣ khuẩn từ mẫu đất 36

3.1 Phân bố củ a khuẩn la ̣c xa ̣ khuẩn 36

3.2 Phân bố củ a khuẩn la ̣c xa ̣ khuẩn theo nhóm màu 39

3.3 Kết qủ a nghiên cứu các chủng tuyển cho ̣n 41

3.3.1 Hoạt tính kháng sinh của các chủng xa khuẩn 41

3.3.2 Hoạt tính kháng sinh với vi sinh vật kiểm định 43

3.3.3 Tuyển chọn các chủng xa ̣ khuẩn có hoa ̣t tính kháng sinh 44

3.4 Đặc điểm hình thái và hệ sợi của chủng xạ khuẩn 47

3.4.1 Đặc điểm hình thái và hệ sợi của chủng L4 47

3.4.2 Đặc điểm hình thái và hệ sợi của chủng C 3 48

3.4.3 Đặc điểm hình thái và hệ sợi của chủng T9 48

3.5 Ảnh hưởng các yếu tố của môi trường với chủng xạ khuẩn 49

3.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl 49

3.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 52

3.5.3 Ảnh hưởng của pH 53

3.6 Khả năng tiết enzyme ngoại bào của chủng xạ khuẩn 55

3.6.1 Khả năng hoạt tính enzyme của chủng xạ khuẩn 55

3.6.2 Khả năng chịu nhiệt của enzym e chủ ng L4 56

3.7 Kết quả đi ̣nh danh loa ̣i của chủng xa ̣ khuẩn 57

3.7.1 Chủng T9 57

A Tài liệu tham khảo 61

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Xạ khuẩn là nhóm sinh vật nhân sơ (prokaryote) vớ i số lươ ̣ng loài lớn và phân bố ở nhiều vùng sinh thái khá c nhau trên thế giới và là đối tượng nghiên cứu quan trọng của ngành vi sinh vật Nhóm vi sinh v ật được biết đến với nhiều ứng dụng thực tế thông qua việc tạo ra các sản phẩm trao đổi thứ cấp có giá tri ̣ sử du ̣ng cao như các hợp chất y dươ ̣c , các chất kháng sinh và enzyme thủy phân hợp chất cao của phân tử Các chất kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra đư ợc sử dụng rất nhiều trong y học, sinh học, trong công tác bảo vệ thực vật và trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người [6]

Sự ra đời của chất kháng sinh (CKS) do xạ khuẩn có vai trò quan tro ̣ng trong nhiều lĩnh vực sản xuất và đời sống Trong y ho ̣c, CKS được sử du ̣ng để phòng và chữa bê ̣nh cho người Trong chăn nuôi, CKS được sử du ̣ng để chữa bê ̣nh và tăng trọng cho vật nuôi Trong nông nghiê ̣p , CKS được sử du ̣ng để thay thế thuốc hóa học và dùng làm chất kích thích sinh trưởng Ngoài ra, chất CKS còn được sử du ̣ng để bảo quản th ực phẩm, [2] Hiện nay, các loài chất kháng sinh rất phổ biến trên thị trường nhưng công nghệ sản xuất chất kháng sinh lại chủ yếu tập trung vào một số nườc như Mỹ, Đức, Nhâ ̣t, Anh, và là được bảo hộ chặt chẽ dưới dạng các sáng chế đô ̣c quyền và lưu giữ trong từng cơ sở sản xuất công nghiê ̣p [20]

Trong xu hướ ng nghiên cứu để điều chỉnh sinh tổng hợp chất kháng sinh của xạ khuẩn là tuyển chọn tạo ra các chủng xạ khuẩn công nghiệp mà có khá năng siêu tổng hơ ̣p chất kháng sinh và tối ưu hóa các thành phần môi trường , thiết bi ̣ và điều kiê ̣n lên men Cứ công viê ̣c sử du ̣ng mô ̣t số chất đă ̣c hiê ̣u và các CKS không hợp lý để chữa bệnh đã làm cho hiện tượng kháng sinh xuất hiê ̣n , phát hiện , lan rô ̣ng và ngày càng gia tăng Do vâ ̣y, viê ̣c tìm kiếm ra những CKS mới luôn thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học Đến này, con người đã phát hiê ̣n khoảng 19.000 CKS có nguồn gốc từ vi sinh vật , hơn 3500 CKS bán tổng hợp và mỗi năm còn có

khoảng vài trăm CKS mới được phát hiện , trong đó chủ yếu thuô ̣c chi Streptomyces

[10, 32] Kháng thuốc là mối lo nga ̣i và thách thức đối với nền y ho ̣c hiê ̣n đa ̣i Trên thế giới, 70% các chủng vi khuẩn gây bệnh trong bệnh viện đã kháng lại ít nhất một loài kháng sinh thường dùng trong điều trị Vi khuẩn E.coli, A Baumannii, K.pneumoniae va ̀ P aeruginosa đã kháng la ̣i tất cả các loa ̣i kháng sinh gồm cả các

kháng sinh mạnh nhất hiện nay như carbapenem và cephalosporin [56]

Hiê ̣n nay, hiê ̣n tượng kháng thuốc kháng sinh ngày càng trở nên phổ biển và có xu hướng tăng nhanh Do đó, trong viê ̣c nghiên cứu để tìm ra các hợp chất mới từ tự nhiên có hoa ̣t tính kháng khuẩn là vai trò quan tro ̣ng , cần thiết trong những hướng nghiên cứu tro ̣ng tâm là xa ̣ khuẩn

2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Đối với Lào , sự nghiên cứu trong các ngành khoa ho ̣c sinh ho ̣c như vi sinh

vâ ̣t học, sinh hóa ho ̣c, sinh ho ̣c phân tử, di tryuền ho ̣c, còn thiếu các loại thông tin cấp cơ sở và tài liệu cần thiết trong nghiên cứu cơ bản và ứng dụng Do đó, nghiên cứu này mong muốn sẽ góp phần vào trong công viê ̣c nghiên cứu khoa ho ̣c của Lào

Lào nằm trong vùng khí hậu cận nhiệt đới với phong phú đa dạng sinh học của các nguồn tài nghiên thiên nhiên thực vật di truyền, đa dạng rộng lớn của các vi sinh vật và tiềm năng về lâm nghiê ̣p, nông nghiê ̣p và hê ̣ VSV mà khá phong phú , trong số đó có không nhiều cũng ít loài xạ khuẩn sinh chất kháng sinh mà chưa được nghiên cứu và khám phá Xuất phát từ nhu cầu thực tế đó , chúng tôi đã tiế n hành thực hiện đề tài : Nghiên cứu đă ̣c điểm sinh ho ̣c của mô ̣t số chủng xạ khuẩn phân lâ ̣p từ đất ở Lào

3 Mục tiêu nghiên cƣ ́ u

 Phân lâ ̣p, tuyển cho ̣n và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng xạ khuẩn từ đất ở Lào

4 Nô ̣i dung nghiên cƣ́u

 Phân lâ ̣p và tuyển cho ̣n chủng xa ̣ khuẩn có hoa ̣t tính kháng sinh vi sinh vâ ̣t kiểm đi ̣nh

 Đánh giá thử hoa ̣t tính kháng sinh chủng xa ̣ khuẩn với vi sinh vâ ̣t kiểm đi ̣nh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Giơ ́ i thiê ̣u về xa ̣ khuẩn

1.1 Vị trí phân loại và sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn (XK) là mô ̣t nhóm vi khuẩn Gram dương có tỷ lệ G+C cao (>55%) trong DNA XK thuộc ngành Tenericutes, thuô ̣c giới vi khuẩn thâ ̣t (Eubateria), siêu

giới nhân sơ (Prokaryota) và thuô ̣c lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae,

bô ̣ Actinomycetales Bộ bao gồm 10 phân bô ̣, 35 họ, 110 chi và 1000 loài trong đó

có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại được xếp

vào nhóm XK hiếm [11]

Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh , 60 đến 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất mà có kh ả năng sinh chất kháng sinh [16] Phân lớn các chất kháng sinh được sử du ̣ng hiê ̣u quả

trong điều tri ̣ có nguồn gốc từ các loài Streptomyces Các chất kháng sinh được biết

đến nhất là streptomycin , erythromycin, tetracyclin, Điều đáng chú ý là các xa ̣ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá tri ̣ đang dùng trong y ho ̣c như gentamixin, vancommixin, tobramixin, [56]

Xạ khuẩn rất đa dạng và phân bố rộng rãi trong tự nhiên có thể tìm thấy trong hầu hết các môi tường như : đất, nước và xác thực vâ ̣t Sự phân bố của xa ̣ khuẩn còn ph ụ thuô ̣c nhiều yếu tố như nhiê ̣t đô ̣, đô ̣ pH môi trường , nồng đô ̣ NaCl Xạ khuẩn có nhiều trong đất trung tính và ki ềm yếu hoặc axit yếu với pH từ 6,8-7,5 Phần lớn xa ̣ khuẩn thích hợp phát tr iển trong khoảng nhiệt độ 25-30°C, mô ̣t số loài xạ khuẩn ưa nhiệt có nhiệt độ phát trển tối ưu từ 45-50°C Xạ khuẩn phân bố nhiều nhất ở trong đất và đóng vai trò quan tro ̣ng trong chu trình về mă ̣t sinh thái trong vòng tuần hoàn vâ ̣t chất trong tự nhiên [62] Xạ khuẩn đa số sinh trưởng hiếu khí và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm Mô ̣t trong những đă ̣c điểm để phân loa ̣i xạ khuẩn là mạng lưới phân nhánh của thể sợi , chúng thường phát triển ở cả bề mặt

cơ chất rắn (tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong (tạo thành hê ̣ sợi cơ chất) [29]

Theo Waksman thì trong mô ̣t gam đất có khoảng 29.000-2.400.000 mầm xa ̣ khuẩn, chiếm 9-45% tổng số vi sinh vâ ̣t [69] Xạ khuẩn đóng vai trò quan tro ̣ng về

mă ̣t sinh thái trong vòng tuần hoàn tự nhiên , chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như humic acid trong đất Mô ̣t số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, đô ̣ng vâ ̣t nhưng có thể dùng để sản xuất enzyme như proteaza , cellulaza, amylaza, một số axit amin và axit hữu cơ [12]

1.2 Đặc điểm sinh học-hình thái của xạ khuẩn

1.2.1 Cấu ta ̣o tế bào của xa ̣ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn G (+), toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phàn chính như : thành tế bào , màng sinh chất , nguyên sinh chất , chất nhân và các thể ẩn nhập Thành tế bào của xạ khuẩn không chứa cellulose và kitin nhưng chứa nhiều enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vâ ̣n chuyển vâ ̣t chất qua màng tế bào Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới , dày 10-20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của k huẩn ty và bảo vệ tế bào Thành tế bào bao gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày khoảng 60Ao

, lớ p giữa và lớp trong dày khoảng 50Ao Các lớ p này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glycopeptide bao gồm các gốc N -acetyl glucozamin liên kết với N -acetyl muramic

bởi các liên kết 1,4-β glucozit [7] Xạ khuẩn được chia thành 8 nhóm [50] gồm:

1 Nhóm I: Xạ khuẩn không được t ạo ra những sợi nấm "mycelium" Ví dụ :

Actinomyces (trong ho ̣ Actinomycetaceae)

2 Nhóm II: Mycobacteria, trong ho ̣ Mycobacteriaceae Đại diện là chủng gây bệnh lao Mycobacterium tuberculosis

3 Nhóm III: Xạ khuẩn cố định ni tơ Ví d ụ Frankia, các chủng xạ khuẩn trong

nhóm này tạo ra sợi giống nấm

4 Nhóm IV: Actinoplanes, chủng trong nhóm này t ạo ra sợi nấm và bào tử bên trong các túi bào tử "sporangia" Ví dụ Actinoplanes (họ Micromonosporaceae), Streptospora-ngium (họ Streptosporangiaceae)

5 Nhóm V: Dermatophilus, nhóm này t ạo ra sợi nấm sợi "mycelia filament",

Dermatophilus (thuộc họ Dermatophilaceae), Geodermatophilus (thuộc họ Geodermatophilaceae)

6 Nhóm VI: Nocardias Ví dụ như Nocardiaceae, gồm các chủ ng trong c hi

Nocardia

7 Nhóm VII: Streptomycetes, gồm các chủng t ạo ra rất nhiều sợi nấm và bào tử thường gồm các chi Streptomyces, Streptoverticillium và Kitasatospora (họ Streptomycetaceae) và Sporichthya (họ Sporichthyaceae)

8 Nhóm VIII: Micromonosparas, nhóm này tạo ra sợi nấm và thường xuyên tạo ra

bào tử đơn Ví dụ Micromonospora (họ Micromonosporaceae), Microbispora (họ Streptosporangiaceae), Thermmoonospora (họ Thermomonosporaceae)

1.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh ho ́ a của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có khả năng hình thành enzyme và các chất kháng sinh nên được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực của đời sống Để phân loa ̣i xa ̣ khuẩn người ta sử du ̣ng các đặc điểm sinh lý , sinh hóa khác như khả nă ng đồng hóa các nguồn cac bon, ni

tơ, axit amin và nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng hay khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hê ̣ thống enzyme Nhu cầu về oxy, giới ha ̣n pH, nhiê ̣t đô ̣ tối ưu, khả năng chịu NaCl và các yếu tố khác của môi trường , mối quan hê ̣ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau cũng là các đặc điểm của xạ khuẩn

Xạ khuẩn sử dụng đường, rượu, axit hữu cơ, lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacborn , amino axit, peptone, muối nitrat để làm nguồn nitơ Phần lớn xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, mô ̣t số ít ưa nhiê ̣t Nhiệt đô ̣ thíc h hợp cho sự sinh trưởng là 25-30°C Tuy nhiên, nhiê ̣t đô ̣ tối ưu cho sinh trưởng hợp chất kháng sinh thường chỉ nằm trong khoảng 18-30°C Độ ẩm thích hợp đ ối với xạ khuẩn dao động trong khoảng 40-50%, giớ p ha ̣n pH trong

1.2.3 Khuẩn la ̣c của xạ khuẩn

Khuẩn la ̣c của xạ khuẩn thường tròn, xù xì, rắn chắc, có dạng da , dạng vôi, dạng nhung tơ hay da ̣ng màng dẻo và có màu sắc rất đa dạng : hồng, da cam, vàng, nâu, trắng, xám, tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh (hình 1) Khuẩn la ̣c xạ khuẩn có kích th ước và khối lượng không ổn định và phu ̣ thuô ̣c vào điều kiê ̣n sinh lý và các điều kiện nuôi cấy [12] Khuẩn la ̣c của xa ̣ khuẩn khác so với nấm mốc bởi

hê ̣ sợi của nấm mốc có đường kính lớn (từ 5-50 µm) và quan sắt được bằng mắt thường

Đường kính của khuẩn lạc chỉ chừng 0,5-4 mm nhưng cũng có khuẩn la ̣c đa ̣t tới đường kính 1 cm hoă ̣c lớn hơn Điểm nổi bâ ̣t của khuẩn la ̣c xa ̣ khuẩn là có hê ̣ sợi phát triển , phân nhánh ma ̣nh và không có vách ngăn Hê ̣ sợi xa ̣ khuẩn mảnh hơn nấm mốc với đường kính thay đối trong khoảng từ 0,2-1µm đến 2-3 µm, chiều dài có thể đạt tới mô ̣t vài cm [14]

Khuẩn lạc có 3 lớp như: lớp vỏ ngoài có da ̣ng sợi bê ̣n chă ̣t , lớp trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong Khuẩn la ̣c trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau , các sản phẩm trong quá trình trao đối chất như : chất kháng sinh , vitamin, độc tố, axit hữu cơ, enzyme, có thể được tích lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra môi trường Hê ̣ sợi cơ chất có thể tiết vào môi trường các loại sắc tố , thường có máu xanh , nâu, đen, tím, hồng, và có sắc tố chỉ tan trong nước, hoặc trong dung môi hữu cơ (hình 1.1)

1.2.4 Khuẩn ty của xạ khuẩn

Khuẩn ty bắt màu tương tự như vi khuẩn Gram dương, hoại sinh, hiếu khí không hình thành nha bào , không có lông và giáp mô , dạng phân nhánh hay dạng

sơ ̣i dài, đa hình thái như da ̣ng hình chùy , dạng phân nhánh thành chùm , thành bó gọi là khuẩn ty Khi nuôi cấy trên môi t rường đă ̣c khuẩn ty của xa ̣ khu ẩn phát triển thành 2 loại như: mô ̣t loa ̣i cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty

cơ chất-subtrate mycelium ) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng và mô ̣t loa ̣i phát triển trên bề mă ̣t tha ̣ch go ̣i là hê ̣ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh-aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản [39]

Hê ̣ sợi khuẩn ty xa ̣ khuẩn có màu sắc rất đ a da ̣ng như: trắng, vàng, xám, đỏ và có đường kính từ 0,2-1µm đến 2-3 µm, phát triển theo kiểu mọc chồi , đô ̣ dài khuẩn ty xa ̣ khuẩn trong giai đoa ̣n phát triển là 11µm [67] Khuẩn ty thường có kích thước và khối lượng không ổn đi ̣nh và phu ̣ thuô ̣c vào từng loa ̣i điều kiê ̣n môi trường nuôi cấy Các loài xạ khuẩn khác nhau đều có cùng một kiểu cấu tạo hệ sợi , chỉ khác nhau ở chỗ có loài có hệ sợi dài, thẳng hay làn sóng hoă ̣c ít

Khuẩn ty khí sinh ở giai đoạn trưởng thành tạo chuỗi từ ba đến nhiều bào tử, một số ít loài hình thành chuỗi bào tử ngắn trên khuẩn ty cơ chất, bào tử không có khả năng di động Một số xa ̣ khuẩn không có sợi khí sinh mà chỉ có sợi cơ chất, làm cho bề mă ̣t xa ̣ khuẩn nhẵn và khó tách ra khi cấy tryuền ; loại chỉ có sợi k hí sinh thì ngươ ̣c la ̣i, rất dễ tách ra toàn bô ̣ khuẩn ty khỏi môi trường [28]

Hình 1.2 Khuẩn ty xa ̣ khuẩn [73]

1.2.5 Sƣ ̣ hình thành bào tƣ̉ của xa ̣ khuẩn

Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh, gọi là cuống sinh bào tử Đây là cơ quan sinh sản đă ̣c trung cho xa ̣ khuẩn cuống bào tử của xa ̣ khuẩn có da ̣ng thẳng hoă ̣c lươ ̣n sóng , dạng xoắn lò xo , chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có hình móc câu Trên mỗi cuống sinh bào tử mang 30-100 bào tử, có thể mang tới 200 bào tử Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là đă ̣c điểm quan tro ̣ng trong phân loại xạ khuẩn [9]

Sự hình thành của bào tử của xa ̣ khuẩn có 2 kiểu: kiểu kết đoạn (fragmentation) và kiểu cắt khúc (segmentation) Bào tử xạ khuẩn có nhiều hình thái dạng khác nhau , thường có hình đơn, kép, trụ, ovan, hình que với kích thước trung bình khoảng 0,7-0,9 × 0,7-1,9 µm Kích thước của bào tử thay đổi khác nhau tùy loài, tùy cá thể trong loài thâ ̣m chí ngay trên cùng mô ̣t chuỗi bào từ Bề mă ̣t bào tử xa ̣ khuẩn có thể nhẵn, có gai, khối u, nếp nhăn hay da ̣ng tóc [13]

Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với đô ̣ dày khoảng 300-400 A°, chia làm 3 lớp Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác đô ̣ng bất lợi của điều kiê ̣n ngoại cảnh như : nhiê ̣t đô ̣, pH, Hình dạng, kích thược chuỗi bào từ và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương đối ổn

đi ̣nh và là đă ̣c điểm quan tro ̣ng dùng trong phân loa ̣i xa ̣ khuẩn [15]

Hình 1.3 Bào tử xạ khuẩn [70]

1.3 Sơ lươ ̣c về vi khuẩn kiểm định

1.3.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus

1.3.1.1 Đặc điểm hình thái

Staphylococcus aureus (S aureus) thuộc giống Staphylococcus, họ: Micrococceae, lớp: Firmibacteria, giới: Prokaryote S aureus là những vi khuẩn

hình cầu, Gram dương, đường kính 0,5-1,5 µm, tế bào xếp thành hình chùm nho , từng đôi, từng chuỗi ngắn, không di động và không sinh bào tử Thành tế bào kháng với lysozyme và nhạy với lysotaphin, một chất có thể phá hủy cầu nối pentaglycin của tụ cầu [64]

Hình 1.4 Hình thái vi khuẩn S aureus [72]

1.3.1.2 Đặc điểm nuôi cấy, sinh hóa

S aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có enzyme

catalase phân giải oxy già giải phóng oxy và nước Trên môi trường BP (Baird

Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S aureus có màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính

1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2-5 mm và khả năng thủy phân lòng đỏ trứng của lethinase), còn trên môi trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường Chapman, khuẩn lạc có hình dạng tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol) [52]

1.3.1.3 Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố

S aureus là loài phổ biến nhất trong Staphylococcus Trong điều kiện kị khí

sự phát triển của vi khuẩn cần có axit amin và vitamin, nhưng trong điều kiện hiếu

khí cần có thêm uracil và nguồn carbon S aureus phát triển tốt nhất ở điều kiện

hiếu khí, nhiệt độ tối thích cho sự phát triển là 35oC, nhưng có thể phát triển được trong khoảng nhiệt độ từ 10 đến 45oC khoảng pH có thể phát triển từ 4,5 đến 9,3,

nhưng pH tối thích khoảng 7,0 đến 7,5 và trong môi trường chứa trên 15% NaCl S aureus được cho là vi khuẩn khá mạnh có thể sống tốt bên ngoài kí chủ Vi khuẩn

này còn có mặt trong không khí, bụi và trong nước dù chúng thiếu tính di động và

rất nhạy với thuốc kháng sinh và chất diệt khuẩn Tuy nhiên, S aureus cũng khá

nhạy với nhiệt độ, không phát triển ở 60oC trong thời gian 2-50 phút tùy từng loại

Chính nhờ những đặc điểm trên giúp S aureus có sự phân bố rộng, chủ yếu được

phân lập từ da, màng nhày, tóc và mũi của người và động vật máu nóng [33]

1.3.1.4 Tính kháng thuốc kháng sinh

Hầu hết các chủng S aureus kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau

Một vài chủng kháng với tất cả các loại kháng sinh ngoại trừ vancomycin, và những

dòng này ngày càng tăng Những dòng MRSA (Methicilin Resistant Staphylococcus aureus) rất phổ biến và hầu hết các dòng này cũng kháng với nhiều kháng sinh

khác Nhiều dòng hiện nay đã kháng với hầu hết kháng sinh thông thường, và sắp tới sẽ kháng cả những kháng sinh mới [48]

1.3.2 Vi khuẩn Escherichia coli

1.3.2.1 Tính chất vi sinh vật, hình thái

Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) thuộc lớp : Schgzomycetes, bô ̣:

Eubacteriales, họ: Enterobacteriaceae, giống: Escherichia E coli trướ c đây còn có tên go ̣i là Bacterium coli commune mà lần đầu tiên được phân lâ ̣p từ phân trẻ em bi ̣ tiêu năm 1885 và đặt theo tên của bác sĩ nhi khoa Đức Theodor Escherich [22]

Hình 1.5 Hình thái vi khuẩn E coli [72]

E coli là một trực khuẩn ngắn 2 đầu tròn, kích thước 1,1-1,5µm × 2-6 µm Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn , đứng riêng lẻ , đôi khi xếp thành chuỗi ngắn

Hầu hết các vi khuẩn E coli có khả năng di động do có lông ở xung quanh thân ,

nhưng cũng có mô ̣t số chủng không có khả năng di đô ̣ng [25] Vi khuẩn E coli không sinh nha bào , có thể có giáp mô E coli bắt màu Gram âm , có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu

1.3.2.2 Đặc điểm nuôi cấy và phân bố

E coli là vi khuẩn hiếu khí hay ky ̣ khí tuỳ nghi , nhiê ̣t đô ̣ phát triển thích

hơ ̣p là 37°C, pH thích hợp nhất là 7,2-7,5 Mọc tốt trên môi trường dinh dưỡng thông thường chi ̣u được nhiê ̣t đô ̣ từ 4-45°C Trên môi trường tha ̣ch dinh dưỡng , sau

24 giờ nuôi cấy ở 37°C vi khuẩn ta ̣o hình thành khuẩn la ̣c tròn ướt , màu trằng đục hơi lồi để lâu có da ̣ng khô rìa hơi nhăn ; môi trường Eosin mythylen blue (EMB) tạo khuẩn la ̣c tím ánh kim và trên môi trường Brilliant green agar (BGA) tạo khuẩn lạc xanh lá mạ [26] E coli có nhiều trong ruột của động vật ăn thịt , ăn ta ̣p hơn là đô ̣ng

vâ ̣t ăn cỏ , sống vài tuần đến vài tháng trong bu ̣i , phân, nước, ngoài tự nhiên Hầu hết chúng không gây ha ̣i cho người và đô ̣ng vâ ̣t, giúp ổn định sinh lý đường ruột

1.3.2.3 Sƣ ́ c đề cấu trúc kháng nguyên

E coli bị diệt ở 55°C trong 1 giờ , 60°C trong 15-30 phút, các chất sát trùng

như acid phenic , formol có thể bi ̣ diê ̣t trong 5 phút Đề kháng với sự sấy khô , 95%

E coli bị diệt ở nhiệt độ đông lạnh trong 2 giơ ̀ Vi khuẩn đường ruô ̣t E.coli có cấu

trúc kháng nguyên phức tạp Dựa vào tính chất kháng nguyên , người ta phân chia các vi khuẩn cùng loại thành các tuýp huyết thanh (serotype) khác nhau [22]

Hiê ̣n nay có hơn 70 týp huyết thanh E coli từ sự tổ hợp các nhóm kháng

nguyên O, H, K, F và dựa vào các đặc điểm đó có thể định danh vi khuẩn

1.3.3 Vi khuẩn Bacillus subtilis

1.3.3.1 Đặc điểm phân loại

Theo phân loại của Bergy , Bacillus subtilis thuô ̣c bô ̣: Ecubacteriales, họ:

Bacillaceae, giống: Bacillus, loài: Bacillus subtilis Vi khuẩn B subtilis thuộc nhóm

vi sinh vâ ̣t bắt buô ̣c ở đường ruô ̣t , chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên như : cỏ khô, bụi, đất nước, Phần lớn chúng tồn tại trong đất , thông thường có trong đất trồng tro ̣t với số lượng 10-100 triê ̣u CFU/g [27]

Hình 1.6 Hình thái vi khuẩn B subtilis [72]

1.3.3.2 Đặc điểm hình thái

Bacillus subtilis là trực khuẩn , Gram dương, kích thước 0,50,8µm ×1,5 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thước từ 0,8-1,8µm Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt (ở 100oC trong 180 phút), chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ, áp suất, chất sát trùng Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm [5]

-1.3.3.3 Đặc điểm nuôi cấy

B subtilis phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn phát triển được

trong môi trường thiếu oxy Nhiệt độ tối ưu là 37oC, pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4

B subtilis phát triển hầu hết trên các môi trường dinh dưỡng cơ bản: môi trường

thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA), môi trường Trypticase Soy Broth (TSB), trên môi trường giá đậu [5] Nhu cầu dinh dưỡng củ a B subtilis chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố vi lượng khác B subtilis phát triển tốt trong môi

trường cung cấp đủ nguồn cac bon và ni tơ

1.3.3.4 Tính chất đổi kháng

Vớ i vi sinh vâ ̣t gây bê ̣nh , mỗi loa ̣i sinh vâ ̣t khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiê ̣n môi trường khác nhau , sinh khuẩn la ̣c khác nhau Thay đổi môi trường hoă ̣c các yếu tố môi trường bất lợi là làm thay đổi điều kiê ̣n sống , làm hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vâ ̣t Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm có sự hiê ̣n

diê ̣n của B subtilis với mô ̣t số lượng lớn sẽ xảy ra sự ca ̣nh tranh dinh dưỡng , không

gian Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn sẽ sử du ̣ng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường , đồng thời ta ̣o ra mô ̣t số loa ̣i kháng sinh nên sự sinh trường của nấm bi ̣ ức chế [12]

1.3.4 Vi khuẩn Bacillus cereus

1.3.4.1 Đặc điểm phân loại

Bacillus cereus (B cereus) là trực khuẩn Gram dương , thuộc giới Bacteria ,

ngành Firmicutes , lớp Bacilli , bô ̣ Bacillales , họ Bacillaceae , chi Bacillus , loại B.cereus

B cereus là vi khuẩn hiếu khí , bào tử dạng hình ovan , có khả năng sinh

nha bào Chúng được phát hiển đầu tiên trong mô ̣t ca nhiễm đô ̣c thực phẩm vào năm 1955 Từ những năm 1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp ngộ đô ̣c thực phẩm

do B cereus được phát hiê ̣n và chiếm khoảng 2% số ca bê ̣nh thực phẩm mặc dù trên thực tế con số này có thể lớn hơn nhiều [27]

Hình 1.7 Hình thái vi khuẩn B cereus [73]

1.3.4.2 Hình thái và phân bố

B cereus hình que , gậy, đầu vuông , có kích thước 3-5µm × 1-1,2µm; tạo bào tử, bào tử nằm ở cuối thân tế bào , bào tử có thể chịu được nhiệt độ cao Đứng

riêng rẽ, xếp chuỗi hoă ̣c nhiều tế bào chụm lại thành từng chùm Khuẩn la ̣c của B cereus phẳng, khá khuếch tán, hơi lõm, trắng đu ̣c, mép lồi lõm Có khả năng chuyển

đô ̣ng [12] B cereus là phổ biến trong đất, có trong nhiều loa ̣i thực phẩm đă ̣c biê ̣t là

ở các loại thực phẩm từ thực vật, và trong cả thịt, cá, những sản phẩm từ sữa

1.3.4.3 Đặc điểm nuôi cấy

B cereus là loại vi khuẩn dễ mọc , hiếu khí và ki ̣ khí tùy nghi , là vi khuẩn ưa nhiê ̣t, nhiê ̣t đô ̣ phát triển từ 5-50°C, nhiê ̣t đô ̣ tối ưu là 35-40°C, pH phát triển từ 4,5-9,3 còn pH thích hơ ̣p là 7-7,2 Trên môi trường NA hay TSA sau 24 giờ ta ̣o khuẩn lạc nhăn nheo , xù xì ; trên môi trườ ng BA ta ̣o dung huyết rô ̣ng ; trên môi trườ ng Mossel tạo khuẩn lạc màu hồng chung quanh có vòng sáng và trên môi trường canh

NB, TSB làm đục môi trường và có màu vàng

1.4 Đa ̣i cương về chất kháng sinh

1.4.1 Chất kháng sinh

Chất kháng sinh là mô ̣t nhóm chất đă ̣c biê ̣t có hoa ̣t tính sinh ho ̣c cao , là sản phẩm trao đổi có nguồn gốc từ vi sinh vâ ̣t mà ngay ở nồng đô ̣ thấp (µg/ml) cũng có thể ức chế hoă ̣c tiêu diê ̣t các vi sinh vâ ̣t khác mô ̣t cách cho ̣n lo ̣c (vi khuẩn , nấm

mốc, nấm men, )

Thuâ ̣t ngữ antibiotic được bắt nguồn từ chữ Hi La ̣p "anti" là kháng lại, "bios" là sự sống Thuâ ̣t ngữ này được Waksman sử du ̣ng vào những năm 1940 để phân biê ̣t penicillin với sulfonamit đã được phát hiê ̣n từ những năm 1930 [32, 38] Ngày nay, thuật ngữ đã được sử du ̣ng phổ biến để chỉ các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên , tổng hơ ̣p hoă ̣c bán tổng hợp có hiê ̣u quả diê ̣t khuẩn ở nồng đô ̣ thấp Nhiều CKS đươ ̣c sử du ̣ng dưới dạng chất hóa tri ̣ liê ̣u có khả năng kháng tế bào ung thư , virus, Tất cả các chất kháng sinh đều có tính đô ̣c cho ̣n lo ̣c, mỗi chất kháng sinh thường chỉ tác dụng với một nhóm vi sinh vật nhất định [13]

1.4.2 Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn

Chất kháng sinh là sản phẩm trao đối thứ cấp của xa ̣ khuẩn , đa số các thuốc kháng sinh được dùng trong y học hiện nay có nguồn gốc từ xạ khuẩn Trong số 23,000 hợp chất có hoa ̣t tính sinh ho ̣c có nguồn gốc từ vi sinh vâ ̣t được công bố sử dụng trên toàn thế giới, thì 45% có nguồn gốc từ xạ khuẩn, 38% từ nấm và 17% vi khuẩn khác [63, 45]

Streptomycin: có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces griseus, có khả năng

chống vi khuẩn Gram dương ma ̣nh Streptomycin được sử du ̣ng rất hiê ̣u quả để điều

trị các bệnh dịch hạch, chữa bê ̣nh lao [13]

Tetracyclin: Được tách chiết từ dịch nuôi cấy một số chủng xa ̣ khuẩn thuô ̣c chi Streptomyces , chất kháng sinh này có phổ kháng sinh rô ̣ng , chống được vi

khuẩn Gram dương và âm trừ mô ̣t vài loa ̣i virus lớn Tetracyclin được sử du ̣ng

trong y ho ̣c và còn được sử du ̣ng trong chăn nuôi-thú y [13]

Daunorubixin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces coeruleorubidus,

đươ ̣c dùng để điều tri ̣ bê ̣nh ba ̣ch cầu cấp tính [20]

Erythromycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces erythrus, là chất

kháng sinh có phổ rộng đối với vi khuẩn Gram dương Được sử dụng trong điều trị

bê ̣nh viêm phổi do Mycoplasma và viêm họng do liên cầu khuẩn [13]

Gentamycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Micromonospora purpurea, có phổ

kháng sinh rộng , có tác dụng chống vi khuẩn Gram dương như tu ̣ cầu , phề cầu đã kháng lại penicillin trừ như màng não cầu [13]

Neomycin: Được tách ra từ xạ khuẩn Streptomyces fradiae vào năm 1949 có

tác dụng chống cả vi khuẩn Gram dương và âm trừ Đặc biệt là chống được nhiều

loại vi khuẩn đã kháng lại với Streptomycin và Penicillin [13]

Amphoterycin B: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces nodosus, được sử

dụng để điều trị các bệnh ngoài da do nấm Candida abbicans gây ra [20, 54]

Dactinomycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces antibiticus, có hoạt

tính kìm hãm phát triển các khối u ác tính , đươ ̣c dùng để điều tri ̣ mô ̣t số bê ̣nh ung thư [20, 61]

Novobicin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces spheroides và Streptomyces niverus, có hoạt tính mạnh kháng sinh với vi khuẩn Gram dương, khả

năng chống các tụ cầu đã kháng với Penicillin và một số chất kháng sinh khác [20]

Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960, nhiều chất kháng sinh mới đươ ̣c xác đi ̣nh hầu hết từ xa ̣ khuẩn, bảng 1.1

Bảng 1.1 Chất kháng sinh được phát hiê ̣n [8, 38]

Năm CKS đươ ̣c phát hiê ̣n Nước Năm CKS đươ ̣c phát

hiê ̣n

Nước

1943 Streptomycin/Bacitracin Mỹ 1945 Cephalosporin Italia

1.4.3 Sư ̣ hình thành chất kháng sinh ở xa ̣ khuẩn

Mô ̣t trong những đă ̣c điểm quan trong của xa ̣ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh Trong số 8000 CKS hiê ̣n biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn

xạ khuẩ, hai giả thuyết được ủng hô ̣ hơn cả là viê ̣c tổng hợp CKS nhằm ta ̣o ra ưu thế phát triển ca ̣nh tranh có lợi cho chủng sinh kháng sinh , nhờ đo chúng có thể tiêu diê ̣t hay kìm hãm được sự phát triển của cá c loài khác cùng tồn ta ̣i và phát triển trong hê ̣ sinh thái cu ̣c bô ̣ đó và viê ̣c tổng hợp CKS là mô ̣t đă ̣c tính cần thiết và đ ảm bảo cho khả năng sống sót cao của chủng sinh ra CKS trong tự nhiên nhất là các loài có bào tử [3]

Đa số các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xa ̣ khuẩn đều có phổ kháng

kháng sinh rộng , kìm hãm hoặc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nhiều loài VSV khác nhau Mă ̣c dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng , nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo số con đường nhất đi ̣nh như: CKS được tổng hợp từ mô ̣t chất chuyển hóa sơ cấp duy nhất như chloramphenicol, các kháng sinh thuộc nhóm nucleotide ; CKS được hình thành từ hai hoă ̣c ba chất trao đổi bâ ̣c mô ̣t khác nhau như lincomycin , novobiocin; CKS đươ ̣c hình thành bằng con đường polymer hóa các chất trao đổi bâ ̣c mô ̣t, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác [19] Có thể phân biê ̣t thành 4 dạng trong các con đường sing tổng hợp chất kháng sinh như [32]:

- Chất kháng sinh nhóm polypeptit theo con đườ ng trùng hợp các acid amin : bacitracin; polymycin,

- Chất kháng sinh đươ ̣c ta ̣o thành nhờ phản ứng polyme hóa các đơn vi ̣ acetat , propionat: chất kháng sinh nhóm macrolit, tetracilin, rifamicin,

- Chất kháng sinh aminoglycozit đươ ̣c ta ̣o thành nhờcác phản ứng trùng hợp polysacarit: neomicin, streptomycin,

- Chất kháng sinh đươ ̣c hình thành theo con đường tổng hợp các hợp chất izopreonit từ các đơn vi ̣ acetate,

Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều kiện đa gen , ngoài các gen chịu trách nhiệm tổng hợp chất kháng sinh , còn có các gen chịu trách nhiê ̣m tổng hơ ̣p các tiền chất, enzyme

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh

1.5.1 Điều kiê ̣n nuôi cấy

- Độ thông khí: Các xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí nên độ thông khí để

đa ̣t hiê ̣u suất cực đa ̣i đóng vai trò quan tro ̣ng ảnh hưởng khả năng sinh chất kháng sinh ; lươ ̣ng không khí cung cấp vào môi trường nuôi cấy là lưu lượng

thuổi khí mô ̣t thể tích môi trường/mô ̣t phút

- Nhiệt đô ̣: Trong những loại xạ khuẩn ưa nhiệt hay sống tốt khi nhiê ̣t độ của môi

trường cao nhưng đa số các xa ̣ khuẩn thường phát triển tốt ở 28°-37°C Nhiê ̣t đô ̣

tối ưu cho sinh tổng hơ ̣p chất kháng sinh nằm trong khoảng 18°-30°C

- pH: Trong sự sinh tổng hơ ̣p chất kháng sinh ph ụ thuộc vào đáng kể độ pH của môi trường Độ pH thích hợp để sinh tổng hợp chất kháng sinh là pH trung tính,

ở pH acid và kiềm sẽ ức chế quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh

- Nhân giống : Sự sinh tổng hơ ̣p chất kháng si nh không chỉ phu ̣ thuô ̣c vào điều kiê ̣n lên men mà con phu ̣ thuô ̣c vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng , tuổi và khả năng đồng đều về mă ̣t di truyền và hoa ̣t tính trao đổi chất của giống

phản ánh điều kiện nuôi cấy

- Hình thức lên men : Trong sinh tổng hợp chất kháng sinh phương pháp nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định Qui trình sản xuất chất kháng sinh thường được nuôi cấy theo phương pháp nuôi cấy chìm trong nồi lên men có

khuấy đảo và su ̣c khí

1.5.2 Thành phần muôi trường nuôi cấy

Các vi sinh vật khi đã phát triển trên môi trường nhân giống và cấy truyền lên môi trường lên men có nguồn gốc carbon , nitơ, phosphate vô cơ và các thành phần môi trường khác nhau sẽ dẫn đến khả năng sinh chất khác nhau [66]

- Nguồn gốc carbon : quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh chịu ảnh hưởng thông qua các nguồn ca c bon khác nhau Tuỳ thuộc vào từng chủng mà cần chọn nguồn ca c bon thích hợp ; Đối với xạ khuẩn , nhiều chủng có hoa ̣t tính amylaza cao nên nguồn gốc ca c bon thích hợp đối với chủng là tinh bô ̣t

- Nguồn ni tơ: nguồn và nồng đô ̣ ni tơ trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn thường đỏi hỏi có cả 2 nguồn ni tơ hữu cơ và vô cơ trong môi trường Nguồn ni tơ hữu cơ là các hợp chất từ thự c vâ ̣t như bô ̣t đâ ̣u xanh , đâ ̣u tương, và nguồn nitơ vô cơ là muối amon hoặc nitrat

1.6 Sƣ ̣ ƣ́ng du ̣ng chất kháng sinh tƣ̀ xa ̣ khuẩn

Xạ khuẩn là có vai trò ý nghĩa quan trọng trong công nghệ sinh học Trong các hợp chất ứng dụng trên toàn cầu được hình thành bởi các vi sinh vật thì xạ khuẩn, nấm và vi khuẩn chiếm tỷ lệ tương ứng 45%, 38% và 17% [36] Xạ khuẩn không chỉ đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái tự nhiên và còn là nguồn sản xuất thuốc kháng sinh, thuốc kháng u, enzyme, các chất ức chế enzyme Các sản phẩm từ xạ khuẩn đa dạng và được áp dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp, nông nghiệp, lâm nghiệp và ngành công nghiệp dược phẩm [46, 57]

Xạ khuẩn đóng vai trò như một mắt xích trong sinh thái tự nhiên Họ phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như axit humic trong đất Nhiều xạ khuẩn có khả năng cho hòa tan lignin và phân hủy các hợp chất liên quan lignin bằng cách sử dụng các enzyme thủy phân như cellulose và hemicellulose và peroxidase ngoại bào [58, 55]

1.6.1 Ứng dụng trong y ho ̣c

Phần lớn các chất kháng sinh (1/3 các chất kháng sinh) được sử du ̣ng trong y học có nguồn gốc từ xạ khuẩn Sự phát triển ngành dược phẩm, cùng với hiê ̣n tượng kháng thuốc ngày càng phổ biến , thúc đấy các nghiên cứu mới , tìm ra các hợp chất kháng sinh mới, có khả năng điều trị bê ̣nh từ xạ khuẩn [42]

Hiê ̣n nay , y ho ̣c đã sử du ̣ng thuốc kháng sinh trong điều tri ̣ ung thư như Daunorubicin được dùng trong điều tri ̣ bê ̣nh ba ̣ch cầu cấp tính ; các thuốc kháng

sinh như Mitomycin (từ Streptomyces cacspitosus) đươ ̣c du ̣ng trong điều tri ̣ ung thư

vú, phổi, dạ dày,…[21] Trong y ho ̣c, mô ̣t số loa ̣i thuốc kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn như : Gentamycin, Dactinomycin, Strepyomycin, Daunorubicin, Mitomycin,…(hình 1.8)

 Daunorubicin: có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces coeruleorubidus được

dùng trong điều tri ̣ bê ̣nh ba ̣ch cầu cấp tính

 Streptomycin: có nguồn gốc từ Streptomyces griseus, được sử du ̣ng hiê ̣u quả

trong điều tri ̣ bê ̣nh lao

Hình 1.8 Mô ̣t số thuốc kháng sinh du ̣ng trong y ho ̣c có nguồn gốc từ xa ̣ khuẩn [73]

1.6.2 Ứng dụng trong bảo vệ thực vật

Viê ̣c sử du ̣ng các chất kháng sinh trong công tá c bảo vê ̣ thực vâ ̣t được phổ biền rô ̣ng rãi trên thế giới nhất là ở nước Nhâ ̣t, Nga, Ấn Đô ̣, Trong Quốc, các CKS đươ ̣c dùng trong công tác bảo vê ̣ thực vâ ̣t thường ở da ̣ng bô ̣t hoă ̣c dung di ̣ch có bổ sung các chất phụ gia để tăng độ bền của chất kháng sinh Chất kháng sinh có thể đươ ̣c trô ̣n lẫn vào đất , phun trực tiếp lên thực vâ ̣t hoă ̣c dùng trong quá trình xử lý hạt giống để tiệu diệt các mầm bệnh ở bên trong và bên hạt Các chất kháng sinh đươ ̣c dùng để tiê ̣u diê ̣t các nấm và vi khuẩn gây bê ̣nh cho gây trồng như các bê ̣nh khô vắn, vàng lụa ở lúa, bê ̣nh thối cổ rễ ở các cây có củ , làm kích thích tăng trưởng ở những nồng độ nhất định như khích thích sự nảy nấm của hạt

Năm 1950, Trung quốc đã tyuển cho ̣n được chủng Streptomyces sp 5406 mà có khả năng ức chế Rhizoctonia solani và Verticillium alboatrum gây thối rễ ở bông

non [18] Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lâ ̣p đươ ̣c chủng Streptomyces sp 201 có khả

năng sinh chất kháng sinh mới là z -methylheptyliso-nicotinate, chất kháng sinh này

semitectum, Fusarium oxysporum, [17] Môt số chế phẩm sinh học p hòng trừ bệnh cây mà xa ̣ khuẩn đóng vai trò chính có như : Mycostop, Biomycin, Actinovate, (hình 1.9)

Hình 1.9 Mô ̣t số kháng sinh du ̣ng trong bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ

xạ khuẩn [74]

1.6.3 Ứng dụng trong chăn nuôi

Chất kháng sinh được ứng du ̣ng rô ̣ng rãi trong mô ̣t số lĩnh vực khác như: bảo

vệ thực vâ ̣t, bảo quản thực phẩm , chăn nuôi , Trong chăn nuôi , chất kháng sinh đươ ̣c dùng để phòng chữa bê ̣nh và kích t hích tăng trọng cho gia súc CKS bổ sung vào thức ăn chăn nuôi có tác dúng ức chế và loại bỏ sự hoạt động của vi khuẩn , đă ̣c biê ̣t là vi khuẩn gây bê ̣nh đường tiêu hóa và hô hấp trên đô ̣ng vâ ̣t non mà làm cho chúng khỏe mạnh , tăng trưởng tốt Chất kháng sinh thường được sử du ̣ng trong chăn nuôi có như biomycin, tetracyclin, terranycin, [1] (hình 1.10)

Hình 1.10 Mô ̣t số thuốc kháng sinh du ̣ng trong chăn nuôi có nguồn gốc từ

xạ khuẩn [75]

1.6.4 Ứng dụng trong bảo vệ thực phẩm

CKS được sử du ̣ ng trong công nghê ̣ thực phẩm , dùng kháng sinh để bảo quản thực phẩm vừa rẻ vừa đơn giản , vừa ngon, và không cần trang thiệt bị đặc biệt nhưng vẫn đảm bảo chất lượng thực phẩm Mô ̣t số chất kháng sinh được sử du ̣ ng trong bảo quản thực phẩm như : nisin, biomicin, actidion, [1] (hình 1.11) Tuy nhiên, trong công viê ̣c sử du ̣ng chất kháng sinh trong bảo quản thực phẩm cũng còn có một số tồn tại chất kháng sinh khó phân hủy và khi tồn dư trong thực phẩm có thể gây ra nhiều mối nguy hiểm cho con người

Hình 1.11 Mô ̣t số kháng sinh du ̣ng trong bảo vê ̣ thực phẩm nguồn gốc từ

xạ khuẩn [75]

1.7 Các phương pháp phân loại xạ khuẩn

1.7.1 Phương pha ́ p phân loa ̣i xa ̣ khuẩn theo phương pháp truyền thống

Các đặc điểm phân loại về hình thái, các đặc điểm sinh lý , sinh hóa thường đươ ̣c sử dụng để định danh xạ khuẩn

Đặc điểm sinh lý , sinh hóa thường được kết hợp sử du ̣ng trong phân loa ̣i xạ khuẩn là khả năng đồng hóa các nguồn gốc cac bon và ni tơ, nhu cấu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng phân hủy các chất khác nhau nhờ hê ̣ thống enzyme [65] Các chỉ tiêu khác như ảnh hưởng với pH, nhiê ̣t đô ̣, khả năng chịu muố i và các yếu tố khác của môi trường , mối quan hê ̣ với chất kìm hãm sinh trường và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm vớ i chất kháng sinh, khả năng tạo thành

1.7.2 Phương pha ́ p phân loa ̣i xa ̣ khuẩn theo phương pháp hiê ̣n đa ̣i

Tất cả các loài vi sinh vật trong đều sử du ̣ng cùng mô ̣t cách tổng hợp prote in nhờ các ribosome , vì vậy sự tiến hành so sánh trình tự nucleotit của gen mã hóa rDNA ở các VSV khác nhau để xác định mối quan hệ giữa chúng Cấu trú c của rDNA thay đổi rất chậm theo thời gian , hay nói cách khác gen mã h óa cho chúng đươ ̣c bảo tồn rất tốt trong quá trình tiến hoá [30]

Hiê ̣n nay, phân loa ̣i xạ khuẩn được tiến hành dựa trên so sánh trình tự gen mã hóa cho phân tử 16S rDNA kết hơ ̣p với các đă ̣c điểm khác theo phân loa ̣i truyền thống Các nhà phân loại học thường lấy ngưỡng 98% trong độ tương đồng về tình tự 16S rDNA để phân biệt 2 loại khác nhau Hai loa ̣i chủng xạ khuẩn được coi là hai loài riêng biệt nếu chúng có độ tương đồng về DNA genome thấp hơn 70% Dựa trên mức đô ̣ tương đồng về t rình tự 16S rDNA người ta có thể du ̣ng cây phát sinh chủng loại thể hiện mối tương quan của các loại đang nghiên cứu với các loại có họ hàng gần và tổ tiên của chúng Trong đa số trường hợp, các phân tích về hóa phân loại và sinh lý , sinh hóa có sự tương đồng cao so với phân loa ̣i theo trình tự 16S rDNA [31]

1.8 Khả năng sinh tổng hợp enzyme ở vi sinh vật

1.8.1 Ứu thế của vi sinh vật để sinh tổng hợp enzyme

Enzyme là những protein được sản xuất trong cơ thể sống vâ ̣t, có vai trò quyết đi ̣nh quá trình trao đổi chất của tế bào Viê ̣c sản xuất và sử du ̣ng enzyme đã có từ lâu ở nhiều nước trên thế giới Tuy nhiên, chỉ sau con người chứng minh được khả năng xúc tác của enzyme ngoài tế bào thì việc nghiên cứu , sản xuất và ứng dụng enzyme mới thực sự phát trển ma ̣nh mẽ Hiê ̣n nay, nhiều loa ̣i enzyme đã được sản xuất ra với sản lượng lớn và được sử dụng rô ̣ng rãi trong nhiều ngành kinh tế như: công nghiê ̣p thực phẩm, dược phẩm, dê ̣t, hóa chất, [24]

Vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng là đối tượng chính được sử dụng để sản xuất enzyme Do chúng có thể đồng hóa được hầu hết các chất có trong t ự nhiên, từ các hợp chất đơn giản như : N2, S, Fe, CO2, CH4, đến các hợp chất hữu

cơ phức ta ̣p như: tinh bô ̣t, protein, các protein celluose, [4]

1.8.2 Mô ̣t số enzyme có nguồn gốc tƣ̀ xa ̣ khuẩn

Ở xạ khuẩn , enzyme tổng hơ ̣p chủ yếu tiết ra môi trường bên ngoài , giúp xạ khuẩn tâ ̣n du ̣ng tối đa nguồn dinh dưỡng có được do môi trường cung cấp Enzyme từ xạ khuẩn được ứng dụng ngày càng (trên1000 loại enzyme khác nhau) tập trung chủ yếu là các enzym thủy phân: amylase, celluloase và protease [23] Mô ̣t số enzyme phổ biến có thể thu nhâ ̣n từ xa ̣ khuẩn và được ứng dụng vào sản xuất như:

 Amylase: được thu nhâ ̣n từ Streptomyces erumpens, Nocardiopis sp [48, 49]

Các enzyme amylase có ý nghĩa quan trọng trong việc phân hủy phế thải chứa các nguồn tinh bột từ các làng nghề làm bún , bánh cuốn, bánh đa, chế biến nông sản ngô, sắn, khoai, [43]

 Cellulose: chu yếu được thu nhâ ̣n từ chi Streptomyces sp tối ưu trong điều kiê ̣n

môi trường pH kiềm và nhiê ̣t đô ̣ cao [68] Enzyme cellulose có vai trò quan trọng trong sự ứng dụng trong công nghiệp dệt may và sản xuật thức ăn chăn nuôi [51] Ngoài ra , có một số chi xa ̣ khuẩn khác như Thermobifida và Micromonospora cũng được sử dụng để sản xuất một lượng lớn cellulose tái tổ

hơ ̣p có giá tri ̣ thương ma ̣i cao, có chi phí thấp, tâ ̣n du ̣ng tối đa các nguồn phế thải như vu ̣n giấy, vỏ trái cây [44]

 Protease: thu nhâ ̣n được từ Streptomyces pactum [60], Streptomyces nogalator

[41], ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm và xử lý môi

trường Protease thủy phân các protein không tan thông qua nhiều bước , ban đầu chúng được hấp thụ lên các chất rắn, cắt các chuỗi polypeptit [59]

 Chitinase: chủ yếu thu nhận được ở các loại xạ khuẩn có môi trường ở biển ,

rừng ngâ ̣p mă ̣n Hiê ̣n này , chitinase từ Microbispora sp được ứng du ̣ng trong

quy trình thu hồi chitobiose -mô ̣t chất chống oxy hóa tiềm năng , có vai trò quan trọng trong y sinh học [53]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 Vâ ̣t liê ̣u nghiên cứu

2.1 Mẫu đất

4 mẫu đất được lấy từ các địa điểm khác nhau ở Lào như: 1 mẫu đất được lấy từ làng Hai Park Nguem , huyê ̣n P arknguem và 3 mẫu đất được lấy từ làng Huay Tay, Non Sieng Chan, và Dong Dok, huyện Xaythany, thủ độ Viêng Chăn, bảng 2.1

Bảng 2.1 Các địa điểm lấy mẫu đất

lấy mẫu

Kí hiê ̣u

Huyê ̣n Parknguem, thủ đô Viêng Chăn, Lào

Huyê ̣n Xaythany, thủ độ Viêng Chăn, Lào

Hình 2.1 Hình mẫu đất thu thập tại Lào

Làng Dong Dok (bên trái) và Làng Hai Park Nguem (bên phải)

2.2 Vi sinh vâ ̣t kiểm đi ̣nh

Các chủng vi sinh vâ ̣t kiểm đi ̣nh gồm 4 chủng loại thuô ̣c nhóm vi khuẩn Gram dương và Gram âm Các chủng vi sinh vật kiểm định được cung cấp từ Việ n

vi sinh vâ ̣t và Công nghê ̣ sinh ho ̣c, ĐHQGHN, bảng 2.2

Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật kiểm định

Tên vi sinh vâ ̣t kiểm đi ̣nh Nơi cung cấp

Gram dương Staphylocuccus aureus ATCC 25923

Bacillus subtilis ATCC 23857 Bacillus cereus ATCC 14579

Viê ̣n Vi sinh vâ ̣t và Công nghê ̣ sinh học, ĐHQGHN Gram âm Escherichia coli ATCC 25922

2.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.3.1 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng đạt yêu cầu phân tích

2.3.2 Dụng cụ và thiết bị

- Tủ ấm (Memmert, Đức)

- Tủ sấy (Memmert, Đức)

- Máy cất nước 2 lần (Aquation, Anh)

- Tủ lạnh (LG, Việt Nam)

- Máy ly tâm (Sartorius, Đức)

- Máy lắc (Sartorius, Đức)

- Máy đo pH (Thermo, scientific orion, Mỹ)

- Nồi khử trùng (ALP, Nhâ ̣t)

- Kính hiển vi điện tử Olympus (CX21, Nhật)

- Máy vortex (Ika, Đức)

- Cân Pressica XT 220A (Ý)

- Tủ cấy vi sinh vật (Aura vertical, Ý)

2.4 Các môi trường dùng nghiên cứu

2.4.1 Môi trươ ̀ ng phân lâ ̣p xa ̣ khuẩn

1 Starch Casein Agar (SCA) (g/L)