Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi aspergillus oryzae

Các gen liên quan Quá trình chuyển đổi DMDHST -> AFB2, AFG2 Trong hai thập kỷ qua, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã đƣợc sử dụng để phân biệt các loài thuộc phân nhóm Flavi nhƣ kỹ th

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

-

Nguyễn Thị Khuyến

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN

GEN BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

CHO NẤM SỢI Aspergillus oryzae

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

-

Nguyễn Thị Khuyến

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN

GEN BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

CHO NẤM SỢI Aspergillus oryzae

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Văn Tuấn

Hà Nội - 2016

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn thạc sĩ của mình, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới

TS Trần Văn Tuấn - Bộ môn Vi sinh vật học, Trưởng Phòng Genomic, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên– Đại học Quốc gia Hà Nội, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và luôn tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo và các thành viên Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein đã giúp đỡ, cung cấp cơ sở vật chất và tạo điều thuận lợi cho em hoàn thành tốt nghiên cứu của mình Em cũng vô cùng biết

ơn các thầy cô Bộ môn Vi sinh vật học và Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình chỉ bảo, truyền đạt những kiến thức quý báu và giúp đỡ

em trong quá trình học tập

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè và các em, các anh chị Phòng Genomic đã khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và trong cuộc sống

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 09 tháng 11 năm 2016

Học viên

Nguyễn Thị Khuyến

cDNA Complementary deoxyribonucleic acid

GFP Green fluorescent protein

IM Induction medium (Môi trường cảm ứng)

ITS Internal transcribed spacer

Left Border PCR Polymerase chain reaction

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các gen liên quan trong quá trình sinh tổng hợp aflatoxin………… ….8 Bảng 2.1 Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu……… ……… 20 Bảng 2.2 Mồi PCR dùng trong nghiên cứu……… ……… 22

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Hình thái khuẩn lạc và cấu trúc cuống sinh bào tử của nấm sợi

Aspergillus oryzae RIB40

Hình 1.5 Biểu hiện gen GFP ở nấm sợi Aspergillus fumigatus 18

Hình 1.6 Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợi Fusarium oxysporum 19

Hình 3.1 Hình thái A oryzae và A flavus trên đĩa môi trường PDA và

dưới kính hiển vi quang học

36

Hình 3.2 Kiểm tra sự phát quang của độc tố aflatoxin trên môi trường

CAM của các chủng A flavus NRRL 3357, A oryzae RIB40 và

Hình 3.6 Sơ đồ tạo cấu trúc xóa gen pyrG ở nấm sợi A oryzae 44

Hình 3.7 Các bước xóa gen pyrG ở A oryzae sử dụng phương pháp

ATMT

45

Hình 3.8 Kiểm tra khả năng sinh trưởng của các chủng xóa gen trên các

môi trường Czapek-Dox có và không có 5-FOA, uridine, uracil

46

Hình 3.9 Xác nhận các chủng xóa gen pyrG bằng PCR 47

Hình 3.14 Tạo vector pEX3 biểu hiện enzyme phytase 54

Hình 3.15 Quy trình chuyển gen vào A oryzae trợ dƣỡng uridine/uracil

Hình 3.19 Chuyển gen vào chủng A oryzae VS1 trợ dƣỡng uridine/uracil 61

Hình 3.20 Biểu hiện gen DsRed ở chủng AUT1-PlD trợ dƣỡng

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu chung về nấm sợi Aspergillus oryzae 3

1.1.1 Đặc điểm sinh học của nấm sợi Aspergillus oryzae 3

1.1.2 Đặc điểm di truyền của nấm sợi A oryzae 4

1.1.3 Vai trò của nấm sợi A oryzae 5

1.1.4 Phân biệt Aspergillus oryzae với Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin 6 1.2 Các phương pháp chuyển gen vào nấm sợi 9

1.2.1 Phương pháp chuyển gen sử dụng tế bào trần (protoplast) 9

1.2.2 Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện (electroporation) 10

1.2.3 Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens (ATMT) 10

1.2.4 Marker sử dụng trong chọn lọc các chủng chuyển gen 14

1.2.5 Một số gen chỉ thị dùng trong chuyển gen ở vi nấm 17

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

2.1 Nguyên liệu 20

2.1.1 Chủng vi sinh vật 20

2.1.2 Thiết bị và hóa chất 22

2.1.3 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Thu nhận bào tử nấm 26

2.2.2 Tách chiết DNA, RNA và tổng hợp cDNA 27

2.2.3 Quan sát hình thái và kiểm tra một số đặc điểm sinh lý sinh hóa 28

2.2.4 Phân biệt A oryzae và A Flavus bằng các kỹ thuật sinh học phân tử 29

2.2.5 Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen 30

2.2.6 Chuyển gen vào nấm sợi A oryzae 33

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Xác nhận chủng A oryzae an toàn để sử dụng cho chuyển gen 36

3.1.1 Phân biệt các chủng A oryzae an toàn và chủng Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin 36

3.1.2 Lựa chọn chủng A oryzae phục vụ cho chuyển gen 40

3.2 Lựa chọn marker chuyển gen vào A oryzae 41

3.3 Xây dựng hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens 43

3.3.1 Xóa gen pyrG để tạo chủng đột biến trợ dưỡng uridine/uracil 43

3.3.2 Tạo một số vector nhị thể dùng cho chuyển gen vào A oryzae trợ dưỡng uridine/uracil 50

3.4 Đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen với gen huỳnh quang GFP và DsRed 54

3.4.1 Chuyển gen GFP và DsRed vào nấm sợi A oryzae trợ dưỡng uridine/uracil 54

3.4.2 Xác nhận các thể chuyển gen 57

3.5 Ứng dụng hệ thống chuyển gen mới thiết lập để biểu hiện gen phyA mã hóa enzyme phytase của A fumigatus ở A oryzae 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

MỞ ĐẦU

Aspergillus oryzae là loài nấm sợi được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực

phẩm truyền thống và đồ uống tại nhiều nước châu Á bao gồm Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia và Philippines Loài nấm này đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn

(GRAS) Ở Việt Nam, A oryzae được sử dụng để sản xuất tương truyền thống tại một số địa phương ở các tỉnh phía Bắc A oryzae có khả năng tiết một lượng lớn

các enzyme khác nhau vào môi trường Do đó, loài nấm này được sử dụng như nhà máy tế bào để sản xuất thương mại nhiều loại enzyme và protein cả ở dạng tự nhiên

và tái tổ hợp Gần đây chủng A oryzae RIB40 dùng trong sản xuất công nghiệp tại

Nhật Bản đã được giải trình tự toàn bộ hệ gen Sự hiểu biết tường tận về hệ gen của

A oryzae mở ra nhiều cơ hội trong cải biến di truyền và biểu hiện gen trên loài nấm

sợi an toàn này

Hiện nay, hai phương pháp phổ biến nhất trong chuyển gen vào nấm sợi là

chuyển gen qua tế bào trần và chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens Tuy nhiên việc chuyển gen vào nấm sợi A oryzae cho đến nay chỉ sử

dụng phương pháp chuyển gen qua tế bào trần Phương pháp này tương đối phức tạp và tốn kém, khó có thể thực hiện tại điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam

Phương pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn A tumefaciens đơn giản hơn với chi phí

hợp lý Tuy nhiên chưa có một nghiên cứu nào báo cáo về việc chuyển gen thành

công ở nấm sợi A oryzae Bên cạnh đó, A oryzae có khả năng kháng lại hầu hết các

hợp chất kháng sinh thường được sử dụng cho chuyển gen Do đó phát triển các

chủng A oryzae trợ dưỡng để sử dụng cho chuyển gen là giải pháp duy nhất để cải biến di truyền cũng như biểu hiện gen ở A oryzae

Với mục đích xây dựng hệ thống chuyển gen hiệu quả cho nấm sợi A oryzae thông qua vi khuẩn A tumefaciens nhằm phục vụ hướng nghiên cứu bền vững về

biểu hiện enzyme/protein tái tổ hợp ở loài nấm này, chúng tôi thực hiện đề tài

―Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens cho nấm sợi Aspergillus oryzae‖ với những nội dung chính như sau:

- Xác nhận các chủng A oryzae an toàn, có thể sử dụng làm đối tượng

chuyển gen

- Tạo chủng A oryzae đột biến trợ dưỡng uridine/uracil bằng cách xóa gen

pyrG

- Tạo một số vector nhị thể (binary vector) sử dụng cho chuyển gen và biểu

hiện gen ở nấm sợi A oryzae

- Đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen sử dụng các gen chỉ thị huỳnh

quang GFP và DsRed

- Bước đầu ứng dụng hệ thống chuyển gen mới tạo được để biểu hiện gen

phyA mã hóa enzyme phytase từ nấm sợi Aspergillus fumigatus

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về nấm sợi Aspergillus oryzae

1.1.1 Đặc điểm sinh học của nấm sợi Aspergillus oryzae

Nấm sợi A oryzae thuộc phân nhóm Flavi của chi Aspergillus, trong họ

Trichocomaceae A oryzae có cấu tạo đa bào, khi được nuôi cấy trên môi trường

đĩa thạch, hệ sợi có màu trắng xám sau đó phát triển chuyển sang màu vàng nhạt

đến xanh Hệ sợi nấm A oryzae sinh trưởng rất nhanh và phân mảnh, chiều ngang

có kích thước 5-7 µm Trên những sợi này hình thành cấu trúc sinh sản vô tính, gọi

là cuống sinh bào tử Cuống sinh bào tử của A oryzae thường dài 1-2 mm Trên

cuống phồng lên tạo thành bọng, từ bọng này mọc lên các tế bào nhỏ, thuôn dài hình chai, xếp sát nhau, gọi là thể bình; trên thể bình có đính những chuỗi bào tử màu vàng lục hay màu vàng hoa cau (còn gọi là bào tử đính) [31, 53, 80, 99] Hình

thái khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của nấm sợi A oryzae được Machida và cộng

sự mô tả chi tiết như trong Hình 1.1

Hình 1.1 Hình thái khuẩn lạc và cấu trúc cuống sinh bào tử của nấm sợi

Nấm sợi A oryzae sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 30ºC-40ºC, chúng có thể sinh

trưởng và phát triển dễ dàng trên nhiều loại cơ chất khác nhau như các mảnh vụn

thực vật, cây lá, gỗ mục nát, các loại hạt, thức ăn gia súc A oryzae phân bố rộng

rãi trên toàn thế giới, đặc biệt phổ biến ở các nước nhiệt đới Trong quá trình sinh

trưởng và phát triển, A oryzae tiết ra môi trường một lượng lớn các enzyme thủy

phân như cellulase, pectinase, xylanase, amylase, protease, glucoamylase [36, 53]

1.1.2 Đặc điểm di truyền của nấm sợi A oryzae

Gần đây, chủng A oryzae RIB40 được sử dụng trong công nghiệp sản xuất

các thực phẩm lên men truyền thống tại Nhật Bản đã được giải trình tự toàn bộ hệ

gen, theo đó hệ gen của A oryzae gồm 8 nhiễm sắc thể với tổng kích thước là 37

megabase (Mb), dự đoán có 12.074 gen mã hóa protein, lớn hơn 25%-30% so với

các loài khác thuộc chi Aspergillus Chẳng hạn, hệ gen của A oryzae lớn hơn loài A

nidulans (loài chuẩn dùng cho nghiên cứu trong phòng thí nghiệm) và A fumigatus

(tác nhân gây bệnh cơ hội ở người) lần lượt là 29% và 34% [53] Hệ gen của A

oryzae lớn hơn chủ yếu do thu nạp thêm DNA trong quá trình tiến hóa Việc mở

rộng kích thước hệ gen dường như đặc trưng cho các loài có quan hệ gần gũi với A

oryzae như A niger và A flavus, các loài này có kích thước hệ gen tương đương

nhau Đặc biệt loài có quan hệ rất gần gũi với A oryzae là A flavus có độ tương

đồng DNA đến 99,5% [2, 53, 85]

A oryzae có khả năng phân giải mạnh nhiều loại cơ chất có trong tự nhiên do

loài này sở hữu các gen mã hóa enzyme thủy phân khác nhau Các loài A oryzae, A

fumigatus và A nidulans chứa lần lượt 135, 99 và 90 gen mã hóa cho các protease,

chiếm khoảng 1% tổng số các gen trong hệ gen Tất cả các gen mã hóa protease

được tìm thấy trong A fumigatus và/hoặc A nidulans đều có mặt trong A oryzae, tuy nhiên các gen mã hóa một số enzyme aminopeptidase có mặt trong A oryzae lại không có mặt trong hệ gen của A fumigatus và A nidulans Ngoài ra, A oryzae còn

sở hữu thêm nhiều gen mã hóa protease tiết có khả năng hoạt động trong môi

trường có tính axit Sự gia tăng các protease hoạt động trong pH axit của A oryzae

có thể hình thành trong quá trình thuần hóa của con người [53] Sự hiểu biết tường

tận về hệ gen của Aspergillus oryzae đã mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu

cải biến di truyền ứng dụng loài nấm an toàn này trong sản xuất các sản phẩm nhằm phục vụ mục đích con người

1.1.3 Vai trò của nấm sợi A oryzae

Nấm sợi A oryzae được thuần hóa từ ít nhất 2000 năm trước và hiện nay

được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm ở Nhật Bản, Trung Quốc và các nước Đông Á như lên men đậu nành, làm nước sốt, tương và một số đồ uống có cồn

như huangjiu, sake, makgeolli và shochu [4, 36, 111] A oryzae được sử dụng rộng

rãi trong thực phẩm do đặc tính sinh trưởng nhanh, tiết lượng lớn các enzyme thủy phân như amylase, glucoamylase, carboxypeptidase, protease trong quá trình sinh trưởng và tạo mùi thơm dễ chịu cho các sản phẩm lên men [37] Trong lên men

truyền thống, A oryzae thường được nuôi ở môi trường rắn, điều kiện này thích hợp

cho sự phát triển hiếu khí của sợi nấm Độ ẩm thích hợp trong quá trình lên men ở môi trường rắn giúp tăng khả năng sản sinh các enzyme và các chất chuyển hóa mà thường sẽ không được sản xuất trong điều kiện lên men lỏng [99]

Ngoài vai trò trong sản xuất các thực phẩm truyền thống, nấm sợi A oryzae

còn được sử dụng trong một số ngành công nghiệp sản xuất enzyme có giá trị kinh

tế cao như glucoamylase, α-amylase và một số protease phục vụ sản xuất bánh kẹo,

đồ uống Glucoamylase và α-amylase thuộc nhóm enzyme amylase, chiếm tới gần 20% tổng sản lượng enzyme được sản xuất, trong đó chủ yếu được sản xuất bởi

nấm sợi A oryzae [16, 81, 98, 113] Nguồn cung cấp enzyme protease cho công

nghiệp sản xuất thực phẩm và các chất tẩy rửa đến từ các loài nấm sợi thuộc chi

Conidiobolus, Verticillium, Penicillium và Aspergillus, trong đó phải kể đến loài

sinh protease rất cao là A oryzae [1, 106]

Bên cạnh những lợi ích về kinh tế, A oryzae còn được coi là vi sinh vật mô

hình dùng cho nghiên cứu về biểu hiện enzyme và protein tái tổ hợp Ngoài ra nghiên cứu chuyển gen còn hỗ trợ trong việc tìm ra chức năng cũng như vai trò của các gen mới [54]

1.1.4 Phân biệt Aspergillus oryzae với Aspergillus flavus sinh độc tố

aflatoxin

Hiện nay, tỷ lệ người mắc bệnh ung thư tăng lên ngày một tăng cao Một trong những nguyên nhân chính là do ăn phải thực phẩm chứa các chất gây ung thư, trong đó có độc tố nấm aflatoxin Độc tố aflatoxin được sinh ra bởi nấm mốc

Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus trên các loại hạt nông sản quan trọng

không được bảo quản tốt như gạo, lạc, ngô, đậu tương Hình thái của A flavus gần như giống hệt với loài A oryzae mà thường được sử dụng trong ngành công nghiệp

thực phẩm [17, 26, 80]

A flavus và A oryzae là hai loài thuộc phân nhóm Flavi của chi Aspergillus

Tương tự như A oryzae, nấm sợi A flavus có khả năng tồn tại ở nhiệt độ từ 12ºC

đến 48ºC và sinh trưởng tối ưu nhất ở 28ºC đến 37ºC Hầu hết trong chu trình sống

A flavus tồn tại ở dạng hệ sợi và sinh sản bằng bào tử đính Giống với một số chủng

A oryzae, dưới điều kiện bất lợi, sợi nấm A flavus chuyển thành cấu trúc đặc biệt

gọi là hạch nấm (sclerotia) Hạch nấm giúp chúng có thể tồn tại dưới các điều kiện khắc nghiệt Khi điều kiện trở nên thuận lợi, các hạch nấm sẽ phát triển thành dạng sợi và từ đó sinh ra các cuống mang bào tử đính, phát tán ra ngoài môi trường đất và

không khí [17, 26]

Trong tự nhiên, rất khó để có thể phân biệt hai loài A oryzae và A flavus bởi

hình thái rất giống nhau Hơn nữa, khi giải trình tự hai chủng đại diện cho hai loài,

nhận thấy genome của chủng A oryzae RIB40 và A flavus NRRL 3357 có độ tương

đồng 99,5% DNA và 98% protein [85] Phân tích tiến hóa trên một số chủng thuộc

hai chi này, nhận thấy A flavus và A oryzae có mức độ tương đồng tùy thuộc vào

từng chủng Ví dụ như hai chủng A flavus SRRC 1357 và SRRC 2112 có mối quan

hệ gần gũi với A oryzae hơn các chủng A flavus khác, do có nhiều đặc điểm của A

oryzae hơn (Hình 1.2) Từ các dữ liệu về hệ gen, A oryzae được cho rằng có nguồn

gốc phát sinh từ loài A flavus [18]

Hình 1.2 Mối quan hệ phát sinh loài và sự khác biệt trong hệ gen của A oryzae và

A flavus (màu xanh lam là A oryzae, màu xanh lá cây là A flavus) [18]

A oryzae khác với A flavus ở việc mất khả năng sinh độc tố aflatoxin trong

quá trình sinh trưởng do trong quá trình tiến hóa đã tích lũy nhiều đột biến điểm và đột biến mất đoạn ở một số gen liên quan đến sinh tổng hợp aflatoxin [8] Con đường sinh tổng hợp aflatoxin bắt nguồn từ axit norsolorinic (NOR), trải qua ít nhất 23 quá trình chuyển hóa trung gian, nhờ các enzyme được mã hóa bởi 25 gen nằm trong một vùng DNA kích thước 70 kb để tạo thành aflatoxin có độc tính cao nhất là aflatoxin B1 (AFB1) [47, 97, 112]

Các bước chuyển hóa được thực hiện bởi các enzyme có chức năng riêng biệt Các gen liên quan đến từng bước chuyển hóa trong quá trình sản xuất aflatoxin trong tế bào nấm được liệt kê tại Bảng 1.1

Bảng 1.1 Các gen liên quan trong quá trình sinh tổng hợp aflatoxin

Các gen liên quan Quá trình chuyển đổi

DMDHST -> AFB2, AFG2

Trong hai thập kỷ qua, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã đƣợc sử dụng để

phân biệt các loài thuộc phân nhóm Flavi nhƣ kỹ thuật PCR (Polymerase Chain

Reaction) [10], RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) [38], AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) [66], phân tích so sánh trình tự vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) của DNA ribosome [41] hoặc phân tích tính đa

hình nucleotide đơn SNP (Single Nucleotide Polymorphism) [45] Tuy nhiên, các

phương pháp kể trên vẫn còn những hạn chế nhất định trong việc phân biệt A

oryzae và A flavus hoặc thiếu sự ổn định trong các lần lặp lại thí nghiệm [8] Dựa

trên sự khác biệt về trình tự DNA của nhóm gen liên quan đến sinh tổng hợp

aflatoxin ở A flavus và A oryzae, một số cặp mồi PCR đặc hiệu cho các gen này đã được thiết kế và sử dụng để phân biệt A flavus và A oryzae [10]

1.2 Các phương pháp chuyển gen vào nấm sợi

Các nghiên cứu về di truyền học phân tử của nấm sợi đã có những đóng góp đáng kể cho sự hiểu biết của con người về cơ chế gây bệnh và các con đường sinh tổng hợp enzyme, protein Chuyển gen là một công cụ không thể thiếu trong các nghiên cứu này

Hiện nay, nhiều phương pháp chuyển gen được sử dụng như chuyển gen thông qua tế bào trần (protoplast), chuyển gen bằng xung điện, chuyển gen bằng súng bắn gen và chuyển gen sử dụng vi sinh vật trung gian là vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens Mỗi phương pháp đều có những ưu, nhược điểm riêng

và tùy thuộc vào từng loài mà hiệu suất chuyển gen khác nhau đối với từng phương pháp Tuy nhiên phương pháp được sử dụng phổ biến nhất ở nấm sợi là chuyển gen qua tế bào trần (protoplast), chuyển gen bằng xung điện (electroporation) và chuyển

gen trung gian qua vi khuẩn A.tumefaciens [6, 51, 62, 63]

1.2.1 Phương pháp chuyển gen sử dụng tế bào trần (protoplast)

Ðể chuyển gen vào nấm thông qua tế bào trần, tế bào nấm cần được xử lý enzyme nhằm loại bỏ thành tế bào, từ đó tạo protoplast giúp DNA dễ dàng xâm nhập vào tế bào Phương pháp này có thể được sử dụng để chuyển trực tiếp các đoạn DNA hoặc các vector mang gen mong muốn vào tế bào Ðể nâng cao hiệu quả chuyển gen, protoplast thường được xử lý với PEG (polyethylene glycol) hoặc bằng xung điện Phương pháp chuyển gen này khá hiệu quả, đặc biệt đối với những loài

mà các phương pháp chuyển gen khác không thể thực hiện được Tuy nhiên, quá

công sức, chi phí cao và không ổn định, đòi hỏi người thực hiện phải có nhiều kinh nghiệm, không thể áp dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm vừa và nhỏ Đặc biệt protoplast phải được sử dụng ngay sau khi chuẩn bị [51, 57]

1.2.2 Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện (electroporation)

Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện là phương pháp cơ học được sử dụng

để đưa các phân tử DNA vào trong tế bào chủ qua màng tế bào Trong phương pháp này, một xung điện cao thế trong thời gian rất ngắn (vài phần nghìn giây) tạo ra các

lỗ thủng tạm thời giúp cho các phân tử DNA ngoại lai từ môi trường có thể xâm nhập vào bên trong tế bào Phương pháp xung điện đã được áp dụng thành công trên nhiều loại tế bào, trong đó có tế bào nấm sợi [6, 7] Trước khi xử lý với xung điện, bào tử nấm nảy chồi sẽ được loại bỏ thành tế bào bằng một số enzyme để tạo tế bào trần Sau đó tế bào trần được trộn với DNA và được đưa vào máy tạo xung điện để chuyển DNA vào trong tế bào nấm [7] Phương pháp này mới chỉ áp dựng thành công với một số loài nấm sợi và đòi hỏi phải có thiết bị chuyên dụng dùng cho quá trình chuyển gen

1.2.3 Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens (ATMT)

1.2.3.1 Cơ chế chuyển gen vào tế bào chủ của A tumefaciens

Vi khuẩn A tumefaciens là một loài vi khuẩn Gram âm sống trong đất, thuộc chi Agrobacterium, họ Rhizobiaceae Vi khuẩn A tumefaciens là tác nhân gây khối

u trên thực vật nhờ chuyển một phần DNA (T-DNA) trên plasmid cảm ứng khối u (Ti-plasmid) của nó vào tế bào thực vật Các gen nằm trên T-DNA mã hóa cho các enzyme ảnh hưởng đến sự sinh trưởng mất kiểm soát của tế bào thực vật là nguyên nhân chính dẫn đến sự hình thành khối u [28, 108] Quá trình chuyển gen gây khối u

nằm trên Ti-plasmid của vi khuẩn A tumefaciens được mô tả trên Hình 1.3

Hình 1.3 Vi khuẩn A tumefaciens gây khối u trên thực vật [95]

Ti plasmid có kích thước 200 kb-800 kb, bao gồm đoạn T-DNA được giới hạn bởi biên trái (LB) và biên phải (RB), các biên có kích thước khoảng 25 bp T-DNA mang gen tổng hợp auxin, cytokinin và opine Các gen này sẽ tích hợp vào

hệ gen của thực vật ở một vị trí ngẫu nhiên Ngoài T-DNA, trên Ti plasmid còn có

vùng gen độc, chứa các gen vir mã hóa các protein (virA, virG, và một số protein khác) giúp vận chuyển T-DNA vào trong tế bào thực vật [28] Các gen vir này

chính là yếu tố quyết định khả năng chuyển T-DNA vào tế bào chủ của vi khuẩn

Agrobacterium Sự hoạt động của các gen vir được cảm ứng bởi hợp chất

phenolic có nguồn gốc từ thực vật, có tên là acetosyringone (AS) [63] Khi có mặt

chất cảm ứng, gen vir hoạt động dẫn tới quá trình chuyển T-DNA trên Ti plasmid

vào tế bào

1.2.3.2 Chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens

Trong điều kiện có chất cảm ứng, vi khuẩn A tumefaciens sẽ chuyển một

phần DNA trên Ti plasmid (còn gọi là T-DNA) của nó vào tế bào thực vật T-DNA sau đó được tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gen [24, 28] Lợi dụng cơ chế này, vi khuẩn

A tumefaciens được sử dụng làm sinh vật trung gian để chuyển gen vào thực vật từ

những năm 1980, sau đó vào năm 1998 vi khuẩn này lần đầu tiên được ứng dụng thành công để chuyển gen vào nấm [12]

Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens được coi là

phương pháp đơn giản nhất để chuyển gen vào nấm sợi Phương pháp ATMT chuyển gen vào nấm dựa trên cơ chế chuyển đoạn T-DNA trên Ti-plasmid có mặt trong tế bào vi khuẩn sau đó tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gen nấm Các gen cần

chuyển sẽ được gắn vào vùng T-DNA, sau đó được biến nạp vào vi khuẩn A

tumefaciens dùng cho chuyển vào nấm Phương pháp chuyển gen này đã được thực

hiện thành công trên nhiều loài nấm sợi khác nhau [12, 23, 62, 63, 93]

Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens cần một hệ thống gồm hai plasmid là plasmid trợ giúp (vir helper) có chứa các gen vir (virulence)

giúp vận chuyển T-DNA vào tế bào chủ, và một vector nhị thể (binary vector) chứa đoạn T-DNA đã được cải biến cho mục đích chuyển gen [63] Trên vectornhị thể có chứa gen kháng kháng sinh dùng để chọn lọc vi khuẩn mang vector và vùng T-DNA giới hạn bởi hai biên LB (left border) và RB (right border) có chứa marker chọn lọc thể chuyển gen và một vùng DNA có thể được cải biến tùy vào mục đích chuyển gen [27, 74] Mô hình hệ thống vector nhị thể hiện trong Hình 1.4

Hình 1.4 Mô hình tổng quát về hệ thống vector nhị thể cho chuyển gen vào nấm

thông qua vi khuẩn A tumefaciens [46]

Một trong những ưu điểm lớn nhất của phương pháp chuyển gen nhờ vi

khuẩn A tumefaciens là có thể tạo ra một loạt các thể đột biến ngẫu nhiên do

T-DNA từ tế bào vi khuẩn chèn ngẫu nhiên vào hệ gen của vi nấm Một số nghiên

cứu chỉ ra rằng A tumefaciens chèn T-DNA vào hệ gen của nấm chủ yếu chỉ ở dạng

một bản đơn và đoạn T-DNA này có thể phá hủy một gen duy nhất ở thể biến nạp tương ứng Từ việc nghiên cứu các thể đột biến chèn ngẫu nhiên có thể giúp xác định chức năng của gen Ngoài chức năng biểu hiện và tạo các thể đột biến ngẫu

nhiên, phương pháp chuyển gen bằng A tumefaciens còn được sử dụng trong việc

xóa các gen nhờ cơ chế trao đổi chéo tương đồng trong tế bào nấm [49]

Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens đã được ghi nhận chuyển thành công ở một số loài nấm sợi thuộc chi Aspergillus (A fumigatus,

A awamori, A japonicas, A niger), tuy nhiên chưa có một nghiên cứu nào đề cập

đến việc chuyển gen vào A oryzae thông qua vi khuẩn A tumefaciens [12, 23, 62,

63, 93]

1.2.3.3 Ưu và nhược điểm của phương pháp

Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens thực hiện đơn giản

hơn nhiều so với các phương pháp khác, tuy nhiên thời gian tiến hành dài hơn do cần thời gian đồng nuôi cấy cảm ứng giữa nấm và vi khuẩn [62] Nguyên liệu của chuyển gen có thể sử dụng hệ sợi hoặc bào tử nấm mà không cần bất cứ khâu xử lý

bổ xung nào như chuyển gen qua protoplast hay chuyển gen bằng xung điện Thậm chí, chỉ sử dụng phương pháp này mới khả thi đối với một số loài nấm [90, 102]

Hiệu quả chuyển gen vào nấm sợi khi sử dụng vi khuẩn Agrobacterium thu được số

thể chuyển cao hơn nhiều lần so với chuyển gen bằng tế bào trần nhờ PEG [61, 86] Bên cạnh đó, các nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra rằng việc xóa gen ở nấm nhờ cơ

chế trao đổi DNA tương đồng nhờ A tumefaciens đạt hiệu quả cao hơn so với xóa

gen bằng các phương pháp khác Hiệu quả xóa gen khi sử dụng protoplast chỉ đạt

1%-50%, nhưng khi sử dụng vi khuẩn A tumefaciens hiệu quả có thể đạt đến 97%

[11]

1.2.3.4 Ứng dụng của phương pháp ATMT trong cải biến di truyền

Phương pháp chuyển gen vào nấm bằng vi khuẩn A tumefaciens đã được

chứng minh lợi thế hơn các phương pháp chuyển gen thông thường Nguyên liệu ban đầu có thể được sử dụng như sợi nấm, tế bào trần hoặc bào tử Chuyển gen bằng phương pháp ATMT tạo một tỷ lệ cao các thể đột biến ngẫu nhiên do T-DNA chèn vào hệ gen vật chủ [12, 61, 68] Ngoài ra, chuyển gen bằng phương pháp này

có thể tạo ra các trao đổi chéo tương đồng Do đó là công cụ hữu ích để xóa và xác định các chức năng của gen [63]

Để xác định chức năng của một gen cụ thể, phương pháp hữu hiệu nhất là

gây đột biến xóa hoặc làm hỏng gen đó Xóa một gen cụ thể ở Saccharomyces

cerevisiae đạt hiệu quả cao và chỉ cần hai đoạn tương đồng nhỏ (50 bp) ở hai phía

trình tự mã hóa [91] Tuy nhiên, ở nấm sợi cần hai đoạn tương đồng kích thước lớn hơn Xóa gen sử dụng phương pháp ATMT được ghi nhận là có hiệu quả cao hơn so các phương pháp chuyển gen khác Hiệu quả xóa gen dao động từ 14% đến 75%, cao hơn hẳn so với các phương pháp chuyển gen thông thường [63]

1.2.4 Marker sử dụng trong chọn lọc các chủng chuyển gen

Hiện nay, marker dùng trong chọn lọc các thể chuyển gen gồm 2 loại là gen kháng kháng sinh và các gen liên quan đến sinh tổng hợp một hay nhiều hợp chất thiết yếu trong quá trình sinh trưởng của nấm

1.2.4.1 Gen kháng kháng sinh dùng trong chuyển gen ở nấm

Các loại kháng sinh kháng nấm thông dụng nhất được sử dụng trong chọn lọc thể chuyển gen là hygromycin B, phleomycin và nourseothricin Hygromycin B là một loại kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside, được sản xuất từ xạ khuẩn

Streptomyces hygroscopicus Chúng có thể tiêu diệt vi khuẩn, nấm và các tế bào

nhân chuẩn bằng cách ức chế tổng hợp protein [76] Phleomycin được sản xuất bởi

xạ khuẩn Streptomyces verticillus, là một kháng sinh phổ rộng có hiệu quả chống lại

hầu hết các loại vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, thực vật và tế bào động vật Kháng

sinh phleomycin thuộc nhóm kháng sinh glycopeptide, gây chết tế bào bằng cách bám vào DNA và làm phá vỡ sợi kép của DNA dẫn đến các hoạt động của tế bào bị ngừng và chết [9] Nourseothricin, với tên thương mại là clonNAT, thuộc nhóm

kháng sinh aminoglycoside có nguồn gốc từ loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces

Kháng sinh này hoạt động bằng cách gây lỗi mã hóa trong quá trình dịch mã dẫn tới không tổng hợp được protein ClonNAT được dùng rất phổ biến làm marker chọn lọc thể chuyển gen gồm cả vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và tế bào thực vật [39]

1.2.4.2 Gen trợ dưỡng dùng làm marker cho chuyển gen

Chủng nấm đột biến trợ dưỡng là các chủng mất khả năng sinh tổng hợp một loại axit amin hoặc một hợp chất cần thiết trong quá trình sinh trưởng, việc mất khả năng tự tổng hợp khiến chúng không còn khả năng sinh trưởng trên môi trường tối thiểu mà cần phải bổ sung thêm axit amin hoặc hợp chất tương ứng Gen trợ dưỡng

được sử dụng nhiều nhất trong chọn lọc thể chuyển gen là gen pyrG (mã hóa protein

tham gia quá trình tổng hợp uridine/uracil) [49, 59, 94] Ngoài ra còn có các gen trợ

dưỡng khác cũng được sử dụng như adeA (gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp adenine), met (gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp methionine), trp (gen mã hóa enzyme tham gia quá trình tổng hợp tryptophan), argB (gen mã hóa enzyme tham

gia quá trình tổng hợp arginine) …[30, 116]

Các marker dùng cho chọn lọc các thể chuyển gen giữ vai trò hết sức quan trọng, quyết định sự thành công của quá trình chuyển gen Phần lớn các nghiên cứu chuyển gen vào nấm sợi sử dụng các chất kháng sinh diệt nấm Tuy nhiên, các kháng sinh này thường có giá thành rất cao, khiến việc chuyển gen bị hạn chế Bên

cạnh đó, nhiều loài nấm sợi (tiêu biểu là A oryzae) có khả năng kháng tự nhiên với

nhiều loại kháng sinh hoặc chỉ bị ức chế ở nồng độ kháng sinh rất cao Do đó việc

sử dụng kháng sinh trong chọn lọc thể chuyển gen là không khả thi [96] Để khắc phục nhược điểm này, một số loài nấm sợi đã được cải biến di truyền để có thể sử các gen trợ dưỡng dụng làm các marker chuyển gen Chuyển gen vào các chủng trợ

dưỡng giúp giảm chi phí, an toàn đối với môi trường và có tiềm năng ứng dụng vào sản xuất thực tiễn

1.2.4.3 Marker pyrG

Uridine 5’-monophosphate (UMP) và uracil là những hợp chất quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, bởi chúng liên quan đến sự tổng hợp các axit nucleic cần thiết cho mọi tế bào sống Sinh tổng hợp UMP được thực hiện bởi enzyme orotidine 5’-monophosphate decarboxylase (OMP decarboxylase)

được mã hóa bởi gen pyrG ở nấm sợi hoặc gen URA3 ở nấm men [13, 49] Gen

pyrG giúp tế bào nấm tự tổng hợp UMP trong quá trình sinh trưởng Tuy nhiên với

những chủng đột biến hỏng gen pyrG, chúng chỉ có thể sinh trưởng được trong điều kiện môi trường ngoại bào có bổ sung uridine hoặc uracil Khi gen pyrG được đưa

trở lại các chủng đột biến này, chúng có thể sinh trưởng bình thường Chính vì lý do

đó nhiều nghiên cứu trước đây đã sử dụng gen pyrG làm marker chọn lọc trong quá

trình chuyển gen [13, 58, 73, 104, 107]

Với chủng tự nhiên (wild type), hoạt động của enzyme OMP decarboxylase

mã hóa bởi gen pyrG sẽ chuyển hóa hợp chất 5-fluoroorotic acid (5-FOA) không

độc thành chất gây độc tế bào là 5-fluorouracil Ngược lại, các chủng bị đột biến sai

hỏng về gen pyrG sẽ không thể chuyển hóa hợp chất 5-FOA và các chủng này có

thể sinh trưởng bình thường trên môi trường chứa 5-FOA Chính vì vậy 5-FOA thường được bổ sung vào môi trường trong quá trình chọn lọc các chủng vi nấm đột

biến hỏng hoặc mất gen pyrG Việc đưa gen pyrG quay trở lại thể đột biến tương

ứng sẽ giúp thể đột biến tự tổng hợp uridine/uracil và sinh trưởng được trên môi trường tối thiểu (không bổ sung uridine/uracil) [116]

Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm tạo ra các chủng nấm sợi trợ dưỡng

uridine/uracil, trong đó có các loài thuộc chi Aspergillus Phương pháp phổ biến

nhất để tạo chủng đột biến trợ dưỡng uridine/uracil là chiếu tia UV sau đó sàng lọc trên môi trường chọn lọc có chứa hợp chất 5-FOA, uridine và uracil [34, 49, 104] Ngoài cách chiếu UV, thể đột biến trợ dưỡng uridine/uracil còn được tạo ra nhờ

phương pháp loại bỏ trực tiếp gen pyrG thông qua việc chuyển cấu trúc xóa gen

pyrG vào tế bào nấm Nhờ cơ chế trao đổi chéo tương đồng, gen pyrG trong hệ gen

của nấm có thể được loại bỏ để tạo ra thể đột biến mất khả năng tổng hợp uridine/uracil [25, 49, 116]

1.2.5 Một số gen chỉ thị dùng trong chuyển gen ở vi nấm

Gen chỉ thị mã hóa các protein tương ứng được sử dụng trong đánh giá hiệu quả chuyển gen hoặc dùng như dấu hiệu để sàng lọc các thể chuyển gen Sự có mặt của gen chỉ thị khiến các tế bào/khuẩn lạc của thể chuyển gen có kiểu hình khác biệt

và dễ dàng phân biệt với các chủng tự nhiên Gen chỉ thị không gây ảnh hưởng đến chức năng sinh lý cũng như sinh trưởng của các thể chuyển gen [33]

Ngược lại với marker chọn lọc bảo vệ thể chuyển gen trên môi trường chọn chọn lọc và gây chết hoặc ngăn chặn sự phát triển của chủng tự nhiên, gen chỉ thị được sử dụng để sàng lọc các chủng chuyển gen làm cho các tế bào/khuẩn lạc chứa gen chỉ thị có đặc điểm có thể quan sát trực quan bằng mắt Các gen chỉ thị có thể được gắn liền với gen đích và được điều khiển dưới cùng một promoter hoặc biểu hiện độc lập mà không có gen đích đi kèm Một số các gen chỉ thị hay được sử dụng

như: GFP, DsRed, GUS, lacZ…[40, 69, 72] Các gen chỉ thị được dùng phổ biến trong chuyển gen ở nấm sợi là gen mã hóa protein huỳnh quang xanh GFP và gen

mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed

1.2.5.1 Gen mã hóa huỳnh quang xanh (GFP)

Gen GFP có chiều dài 720 bp được phân lập lần đầu tiên từ sứa

Aequoreavictoria bởi Osamu Shimomura năm 1962 GFP mã hóa protein có kích

thước 238 axit amin (26,9 kDa) Protein này phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh

lá cây khi tiếp xúc với ánh sáng bước sóng 509 nm (Hình 1.5) [78, 89]

Trong lĩnh vực sinh học phân tử, gen GFP thường được sử dụng như một gen chỉ thị trong chuyển gen và biểu hiện gen GFP thường được đưa vào tế bào thông qua các kỹ thuật chuyển gen và sự tích hợp của GFP trong hệ gen của tế bào

có thể đủ bền vững qua các thế hệ sau Đến nay, GFP đã được biểu hiện ở nhiều

loài, bao gồm cả sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn, trong đó có nấm sợi [52]

Hình 1.5 Biểu hiện gen GFP ở nấm sợi Aspergillus fumigatus [35]

Gen huỳnh quang GFP rất hữu ích trong việc nghiên cứu xác định vị trí của

protein hoặc kiểm tra mức độ biểu hiện của một gen mong muốn Trong nghiên cứu

phát triển các phương pháp chuyển gen, biểu hiện gen chỉ thị GFP đã được chứng minh là thành công trên nhiều loài nấm sợi như Aspergillus fumigatus [35],

Aspergillus oryzae [56], Aspergillus nidulans [5], Aspergillus niger [21], Fusarium oxysporum [48]…

1.2.5.2 Gen mã hóa huỳnh quang đỏ (DsRed)

Gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed có chiều dài 678 bp được phân lập từ một loài san hô thuộc chi Discosoma Protein DsRed gồm 226 axit amin với

kích thước 28 kD, phát huỳnh quang màu đỏ và tín hiệu huỳnh quang mạnh nhất khi được quan sát dưới ánh sáng bước sóng 583 nm [3] Do đặc tính tương tự như gen

huỳnh quang GFP nên DsRed cũng được sử dụng làm gen chỉ thị trong nghiên cứu

ở nhiều loài sinh vật khác nhau Riêng với nấm sợi, gen DsRed được biểu hiện thành công trên nhiều loài như Sordaria macrospora [15], Fusarium oxysporum

[70], Acremonium chrysogenum [32], Aspergillus fumigatus [44]… Các tế bào nhận

được gen DsRed sẽ có màu đỏ dưới kính hiển vi huỳnh quang với bước sóng phù

hợp (Hình 1.6)

Hình 1.6 Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợi Fusarium oxysporum [70]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Chủng vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu STT Tên chủng Phân loại Nguồn gốc

1 RIB40 A oryzae National Research Institute of Brewing

STT Tên chủng Phân loại Nguồn gốc

9 VTCCF 912 A oryzae Viện Vi sinh vật học và Công nghệ

Sinh học, ĐHQGHN

10 VTCCF 914 A oryzae Viện Vi sinh vật học và Công nghệ

Sinh học, ĐHQGHN

điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

12 NRRL 3357 A flavus ARS (NRRL) Culture Colection (Mỹ)

13 VTCCF 013 A flavus Viện Vi sinh vật học và Công nghệ

sinh học, ĐHQGHN

14 N402 A niger CBS Fungal Biodiversity Centre (Hà Lan)

15 VTCCF 015 A fumigatus Viện Vi sinh vật học và Công nghệ

Chủng A tumefaciens AGL1 là chủng đã được cải biến di truyền và được sử dụng làm sinh vật trung gian để chuyển gen vào nấm Chủng AGL1 mang gen kar

kháng kháng sinh kanamycin sử dụng trong chọn lọc các chủng mang vector nhị thể

Chủng A oryzae AUT1-PlD có nguồn gốc từ chủng RIB40 Chủng này đã

bị xóa gen pyrG trong hệ gen và được sử dụng trực tiếp để chuyển gen sử dụng marker pyrG

2.1.2 Thiết bị và hóa chất

Các hóa chất được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật và trong các thí nghiệm sinh học phân tử gồm: glucose, sucrose, KCl, NaCl, MgSO4, KH2PO4, K2HPO4, FeSO4, MnSO4, glycerol, NaNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl, EDTA, KOH, HCl, Tris-HCl, SDS…Các hóa chất với độ tinh khiết cao được mua từ những hãng uy tín như Thermo Scientific, Biobasic, Merck, Sigma, Biozym

Các mồi dùng cho phản ứng PCR do công ty IDT (Singapore) tổng hợp Danh sách mồi được liệt kê ở Bảng 2.2

Bảng 2.2 Mồi PCR dùng trong nghiên cứu

Tên mồi Trình tự (5’-3’) Enzyme

giới hạn

Kích thước

Tham khảo

Tham khảo

P5

P7

GGGAATTCATGCGAAGGTAAGTGC TTCT

TGTAAGGTGATGTGTGCCAG

1,70- 2,98 kb

730 bp

ATCCTACAGGAACAGGTGGTGGC

EcoRV, SacI, SacII, BamHI

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được sử dụng tại Phòng Genomic, Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Tên thiết bị Hãng sản xuất/ Xuất xứ

Tủ cấy vi sinh an toàn cấp 2 Nuaire/Mỹ

Kính hiển vi quang học CX21 Olympus/Nhật Bản

Tên thiết bị Hãng sản xuất/ Xuất xứ

Máy cô quay chân không Thermo Scientific/Mỹ

Các thiết bị khác

2.1.3 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu

 Môi trường PDA (potato dextrose agar, Himedia) dùng để nuôi cấy và thu

bào tử của các chủng nấm

 Môi trường CD (Czapek-Dox) dùng để nuôi các chủng nấm sợi: 2%

sucrose; 0,2% NaNO3; 0,1% KH2PO4; 0,05% MgSO4; 0,05% KCl; 0,05% NaCl; 0,002% FeSO4; 2% agar; pH 5,5 Môi trường CD dùng khi nuôi cấy các chủng

A oryze trợ dưỡng uridine/uracil cần bổ sung thêm 0,1% uridine và 0,1% uracil

 Môi trường LB dùng để nuôi vi khuẩn: 1% peptone; 0,5% cao nấm men;

0,5% NaCl

 Môi trường DPY dùng để nuôi và thu bào tử chủng A oryzae AUT1-PlD trợ

dưỡng uridine/uracil [116]: 2% glucose; 1% peptone; 0,5% cao nấm men; 0,5%

KH2PO4; 0,05% MgSO4; 0,1% uridine; 0,1% uracil; pH 5,5

 Môi trường M+ Met dùng để chọn lọc các thể chuyển gen [116]: 0,2%

NH4Cl; 0,1% (NH4)2SO4; 0,05% KCl; 0,05% NaCl; 0,1% KH2PO4; 0,05% MgSO4; 0,002% FeSO4; 2% glucose; 0,15% methionine; pH 5,5

 Môi trường PSM kích thích sinh enzyme phytase [29]: 1% glucose; 0,4%

Na-phytate; 0,2% CaCl2; 0,5% NH4NO3; 0,05% KCl; 0,05% MgSO4; 0,001% FeSO4; 2% agar

 Môi trường cảm ứng IM lỏng: 8 ml MES 1M; 80 ml MM salts 2,5x; 0,36 g

glucose; 1 ml glycerol; 200 ml nước cất

MM salts 2,5x: 2,05g K2HPO4; 1,45 g KH2PO4; 0,15 g NaCl; 0,5 g MgSO4.7H2O; 0,1g CaCl2.6H2O; 0,5 g (NH4)2SO4; 0,0025 g FeSO4.7H2O, 1000 ml

H2O

 Môi trường cảm ứng IM rắn: 8 ml MES 1M; 80 ml MM salts 2,5x; 0,18 g

glucose; 1 ml glycerol; 3g agar; 200 ml nước cất

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Các kĩ thuật về sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu như PCR, nhân dòng gen, tạo vector, xử lý enzyme giới hạn,… được thực hiện tham khảo theo cẩm nang Molecular Cloning của tác giả Sambrook, xuất bản năm 1989 [87] Một số phương pháp như tách chiết DNA, tách chiết plasmid,… được phát triển bởi Phòng Genomic- Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein hoặc sử dụng các kit tách chiết thương mại

2.2.1 Thu nhận bào tử nấm

Các chủng nấm được nuôi trên đĩa môi trường Czapek-Dox Với chủng

A oryzae VS1 trợ dưỡng uridine/uracil cần bổ sung thêm 0,1% uridine và 0,1%

uracil vào môi trường nuôi Chủng AUT1-PlD được nuôi trên đĩa môi trường DPY Sau khoảng 3-5 ngày nuôi cấy ở 30ºC, nước cất vô trùng được bổ sung lên bề mặt đĩa nuôi cấy, dùng que gạt bằng thủy tinh vô trùng gạt nhẹ để bào tử nấm rời khỏi

hệ sợi và hòa vào nước Dùng pipet hút dịch và lọc qua màng Miracloth (Calbiochem, Đức) Dịch lọc được ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút để thu bào

tử Bào tử được rửa bằng nước cất vô trùng 2 lần trước khi hòa trở lại vào nước cất

vô trùng Nồng độ bào tử được điều chỉnh đến 107

bào tử/ml và dịch bào tử được bảo quản ở 4ºC Đối với các chủng nấm trợ dưỡng uridine/uracil, bào tử sau khi thu được cần kiểm tra để tránh nhiễm bằng cách nhỏ 20- 50 µl dịch bào tử trên đĩa môi trường tối thiểu Czapek-Dox (CD) và ủ đĩa khoảng 1- 2 ngày ở 30ºC Nếu hệ sợi nấm không xuất hiện, chứng tỏ bào tử là thuần khiết và đáp ứng được yêu cầu dùng cho chuyển gen

2.2.2 Tách chiết DNA, RNA và tổng hợp cDNA

Tách chiết DNA tổng số: 1 ml bào tử nấm được bổ sung vào bình tam giác

250 ml chứa 100 ml môi trường CD lỏng Bình được nuôi lắc trong máy lắc tốc độ

200 vòng/phút, ở 30ºC trong 3 ngày Hệ sợi nấm được thu bằng cách lọc qua màng Miracloth và được thấm khô bằng giấy lọc trước khi chia vào ống eppendorf 2 ml Khoảng 200 mg sợi nấm được nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn bằng cối chày

sứ hoặc được giã trực tiếp trong ống eppendorf sử dụng đũa thủy tinh Bổ sung 600

µl đệm chiết GX (2,5% SDS; 200 mM Tris-HCl pH 8,0; 250 mM NaCl; 25 mM EDTA; 0,2% β-mercaptoethanol) và 0,1 mg proteinase K Ống được vortex đều sau

đó ủ ở nhiệt độ 60- 65ºC trong 15- 30 phút Thêm vào ống 300 µl natri acetate 3M (pH 5,2) trộn đều và ly tâm ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 20 phút ở 4ºC Hút khoảng 700 µl dịch trong ở phía trên chứa DNA và chuyển sang ống eppendorf 1,5

ml Ống được bổ sung thêm 700 µl isopropanol lạnh, trộn đều sau đó ly tâm ở

12000 vòng/phút trong 20 phút ở 4ºC Tủa chứa DNA được rửa bằng 500 µl ethanol 70% và được làm khô bằng máy cô quay chân không SpeedVac trước khi hòa vào

50 µl đệm TE 1x (Tris-EDTA, pH 8) Bổ sung 2 µl RNase (10 mg/ml) và ủ ở 60ºC trong 30 phút để loại bỏ RNA Sản phẩm DNA tổng số được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và được bảo quản ở -20ºC

Tách chiết RNA tổng số: Sợi nấm 2 ngày tuổi được thu bằng cách lọc dịch

nuôi qua màng Miracloth và được nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng Bột sợi nấm nhanh chóng được chia vào ống eppendorf 2 ml (20-50 mg/ống) và đặt trên nước đá RNA tổng số được chiết bằng kit tinh sạch RNA của hãng ANABIO R&D JSC theo hướng dẫn của nhà sản xuất RNA sau khi tinh sạch được xử lý 20 phút ở 37ºC bằng enzyme DNase I để loại bỏ hoàn toàn DNA DNase I sau đó được bất hoạt ở 75ºC trong 15 phút và mẫu được chuyển ngay lên nước đá Sản phẩm RNA thu được được kiểm tra bằng PCR để đánh giá mức độ tinh sạch, sử dụng cặp mồi ITS1/ITS4 để khuếch đại đoạn ITS của DNA ribosome RNA được coi là sạch và không nhiễm DNA hệ gen chỉ khi phản ứng PCR kiểm tra không xuất hiện băng

ITS RNA sau khi tinh sạch được sử dụng ngay cho tổng hợp cDNA hoặc được bảo quản ở -30ºC

Tổng hợp cDNA: RNA tổng số sau khi tinh sạch được sử dụng ngay để tổng

hợp cDNA Một lượng 800-1000ng RNA được sử dụng cho một phản ứng tổng hợp cDNA với mồi oligo dT và enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase Toàn bộ quy trình được thực hiện với ProtoScript® First Strand cDNA Synthesis Kit của hãng New England Biolabs theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sản phẩm cDNA được sử dụng ngay cho các thí nghiệm tiếp theo hoặc được bảo quản ở -30ºC

2.2.3 Quan sát hình thái và kiểm tra một số đặc điểm sinh lý sinh hóa

Quan sát hình thái các chủng A oryzae: Các chủng nấm được cấy điểm

hoặc nhỏ 10 µl bào tử trên môi trường đĩa thạch PDA hoặc CD đối với các chủng tự nhiên và M+ Met hoặc CD bổ sung thêm uridine/uracil với chủng AUT1-PlD và những chủng trợ dưỡng uridine/uracil Đĩa nuôi cấy được ở 30ºC-37ºC trong 2-3 ngày Hình thái bào tử và cuống mang bào tử được quan sát dưới kính hiển vi quang học Olympus hoặc kính hiển vi huỳnh quang Axioplan (Carl Zeiss, Đức)

Kiểm tra khả năng mẫn cảm kháng sinh của các chủng A oryzae: 10 µl

dịch bào tử các chủng A oryzae được nhỏ trên môi trường CD pH7 có bổ sung

kháng sinh với các nồng độ 100mg/l, 200 mg/l và 300 mg/l Đĩa nuôi cấy được đặt

ở 30ºC trong 3 ngày để quan sát sự sinh trưởng của nấm

Kiểm tra khả năng sinh enzyme phytase[29]: 10 µl bào tử nấm được nhỏ lên

đĩa môi trường PSM Đĩa nuôi cấy được đặt ở 30ºC trong 3 ngày Enzyme phytase

sẽ phân giải phytate tạo thành vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc Vòng phân giải càng lớn thì mức độ sinh enzyme và hoạt tính enzyme càng mạnh

Kiểm tra khả năng sinh enzyme amylase [100]: 10 µl bào tử nấm được nhỏ

lên đĩa môi trường CD+ 1% tinh bột tan (pH 6,5) Sau 3 ngày sinh trưởng ở 30ºC, vòng phân giải tinh bột xung quanh khuẩn lạc nấm được nhận biết bằng cách nhỏ dung dịch thuốc thử lugol

Xác định khả năng sinh độc tố aflatoxin trên môi trường CAM [82]: Các

chủng A oryzae RIB40, A oryzae VS1, A flavus NRRL 3357 được nuôi cấy trên

môi trường thạch dừa (môi trường CAM) ở 28ºC, trong tối 5 ngày Quan sát đĩa nuôi cấy dưới ánh sáng cực tím UVA bước sóng 365 nm của máy soi UV để kiểm tra sự phát quang màu xanh lá cây của aflatoxin B1 Môi trường CAM được chuẩn

bị như sau: 100 g dừa tươi thái nhỏ đun sôi 15 phút trong 300 ml nước, lọc thu dịch,

bổ sung 2% agar, pH 7

2.2.4 Phân biệt A oryzae và A Flavus bằng các kỹ thuật sinh học phân tử

Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ITS1/ITS4: Cặp mồi ITS1/ITS4 được sử

dụng để khuếch đại vùng ITS (gồm một phần gen 18S rRNA + ITS1 + gen 5,8S rRNA + ITS2 + một phần gen 28S rRNA) của DNA ribosome Phản ứng PCR cặp

mồi này được dùng để kiểm tra chất lượng DNA của A oryzae và A flavus trước

khi sử dụng cho phản ứng phân biệt với mồi đặc hiệu Chu trình nhiệt như sau: 94ºC (3 phút); 30 chu kì của 94ºC (30 giây), 58ºC (30 giây), 72ºC (40 giây); 72ºC (5 phút) Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra

Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Aof-ITS-F/ITS4: Mồi Aof-ITS-F được

thiết kế dựa trên trình tự ITS1 đặc hiệu chỉ với A oryzae và A flavus Mồi Aof-ITS-F kết hợp với mồi ITS4 được dùng để nhận biết nhóm bao gồm A oryzae

và A flavus Chu trình PCR tương tự như PCR sử dụng cặp ITS1/ITS4

Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi AFB-F/AFB-R: Sản phẩm PCR có băng

đặc trưng và chỉ xuất hiện ở nấm sợi A flavus mà không xuất hiện ở A oryzae Do

đó, cặp mồi này được sử dụng để phân biệt hai loài này Chu trình nhiệt như sau: 94ºC (3 phút); 30 chu kì của 94ºC (30 giây), 58ºC (30 giây), 72ºC (20 giây); 72ºC (5 phút) Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%

Phản ứng PCR đa mồi (multiplex PCR): cũng tương tự như phản ứng PCR

thường nhưng được thực hiện với 5 mồi đặc hiệu (ITS1, ITS4, Aof-ITS-F, AFB-F, AFB-R) Các thành phần trong tổng thể tích 10 µl phản ứng bao gồm: 5 µl GoTaq®

Chu trình nhiệt như sau: 94ºC (3 phút), 30 chu kì của 94ºC (30 giây), 60ºC (30 giây), 72ºC (1 phút 30 giây); 72ºC (10 phút) Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra

2.2.5 Tạo các vector nhị thể dùng cho chuyển gen

PCR các đoạn DNA: Trình tự các đoạn DNA được lấy từ cơ sở dữ liệu của

ngân hàng GenBank, các cặp mồi khuếch đại gen hoặc DNA được thiết kế trên phần mềm Primer3 và được tổng hợp hóa học bởi công ty IDT Các đoạn DNA được PCR từ DNA tổng số hoặc cDNA sử dụng enzyme Phusion® High-Fidelity DNA polymerase của hãng Thermo Scientific Thành phần trong 25 µl hỗn hợp phản ứng như sau: buffer 5x HF 5 µl, enzyme Phusion DNA polymerase 1 µl, dNTP 1 µl, mồi xuôi 1 µl, mồi ngược 1 µl, DNA khuôn 1 µl, nước cất khử ion 15 µl Chu trình nhiệt như sau: 94ºC (3 phút); 35 chu kỳ của 94ºC (30 giây), 50-60ºC (30 giây), 72ºC (30 giây đến 1 phút); 72ºC (7 phút) Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% sau đó được tinh sạch bằng kit tinh sạch DNA của hãng Promega hoặc Anabio R&D JSC theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Xử lý vector và đoạn DNA với enzyme giới hạn: Các vector và đoạn DNA

được cắt với enzyme giới hạn dạng FastDigest của hãng Thermo Scientific Quy trình xử lý enzyme theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sản phẩm xử lý enzyme giới hạn được điện di trên gel agarose 0,8% Đoạn DNA trên gel được cắt và chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml Quy trình tinh sạch được thực hiện với kit tinh sạch DNA thương mại theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất Sản phẩm sau tinh sạch được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%

Nối đoạn DNA vào plasmid (ligation): Plasmid và đoạn DNA sau khi xử lý

enzyme giới hạn và tinh sạch được trộn với tỉ lệ 1:1 theo thể tích, sử dụng enzyme nối T4 DNA ligase của hãng Thermo Scientific Các thành phần trong 20 µl hỗn hợp phản ứng như sau: T4 ligase buffer 10x 2 µl, enzyme T4 DNA ligase 1 µl, plasmid 4 µl, đoạn DNA 4 µl, nước cất khử ion 9 µl Hỗn hợp phản ứng được ủ ở

4ºC-10ºC qua đêm, sau đó được biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α bằng phương

pháp sốc nhiệt Quá trình biến nạp như sau: ống chứa tế bào vi khuẩn E coli DH5α

được giữ trên nước đá 5-10 phút cho tới khi rã đông Hút hỗn hợp lai vào ống tế bào khả biến, trộn nhẹ bằng pipet và đặt trên đá 20 phút Sau đó sốc nhiệt 40 giây ở 42ºC và đặt trên nước đá 2 phút Bổ sung 800 µl LB lỏng và ống được lắc 1 giờ ở 37ºC Tế bào được thu bằng ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 20 giây và được trải trên đĩa môi trường chọn lọc LB chứa kháng sinh kanamycin (100 mg/l) Đĩa được ủ ở 37ºC trong 24 giờ Các khuẩn lạc nhận được từ đĩa chọn lọc được kiểm tra bằng colony-PCR (PCR từ khuẩn lạc) với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA Phản ứng colony-PCR sử dụng GoTaq® Green Master Mix của hãng Promega Những khuẩn lạc cho kết quả PCR đúng với kích thước của đoạn chèn sẽ được sử dụng để tách chiết plasmid và cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn

Tách plasmid: Khuẩn lạc chọn được cấy vào bình tam giác 100 ml chứa

10-20 ml môi trường LB lỏng (1% peptone; 0,5% cao nấm men; 0,5% NaCl) bổ sung thêm kháng sinh kanamycin (100 mg/l) Bình nuôi cấy được lắc qua đêm ở 30- 37ºC Ly tâm 4 ml dịch nuôi ở 12000 vòng/phút trong 20 giây (ly tâm 2 lần, mỗi lần

2 ml) Bổ sung 250 µl buffer B1 (50 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; pH 7,6) và 3 µl RNase (10 mg/ml) Cặn tế bào được hòa tan vào đệm bằng vortex Bổ sung thêm

250 µl buffer B2 (200 mM NaOH, 1% SDS) sau đó đảo ống nhẹ nhàng 5 lần Tiếp

đó bổ sung thêm 350 µl buffer N3 (kali acetate 3M; pH 5,5) và đảo ống nhẹ 5 lần

Ly tâm ống ở 12000 vòng/phút ở 4ºC trong 20 phút Hút khoảng 700 µl dịch trong

có chứa plasmid chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml và bổ sung thêm 700 µl isopropanol lạnh Ống được trộn đều bằng vortex đều và được ly tâm ở tốc độ

12000 vòng/phút trong 20 phút ở 4ºC Đổ bỏ dịch trong và rửa cặn bằng 500 µl ethanol 70% Ly tâm 5 phút và đổ bỏ dịch Cặn chứa DNA được làm khô bằng máy

cô quay chân không SpeedVac và hòa vào 50 µl đệm TE 1x Plasmid được bảo quản ở ngăn đá tủ lạnh hoặc ở -30ºC

Tạo vector xóa gen pyrG ở A oryzae: Cấu trúc xóa gen pyrG ở A oryzae

được thiết kế nằm trong vùng T-DNA trên một vector nhị thể (binary vector), cấu