Trong tự nhiên nấm đóng một vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy các vật chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật chất. Bên cạnh đó nấm cũng được xem là vi sinh vật chủ yếu tham gia phân giải lignin và cellulose. Mục tiêu của đề tài nhằm đánh giá một số đặc tính sinh lý của bốn dòng nấm có khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ được phân lập từ nền đất thâm canh lúa tại xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp. Một số đặc tính sinh lý của bốn dòng nấm này được khảo sát gồm pH, nhiệt độ và nồng độ muối NaCl nhằm tìm ra môi trường thích hợp cho sự phát triển của chúng. Bên cạnh đó, việc kiểm tra tính đối kháng lẫn nhau giữa bốn dòng nấm, khả năng phòng trừ sinh học của chúng đối với dòng nấm gây bệnh thối rễ trên cây cam sành Fusarium solani cũng như việc kiểm tra tiềm năng gây bệnh và khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng của bốn dòng nấm này đối với hạt giống cây đậu xanh, rau muống và lúa là rất cần thiết. Kết quả thí nghiệm cho thấy điều kiện môi trường thích hợp cho sự phát triển sinh khối của cả bốn dòng nấm PHL3, PHL4, PHC5 và PHL6 là nhiệt độ 30ºC và pH = 3. Riêng dòng nấm PHL4 có thể phát triển tốt khi nhiệt độ môi trường lên đến 40ºC và dòng PHL6 có thể phát triển tốt khi pH môi trường đạt 6. Bốn dòng nấm này cũng có khả năng chịu được độ mặn của môi trường lên đến 3%. Cả bốn dòng nấm thí nghiệm đều thể hiện khả năng ức chế lẫn nhau khi chúng được nuôi cấy trên cùng một môi trường, tuy nhiên, cường độ ức chế lẫn nhau của bốn dòng nấm này khác nhau. Đặc biệt cả bốn dòng nấm thử nghiệm đều thể hiện khả năng đối kháng rõ rệt đối với dòng nấm gây bệnh thối rễ trên cam sành Fusarium solani. Bên cạnh đó, cả bốn dòng nấm này không phải là tác nhân gây bệnh cũng không ức chế phát triển đối với 3 loại cây trồng thử nghiệm gồm đậu xanh, rau muống và lúa. Do đó, bốn dòng nấm thử nghiệm có tiềm năng rất cao trong việc sản xuất chế phẩm vi sinh có lợi trong sản xuất nông nghiệp.
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN KHOA HỌC ĐẤT - -
CAO TRƯỜNG SƠN
ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH LÝ CỦA BỐN DÒNG NẤM PHÂN HỦY VẬT LIỆU HỮU CƠ ĐƯỢC PHÂN LẬP
TỪ NỀN ĐẤT THÂM CANH LÚA TẠI XÃ PHONG HÒA
HUYỆN LAI VUNG, TỈNH ĐỒNG THÁP
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH KHOA HỌC ĐẤT
CẦN THƠ, 2016
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN KHOA HỌC ĐẤT - -
CAO TRƯỜNG SƠN
ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH LÝ CỦA BỐN DÒNG NẤM PHÂN HỦY VẬT LIỆU HỮU CƠ ĐƯỢC PHÂN LẬP
TỪ NỀN ĐẤT THÂM CANH LÚA TẠI XÃ PHONG HÒA
HUYỆN LAI VUNG, TỈNH ĐỒNG THÁP
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH KHOA HỌC ĐẤT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts NGUYỄN KHỞI NGHĨA
CẦN THƠ, 2016
Trang 31 CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG
Ts Nguyễn Khởi Nghĩa Cao Trường Sơn
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
Luận văn với tên đề tài: “Đánh giá một số đặc tính sinh lý của 4 dòng nấm có khả
năng phân hủy vật liệu hữu cơ phân lập từ nền đất thâm canh lúa tại xã Phong
Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp”, do sinh viên Cao Trường Sơn thực hiện
với sự hướng dẫn của Ts Nguyễn Khởi Nghĩa Luận văn này đã báo cáo và được
hội đồng chấm luận văn thông qua
Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2016.
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
I
Trang 42 LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và cán bộ hướngdẫn Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được aicông bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây
3
4 5 6
II
Trang 57 THÔNG TIN CÁ NHÂN
I LÝ LỊCH SƠ LƯỢC
Họ và tên: Cao Trường Sơn Giới tính: Nam
Ngày sinh: 02-08-1995 Nơi sinh: Long An
Quê quán: Huyện Thủ Thừa, Tỉnh Long An - Dân tộc: Kinh
Địa chỉ liên lạc: L40/18/19, đường 30, KDC Ngân Thuận, Bình Thủy, TP Cần
Năm 2013 – 2017, học tại Trường Đại Học Cần Thơ, đường 3/2, phường Xuân
Khánh, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ
Trang 69 LỜI CẢM ƠN Kính dâng!
Cha mẹ suốt đời tận tụy vì sự nghiệp và tương lai của chúng con!
Thành kính biết ơn!
Thầy Nguyễn Khởi Nghĩa đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên và
truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và
hoàn thành luận văn này
Chân thành biết ơn,
Thầy Dương Minh Viễn, cô Đỗ Thị Xuân, anh Đỗ Hoàng Sang, chị
Nguyễn Thị Kiều Oanh cùng các anh, chị và các bạn thuộc phòng Sinh Học Đất,
Bộ Môn Khoa Học Đất đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành thí nghiệm
Quý thầy cô và các anh chị trong Bộ môn Khoa Học Đất, khoa Nông Nghiệp
và Sinh Học Ứng Dụng đã nhiệt tình truyền thụ những kiến thức nền tảng vững
vàng cho tôi
Thân ái gởi về,
Tập thể lớp Khoa học đất, khóa 39 lời chúc sức khỏe, hạnh phúc và thành
Trang 710 MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG……… ……… …viii
DANH MỤC HÌNH……….……….………….… … ………ix
TÓM LƯỢC……… ……….… ………… … xii
MỞ ĐẦU……… ……… ………1
CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU……….………
2 2.1 Sơ lược về nấm phân hủy vật liệu hữu cơ……… … 2
2.2 Sơ lược về nhóm nấm Penicilium……….………2
2.3 Sơ lược về nhóm nấm Aspergillus ……….… 3
2.4 Sơ lược về nhóm nấm Rhizomucor 8
2.5 Khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ của bốn dòng nấm thử nghiệm……… ……….…… 9
CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP………12
3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm 12
3.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 12
3.3 Môi trường dùng trong thí nghiệm 12
3.4 Vật liệu thí nghiệm 13
3.5 Nội dung nghiên cứu: 15
3.5.1 Nội dung 1: Kiểm tra tính đối kháng lẫn nhau giữa bốn dòng nấm PH-L3, PH-L4, PH-C5 và PH-L6 thử nghiệm 15
3.5.2 Nội dung 2: Kiểm tra tính đối kháng sinh học của bốn dòng nấm thử nghiệm đối với dòng nấm Fusarium solani gây bệnh thối rễ cây cam sành 16
3.5.2.1 Mô tả đặc tính hình thái khuẩn lạc và tế bào của dòng nấm gây bệnh thối rễ cam sành Fusarium solani 16
a Nguồn nấm……… ……….14
b Phương pháp Slide Culture……… 16
Trang 83.5.2.2 Chuẩn bị nguồn nấm 17
3.5.2.3 Bố trí thí nghiệm 17
3.5.2.4 Chỉ tiêu theo dõi 18
3.5.3 Nội dung 3: Đánh giá ảnh hưởng của pH lên sự phát triển sinh khối nấm trong môi trường ME lỏng 18
3.5.4 Nội dung 4: Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển sinh khối nấm trong môi trường ME lỏng 19
3.5.5 Nội dung 5: Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ muối lên sự phát triển sinh khối nấm trong môi trường ME lỏng 20
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… …… ……23
4.1 Đánh giá sự đối kháng lẫn nhau giữa bốn dòng nấm thử nghiệm……… ……….……… 23
4.2 Tính đối kháng sinh học của bốn dòng nấm thử nghiệm đối với dòng nấm Fusarium solani gây bệnh thối rễ cây cam sành……….24
4.2.1 Nhận biết đặc tính, hình thái của dòng nấm gây bệnh Fusarium bằng phương pháp Slide culture 25
4.2.2 Kết quả kiểm tra tính đối kháng sinh học của bốn dòng nấm thí nghiệm đối với dòng nấm gây bệnh Fusarium solani trong điều kiện tiệt trùng 26
4.3 Ảnh hưởng của pH lên sự phát triển sinh khối nấm trong điều kiện tiệt trùng ……… 28
4.3.1 Penicillium janthinellum PH-L3 ………27
4.3.2 Aspergillus fumigatus PH-L4 ……….……28
4.3.3 Aspergillus fumigatus PH-C5……… 28
4.3.4 Rhizomucor variabilis PH-L6……….29
4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển sinh khối nấm trong điều kiện tiệt trùng 31
4.4.1 Penicillium janthinellum PH-L3……….………….30
4.4.2 Aspergillus fumigatus PH-L4……….….31
4.4.3 Aspergillus fumigatus PH-C5……….32
4.4.4 Rhizomucor variabilis PH-L6……….32
Trang 94.5 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên sự phát triển sinh khối nấm trong
điều kiện tiệt trùng 34
4.5.1 Penicillium janthinellum PH-L3………33
4.5.2 Aspergillus fumigatus PH-L4……….…34
4.5.3 Aspergillus fumigatus PH-C5………35
4.5.4 Rhizomucor variabilis PH-L6………36
4.6 Kiểm tra tiềm năng gây bệnh và khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng của bốn dòng nấm thử nghiệm đối với một số giống cây trồng ở ĐBSCL 38
4.6.1 Đậu xanh……….37
a Chiều cao thân………37
b Chiều dài rễ………38
c Số rễ……… 38
d Sinh khối khô……….……39
4.6.2 Rau muống……… 40
a Chiều cao thân……….………40
b Chiều dài rễ……….……41
c Số rễ……….…… 42
d Sinh khối khô……….………….43
4.6.3 Lúa……… 43
a Chiều cao thân……….43
b Chiều dài rễ ………44
c Số rễ………45
d Sinh khối khô……… 46
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 49
5.1 Kết luận 49
5.2 Kiến nghị 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO……….………50
PHỤ CHƯƠNG……… ………… … 43
Trang 1011 DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 Môi trường nuôi cấy Hoagland 10
Bảng 3.2 Đặc tính hình thái khuẩn lạc của bốn dòng nấm thử nghiệm………11
Trang 1112 DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1 Hai dạng cuống bào tử nấm điển hình cho 4 dòng nấm: (A) cuống bào tử
dòng nấm PH-L4 và PH-C5; (B) cuống bào tử dòng nấm PH-L3 và PH-L6 được quansát trên kính viển vi ở vật kính 100……….… 12
Hình 3.2 Hai dạng bào tử nấm điển hình cho 4 dòng nấm phân lập: (A) bào tử dạng hình cầu của dòng nấm PH-L3, PH-L4 và PH-L6 và (B) bào tử dạng hình hạt lúa dòng
nấm PH-C5 được quan sát trên kính viển vi ở vật kính 100……….…12Hình 3.3 Sơ đồ mô tả thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng giữa bốn dòng nấm thửnghiệm……….……… 14Hình 3.4 Sơ đồ mô tả thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng giữa bốn dòng nấm thử
nghiệm với dòng nấm gây bệnh thối rễ cam sành Fusarium solani……… 16
Hình 3.5 Hạt giống lúa nảy mầm trên môi trường agar bán lỏng 1% sau 5 ngày ủ… 19Hình 4.1 Sự đối kháng và ức chế lẫn nhau giữa 4 dòng nấm thử nghiệm trên môitrường ME……… 22
Hình 4.2 Hình thái dòng nấm gây bệnh Fusarium solani……… 23 Hình 4.3 Đối kháng giữa 4 dòng nấm thí nghiệm và dòng nấm gây Fusarium
solani……… 25
Hình 4.4 Sinh khối gia tăng của dòng nấm PH-L3 trong các khoảng pH khácnhau……… 25Hình 4.5 Sinh khối gia tăng của dòng nấm PH-L4 trong các khoảng pH khácnhau……… 26Hình 4.6 Sinh khối gia tăng của dòng nấm PH-C5 trong các khoảng pH khácnhau……… 27Hình 4.7 Sinh khối gia tăng của dòng nấm PH-L6 trong các khoảng pH khácnhau……… 28
Trang 12Hình 4.8 Sinh khối gia tăng của dòng nấm PH-L3 ở các khoảng nhiệt độ khác nhau
……… 29Hình 4.9 Sinh khối gia tăng của dòng nấm PH-L4 ở các khoảng nhiệt độ khácnhau……… 30Hình 4.10 Sinh khối gia tăng của dòng nấm PH-C5 ở các khoảng nhiệt độ khácnhau……… 30Hình 4.11 Sinh khối gia tăng của dòng nấm PH-L6 ở các khoảng nhiệt độ khácnhau……… 31Hình 4.12 Sinh khối gia tăng của dòng nấm PH-L3 ở các khoảng nồng độmuối……….… 32Hình 4.13 Sinh khối gia tăng của dòng nấm PH-L4 ở các khoảng nồng độmuối……… 33Hình 4.14 Sinh khối gia tăng của dòng nấm PH-C5 ở các khoảng nồng độmuối……….… 34Hình 4.15 Sinh khối gia tăng của dòng nấm PH-L6 ở các khoảng nồng độmuối……… 35Hình 4.16 Chiều dài rễ đậu xanh ở các nghiệm thức sau thời gian 7ngày……….………… 35Hình 4.17 Chiều cao thân đậu xanh ở các nghiệm thức sau thời gian 7ngày……… ……… 36Hình 4.18 Số rễ đậu xanh ở các nghiệm thức sau thời gian 7 ngày……… 37Hình 4.19 Sinh khối khô đậu xanh ở các nghiệm thức sau thời gian 7 ngày……… 38Hình 4.20 Chiều dài rễ rau muống ở các nghiệm thức sau thời gian 7 ngày ……… 40Hình 4.21 Chiều cao thân rau muống ở các NT sau thời gian 7 ngày……… 40
Trang 13Hình 4.22 Số rễ rau muống ở các nghiệm thức sau thời gian 7 ngày……… 41
Hình 4.23 Sinh khối khô rau muống ở các NT sau thời gian 7 ngày……… 41
Hình 4.24 Chiều dài rễ lúa ở các nghiệm thức sau thời gian 7 ngày………43
Hình 4.25 Chiều cao thân lúa ở các nghiệm thức sau thời gian 7 ngày……… 43
Hình 4.26 Số rễ lúa ở các nghiệm thức sau thời gian 7 ngày……… 44
Hình 4.27 Sinh khối khô lúa ở các nghiệm thức sau thời gian 7 ngày……….45
Cao Trường Sơn, 2016 “Đánh giá một số đặc tính sinh lý của bốn dòng nấm có
Trang 14khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ phân lập từ nền đất thâm canh lúa tại xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp” Luận văn đại học chuyên ngành
Khoa học đất, Bộ môn Khoa Học Đất, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng,Trường Đại học Cần Thơ
Người hướng dẫn khoa học: Ts Nguyễn Khởi Nghĩa.
13 TÓM LƯỢC
Trong tự nhiên nấm đóng một vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phânhủy các vật chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và traođổi vật chất Bên cạnh đó nấm cũng được xem là vi sinh vật chủ yếu tham gia phângiải lignin và cellulose Mục tiêu của đề tài nhằm đánh giá một số đặc tính sinh lý củabốn dòng nấm có khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ được phân lập từ nền đất thâmcanh lúa tại xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp Một số đặc tính sinh lýcủa bốn dòng nấm này được khảo sát gồm pH, nhiệt độ và nồng độ muối NaCl nhằmtìm ra môi trường thích hợp cho sự phát triển của chúng Bên cạnh đó, việc kiểm tratính đối kháng lẫn nhau giữa bốn dòng nấm, khả năng phòng trừ sinh học của chúng
đối với dòng nấm gây bệnh thối rễ trên cây cam sành Fusarium solani cũng như việc
kiểm tra tiềm năng gây bệnh và khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng của bốn
dòng nấm này đối với hạt giống cây đậu xanh, rau muống và lúa là rất cần thiết Kết
quả thí nghiệm cho thấy điều kiện môi trường thích hợp cho sự phát triển sinh khối của
cả bốn dòng nấm PH-L3, PH-L4, PH-C5 và PH-L6 là nhiệt độ 30ºC và pH = 3 Riêngdòng nấm PH-L4 có thể phát triển tốt khi nhiệt độ môi trường lên đến 40ºC và dòngPH-L6 có thể phát triển tốt khi pH môi trường đạt 6 Bốn dòng nấm này cũng có khảnăng chịu được độ mặn của môi trường lên đến 3% Cả bốn dòng nấm thí nghiệm đềuthể hiện khả năng ức chế lẫn nhau khi chúng được nuôi cấy trên cùng một môi trường,tuy nhiên, cường độ ức chế lẫn nhau của bốn dòng nấm này khác nhau Đặc biệt cảbốn dòng nấm thử nghiệm đều thể hiện khả năng đối kháng rõ rệt đối với dòng nấm
gây bệnh thối rễ trên cam sành Fusarium solani Bên cạnh đó, cả bốn dòng nấm này
không phải là tác nhân gây bệnh cũng không ức chế phát triển đối với 3 loại cây trồngthử nghiệm gồm đậu xanh, rau muống và lúa Do đó, bốn dòng nấm thử nghiệm cótiềm năng rất cao trong việc sản xuất chế phẩm vi sinh có lợi trong sản xuất nôngnghiệp
Trang 15CHƯƠNG I
MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, các đề tài nghiên cứu về các dòng nấm có tiềm năngphân hủy lignin và cellulose đã được quan tâm và chú ý nhiều hơn, các nghiêm cứunày góp phần cho sự đa dạng về các dòng nấm bản địa có tiềm năng phân hủy caocellulose và lignin trên các hệ sinh thái khác nhau, đặc biệt là vùng Đồng Bằng Sông
Cửu Long Một số đề tài được thực hiện đã phân lập và đánh giá hiệu quả phân hủy
cellulose và lignin của một số dòng nấm đối với một số vật liệu hữu cơ từ phế phẩmnông nghiệp trong điều kiện tiệt trùng và không tiệt trùng nhằm chuyển hóa phế thảinông nghiệp thành phân bón hữu cơ cung cấp dinh dưỡng cho đất và cây trồng vùng
ĐBSCL Trong số đó, có đề tài “Phân lập một số dòng nấm bản địa có khả năng
phân hủy vật liệu hữu cơ chứa cellulose và lignin từ nền đất thâm canh lúa tại xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp” của Võ Thị Ngọc Cẩm và ctv.,
(2015) đã phân lập được bốn dòng nấm phân hủy tốt vật liệu hữu cơ chứa cellulose vàlignin Tuy nhiên, nghiên cứu này chỉ dừng lại ở mức định danh các dòng nấm chứchưa tìm hiểu sâu về các đặt tính sinh lý của các dòng nấm này cũng như khả năng đốikháng lẫn nhau và với các dòng nấm gây bệnh trên cây trồng Tiềm năng gây bệnhcũng như khả năng kích thích sự phát triển một số cây trồng của bốn dòng nấm này
chưa được nghiên cứu và tìm hiểu rõ Vì vậy, đề tài “Đánh giá một số đặc tính sinh
lý của bốn dòng nấm có khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ phân lập từ nền đất thâm canh lúa tại xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp” này được thựchiện nhằm mục tiêu:………
Trang 16nhóm nấm bất toàn: Clasdosporium sp., Heminthosporium sp., Humicola sp.,
Dematium sp., Alternaria sp., Aspergillus sp., Metarrhizum sp và Gliocladium sp, ; 2)
Các dòng nấm thuộc lớp nấm Đảm: Agaricus sp., Marasmius sp., Pleurotus sp.,
Polyporus sp., Trametes sp., Ustulina sp 3) Một số nấm ăn được trồng trên mùn cưa: Pleurotus sp (nấm bào ngư), Auricularia sp., Polytricha sp (nấm mèo), nấm Trametes sp Các nấm làm mục gỗ được xếp thành hai nhóm: a) Nhóm nấm làm thối
gỗ có màu nâu: Là nhóm nấm phân giải cellulose mà không phân giải được lignin vàb) Nhóm nấm làm thối gỗ có màu trắng: Có thể phân giải cả cellulose lẫn lignin gồm:
Polystictus sp., Armillaaria sp., Polyporus sp., Stereum sp., Ganoderma sp., Pleurotus
sp., Trametes sp., Fomes sp., Ustulina sp (Phạm Văn Kim, 2000) Những vi sinh vật
phát triển trên hợp chất chứa cellulose thường tiết ra các loại enzyme này để phân hủychuyển hóa cellulose (Nguyễn Xuân Thành và ctv., 2003) Một số loại nấm sau đây có
khả năng phân hủy tốt lignin như: Polysitctus versicolor, Stereum hisutum, Pholiota sp., Clytocye sp Trichoderma là một trong những chi nấm được nghiên cứu nhiều nhất và đặc biệt là Trichoderma reesei Ưu điểm của dòng nấm này là có hệ enzyme
hoạt động rất mạnh và có khả năng phân giải hoàn toàn cellulose tự nhiên (Markku
Saloheimo và ctv., 2012) Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy nấm Trichoderma sp.
tổng hợp một lượng lớn endo-glucanase và exo-glucanase, nhưng chỉ một lượng ít
β-glucosidase, trong khi đó các chủng thuộc giống Aspergillus sp thường sinh ra một
lượng lớn endo-glucanase và β-glucosidase nhưng một lượng ít exo-glucanase
(Bothast và Saha, 1997) Exo-glucanase được tạo ra từ Trichoderma sp., Aspergillus
sp và Penicillium sp nhưng nhiều nhất từ Aspergillus sp đặc biệt là Aspergillus niger (Shen và ctv., 2003), trong khi ezyme β-glucosidase được tiết ra nhiều từ Trichoderma
sp và Aspergillus oryzae (Fareeha và ctv., 2011) Enzyme cellulase tiết ra từ Trichoderma reesei thích hợp với khoảng pH = 6 ở nhiệt độ là 40oC (Han và ctv.,
Trang 172010) Cellulase thu được từ Aspergillus sp hoạt động tốt ở khoảng pH =7 và ở 30oC(Chandra và ctv., 2012) Deschams và ctv (1985) nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp
cellulase của Trichoderma haianum trên môi trường gồm hỗn hợp rơm lúa mì (80%)
và cám (20%) với ẩm độ 74% và pH 5,8 Trichoderma virde có khả năng phân hủy
cellulose khá cao: 80% trong vòng 3 ngày (Lars và ctv., 2005) Một số loài nấm có khảnăng sinh ra một lượng lớn cellulase để phân giải cellulose, phần lớn chúng thuộc
giống Alternaria, Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus, Penicillium… Trong đó hai giống Trichoderma và Aspergillus được nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản
xuất cellulase (Bothast và Saha, 1997) Theo Mandels và Reese (1964) thì nhiều loàinấm có khả năng tổng hợp enzyme Cx (exoglucanza), nhưng rất ít loài có khả năng sảnsinh enzyme C1 (endogluanase) Trong khi đó, Teho Reese (1984) thì cho rằng C1 là
"tiền nhân tố thủy phân", là enzyme không đặc hiệu, nó làm trương cellulose tự nhiênthành các chuỗi cellulose hoạt động có mạch ngắn hơn và bị enzyme Cx tiếp tục phâncắt tạo thành các đường tan và cuối cùng thành glucose
Hầu hết nấm phân hủy lignin thuộc chi Basidiomycetes gồm: Phanerochaete
chrysoporium, Phlebia radiata, Trametes versicolor, Bjerkandera adusta, Chrysonilia sitophila, Streptomyces badius và Streptomyces flavovirens (Kirk và Farrell, 1987;
Blanchette, 1991) Ngoài ra, còn một số dòng nấm phân hủy lignin thuộc nhóm
Ascomycetes sp (Duranvà ctv., 1987) và Actiomyces sp (Crawford ctv., 1983;
Ramachandra và ctv., 1987) Ngoài ra, một vài loài nấm sống trong đất và gỗ có khả
năng phân hủy lignin cao như: Paraconiothyrium sp có khả năng sử dụng một số dạng
hợp chất tiêu biểu của lignin sau 40 ngày nuôi cấy với tỷ lệ lignin được phân hủy là
22,99 % (Nilsson và ctv., 2011) Bên cạnh đó, nấm Chrysonilia sitophila làm giảm
59,6% trọng lượng lignin của cây thông trong môi trường lỏng sau 12 ngày, trong khi
đó trên môi trường agar có bổ sung glucose thì tỷ lệ này là 25% trong 3 tháng (Ferraz
và Duran, 1994 và 1995)
2.2 Sơ lược về nhóm nấm Penicilium
Trong những năm gần đây, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, quá trình địnhdanh cho nhiều loài vi sinh vật cũng dễ dàng hơn với thiết bị hiện đại hơn Nhiều loại
vi sinh có lợi, hại được biết đến rõ ràng hơn Trong đó, giống nấm mốc Penicillium đã
được các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng trong thực tế Tiêu biểu như loài
Penicillium roqueforti được sử dụng trong việc làm chín phomat xanh, một sản phẩm
Trang 18quen thuộc đối với người dân châu Âu hay Penicillium notatum được dùng trong sản xuất kháng sinh Penicillin Ngoài ra, giống Penicillium còn có một số loài khác như:
Penicillium italicum và Penicillium digitatum, hai loài này thường gây bệnh mốc xanh
trên các loại cây ăn quả có múi, nhất là giai đoạn tồn trữ sau thu hoạch Hoặc loài
Penicillium marneffei gây bệnh lở loét toàn thân trên người Ainsworth (1973) chia
ngành phụ Ascomycotina thành 6 lớp: Hemiascomycetes, Loculoascomycetes,
Plectomycetes, Laboulbeniomycetes, Pyrenomycetes và Discomycetes Alexopoulos và
Mim (1979) chia lớp Plectomycetes thành 4 lớp phụ trong đó lớp phụ Plectomycetidae
có 5 bộ trong đó 2 bộ Eurotiales và bộ Erysiphales Chi Penicillium thuộc họ
Eurotiaceae, bộ Eurotiales Giới: • Fungi Ngành phụ: • Ascomycotina Lớp: • Plectomyceste Bộ: • Eurotiales Họ: • Eurotiaceae • Chi: Penicillium Chi Penicillium
đặc trưng bởi các đặc điểm: Sợi nấm ngăn vách, phân nhánh, không màu hoặc màunhạt, đôi khi màu sẫm Khuẩn lạc màu lục, vàng lục, xanh lục, lục xám, xám, đôi khi
có màu vàng, đỏ, tím hoặc trắng Mặt trái khuẩn lạc không màu hoặc có màu sắc khácnhau, môi trường thạch nuôi cấy không màu hoặc có màu sắc do có mặt các sắc tố hòatan tương ứng Khuẩn lạc có hoặc không có vết khía xuyên tâm hay đồng tâm, có hoặc
không có giọt tiết (exudat) Bộ máy mang bào tử trần (còn gọi là "chổi", penicillius)
hoặc chỉ gồm giá bào tử trần với một vòng thể bình ở đỉnh giá (cấu tạo một vòng,
monoverticillate), hoặc gồm giá bào tử trần với hai đến nhiều cuống tể bình (metulae)
ở phần ngọn giá, trên đỉnh của mỗi cuống thể bình đó có các thể bình (cấu tạo haivòng, biverticillate) Trường hợp các giá bào tử trần mang một hoặc nhiều nhánh(branch) ở phần ngọn giá, sau đó các nhánh mang các cuống thể bình và các cuống thểbình lại mang các th ể bình cũng được coi là cấu tạo hai vòng Khi các cuống thể bìnhxếp đều đặn và sát nhau trên ngọn giá, cấu tạo hai vòng đó gọi là cấu tạo hai vòng đốixứng, trường hợp các cuống thể bình xếp không đều đặn trên phần ngọn giá hoặc cónhánh, cấu tạo này được gọi là cấu tạo hai vòng không đối xứng Trường hợp giá bào
tử trần mang nhiều nhánh và các nhánh này cùng với các cuống thể bình, các thể bìnhxếp đều đặn và sát nhau, bộ máy mang bào tử tr ần có cấu tạo nhiều vòng(polyverticillate) Giá bào tử trần có thể phát triển từ các sợi nấm nằm sát cơ chất, sátmặt môi trường thạch nuôi cấy (các sợi nền), khi đó thường có chiều dài đều nhau vàkhẩn lạc có dạng mặt nhung (velutinate) Giá bào tử trần có th ể là nhánh của các sợinấm khí sinh, khuẩn lạc trong trường hợp này có m ặt dạng len hoặc xốp bông (lanate,
Trang 19floccose) Trường hợp các giá bào t ử tr ần là các nhánh của các bó sợi hoặc bản thânchúng tụ họp lại với nhau thành các bó giá, khuẩn lạc đặc trưng bởi sự có mặt c ủa các
bó sợi (funiculose) ho ặc của các bó giá (fasciculate) Tế bào sinh bào tử trần của các
loài thuộc chi Penicillium là các thể bình Thể bình ở nhiều loài của chi nấm này có
phần đỉnh ngắn và thon nhỏ dần, phần đỉnh này thường có đường kính vào khoảng ⅓
đường kính của phần thân Bào tử trần của các loài thuộc chi Penicillium thuộc tip
phialoconidi (tip cơ bản euconidi), không có vách ngăn, hình cầu, gần cầu, hình trứng,elip, đôi khi hình trụ Khi riêng rẽ, các bào tử trần không màu hoặc màu nh ạt khi t ụhọp thành đám, thường có màu lục, vàng lục, lục xanh, lục xám, xám Các bào tử trầnnày tọa thành chuỗi dài trên miệng thể bình Bào tử trần cũng như giá bào tử trần, cácnhánh, các cuống th ể bình, các thể bình tùy từng loại có mặt ngoài nhẵn, ráp, có gai
hoặc sần sùi, gồ ghề Một số ít loài tạo thành hạch nấm (sclerotium) Hạch nấm cấu t
ạo bởi các tế bào có vách dày, có thể rất cứng hoặc mềm, hình cầu, gần cầu, khôngmàu hoặc có màu sắc khác nhau, đơn độc hoặc thành cụm Một số loài như đã nói, có
bào tử túi (ascosporum) Thể quả túi là những thể quả kín (cleisthothecium), có vỏ thể
quả cứng hoặc mềm, có hoặc không có các sợi nấm bao quanh, thể sinh túi cuộn xoắnhoặc thẳng, túi bào tử (ascus) đơn độc hoặc thành chuỗi, bào tử túi không ngăn vách,
có hoặc không có rãnh và gờ quỹ đạo Penicillium sinh sản vô tính với cọng bào tử và
đính bào tử, cọng bào tử có thể không phân nhánh, phân nhánh bậc 1, 2 hay 3 và tậncùng của cọng bào tử là các thể bình, nếu cọng bào tử không phân nhánh thì tận cùng
là các thể bình và các chuổi đính bào tử giống như cây cọ vẽ của các hoạ sĩ nên còn
gọi là thể bình vẽ (metulae), cán (ramus) và cọ vẽ (penicillus) Penicillium có mặt hầu
hết các vùng có khí hậu khác nhau và phát triển phổ biến trong đất, trong vùng nuớcmặn hay nước ngọt, hoại sinh trên xác bã động thực vật và ký sinh trên thực vật và
động vật Nhiều loài thuộc chi Penicillium phân bố rộng rãi ở nhiều vùng địa lý trên
Trái Đất, có mặt ở nhiều cơ chất tự nhiên, trên nhiều sản phẩm công nông nghiệp vàgây mốc cho các sản phẩm này Nhiều loài đã được phát hiện có ở Việt Nam trên các
cơ chất tự nhiên Nấm Penicillium sống chủ yếu trên các chất hữu cơ phân hủy sinh học Vì vậy nấm Penicillium có mặt trong hầu hết các chế phẩm phân hủy vật liệu hữu
cơ (Cao Ngọc Điệp, 2005)
2.3 Sơ lược về nhóm nấm Aspergillus
Trang 20Aspergillus là một trong những chi có tên lâu đời nhất của nấm Đến năm 1926, Aspergillus đã trở thành một trong những nhóm nấm mốc nỗi tiếng và được nghiêm
cứu nhiều nhất Cuối thế kỉ thứ 19, một số công trình nghiên cứu cho biết một số sản
phẩm lên men của một số loài thuộc giống Aspergillus là axit hữu cơ như axit oxalic, axit citric, và do đó Aspergillus bắt đầu được chú ý nghiên cứu về nhiều mặt như: sinh hóa, lên men, phân loại Nấm Aspergillus là một trong những chủng nấm lớn nhất, có
mặt ở khắp nơi trên thế giới, có khoảng 100 loài, hiện tại có khoảng 20-30 loài gây
bệnh cho người, những chủng quan trọng là A fumigatus, A flavus, A niger như: A.aureus, A.flavus gây viêm da; A.niger gây viêm tai, phổi, dị ứng, hen; A.nidulans, A.versicolerr, A.terreuss gây viêm da ở chân, tay, viêm quanh móng; A.keratitis gây viêm giác mạc; đặc biệt A.fumigatus và A.flavus hay gây viêm phổi Nấm Aspergillus sống hoại sinh trên đất, sản sinh ra hàng tỷ bào tử bay trong
không khí, người suy giảm miễn dịch (HIV/AIDS, ung thư, dùng hóa liệu pháp,glucocorticoides kéo dài…) có nhiều nguy cơ mắc bệnh thể lan tràn Bệnh có liên quannghề nghiệp: giặt áo lông, cạo ống khói, nông dân, nuôi súc vật… Phương thức gây
bệnh của Aspergillus là đầu tiên có thể gây bệnh ở da sau đó tiến triển gây bệnh hệ thống hoặc ngược lại Aspergillus fumigatus là một loại nấm thuộc giống
Aspergillus và là một trong những loài nấm Aspergillus thường gặp nhất và gây bệnh ở
những đối tượng suy giảm miễn dịch Chi Aspergillus thuộc lớp lớp bất toàn (Fungi
Imperfecti), được chia làm 7 nhóm Phương thức gây bệnh của Aspergilluss là đầu tiên
có thể gây bệnh ở da sau đó tiến triển gây bệnh hệ thống hoặc ngược lại(http://tailieu.vn/doc/benh-nam-aspergillosis-328587.html)
A fumigatus có bộ gen đơn bội ổn định, không có biết rõ chu kỳ hữu tính của loài
nấm này và sinh sản bằng cách hình thành bào tử dính (conidiospores) và giải phóngvào trong môi trường Chúng có khả năng phát triển ở nhiệt độ 37°C (cùng thân nhiệtcủa người), bào tử là các chất ô nhiễm do hít phải gặp nhiều nhất ở người; tuy nhiên,chúng cũng bị loại trừ nhanh chóng nhờ hệ miễn dịch ở trên những người khỏe mạnh
Giống Aspergillus có khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn ngang và phát triển chủ yếu
trên bề mặt cơ chất, tế bào chất có nhiều nhân và những nhân này có thể di chuyển qualại giữa các tế bào với một lổ nhỏ ở cách ngăn.Đặc điểm đại thể chính trong các loàinấm này là các chỉ điểm như tỷ lệ phát triển của nấm, màu sắc, khuẩn lạc và sự dung
nạp với nhiệt độ Ngoại trừ Aspergillus nidulans và Aspergillus glaucus, tỷ lệ phát
Trang 21triển là từ nhanh đến trung bình Trong khi Aspergillus nidulans và Aspergillus
glaucus phát triển chậm và đạt đến kích cỡ khuẩn lạc 0.5-1cm sau khi ủ ở nhiệt độ
25°C trong 7 ngày trên môi trường thạch Czapek-Dox, các loài còn lại thì đạt kíchthước đường kính 1-9cm trong môi trường đặc biệt Sự khác biệt về tỷ lệ phát triểnnhư vậy đã giúp các nhà khoa học định loài rõ ràng hơn Các khuẩn lạc
của Aspergillus thì lấm chấm đến bột trên sợi Màu sắc bề mặt có thể khác nhau tùy
theo loài và đảo ngược màu sắc về vàng nhạt trong hầu hết các phân lập Tuy nhiên,
đảo màu sắc có thể từ màu tí đến màu oliu trên một vài dòng của nấm Aspergillus
nidulans và từ màu cam sang màu tía trên dòng Aspergillus versicolor Aspergillus fumigatus là một loại nấm dung nạp tốt với nhiệt độ và phát triển tốt ở nhiệt độ trên
400C Đặc tính này là duy nhất chỉ có ở riêng Aspergillus fumigatustrong số các loàiAspergillus Aspergillus fumigatus có thể phát triển ở khoảng nhiệt độ từ 20-50°C Nấm mốc Aspergillus là vi nấm không chỉ gây hại ở thực vật mà còn gây nhưng bệnh nguy hiểm ở người Sau đây là một số loài: Aspergillus flavus là một loại nấm thuộc chi Apspergillus- là một tác nhân gây bệnh của con người, gắn liền với aspergillosis
phổi gây ra các bệnh nhiễm trùng giác mạc Nhiều chủng sản xuất ra độc tố
aflatoxin-một hợp chất gây ung thư gan Aspergillus niger là aflatoxin-một loại nấm và aflatoxin-một trong những loài phổ biến nhất của các chi Aspergillus Nó gây ra một căn bệnh được gọi là nấm
mốc đen trên một số loại trái cây và rau quả như nho, hành tây, và đậu phộng, và là
một chất gây ô nhiễm phổ biến của thực phẩm Aspergillus niger là một trong những
nguyên nhân phổ biến nhất của nhiễm trùng tai nấm, mà có thể gây đau, thính lực tạmthời mất mát, và trong trường hợp nghiêm trọng, thiệt hại cho ống tai và màngtympanic (http://tailieu.vn/doc/benh-nam-aspergillosis-328587.html)
Các loài nấm thuộc giống Aspergillus phân bố rộng rãi trên cơ chất tự nhiên,
trong các sản phẩm công nông nghiệp, ở nhiều vùng địa lý khác nhau trên thế giới nênchúng được sử dụng rất rộng rải trong nhiều lĩnh vực khác nhau Một số loài đặc biệt
là loài A.oryzae đã được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp lên men truyền thống để
chế biến thực phẩm ở nhiều nước châu Á như Việt Nam, Trung Quốc, Nhậtbản, Trong công nghệ sinh học đã và đang sử dụng một số loài thuộc giống
Aspergillus như: A niger, A.oryzae để sản xuất enzyme như amylase, chitinase,
protease, cellulase, pectinase, ; trong công nghiệp sản xuất chế biến thực phẩm như:tương chao, nước mắm, nước tương, ;công nghiệp sản xuất một số axit hữu cơ như:
Trang 22acid citric, acid glucomic, Một số loài thuộc giống Aspergillus khác có khả năng tạo chất kháng sinh, như A.fumigatus tạo thành fumagilin có tác dụng lên Entamoabae
histolyca; A.humicola, A.nidulans tạo thành humicolin, nidulin có tác dụng ức chế đối
với với các loại vi khuẩn, trong số các chất này thực sự dùng trong công nghiệp dược
phẩm hiện nay chỉ có loài A.fumigatus sản xuất fumagilin làm thuốc chữa lị amip Nhiều loài giống Aspergillus có khả năng biến đổi sinh học, một số khác tạo ra các loại độc tố, đặc biệt chú ý tới loại độc tố gây ung thư gan như loài A.flavus, A.paraciticus tạo thành Aflatoxin (http://123doc.org/document/2276006-tim-hieu-ve-
nam-aspergillus-tac-hai-va-cach-phong-chong.htm)
Chủng A ninger GM156 (ĐB106) là một variant đột biến của chủng dại A ningerGM56, có khả năng sinh tổng hợp xylanaza trên các phế phụ phẩm nông nghiệp.Xylanaza là một loại enzym quan trọng được dùng rộng rãi trong nhiều ngành côngnghiệp và gần đây được sử dụng nhiều để tăng trọng trong chăn nuôi(http://tailieu.vn/tag/benh-nam-aspergillus.html)
2.4 Sơ lược về nhóm nấm Rhizomucor
Dòng nấm Rhizomucor có khuẩn ty đơn bào phân nhánh mạnh, sinh bào tử.Chúng mọc ở các loại hạt, thức ăn gia súc, thực phẩm bị ẩm thành một lớp lông tơ màuxanh Một số dòng nấm Rhizomucor có khả năng lên men rượu và oxy hóa Chúngđược dùng trong sản xuất acid hữu cơ và chế phẩm enzym Bào tử túi
(sporangiopores) ở nấm Rhizomucor chứa trong túi bào tử động (zoosporangium) và
túi bào tử (sporangium) được mang bỡi cuống túi bào tử (sporangiophores) Nấm
Rhizomucor là tác nhân chủ yếu gây bệnh nấm Mucorales Bệnh khởi phát ở mũi và
xoang cạnh mũi tạo ra một bệnh cảnh lâm sàng đặc trưng: sốt nhẹ, đau âm ỉ vùngxoang, có thể có sung huyết mũi hay chảy nước mũi loãng có lẫn máu; mấy ngày saubệnh nhân bị song thị, sốt cao, mất tri giác Khám thấy giảm vận động một mắt, phùkết mạc, lồi mắt; xương xoăn mũi ở vách đỏ sậm hay hoại tử; có thể hoại tử một vùng
ở khẩu cái cứng; viêm da gò má; dễ bị mù do nấm xâm nhập vào nhãn cầu hay độngmạch mắt Nấm khó phát triển ở mô bị nhiễm, chỉ gồm những sợi nấm rộng, hiếm khi
có vách, đường kính khoảng 6 - 50mm, trong khi nó mọc nhanh chóng và đa dạng ởnhững môi trường cấy trong nhiệt độ phòng Bệnh nấm Mucorales hay gặp ở nhữngbệnh nhân trước đây đã từng mắc các bệnh nặng khác Bệnh khởi phát từ những xoangcạnh mũi và mũi hay gặp ở bệnh nhân đái tháo đường Bệnh ở xoang hoặc phổi lại gặp
Trang 23nhiều ở các bệnh nhân cấy ghép cơ quan, bệnh máu ác tính Bệnh tại đường tiêu hóaxuất hiện ở những bệnh nhân bị ure máu cao, suy dinh dưỡng nặng hay bị tiêu chảymạn tính Người mắc bệnh từ tự nhiên, không lây từ người này sang người khác Mọithể bệnh do nấm Mucorales gây ra có đặc điểm nổi bật là sợi nấm xâm nhập mạchmáu; thiếu máu hay hoại tử xuất huyết là đặc điểm tổ chức học cần lưu ý
(http://suckhoedoisong.vn/benh-nam-mucorales-tai-hoa-khon-luong-n3033.html)
2.5 Khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ của bốn dòng nấm thử nghiệm
Qua các nghiên cứu trước đây cho thấy khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ của
các dòng nấm Aspergillus, Penicillium và Rhizomucor rất cao Trong đó, Aspergillus
fumigatus là dòng nấm phân hủy rất hiệu quả đối với các loại vật liệu hữu cơ rơm, bã
cà phê và mùn cưa Penicillium janthinellum là dòng nấm phân hủy rất hiệu quả đối với hai vật liệu hữu cơ: xác mía và mụn dừa Rhizomucor variabilis là dòng nấm phân
hủy rất hiệu quả vật liệu hữu cơ vỏ (Võ Thị Ngọc Cẩm và ctv , 2015) Tuy dòng nấm
Rhizomucor gây các bệnh lí trên con người là chủ yếu, nhưng ở đề tài trước cũng đã
phát hiện được dòng nấm này cũng có khả năng phân hủy tốt vật liệu hữu cơ (Võ ThịNgọc Cẩm và ctv , 2015)
Trang 24
Thiết bị thí nghiệm: tủ sấy, máy lắc, tủ hút, tủ cấy hiệu ESCO, máy vortex, tủ lạnh4°C, Máy đo pH, máy sấy ẩm độ MA35 Sartorius, cân 2 số lẻ, 4 số lẻ
3.3 Môi trường dùng trong thí nghiệm
Các thí nghiệm bố trí sử dụng môi trường Malt Extract (ME), thành phần môitrường gồm: 1.3g K2HPO4.3H2O, 1g KH2P04, 1g NH4NO3, 0.02g CaCl2, 0.2gMgS04.7H20, 13.3g Agar, 10g Malt Extract trong 1L nước khử khoáng, lỏng tiệt trùngđược điều chỉnh nhiệt độ, pH, nồng độ muối cho phù hợp với các thí nghiệm riêngbiệt Môi trường Agar bán lỏng 1% (1g Agar trong 1L nước khử khoáng)
Bảng 3.1 Môi trường nuôi cấy Hoagland.
Trang 25Bốn dòng nấm đã được định danh: Penicillium janthinellum PH-L3, Aspergillus
fumigatus PH-L4, Aspergillus fumigatus PH-C5 và Rhizomucor variabilis PH-L6 sử
dụng trong thí nghiệm được phân lập và tuyển chọn từ đề tài nghiên cứu khoa học của
Võ Thị Ngọc Cẩm và ctv., (2014) với tên đề tài: “Phân lập một số dòng nấm bản địa
có khả năng phân hủy vật liệu hữu cơ chứa cellulose và lignin từ nền đất thâm canh lúatại xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp” Đặc tính hình thái khuẩn lạc vàdạng bào tử của bốn dòng nấm thí nghiệm được thể hiện trong Bảng 2.3 và Hình 3.1,Hình 3.2
Bảng 2.3 Đặc tính hình thái khuẩn lạc của bốn dòng nấm thử nghiệm
STT Ký hiệu Màu sắc và hình dạng khuẩn lạc Màu khuẩn lạc ở mặt dưới đĩa
petri
Đường kính khuẩn lạc (cm)
1 PH-L3 Màu xanh xám, tròn, khôngnhô Trắng đục 1,7
Trang 26Hình 3.1 Hai dạng cuống bào tử nấm điển hình cho 4 dòng nấm: (A) cuống bào tử
dòng nấm PH-L4 và PH-C5; (B) cuống bào tử dòng nấm PH-L3 và PH-L6được quan sát trên kính viển vi ở vật kính 100
Hình 3.2 Hai dạng bào tử nấm điển hình cho 4 dòng nấm phân lập: (A) bào tử dạng
hình cầu của dòng nấm PH-L3, PH-L4 và PH-L6 và (B) bào tử dạng hình hạt
lúa dòng nấm PH-C5 được quan sát trên kính viển vi ở vật kính 100
3.5 Nội dung nghiên cứu:
3.5.1 Nội dung 1: Kiểm tra tính đối kháng lẫn nhau giữa bốn dòng nấm PH-L3, PH-L4, PH-C5 và PH-L6 thử nghiệm
Mục tiêu của nội dung nghiên cứu 1 nhằm kiểm tra khả năng đối kháng vớinhau giữa bốn dòng nấm thử nghiệm
Trang 27a Chuẩn bị nguồn nấm
Mẫu nấm được trữ và bảo quản trong môi trường glycerol trong tủ đông -30oC trướckhi sử dụng Trước khi tiến hành bố trí thí nghiệm, nấm được nuôi cấy riêng biệt trênmôi trường Malt Extract trong 4 ngày ở điều kiện phòng thí nghiệm để các dòng nấmnày gia tăng sinh khối Dùng Pasteur Pipet tiệt trùng có đường kính 2 mm để cắt khốiagar chứa nấm
b Bố trí thí nghiệm
Cấy mỗi hai dòng nấm khác nhau lên các đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy MaltExtract Dùng bút lông chia thành 4 phần bằng nhau cho mỗi đĩa agar, khối nấm vớikích thước 2 mm chứa mỗi dòng nấm được đặt xen kẽ với nhau ở mỗi một phần tư củađĩa (Hình 3.1) Dán parafilm bên ngoài để tránh nhiễm mẫu Đĩa petri được đặt trongtối ở điều kiện phòng thí nghiệm trong 6 ngày Sau đó quan sát và chụp hình để ghinhận khả năng đối kháng lẫn nhau giữa các dòng nấm thí nghiệm
Trang 28Hình 3.3 Sơ đồ mô tả thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng giữa bốn dòng nấm thử
nghiệm
3.5.2 Nội dung 2: Kiểm tra tính đối kháng sinh học của bốn dòng nấm thử
nghiệm đối với dòng nấm Fusarium solani gây bệnh thối rễ cây cam sành
Mục tiêu của thí nghiệm nhằm kiểm tra tính đối kháng sinh học của bốn dòng
nấm thử nghiệm đối với dòng nấm gây bệnh thối rễ cam sành Fusarium solani
3.5.2.1 Mô tả đặc tính hình thái khuẩn lạc và tế bào của dòng nấm gây bệnh thối
rễ cam sành Fusarium solani.
a Nguồn gốc:
Dòng nấm Fusarium sp được phân lập từ rễ cam sành bị bệnh thối rễ tại xã Tường
Lộc, Huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long Nấm được phân lập trên môi trường PDA (4 g Potato Extract, 20 g Dextrose và 15 g Agar, cuối cùng hiệu chỉnh pH = 5,6 trong 1 L nước cất) Sau khi phân lập dòng nấm được mô tả hình thái khuẩn lạc và tế bào (dùng phương pháp Slide Culture) Cuối cùng, dòng nấm phân lập được giải trình tự gen
vùng ITS và được định danh như là dòng Fusarium solani (Nguồn nấm Fusarium
solani được tiếp nhận từ nghiên cứu sinh Nguyễn Ngọc Thanh, ngành Khoa học Đất)
PH-L3 PH-L4
PH-L3 PH-L4
Trang 2918 b Phương pháp Slide Culture được tiến hành như sau:
Đặt giấy lọc tiệt trùng lên trên đĩa petri, sau đó, đặt hai que tăm song songnhau lên trên giấy lọc, nhỏ nước khử khoáng tiệt trùng lên trên bề mặt giấy lọc đến khinước thấm đều khắp bề mặt giấy Đặt slide thủy tinh lên trên 2 que tăm, đặt một khốimôi trường ME agar (Malt Extract) với kích thước 2 cm x 2 cm lên trên slide thủy
tinh, tiếp theo cấy sợi nấm Fusarium solani đang phát triển tốt vào khối agar rồi đậy
kính đậy vật lên trên khối agar đã chủng nấm Dán parafilm bên ngoài để tránh nhiễmmẫu Đĩa petri được đặt trong điều kiện phòng thí nghiệm trong 3-5 ngày Khi quan sáttrên kính hiển vi, lấy kính đậy vật có chứa sợi nấm, bào tử và cuống bào tử ra khỏi đĩapetri, nhỏ 1 giọt alcohol 95% lên trên bề mặt kính đậy vật, đợi đến khi alcohol bốc hơihoàn toàn, đặt kính đậy vật lên trên slide thủy tinh mới có nhỏ 1 giọt thuốc nhuộmFuchsin acid 0,3% và tiến hành quan sát trên kính hiển vi
3.5.2.2 Chuẩn bị nguồn nấm
Bốn dòng nấm ký hiệu: PH-L3,PH-L4, PH-C5 và PH-L6 được chuẩn bị tương
tự mục 3.5.1.a.
Dòng nấm Fusarium solani được nuôi cấy trên môi trường Malt Extract trong
4 ngày ở điều kiện phòng thí nghiệm để gia tăng sinh khối Dùng Pasteur Pipet tiệttrùng có đường kính 2 mm để cắt khối agar chứa nấm
3.5.2.3 Bố trí thí nghiệm
Cấy mỗi dòng nấm trong bốn dòng nấm thí nghiệm và dòng nấm gây bệnh
Fusarium solani lên một đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy Malt Extract Dùng bút
lông chia thành 4 phần bằng nhau cho mỗi đĩa agar, khối nấm với kích thước 2 mmchứa mỗi dòng nấm được đặt xen kẽ với nhau ở mỗi một phần tư của đĩa (Hình 3.2).Dán parafilm bên ngoài để tránh nhiễm mẫu Đĩa petri được đặt trong tối ở điều kiệnphòng thí nghiệm trong 6 ngày Sau đó quan sát và chụp hình để ghi nhận khả năngđối kháng lẫn nhau giữa các dòng nấm thí nghiệm
Trang 30Hình 3.4 Sơ đồ mô tả thí nghiệm đánh giá khả năng đối kháng giữa bốn dòng nấm thử
nghiệm với dòng nấm gây bệnh thối rễ cam sành Fusarium solani *Ghi
chú: FS: Fusarium solani.
3.5.2.4 Chỉ tiêu theo dõi
Quan sát sự đối kháng giữa bốn dòng nấm trong thí nghiệm với dòng nấm gây
bệnh thối rễ cam sành Fusarium solani thông qua sự phát triển về kích thước của
khuẩn lạc nấm trên môi trường agar
3.5.3 Nội dung 3: Đánh giá ảnh hưởng của pH lên sự phát triển sinh khối nấm trong môi trường ME lỏng
19 Mục tiêu của nội dung này nhằm khảo sát ảnh hưởng của các mức pH môitrường khác nhau lên sự phát triển sinh khối nấm trong môi trường nuôi cấy MElỏng
Trang 31nấm đã chuẩn bị sẵn cho thí nghiệm (mục 3.5.3a), cho năm khối agar có chứa sợi nấm
vào mỗi bình tam giác Các bình tam giác được để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm vàtrong 7 ngày Thí nghiệm được tiến hành 3 lần lặp lại cho mỗi dòng nấm, ở mỗi mức
pH Nghiệm thức đối chứng được tiến hành tương tự nhưng không chủng nấm
c Các chỉ tiêu theo dõi
Sự phát triển sinh khối nấm trong bình tam giác ở khoảng pH khác nhau sauthời gian 7 ngày nuôi cấy
Cách xác định sinh khối nấm sau thu hoạch như sau: Chuẩn bị phễu đã tiệttrùng và giấy lọc (giấy lọc đã được cân trước khối lượng và tiệt trùng khô) Dùng phễu
và giấy lọc để lọc lấy sinh khối nấm ra khỏi dung dịch nuôi trong bình tam giác Sau
đó lấy giấy lọc có chứa sinh khối nấm đã lọc đặt vào đĩa petri Đưa các đĩa petri chứamẫu sinh khối nấm cho vào tủ sấy để ở 95oC trong 12 tiếng Ghi nhận trọng lượng sinhkhối khô của nấm sau thí nghiệm
Trang 32b Bố trí thí nghiệm
Chọn ra pH tối ưu từ thí nghiệm 3.5.3 của mỗi dòng nấm để thực hiện thí
nghiệm Trong đó pH tối ưu cho các dòng nấm PH-L3, PH-L4 và PH-C5 là pH=3; pHtối ưu cho dòng nấm PH-L6 là pH=6 Môi trường ME lỏng không chứa agar đượcchuẩn bị với các mức pH=3 và pH=6, sau đó được tiệt trùng ở 121oC trong 20 phút vàđược để nguội trong tủ cấy, bổ sung một lượng xác định dung dịch kháng khuẩnStreptomycine 1000 ppm cho vào môi trường ME để đạt nồng độ sau cùng 100 ppm
và hút 10 mL dung dịch khoáng vi lượng đã được tiệt trùng qua màng lọc cho vào 1 Lmôi trường ME Hút 30 mL môi trường ME nuôi cấy vào bình tam giác 100 mL đã tiệttrùng Dùng Pasteur Pipet tiệt trùng có đường kính 2 mm cắt các khối nấm từ nguồn
nấm đã chuẩn bị sẵn cho thí nghiệm (mục 3.5.3a), cho năm khối agar có chứa sợi nấm
vào mỗi bình tam giác Các bình tam giác được để ở nhiệt độ 30, 35 và 40oC và trong 7ngày Thí nghiệm được tiến hành 3 lần lặp lại cho mỗi dòng nấm, ở mỗi mức nhiệt độ.Nghiệm thức đối chứng được tiến hành tương tự nhưng không chủng nấm
c Các chỉ tiêu theo dõi
Sự phát triển sinh khối nấm trong bình tam giác ở các nhiệt độ khác nhau sauthời gian 7 ngày nuôi cấy Cách xác định sinh khối nấm sau thu hoạch tham khảo mục
22 Chuẩn bị nguồn nấm
23 Tham khảo mục 3.5.3.a
24 Bố trí thí nghiệm.
Chọn ra khoảng pH và nhiệt độ tối ưu của bốn dòng nấm từ thí nghiệm ở mục
3.5.3 và 3.5.4 để thực hiện thí nghiệm Trong đó pH tối ưu cho các dòng nấm PH-L3,
Trang 33PH-L4 và PH-C5 là pH=3; pH tối ưu cho dòng nấm PH-L6 là pH=6 Nhiệt độ tối ưucho cả bốn dòng nấm thí nghiệm là 30oC Môi trường ME được hiệu chỉnh về các mức
pH tối ưu cho từng dòng nấm Môi trường ME sau khi tiệt trùng ở 121oC trong 20 phútđược để nguội trong tủ cấy, sau đó bổ sung một lượng xác định dung dịch khángkhuẩn Streptomycine 1000 ppm cho vào môi trường ME để đạt nồng độ sau cùng 100ppm và hút 10 mL dung dịch khoáng vi lượng đã được tiệt trùng qua màng lọc cho vào
1 L môi trường ME Hút 30 mL môi trường ME nuôi cấy vào bình tam giác 100 mL đãtiệt trùng Dùng Pasteur Pipet tiệt trùng có đường kính 2 mm cắt các khối nấm từ
nguồn nấm đã chuẩn bị sẵn cho thí nghiệm (mục 3.5.3a), cho năm khối agar có chứa
sợi nấm vào mỗi bình tam giác.Các bình tam giác được để ở nhiệt độ 30oC và trong 7ngày Thí nghiệm được tiến hành 3 lần lặp lại cho mỗi dòng nấm Tổng cộng có 4nghiệm thức về các nồng độ NaCl khác nhau gồm: 0, 1, 2 và 3% NaCl Nghiệm thứcđối chứng được tiến hành tương tự nhưng không chủng nấm
25 Chỉ tiêu theo dõi
Sự phát triển sinh khối nấm trong môi trường ME lỏng ở các mức nồng độ NaClkhác nhau sau thời gian 7 ngày nuôi cấy Cách xác định sinh khối nấm sau thu hoạch
như sau: Tham khảo mục 3.5.3.c.
27 Nguồn nấm
Tham khảo mục 3.5.3.a
28 Nguồn hạt giống cây trồng:
Ngâm hạt giống vào dung dịch NaClO 1% trong 10p, rửa lại bằng cồn 70o trong
1 phút và rửa lại bằng nước cất 5 lần Dùng cây nhíp gấp hạt lên đĩa petri chứa môitrường Agar bán lỏng 1%, mỗi đĩa khoảng 15-20 hạt giống Dán parafilm bên ngoài để
Trang 34tránh nhiễm mẫu Các đĩa petri được để ở nhiệt độ phòng, trong tối và trong khoảngthời gian từ 4-5 ngày (Hình 3.3) Quan sát sự nảy mầm của hạt giống trong đĩa petri.Thí nghiệm được tiến hành tương tự với hạt giống rau muống và lúa Riêng hạt giốnglúa nên bóc vỏ trước khi tiệt trùng, tránh làm hư phôi lúa.
Hình 3.5 Hạt giống lúa nảy mầm trên môi trường agar bán lỏng 1% sau 5 ngày ủ.
a Bố trí thí nghiệm
Hút 10ml dung dịch Hoagland vào ống nghiệm tiệt trùng Dùng Pasteur Pipettiệt trùng có đường kính 2 mm cắt các khối nấm từ nguồn nấm đã chuẩn bị sẵn cho thínghiệm Dùng nhíp gấp 5 khối nấm đã được cắt cho vào ống nghiệm, đồng thời dùngnhíp bóp nát sinh khối nấm ở trong ống nghiệm Hạt giống được kẹp vào giữa khốixốp nhỏ để đỡ giá thể khi cây phát triển và đưa vào ống nghiệm Phần xốp nhỏ đượcđặt nổi trên mặt dung dịch, rễ hạt giống được ngâm chìm vào dung dịch nuôi Đậy nắpống nghiệm không kín hoàn toàn để không khí trao đổi và đặt các cống nghiệm chứmẫu vào giá đỡ ống nghiệm Thí nghiệm được tiến hành 4 lần lặp lại cho mỗi dòngnấm và cho mỗi hạt giống Nghiệm thức đối chứng được tiến hành tương tự nhưngkhông chủng nấm Các ống nghiệm nuôi cấy hạt giống được che ánh sang cho phầndung dịch nuôi bằng bọc nylon đen và được để ở ngoài sang trong điều kiện nhiệt độphòng thí nghiệm trong thời gian 7 ngày
Trang 3529 Chỉ tiêu theo dõi
Sự phát triển của hạt giống trong ống nghiệm trong thời gian 7 ngày Lấy các cáthể cây ra khỏi ống nghiệm và tiến hành lấy chỉ tiêu về chiều dài thân, chiều dài rễ, số
rễ và sinh khối thân
Cách xác định sinh khối khô của thân: Đặt cây vào đĩa petri và đem sấy khô ởnhiệt độ 90o trong 12 giờ Tiến hành cân và ghi nhận trọng lượng khô của cây ở từngnghiệm thức
30 Phương pháp xử lí số liệu
Các số liệu được xử lí bằng phần mềm Microsoft Excel 2013 và xử lý thống kêbằng phần mềm Minitab 17
Trang 3631 CHƯƠNG IV
32 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Đánh giá sự đối kháng lẫn nhau giữa bốn dòng nấm thử nghiệm
Kết quả đánh giá tính đối kháng của bốn dòng nấm thử nghiệm được thể hiện quaHình 4.1 Nhìn chung cả bốn dòng nấm này đều gây ức chế sự phát triển lẫn nhau Cácmức độ ức chế của bốn dòng nấm khi chúng được đặt trong cùng một môi trường nuôicấy là khác nhau Đối với dòng nấm PH-L4 và dòng nấm PH-C5, có thể thấy rõ dòngnấm PH-L4 ức chế sự phát triển của dòng nấm PH-C5, thể hiện qua việc kích thướckhuẩn lạc của dòng nấm PH-C5 phát triển nhỏ hơn và có xu hướng co cụm lại khi có
sự hiện diện của dòng nấm PH-L4 (Hình 4.1.a) Đối với dòng nấm PH-L3 và dòngnấm PH-L4, có thể thấy rõ dòng nấm PH-L3 ức chế sự phát triển của dòng nấm PH-L4, thể hiện qua việc kích thước khuẩn lạc của dòng nấm PH-L4 phát triển nhỏ hơn và
có xu hướng co cụm lại khi có sự hiện diện của dòng nấm PH-L3 (Hình 4.1.b) Đối vớidòng nấm PH-L6 và dòng nấm PH-L3, có thể thấy rõ dòng nấm PH-L6 ức chế sự pháttriển của dòng nấm PH-L3, thể hiện qua việc kích thước khuẩn lạc của dòng nấm PH-L3 phát triển nhỏ hơn và có xu hướng co cụm lại khi có sự hiện diện của dòng nấmPH-L6 (Hình 4.1.c) Đối với dòng nấm PH-L4 và dòng nấm PH-L6, có thể thấy rõdòng nấm PH-L6 ức chế sự phát triển của dòng nấm PH-L4, được thể hiện qua việckhuẩn lạc của dòng nấm PH-L4 không thể phát triển khi có sự hiện diện của dòng nấmPH-L6 (Hình 4.1.d) Đối với dòng nấm PH-L3 và dòng nấm PH-C5, có thể thấy rõdòng nấm PH-C5 ức chế sự phát triển của dòng nấm PH-L3, thể hiện qua việc kíchthước khuẩn lạc của dòng nấm PH-L3 phát triển nhỏ hơn và có xu hướng co cụm lạikhi có sự hiện diện của dòng nấm PH-C5 (Hình 4.1.e) Đối với dòng nấm PH-L6 vàdòng nấm PH-C5, có thể thấy rõ dòng nấm PH-L6 ức chế sự phát triển của dòng nấmPH-C5, thể hiện qua việc kích thước khuẩn lạc của dòng nấm PH-C5 phát triển nhỏhơn và có xu hướng co cụm lại khi có sự hiện diện của dòng nấm PH-L6 (Hình 4.1.f).Điều này có thể là do giữa bốn dòng nấm thí nghiệm có tiết ra các hoạt chất bất hoạthoặc các enzym chứa khả năng ức chế sự phát triển lẫn nhau Điển hình như dòng nấm
Aspergillus fumigatus PH-L4, Aspergillus fumigatus PH-C5 có khả năng tạo chất
kháng sinh như fumagilin có tác dụng ức chế các loại vi khuẩn và một số dòng nấm
khác
Trang 37Hình 4.1 Sự đối kháng và ức chế lẫn nhau giữa 4 dòng nấm thử nghiệm trên môi
trường ME
4.2 Tính đối kháng sinh học của bốn dòng nấm thử nghiệm đối với dòng nấm
Fusarium solani gây bệnh thối rễ cây cam sành
4.2.1 Nhận biết đặc tính, hình thái của dòng nấm gây bệnh Fusarium bằng
phương pháp Slide culture
Kết quả thí nghiệm nhận biết đặc tính, hình thái của dòng nấm gây bệnh
Fusarium solani được trình bày qua Hình 4.2 Có thể thấy rõ nấm Fusarium solani có
dạng bào tử lớn trong suốt, có nhiều vách ngăn, bào tử hình trăng khuyết, một đầu thắtlại hình bàn chân Dạng bào tử nhỏ, đơn hoặc đa bào hình cầu hoặc hình bầu dục
Nấm Fusarium solani là tác nhân gây bệnh héo và thối rễ, thân, mầm cây Ngoài ra, theo R.H.Stover (năm) ở vùng nhiệt đới loài nấm Fusarium solani còn gây hại trên
nhiều ký chủ khác nhau như thuốc lá, cà chua, khoai lang, khoai tây, cây hoa huệ….Đây là những bệnh có tác hại kinh tế lớn trong sản xuất
PH-L6
PH-L6 PH-L3 PH-L3
PH-L6
PH-L6
PH-L4 PH-L4
PH-C5
PH-C5
PH-L3 PH-L3
PH-L6
PH-L6 PH-C5
PH-C5
Trang 38Hình 4.2 Hình thái tế bào của sợi nấm và bào tử dòng nấm gây bệnh Fusarium solani
chụp dưới kính hiễn vi quang học ở độ phóng đại 100X
4.2.2 Kết quả kiểm tra tính đối kháng sinh học của bốn dòng nấm thí nghiệm đối với dòng nấm gây bệnh Fusarium solani trong điều kiện tiệt trùng
Kết quả đánh giá tính đối kháng của bốn dòng nấm thử nghiệm được thể hiệnqua Hình 4.3 Nhìn chung cả bốn dòng nấm này đều thể hiện rõ rệt khả năng đối kháng
đối với dòng nấm gây bệnh thối rễ cam sành Fusarium solani Cường độ ức chế
Fusarium solani ở bốn dòng nấm cũng khác nhau Sự sắp xếp xen kẽ giữa các dòng
Trang 39nấm thử nghiệm và dòng nấm gây bệnh Fusarium solani cho thấy các dòng nấm thử
nghiệm phát triển tốt khắp các bề mặt đĩa trong khi kích thước dòng nấm gây bệnhFusarium solani bị thu hẹp lại và không thể phát triển khi có sự hiện diện của bốn dòngnấm thử nghiệm Chưa có các nghiên cứu nào trước đây tìm được kết quả như thí
nghiệm này về khả năng đối kháng của các nhóm nấm Penicillium, Aspergillus và
Rhizomucor đối với dòng nấm gây bệnh thối rễ trên cây cam sành Fusarium solani.
Điều này chứng tỏ bốn dòng nấm thử nghiệm có giá trị rất lớn về mặt đối kháng sinh
học với dòng nấm gây bệnh thối rễ cam sành Fusarium solani Có thể do dòng nấm
Aspergillus fumigatus PH-L4, Aspergillus fumigatus PH-C5 có khả năng tạo chất
kháng sinh như fumagilin, dòng nấm Penicillium có khả năng tạo chất kháng sinh
Penicillin có tác dụng ức chế các loại vi khuẩn và một số dòng nấm khác có thể là kể
cả dòng nấm gây bệnh Fusarium solani Riêng dòng nấm Rhizomucor chưa có nghiên
cứu nào trước đây phát hiện khả năng đối kháng của dòng nấm này đối với dòng nấmgây bệnh
