Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài nấm ở việt nam (tt)

Thách thức đặt ra cho các nhà khoa học nghiên cứu các uy trình phân tách hiệu uả các hợp chất thiên nhiên t các nguồn th c vật, vi nấm, inh vật bi n… và th c hiện các chuy n hóa hóa học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

BÙI THỊ THU HIỀN

Nghiªn cøu thµnh phÇn hãa häc

vµ ho¹t tÝnh sinh häc cña mét sè loµi nÊm

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS ĐẶNG NGỌC QUANG

2 TS LƯU VĂN HUYỀN

Phản biện 1: GS.TSKH Trần Văn Sung

Viện Hóa học, Viện Hàn lâm KHCN VN

Phản biện 2: PGS.TS Trần Thị Thu Hương

Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Phản biện 3: PGS.TS Vũ Quốc Trung

Trường ĐHSP Hà Nội

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường,

họp tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2017

Có thể tìm hiểu luận án tại:

Thư viện Quốc gia, Thư viện Trường Đại học Sư phạm Hà Nội và Phòng Tư liệu khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Đặt vấn đề

Ngày nay, khi đời sống ngày càng được nâng cao thì con người quan tâm nhiều

hơn đến vấn đề sức khỏe Các căn bệnh nan y như: bệnh ung thư, HIV-AIDS và sức

khoẻ cộng đồng là những vấn đề ngày càng được quan tâm ở hầu hết các quốc gia trên thế giới Theo ước tính và thống kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO) thì hàng năm trên toàn cầu có khoảng 9-10 triệu người mới mắc bệnh ung thư và một nửa trong số đó chết

vì căn bệnh này Các phương pháp điều trị hiện nay như hóa trị, xạ trị, phẫu thuật, dùng

thuốc tổng hợp… làm cho người bệnh suy kiệt và có nhiều tác dụng phụ Vì vậy xu

hướng “trở về thiên nhiên“ nhằm sử dụng các hợp chất thiên nhiên làm thuốc chữa bệnh

đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm Thách thức đặt ra cho các nhà khoa học nghiên cứu các uy trình phân tách hiệu uả các hợp chất thiên nhiên t các nguồn th c vật, vi nấm, inh vật bi n… và th c hiện các chuy n hóa hóa học đ tạo ra các ẫn uất mới có tác ụng trong việc phòng và chữa bệnh

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có một thảm th c vật vô cùng phong phú và đa ạng với hơn 12.000 loài th c vật bậc cao khác nhau Trong đó nấm nói chung được biết đến có nhiều tác dụng trong việc chữa bệnh, đặc biệt là bệnh ung thư Theo ước tính, trên thế giới có khoảng 1.5 triệu loài nấm Tuy nhiên, chúng ta mới chỉ phát hiện

và mô tả được khoảng 5% (75000 loài) Nấm có rất nhiều loài ược liệu uý như nấm linh

chi Ganoderma lucidum, nấm Vân chi Trametes versicolor, nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) Việt Nam có khoảng 22000 loài nấm, trong đó nấm linh chi có

khoảng 60 loài Có rất ít các công trình nghiên cứu về hóa học của nấm được công bố, đặc biệt là ở Việt Nam và chủ yếu d ng lại ở việc phân loại Do đó, việc khai thác kho tàng quí đầy tiềm năng t các loài nấm ở nước ta đ khám phá nhiều loại thuốc mới với hiệu l c cao trong phòng và chữa bệnh góp phần nâng cao bảo vệ sức khoẻ con người là hướng đi đúng đắn và phát tri n bền vững Sau khi bảo về thành công luận án Thạc ĩ về Hóa học của nấm

ở Việt Nam, tôi thấy đây là hướng đi mới, có nhiều tiềm năng đ nghiên cứu nhằm tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học uý giá cũng như làm áng tỏ khả năng chữa bệnh của

một số loài nấm trong các bài thuốc cổ truyền Do đó chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu

thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài nấm ở Việt Nam”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tách chiết, tinh chế, ác định cấu trúc hóa học và đánh giá hoạt tính sinh học các

chất phân lập t 5 loài nấm ở Việt Nam: Tomophagus cattienensis, Ganoderma mirabile,

Ganoderma neo-japonicum, Kretzschmaria sandvicensis, Daldinia eschscholzii

3 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu quy trình tách chiết đ phân lập các hợp chất t 5 loài nấm ở Việt Nam Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng cách kết hợp các phương pháp phổ

Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được

4 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận án là 5 loài nấm ở Việt Nam

Họ Ganodermataceae: Tomophagus cattienensis, Ganoderma mirabile và Ganoderma

neo-japonicum

Họ Xylariaceae: Kretzschmaria sandvicensis và Daldinia eschscholzii

5 Những đóng góp mới của luận án

Đây là công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số

chất phân lập được t nấm linh chi vàng (Tomophagus cattienensis), nấm linh chi (Ganoderma mirabile), nấm linh chi tím (Ganoderma neo-japonicum), nấm Kretzschmaria

sandvicensis, nấm Daldinia eschscholzii Các loài nấm này lần đầu tiên được nghiên

cứu tại Việt Nam, đặc biệt nấm linh chi vàng (Tomophagus cattienensis) là loài nấm

mới được phát hiện ở vườn quốc gia Cát Tiên, Lâm Đồng

T cặn chiết của các loài nấm này đã phân lập được 20 hợp chất, trong đó có 3

hợp chất có cấu trúc hóa học mới: cattienoid A (H2), cattienoid B (H3), cattienoid C (H4)

Tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư bi u mô và hoạt tính kháng sinh của các chất sạch cho kết quả:

- Độc tế bào: Các hợp chất sau có hoạt tính:

Schisanlactone A (H1) (IC50 = 30,4 µg/ml), cattienoid B (H3) (IC50 = 31,04

µg/ml), axit ganoderic Y (H7) (IC50 =77,65 µg/ml), ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-on

(H9) (IC50 =12,68 µg/ml), ergosterol (H11) (IC50 =10,72 µg/ml),

ergosta-7,22-đien-3β-ol (H12) (IC50 = 87,95 µg/ml), orthosporin (H14) (IC50 =78,75 µg/ml)

- Hoạt tính kháng sinh: tiến hành thử hoạt tính kháng sinh của các chất H1,

H2, H3, H4, H16, H17, H18 Tuy nhiên các chất này không có hoạt tính

1.2.1 Giới thiệu chung về họ nấm Xylariaceae

Xylariaceae là họ có số lượng loài lớn nhất trong bộ Nấm túi Xylariales thuộc lớp Nấm túi Ascomycetes trong ngành Nấm túi Ascomycota Hiện nay, trên thế giới đã ác định được khoảng 85 chi và ít nhất 1.340 loài Việt Nam có 82 loài với 13 chi thuộc họ Xylariaceae đã được công bố, đây là một trong những họ nấm thường gặp của ngành Nấm túi Ascomyccota ở nước ta

1.2.2 Thành phần hóa học trong họ nấm Xylariaceae

D a theo các loại nhóm chất, chia các hợp chất trong nấm Xylariaceae thành 4 loại: dẫn xuất của Cytochalasin, dẫn xuất azaphilone, dẫn xuất của naphtalen, các hợp chất khác

1.3 Nấm linh chi

1.3.1 Giới thiệu chung về nấm linh chi

Nấm linh chi là một loại nấm thuộc họ đa khổng, thường mọc trên những cây

mục Nấm linh chi chuẩn có tên khoa học là Ganoderma lucidum Hiện nay đã ác định

được khoảng 286 loài nấm linh chi khác nhau thuộc họ nấm gỗ (Gano ermataceae)

1.3.2 Tác dụng của linh chi

1.3.2.1 Tác dụng dược lý của linh chi

Linh chi có tác dụng chống ung thư và chống khối u, chống vi khuẩn, chống nấm, chống viru (đặc biệt đối với herpes và HIV), chống viêm hoặc điều hòa miễn dịch

1.3.2.2 Ứng dụng lâm sàng

1.3.3 Thành phần hóa học của nấm linh chi

Nấm nói chung có tới 90% trọng lượng là nước Ngoài ra, chúng có u hướng

là một nguồn cung cấp protein (10-40% trọng lượng không nước) carbohydrate 28%), chất ơ (3-32%) và au đó các vitamin thiết yếu, chất khoáng Các chất trong nấm linh chi được chia làm 2 loại lớn: các chất hữu cơ và các chất vô cơ

(3-1.3.4 Nghiên cứu nấm của Việt Nam

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1 Phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu tươi: Mẫu nấm được thu hái, rửa sạch đ tiến hành ngâm chiết trong dung môi Mẫu khô: Mẫu nấm được thu hái vào thời đi m thích hợp của năm Mẫu tươi sau khi lấy về được rửa sạch, đ nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở 40-60oC Bảo quản ở điều kiện thích hợp ùng đ thí nghiệm

2.1.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các chất phân lập được

Đ phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất, sẽ sử dụng các phương pháp ắc ký như: Sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC), sắc ký lỏng điều chế (prep.HPLC) và các phương pháp kết tinh

2.1.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất

Cấu trúc các hợp chất được khảo sát nhờ s kết hợp các phương pháp phổ: Phổ

tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (EI-MS, ESI-MS, HR-ESI-MS, FT-ICR-MS), sắc kí khí khối phổ liên hợp (GC-MS) Phổ cộng hưởng t hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC) Cấu trúc lập th của các hợp chất này được ác định bằng các phương pháp phổ 2D NMR với các kỹ thuật ROESY

2.1.4 Phương pháp thử hoạt tính sinh học

Phương pháp thử hoạt tính sinh học được th c hiện tại phòng Sinh học th c nghiệm, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ phân lập các hợp chất H1- H4

2.3.1.3 Thử hoạt tính sinh học của các chất phân lập được

B4 159mg

B5 200mg

B6 174mg

B7 275mg

B7A 60mg

B8A 75mg

g B3A

B7A11 5mg

H2

B8A2 5mg

H4

BTH1A

(2500 mg)

BTH1B (1700 mg)

BTH1C (50 mg)

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ phân lập các chất H5, H6, H7, H8

2.3.2.3 Thử hoạt tính sinh học của các chất phân lập được

2.3.2.4 Hằng số vật lí của các hợp chất

2.3.3 Nghiên cứu các hợp chất trong nấm Linh chi tím (Ganoderma neo-japonicum)

2.3.3.1 Mẫu nấm

2.3.3.2 Phân lập các hợp chất từ nấm Ganoderma neo-japonicum

Nấm linh chi (Ganoderma mirabile)

Sấy khô, nghiền nhỏ

Mẫu khô 400g

5,667g

Cột sephadex CHCl 3 : CH 3 OH =1:1

B9.IV.D

10 mg

H6

Sơ đồ 2.3: Sơ đồ phân lập các hợp chất H9, H10, H11, H12

2.3.3.3.Thử hoạt tính sinh học của các chất phân lập được

A

0.285 g

B 0.039 g

C 0.094 g

D 0.051 g

E 0.060 g

F 0.391 g

G

C3 0.010 g

C3d 5 mg

H13

F2 0.230 g

F2k 0.023 g

F2f 0.032 g

CC/H:E

HPLC/RP-18 H:E =1:3

Sơ đồ 2.5: Sơ đồ thu nhận các cặn chiết t nấm Daldinia eschscholzii

1 Hòa cặn trong 300 ml nước

2 Chiết nhiều lần bằng n- hexan

Cất áp suất thấp

Cất áp suất thấp

Daldinia schscholzii (320 g)

Cao tổng (36.411 g)

Cặn chiết

Cặn chiết etylaxetat Dạng dầu (4,052 g)

Dịch chiết D Dịch butanol

Cặn chiết

butanol

(3,091 g)

Chiết bằng butanol

Sơ đồ 2.6: Sơ đồ phân lập các chất H16-H19

LKL7C1e

43 mg (H18)

Mẫu nấm (Daldinia eschscholzii)

(320 gam) Ngâm trong metanol

g) CC/ H:A= 1:6

Sơ đồ 2.7: Sơ đồ phân lập chất số H20

2.3.5.3 Hoạt tính sinh học

2.3.5.4 Hằng số vật lí

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nấm Linh chi vàng (Tomophagus cattienensis)

3.1.1 Mẫu nấm

Nấm linh chi vàng Tomophagus cattienensis là loài nấm mới được phát hiện ở

vườn quốc gia Cát Tiên, Lâm Đồng và được đặt tên khoa học bởi PGS.TS Lê Xuân Thám (Sở khoa học Công nghệ Lâm Đồng)

NHUD 123mg

NHUE 196mg

NHUF 211mg

NHUG 37mg

NHUK 191mg

NHUI 194mg

NHUH 136mg

NHUC1 123mg

Phổ 13C NMR gồm các tín hiệu sau: hai nhóm cacbonyl ở 166.5 và 167.3 ppm,

bốn liên kết đôi C=C (8 tín hiệu t 117.6 đến 151.1 ppm) Hai cacbon đính với oxi ở

80.4 và 80.1 ppm

Phổ HMBC có các tín hiệu tương uan của nhóm cacbonyl (167.3 ppm) với hai

H (5.80 và 6.68) t đó cho thấy C=O ở vị trí liên hợp với C=C, qui kết H (5.80 và 6.68) là tín hiệu của H-1, H-2 Vị trí 6.24 là tín hiệu của H-19, 6.62 (H-24) Ngoài ra còn có tín hiệu H (1.93) của nhóm metyl đính với liên kết đôi tương uan với nhóm cacbonyl thứ 2 (166.5 ppm)

So sánh các tín hiệu NMR của hợp chất H1 với tài liệu tham khảo chúng tôi thấy hoàn toàn phù hợp, như vậy hợp chất H1 là Schisanlactone A

Schisanlactone A (H1)

3.1.3.2 Chất H2 (BTH1B7A11) (chất mới)

Phổ khối phân giải cao của hợp chất H2 có pic ion giả phân tử ở m/z 407.2187

tương ứng với công thức C24H32O4Na (tính toán cho C24H32O4Na là 407.2198), t đó suy ra công thức phân tử của hợp chất này là C24H32O4

Phổ 1H NMR có ba tín hiệu proton đính với Csp2 Trong đó có hai tín hiệu đôi

ở 6.67 và 5.83 Một tín hiệu đơn ở 6.23 tương t như hợp chất H1 Ngoài ra còn có

một tín hiệu của proton đính với cacbon liên kết với oxi ở 4.14 (d, 6.5) Hợp chất này chỉ có 5 nhóm metyl ( inglet), trong đó có 1 nhóm metyl ở trường yếu (2.27 ppm)

Phổ 13C NMR cho thấy tín hiệu của 24 nguyên tử cacbon, có 1 nhóm xeton no (208.5 ppm), 1 nhóm cacbonyl (167.0 ppm) và 3 liên kết đôi (120-150) Bên cạnh đó còn có 2 tín hiệu cacbon đính với oxi (80.5 và 77.0)

Qua các kết quả phổ NMR có th d đoán H2 là một dẫn xuất của hợp chất H1

Phổ HMBC chúng tôi thấy có các tương uan của nhóm metyl (2.27 ppm) với nhóm xeton vì thế sẽ có mảnh CH3-CO- Hai proton doublet ở 5.83 và 6.67 có tương uan với nhóm cacbonyl ở 167.0 ppm, do vậy chúng tôi quy kết là H-1 và H-2 Còn proton còn lại ở 6.23 là H-19 Kết hợp với phổ HSQC ác định được vị trí 144.0 (C-1), 118.2 (C-2), 142.7 (C-19) Vị trí của OH ở vị trí C-15 o có tương tác của H-16, H-24 với C-15

Đ ác định hóa học lập th của H2, chúng tôi đo phổ ROESY, các tín hiệu

12

quan trọng là H-1 với H-2 và H-19 giúp khẳng định cấu tạo của hai vòng A và B; H-5

và 23 giúp chỉ ra 5 và 23 cùng phía, 15 với 17 và 24 giúp chỉ ra

H-15, H-17, H-24 nằm cùng phía

O O

1 3 4

5 6 8 9 19 10

24

22 23

H H

H H

2.56 dd (5.5, 13.5) 2.41 m

2.31 m và 2.15 m

2.40 m và 2.20 m 2.10 m và 1.84 dd (9.0, 12.0)

4.14 d (6.5) 2.35 m 2.87 t (8.5) 0.99 s 6.23 s

2.27 s 1.41 s 1.55 s 1.01 s

144.0 118.2 167.0 80.5 49.2 35.5 26.9 147.1 129.5 139.4 27.7 31.0 56.4 45.3 77.0 35.5 58.8 19.1 142.7 208.5 31.3 29.0 26.4 26.6

Chúng tôi ki m tra cấu trúc của chất này bằng Scifinder ngày 15/07/2013 thì

thấy rằng hợp chất H2 là một chất mới, đặt tên là cattienoid A

3.1.3.3 Hợp chất H3 (BTH1B3A, Chất mới)

Phổ FT-ICR-MS của hợp chất H3 có tín hiệu ở m/z 363.9335 (tính toán cho

C22H28O3Na là 363.1936), tương ứng với công thức phân tử C22H28O3Na Như vậy, hợp

chất H3 có công thức phân tử là C22H28O3

Phổ 1H NMR, 13C NMR có các tín hiệu tương t hợp chất H2, chỉ khác nhau là

hợp chất H3 có bốn nhóm metyl đính với C bậc 4 và không có proton đính với

cacbon liên kết với o i Như vậy có th suy ra rằng, hợp chất này cũng có cấu trúc

vòng lacton 7 cạnh như các hợp chất H1 và H2

Phổ 13C NMR có tín hiệu xeton no ở 218.5 ppm Vị trí nhóm eton này được

ác định ở C-17 do có tín hiệu tương tác của H-18 với C-17 trong phổ HMBC

Phân tích phổ HMBC chúng tôi suy ra cấu trúc của hợp chất H3 như au:

O O

1 3 4

5 6 8 9 19 10

13 14 15 17 18

22

20 21

Cattienoid B (H3) Kết quả ki m tra bằng Scifinder ngày 15/07/2013 thì thấy rằng hợp chất H3 là

một chất mới, được đặt tên là cattienoid B

2.46 m 2.42 m và 2.30 m 2.21 m và 2.00 m

2.25 m 1.89 m và 1.68 m

2.08 m và 1.81 m 2.55 dd (6.5, 19.5)

0.92 s 6.26 s 1.41 s 1.55 s 1.13 s

143.3 118.3 167.0 80.3 49.3 39.2 26.9 148.3 130.2 140.2 25.8 23.0 51.9 46.7 28.0 34.3 218.5 18.6 142.6 29.3 26.2 28.1

3.1.3.4 Xác định cấu trúc hợp chất H4 (BTH1B8A2)

- Phổ khối phân giải cao FT-ICR-MS (hình 3.12) của hợp chất H4 có pic ion

giả phân tử ở m/z 423.21444, tương ứng với công thức phân tử C24H32O5Na (tính toán cho C24H32O5Na là 423.2147) Như vậy, hợp chất H4 có công thức phân tử là

C24H32O5 nhiều hơn hợp chất H2 một nguyên tử oxi

- Phổ 1H NMR,13C NMR và HMBC của hợp chất H4 hoàn toàn tương t như của hợp chất H2 Chỉ có đi m khác nhau duy nhất là tín hiệu H-5 biến mất, thay vào

đó là C-5 cộng hưởng ở trường yếu hơn (92.8 ppm) T đó gợi ý rằng nhóm OH thứ 2

đính với C-5 Vị trí nhóm OH thứ nhất cũng đính với C-15 giống như ở hợp chất H2

Như vậy cấu trúc của H4 được ác định như au

O

1 3 4

5 6 8 9 19 10

11

O

HO

13 14 15

17 20 21 18

24

22 23

Cattienoid C (H4)

Chúng tôi cũng ki m tra cấu trúc của chất này bằng Scifinder ngày 15/07/2013

thì thấy rằng nó là một chất mới và đặt tên là cattienoid C

2.45 m và 2.34 m 2.32 m

2.48 m và 2.17 m 1.82 ddd (4.4, 5.0, 12.5) và 2.10 m

4.13 brd (6.0) 2.35 m

2.85 t (8.5) 1.03 s 6.22 s

2.16 s 1.15 s 1.25 s 0.94

148.0 116.7 164.3 77.7 92.8 43.9 28.3 150.2 127.3 133.2 27.2 30.9 56.6 45.3 77.0 35.6 59.2 19.2 139.3 208.3 31.2 24.8 24.5 24.6

3.1.4 Hoạt tính sinh học của các chất H1- H4

- Cặn chiết etyl axetat của nấm linh chi vàng được thử khả năng kháng tế bào ung

thư bi u mô KB Kết quả cho thấy cặn chiết có hoạt tính, với giá trị IC50 = 31.58 g/ml