Xác định hàm lượng parabens trong thực phẩm và mỹ phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Trong phạm vi luận văn thạc sĩ “Xác định hàm lƣợng prabens trong thực phẩm và mỹ phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC” chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện HPLC thích hợp để đ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

LÊ THỊ XUÂN

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PARABENS TRONG THỰC PHẨM VÀ MỸ PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

LÊ THỊ XUÂN

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PARABENS TRONG THỰC PHẨM VÀ MỸ PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học

PGS.TS PHẠM THỊ NGỌC MAI

Hà Nội – 2016

đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm

An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia và các anh chị, các bạn công tác tại Khoa Chất lượng Phụ gia và các chất hỗ trợ chế biến thực phẩm – Viện An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu trong môi trường hiện đại

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại Khoa Hoá, đặc biệt là các thầy cô trong Bộ môn Hoá Phân tích, đã cho em những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học hoá K24, đặc biệt là những người bạn trong nhóm Hoá Phân tích K24 đã giúp đỡ, chia

sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, tháng 12 năm 2016

Học viên

Lê Thị Xuân

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về các hợp chất parabens 3

1.1.1 Công thức phân tử và tính chất vật lý của các parabens 3

1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn của parabens 6

1.1.3 Tác động của parabens đối với sức khỏe 7

1.1.3.1 Gây dị ứng da 7

1.1.3.2 Hiện tượng lão hóa da 8

1.1.3.3 Mối liên hệ với giữa parabens và bệnh ung thư vú 8

1.2 Tình hình sử dụng parabens trên thế giới và ở Việt Nam 9

1.3 Các phương pháp phân tích parabens 10

1.3.1 Phương pháp điện di mao quản (CE) 11

1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng 12

1.3.2.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detector UV-VIS 12

1.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) 13

1.3.3 Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) 16

1.3.4 Đại cương về phương pháp sắc ký lỏng 17

1.3.4.1 Nguyên tắc chung của phương pháp sắc ký lỏng 17

1.3.4.2 Một số đại lượng đặc trưng của sắc ký lỏng 19

1.4 Các phương pháp xử lý mẫu 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 24

2.2 Đối tượng nghiên cứu 24

2.3 Nội dung nghiên cứu 24

2.4 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 24

2.4.1 Hóa chất 24

2.4.2 Dụng cụ 26

2.5.1 Xác định các điều kiện phân tích 27

2.5.1.1 Xác định các thông số cho detector khối phổ 27

2.5.1.2 Khảo sát điều kiện đo sắc ký 27

2.5.1.3 Khảo sát các điều kiện chiết mẫu 27

2.5.2 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 30

2.5.2.1 Xây dựng đường chuẩn 30

2.5.2.2 Độ lặp lại (độ chụm) 30

2.5.2.3 Độ thu hồi (độ đúng) 31

2.5.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Xác định các điều kiện phân tích 34

3.1.1 Xác định các thông số của detector khối phổ 34

3.1.2 Khảo sát điều kiện đo trên máy sắc ký lỏng 35

3.1.2.1 Khảo sát chương trình rửa giải 35

3.1.2.2 Khảo sát nồng độ dung dịch đệm 40

3.1.3 Khảo sát điều kiện chiết mẫu 42

3.1.3.1 Khảo sát loại dung môi chiết 43

3.1.3.2 Khảo sát thành phần dung môi chiết MeOH:H2O 45

3.1.3.3 Khảo sát thời gian rung siêu âm 48

3.1.3.4 Khảo sát nhiệt độ rung siêu âm 51

3.2 Đánh giá phương pháp phân tích 54

3.2.1 Xây dựng đường chuẩn 54

3.2.3 Độ thu hồi (độ đúng) của phương pháp 57

3.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 57

3.3 Phân tích parabens trong các mẫu mỹ phẩm và thực phẩm chức năng 58

KẾT LUẬN 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

Bảng 2 1 Bảng nồng độ dung dịch chuẩn gốc của 7 parabens 25

Chương 3 Bảng 3 1 Bảng các điều kiện của detector khối phổ 35

Bảng 3 2 Bảng điều kiện các chương trình gradient 36

Bảng 3 3 Ảnh hưởng của gradient đến độ phân giải của Iso-PrP và PrP 39

Bảng 3 4 Ảnh hưởng của gradient đến cường độ tín hiệu mảnh định lượng của 7 parabens 39

Bảng 3 5 Khảo sát loại dung môi chiết 43

Bảng 3 6 Sự phụ thuộc thành phần dung môi chiết và hàm lượng MeP, PrP 45

Bảng 3 7 Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết 46

Bảng 3 8 Sự phụ thuộc giữa thời gian rung siêu âm và hàm lượng MeP, PrP 48

Bảng 3 9 Khảo sát thời gian rung siêu âm 50

Bảng 3 10 Ảnh hưởng của nhiệt độ rung siêu âm tới hiệu quả chiết MeP, PrP 52

Bảng 3 11 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ rung siêu âm 52

Bảng 3 12 Độ chệch của các điểm chuẩn 55

Bảng 3 13 Hàm lượng các parabens trong mẫu khảo sát 55

Bảng 3 14 Nồng độ chuẩn thêm vào từng nền mẫu trong khảo sát độ lặp lại 56

Bảng 3 15 Độ lặp lại của phương pháp phân tích 56

Bảng 3 16 Độ thu hồi của phương pháp phân tích 57

Bảng 3 17 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 57

Bảng 3 18 Hàm lượng các parabens trong các mẫu TPCN 58

Bảng 3 19 Hàm lượng parabens trong các mẫu mỹ phẩm 60

Hình 1 1 Công thức phân tử của methylparaben 3

Hình 1 2 Công thức phân tử của propylparaben 4

Hình 1 3 Công thức phân tử của isopropylparaben 5

Hình 1 4 Công thức phân tử của isobutylparaben 5

Hình 1 5 Công thức phân tử của phenylparaben 5

Hình 1 6 Công thức phân tử của benzylparaben 6

Hình 1 7 Công thức phân tử của pentylparaben 6

Hình 1 8 Cơ chế gây hại ADN trên da của hợp chất parabens 8

Hình 1 9 Mô hình phân mảnh của các parabens trong phân tích LC-MS/MS 14

Hình 1 10 Sơ đồ cấu tạo hệ thống UPLC-MS/MS 19

Chương 2 Hình 2 1 Lược đồ quy trình phân tích mẫu theo dự kiến 28

Chương 3 Hình 3 1 Sắc đồ khảo sát chương trình rửa giải 38

Hình 3 2 Sắc đồ khảo sát thành phần dung dịch đệm 41

Hình 3 3 Biều đồ khảo sát loại dung môi chiết 43

Hình 3 4 Sắc đồ khảo sát loại dung môi chiết 44

Hình 3 5 Biểu đồ sự phụ thuộc của độ thu hồi và thành phần dung môi chiết 47

Hình 3 6 Biều đồ sự phụ thuộc của hàm lượng MeP, PrP và thời gian rung siêu âm 49

Hình 3 7 Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của độ thu hồi thời gian rung siêu âm 51

Hình 3 8 Quy trình xử lý mẫu phân tích 53

Hình 3 9 Đường chuẩn của các parabens theo diện tích pic 54

Hình 3 10 Biểu đồ hàm lượng (%) parbens trong các mẫu TPCN 59

Hình 3 11 Biểu đồ hàm lượng parabens có trong mỹ phẩm 61

MeP Methylparaben Methylparaben

đối

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chất bảo quản là những hóa chất tự nhiên hay tổng hợp được thêm vào thực phẩm, dược phẩm, các mẫu phẩm sinh học, v.v để ngăn ngừa hoặc làm chậm lại sự thối rữa, hư hỏng gây ra bởi sự phát triển của các vi sinh vật, hay các thay đổi không mong muốn về mặt hóa học của sản phẩm

Parabens là tên gọi chung của nhóm chất bảo quản hóa học, được sử dụng phổ biến và lâu đời Về mặt hóa học, parabens là một loạt các este của axit parahydroxy benzoic hay còn được gọi là acid 4-hydroxybenzoic Parabens có tính chất kháng khuẩn và kháng nấm nên được dùng làm chất bảo quản để ngăn ngừa sự nhiễm khuẩn (do nấm hoặc vi khuẩn) và hạn chế sự phân hủy của các hoạt chất dẫn đến giảm hiệu quả của dược phẩm, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm

Gần đây có nhiều nghiên cứu cho thấy, các hợp chất parabens có thể hoạt động tương tự như hormone oestrogen trong các tế bào của cơ thể Các hoạt động này có liên quan nhất định đến bệnh ung thư vú Những thông tin này làm cho nhiều phụ nữ lo lắng, và người tiêu dùng được khuyến cáo hạn chế sử dụng các loại mỹ phẩm xung quanh cánh tay, ngực và những vùng da nhạy cảm Parabens cũng có thể gây dị ứng da đối với những người có cơ địa dị ứng hay quá mẫn cảm Ngoài ra còn

có thông tin về việc parabens làm thúc đẩy quá trình lão hóa da dưới tác động của ánh nắng mặt trời

Trước những bằng chứng về tác hại của parabens đối với sức khỏe con người, Cục Quản lý Dược đã ban hành công văn số 6577/QLD-MP quy định về việc

sử dụng một số chất trong mỹ phẩm Theo đó, có 5 parabens đã bị cấm sử dụng ở Việt Nam từ ngày 30/7/2015 là: isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben Cũng theo công văn này, propylparaben và các muối được phép dùng riêng lẻ với nồng độ tối đa 0,4% (tính theo acid), và dạng hỗn hợp các parabens khác với tổng nồng độ tối đa là 0,8% (tính theo acid) Thời hạn công bố đối với các sản phẩm mới sản xuất trong nước, nhập khẩu đến hết ngày

31/12/2015 Các sản phẩm sản xuất trong nước, nhập khẩu được phép lưu hành trên thị trường đến hết ngày 30/6/2016

Với yêu cầu thực tế hiện nay, việc kiểm soát các chất bảo quản parabens là

rất cần thiết Trong phạm vi luận văn thạc sĩ “Xác định hàm lƣợng prabens trong thực phẩm và mỹ phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” chúng tôi tiến

hành khảo sát các điều kiện HPLC thích hợp để định tính, định lượng 7 chất

isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben, pentylparaben

Mục tiêu nghiên cứu:

 Xây dựng và chuẩn hóa phương pháp định lượng 7 chất paraben nêu trên bằng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp với đầu dò khối phổ

 Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng parabens trên một số mẫu mỹ phẩm, thực phẩm chức năng

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về các hợp chất parabens

Este alkyl acid p-hydroxybenzoic còn được gọi là parabens được sử dụng rộng rãi làm chất bảo quản trong các dược phẩm từ giữa những năm 1920 và được

sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và mỹ phẩm một thời gian ngắn sau đó [11]

Một số parabens được tìm thấy trong tự nhiên, tuy nhiên tất cả các parabens được sử dụng thương mại đểu được sản xuất tổng hơp Chúng được sản xuất bằng phản ứng este hóa của para-hydroxybenzoic acid và rượu thích hợp, ví dụ methanol, ethanol, n-propanol, v.v khi có mặt chất xúc tác thích hợp (ví dụ axit sulfuric đậm đặc hoặc axit p-toluenesulfonic) [11]

1.1.1 Công thức phân tử và tính chất vật lý của các parabens

Ở điều kiện bình thường, 7 parabens nghiên cứu đều là những tinh thể màu trắng Methylparaben (MeP), propylparaben (PrP), isopropylparaben (Iso-PrP) tan tốt trong nước, các parabens còn lại khó tan trong nước, tan tốt trong dung môi hữu

cơ (methanol, ethanol) Nguyên nhân là do theo chiều khối lượng phân tử tăng lên,

độ phân cực của các parabens giảm xuống [24]

 Methylparaben

p-hydroxybenzoate

Hình 1 1 Công thức phân tử của methylparaben

 Khối lượng mol phân tử: 152,15 g/mol

 Propylparaben

p-hydroxybenzoate,

Hình 1 2 Công thức phân tử của propylparaben

 Khối lượng mol phân tử: 180,2 g/mol

 Isopropylparaben

p-hydroxybenzoate

 Khối lượng mol phân tử: 180,2 g/mol

Hình 1 3 Công thức phân tử của isopropylparaben

 Isobutylparaben

 Khối lượng mol phân tử: 194,23 g/mol

Hình 1 4 Công thức phân tử của isobutylparaben

 Phenylparaben

 Khối lượng mol phân tử: 214,22 g/mol

Hình 1 5 Công thức phân tử của phenylparaben

 Công thức cấu tạo Hình 1.6:

Hình 1 6 Công thức phân tử của benzylparaben

C: 0,05 g/100 mL

 Pentylparaben

 Khối lượng mol phân tử: 208,25 g/mol

Hình 1 7 Công thức phân tử của pentylparaben

1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn của parabens

Các parabens có tác dụng sát khuẩn (tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn khác nhau)

và diệt nhiều loại vi nấm Parabens có hoạt tính kháng khuẩn là do chúng làm thay đổi đặc tính của màng tế bào, khiến cho cấu trúc lớp màng tế bào thay đổi cho phép các chất tan trong tế bào bị rò rỉ ra ngoài [24]

Tác giả Steinberg Doron và cộng sự [24] đã nghiên cứu đặc tính kháng

khuẩn của bốn parabens là: methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben đối với các vi khuẩn Streptococcus sobrinus gây bệnh sâu răng Kết quả thu được cho thấy, theo chiều tăng của chuỗi akyl khả năng kháng khuẩn của parabens tăng dần

Tuy nhiên, theo chiều tăng của chuỗi ankyl khả năng tan trong nước giảm dần, trong khi vi khuẩn thường phát triển trong môi trường nước Do vậy các đồng phân có chuỗi alkyl ngắn thường được lựa chọn sử dụng với mục đích bảo quản

Để tăng hiệu quả bảo quản, các parabens được sử dụng kết hợp với nhau Thông thường, người ta phối hợp hai paraben trở lên, thí dụ như phối hợp 0,18% methyl parabens, 0,02% propyl parabens để làm chất bảo quản sát khuẩn trong nhiều loại thuốc tiêm chích hoặc phối hợp parabens với một số hóa chất khác

Trước đây, parabens đã được sử dụng rộng rãi trong thuốc chữa bệnh, thường

là ở hàm lượng cao, khoảng 1% đến 5% [5] Khi những tác hại của parabens đối với sức khỏe con người được phát hiện, việc sử dụng parabens trong các sản phẩm thuốc chữa bệnh đã giảm xuống So với trong dược phẩm, hàm lượng parabens sử dụng trong các sản phẩm mỹ phẩm thường ở nồng độ thấp hơn (khoảng 0,1% đến l0,8%), và hiện nay, chúng vẫn là loại chất bảo quản được sử dụng nhiều nhất vì nhiều lí do: giá thành rẻ, hiệu quả bảo quản tốt, không màu, không mùi, không làm thay đổi tính chất của sản phẩm

1.1.3 Tác động của parabens đối với sức khỏe

1.1.3.1 Gây dị ứng da

Tác giả Christen M Mowad [9] đã trình bày trong bài báo của mình về hai

trường hợp viêm da dị ứng do tiếp xúc gây ra bởi parabens, thông qua việc sử dụng các sản phẩm hàng ngày là sữa tắm, dầu gội đầu, nước rửa tay, v.v Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, benzylparaben là chất có khả năng gây dị ứng mạnh nhất, có thể là

do khối lượng phân tử lớn hơn

Trong một báo cáo khác, tác giả James E Nagel và cộng sự [13] đã trình bày

về hai trường hợp dị ứng với parabens bằng con đường tiêm dưới da

Cơ chế gây dị ứng của parabens hiện vẫn chưa rõ ràng, nhưng nhiều trường hợp dị ứng với chất bảo quản này đã được ghi nhận Một cuộc điều tra năm 1973,

tiến hành trên 1200 cá nhân được thực hiện bởi The North American Contact

Dermatitis Group đã cho thấy tỷ lệ dị ứng với parabens là 3% [13]

1.1.3.2 Hiện tƣợng lão hóa da

Theo kết quả nghiên cứu của rác giả Osamu Handa và cộng sự [19],

methylparaben tăng cường khả năng gây hại của tia UVB đối với các tế bào sừng

UVB trung bình khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời trong vòng 1 phút vào ngày đẹp trời ở châu Âu) hầu như không gây hại đến tế bào sừng Tuy nhiên khi kết hợp sử dụng methylparaben 0,003% và việc chiếu xạ bằng tia UVB với cường độ như trên thì lượng tế bào sừng bị hoại tử tăng lên đáng kể

Theo kết quả một nghiên cứu khác của tác giả Yoshinori Okamoto và cộng sự

[28], methylparaben và các sản phẩm chuyển hóa của methylparaben, kết hợp với ánh sáng mặt trời có thể gây tổn hại đối với ADN trên da Cơ chế tác động được mô

tả như Hình 1.8:

Hình 1 8 Cơ chế gây hại ADN trên da của hợp chất parabens

1.1.3.3 Mối liên hệ với giữa parabens và bệnh ung thƣ vú

Hơn 50 năm nay, các hợp chất parabens đã được biết đến là có hoạt tính oestrogen Oestrogen được biết là có ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc bệnh ung thư vú và việc ngưng hoạt động của oestrogen vẫn là phương pháp ưu tiên điều trị cho các khối u vú nhạy cảm với hormone

Nhóm tác giả Byford J.E và cộng sự [6] tiến hành nghiên cứu hoạt tính

oestrogen của các hợp chất parabens (methylparaben, ethylparaben, n-propylparaben,

n-butylparaben) trong các tế bào ung thư vú nuôi cấy MCF7 Parabens có thể di chuyển [3H] oestradiol từ các thụ thể của tế bào tương MCF7 Paraben cũng có thể tăng biểu hiện của các gen quy định oestrogen và tăng khả năng sản sinh các tế bào này Liên kết của các parabens với tế bào MCF7 tăng lên theo chiều dài chuỗi alkyl, tuy nhiên liên kết này khá yếu Kết quả này cũng phù hợp với các báo cáo nghiên cứu về tính liên kết áp dụng với hệ tử cung của chuột

Theo tác giả Routledge E.J và cộng sự [20], tất cả các parabens bao gồm:

methylparaben, ethylparaben, n-propylparaben, butylparaben đều có hoạt tính tương

tự oestrogen Trong đó methyl paraben là chất có hoạt tính oestrogen yếu nhất với cường độ thấp hơn khoảng 2500000 lần so với 17-estradiol (một loại oestrogen có trong tự nhiên) Hoạt tính oestrogen mạnh lên theo chiều tăng của chuỗi alkyl, cụ thể ethylparaben, propylparaben và butylparaben lần lượt có cường độ thấp hơn khoảng 150000 lần, 30000 lần, và 10000 so với 17-estradiol Nghiên cứu này cũng chỉ

ra rằng, cường độ hoạt tính oestrogen của parabens trên cá thể chuột thấp hơn 2 đến 3 lần so với cường độ trong thử nghiệm ống nghiệm Nguyên nhân được giải thích do parabens nhanh chóng được đào thải ra ngoài thông qua hệ bài tiết của cơ thể

Một nghiên cứu khác của tác giả Thuy T.B Vo và cộng sự [25] tiến hành đối

với cá thể chuột cái giai đoạn từ 21-40 ngày tuổi cũng cho kết quả tương tự Hoạt động estrgen mạnh lên theo thứ tự sau: ethylparaben < propylparaben < isopropylparaben < butylparaben < isobutylparaben

1.2 Tình hình sử dụng parabens trên thế giới và ở Việt Nam

Năm 1920, parabens lần đầu tiên được sử dụng làm chất bảo quản trong dược phẩm, và được sử dụng rộng rãi một thời gian ngắn sau đó Hiện nay chúng là chất bảo quản được sử dụng phổ biến nhất không chỉ trong dược phẩm, mà còn trong các sản phẩm mỹ phẩm và thực phẩm chức năng

Tác giả Dorota B và cộng sự [11], trong báo cáo về ảnh hưởng của parabens

đối với môi trường và sức khỏe con người đã tổng hợp kết quả các nghiên cứu về

thực trạng sử dụng parabens hiện nay Theo đó, nghiên cứu của tác giả Pouillot

(năm 2006) cho biết parabens có mặt trong khoảng 80% sản phẩm chăm sóc cá

nhân Tác giả Rastogi (năm 1995) cho biết parabens được tìm thấy trong 77% sản

phẩm mỹ phẩm rửa trôi và 99% mỹ phẩm lưu lại trên da Một nghiên cứu khác của

tác giả Masten (năm 2005) cho kết quả butylparaben có mặt trong 13% sản phẩm

khảo sát, methylparaben và propylparaben có mặt trong 48% sản phẩm

Trong nghiên cứu của tác giả Eriksson E và cộng sự [12], khảo sát trong

tổng số 751 sản phẩm thu thập ở Đan Mạch cho thấy có 36% sản phẩm có chứa parabens Khảo sát ở Na Uy cho thấy có 32% trong tổng số 117 sản phẩm chăm sóc

da dành cho trẻ em có mặt parabens

Tại Việt Nam, parabens được sử dụng rất phổ biến trong các sản phẩm chăm sóc cá nhân Một khảo sát của Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực

mẫu kem dưỡng da, tấy trắng da, tái tạo da, trị nám, trị mụn, v.v.) đang có mặt trên thị trường Thừa Thiên Huế có 24 mẫu chứa 2 chất methylparaben và propylparaben,

3 mẫu chỉ chứa methylparaben và 3 mẫu chỉ chứa propylparaben

Trước những bằng chứng về tác hại của parabens đối với sức khỏe con người, Cục Quản lý Dược đã ban hành công văn số 6577/QLD-MP quy định về việc

sử dụng một số chất trong mỹ phẩm Theo đó, có 5 parabens đã bị cấm sử dụng ở Việt Nam từ ngày 30/7/2015 là: isopropylparaben, isobutyl araben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben Cũng theo công văn này, propylparaben và các muối được phép dùng riêng lẻ với nồng độ tối đa 0,4% (tính theo acid), và dạng hỗn hợp các parabens khác với tổng nồng độ tối đa là 0,8% (tính theo acid) Thời hạn công bố đối với các sản phẩm mới sản xuất trong nước, nhập khẩu đến hết ngày 31/12/2015 Các sản phẩm sản xuất trong nước, nhập khẩu được phép lưu hành trên thị trường đến hết ngày 30/6/2016

1.3 Các phương pháp phân tích parabens

Trong tình hình sử dụng parabens và các tác hại của parabens đối với sức khỏe, việc kiểm soát hàm lượng parabens là vô cùng cần thiết Để phân tích các

parabens có các phương pháp phổ biến như: phương pháp điện di mao quản (CE), phương pháp sắc ký lỏng, phương pháp sắc ký khí, v.v

1.3.1 Phương pháp điện di mao quản (CE)

Đây là phương pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất không ion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp chứa đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trường Do độ linh động của các ion khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

Phương pháp điện di mao quản được tác giả Usama A và cộng sự [26] sử

dụng để phân tích bốn parabens là methylparaben, ethylparaben, propylparaben và butylparaben có trong sữa mẹ và trong các mẫu thực phẩm Mẫu sau khi được chiết tách bằng phương pháp chiết vi lượng lỏng-lỏng phân tán (DLLME) được bơm vào máy điện di mao quản với detector UV-VIS tại bước sóng 298 nm Nhóm tác giả sử dụng cột mao quản silica nóng chảy với đường kính trong 75µm, tổng chiều dài 48,5 cm, chiều dài hiệu dụng tới detector là 40 cm Bơm mẫu tại anot, và phát hiện

điện thế 25kV và dung dịch điện di nền là đệm borat 25 mM tại pH 9,2 chứa 5,0% acetonitril (ACN), v.v Các chất phân tích được bơm trong 5s ở áp suất 50 mbar Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp dao động từ 0,9 μg/mL (đối với ethylparaben) và cao nhất là 2,1 μg/mL (đối với methylparaben)

Phương pháp điện di mao quản cũng được ứng dụng để phân tích 4 parabens

là methylparaben, ethylparaben, propylparaben, và butylparaben trong nền mỹ

phẩm [15], [22] Tác giả Shu Ping Wang và cộng sự [22] nghiên cứu phương pháp

chiết mẫu bằng chất lỏng siêu tới hạn (SFE), và phân tích 4 parabens bằng phương

pháp điện di (CE), còn Labat L và cộng sự [15] tiến hành nghiên cứu so sánh hai

phương pháp điện di mao quản (CE) và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đối với quá trình phân tích parabens

Cả hai nhóm tác giả đều sử dụng cột silica có kích thước hạt nhồi 75 µm

Chiều dài cột lần lượt là 60 cm và 70 cm; điện thế tương ứng là 25 kV và 20 kV;

nhiệt độ mao quản tương ứng là 300C và 400C Shu Ping Wang sử dụng dung dich đệm natri tetraborate 30 mM trong 5% ACN Labat L dùng dung dịch đệm là hỗn

hợp natri tetraborate 15 mM (pH 9,2) và methanol (MeOH) [15], [22]

Theo kết quả nghiên cứu của Labat L [15], khoảng tuyến tính của parabens

khi phân tích bằng phương pháp HPLC là từ 1-40 mg/mL, còn với phương pháp CE

là 5-200 mg/mL Giới hạn phát hiện trong phân tích CE (0,21 mg/mL) cao hơn

trong HPLC (0,05 mg/mL) Nghiên cứu của Labat L cho thấy cả 2 phương pháp

HPLC và CE đều phù hợp để phân tích các parabens trong nền mỹ phẩm

Phương pháp điện di mao quản có ưu điểm tiết kiệm, lượng hóa chất sử dụng rất ít, có thể phân tích được nhiều nhóm chất khác nhau Tuy nhiên, độ nhạy kém đồng thời tính ổn định không cao, thiết bị không phổ biến cho các phòng thí nghiệm

1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng

1.3.2.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detector UV-VIS

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong các lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất phân tích sau quá trình rửa giải Để phát

hiện parabens, hai tác giả Kreuz D.M và Saad B đều sử dụng detector UV-VIS

[14], [21]

Tác giả Kreuz D.M và cộng sự [14] ứng dụng phương pháp HPLC để phân

tích kali sorbat, methylparaben và propylparaben trong dung dịch huyền phù Nhóm

tác giả sử dụng cột Eclipse XDB-C8 (3,0 × 150 mm, 5 µm)

Pha động gồm kênh A có thành phần 20% ACN, 80% dung dich muối citrate 0,02M, đệm pH 5,0 và kênh B là ACN Chương trình gradient tuyến tính được thiết lập như sau: 0 phút, 100% kênh A; 35phút,70% kênh A và 30% kênh B; 36phút, 100% kênh A; 46phút, 100% kênh A Tốc độ dòng là 0,5 mL/phút Detector sử dụng UV tại bước sóng 260 nm Thể tích bơm là 50 µL Thời gian chạy là 35 phút

để phân tích và 11 phút để tái cân bằng Trong nghiên cứu này, methylparaben có giới hạn định tính (LOD) là 0,8 ng/mL, giới hạn định lượng (LOQ) là 3,0 ng/mL, khoảng tuyến tính từ 0,3348-0,9917 µg/mL Propylparaben có giới hạn định tính là 1,0 ng/mL, giới hạn định lượng là 4 ng/mL, khoảng tuyến tính từ 0,0339-0,1016 µg/mL

Tác giả Saad B và các cộng sự [21] sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao để phân tích một số chất bảo quản là acid benzoic, acid sorbic, methylparaben và propylparaben trong thực phẩm Quá trình phân tích được tiến

UV-VIS được cài đặt ở 254 nm và thể tích bơm mẫu là 20 µL Pha động tan trong nước là dung dịch ammonium acetate 0,05M, pH 4,4

Kết quả nghiên cứu cho thấy, sử dụng pha động methanol:dung dịch amoni acetate với tỉ lệ 35:65 cho kết quả tách tốt, tuy nhiên thời gian rửa giải propylparaben quá lâu (21 phút) Để khắc phục điều này, sau khi các chất acid benzoic, acid sorbic, methylparaben đã đi ra khỏi cột (9 phút), thành phần pha động được thay đổi là methanol-dung dịch amoni acetate với tỉ lệ 50:50 Trong nghiên cứu này, giới hạn phát hiện (LOD) của methylparaben là 0,3 mg/L, của propylparaben là 0,1 mg/L Khoảng tuyến tính của methylparaben từ 3,0-100 mg/L, của propylparaben từ 1,0-75 mg/L

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV-VIS có một nhược điểm là có thể có sự chồng chéo các pic khi phân tích parabens trong nền mẫu phức tạp Những hạn chế này có thể được khắc phục khi kết hợp sắc ký lỏng với đầu dò khối phổ

1.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)

Đây là một phương pháp nhanh, nhạy và được phát triển nhiều hiện nay Sau khi qua cột tách, chất phân tích được hóa hơi, các hợp chất hữu cơ trung hoà bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dương hoặc âm, các gốc tự do Sau đó, các ion đựơc đưa sang bộ phận tách theo khối lượng Từ các tín

hiệu thu được, dựa vào khối lượng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh ion, người ta định tính và định lượng được chất phân tích một cách chính xác

Tác giả Chao Han và các cộng sự [8] tiến hành định lượng 4 parabens là

methylparaben, ethylparaben, propylparaben và butylparaben (đồng thời với 3 benzophenone) trong mẫu hải sản bằng sắc ký lỏng khối phổ Nhóm tác giả sử dụng

bơm mẫu là 10 µm Pha động sử dụng là ACN (kênh A) và dung dịch acetate 0,1% (kênh B) Rửa giải bằng chế độ gradient với tốc độ dòng đặt cố định ở 30 mL/phút Thành phần pha động thay đổi theo tỷ lệ A:B như sau: 0 phút, 30:70; từ 2 đến 10 phút, 80:20; từ 10,1 đến 20 phút, 30:70

Các parabens được ion hóa bằng kỷ thuật ion hóa phun điện tử (ESI), sau đó được định lượng bằng kỹ thuật quét ion (MRM) Methylparaben, ethylparaben, propylparaben và butylparaben được định lượng với các mảnh ion có m/z lần lượt là

151, 165, 179, 193 Mô hình phân mảnh của các parabens được mô tả trong Hình 1.9 Giới hạn phát hiện LOD của phương pháp đối với các parabens là 10,0 µg/kg

Hình 1 9 Mô hình phân mảnh của các parabens trong phân tích LC-MS/MS

Tác giả Ye X và các cộng sự [27] sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao kết hợp đầu dò khối phổ để phân tích các parabens (bao gồm: methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben, benzylparaben), triclosan và một vài phenol trong sữa mẹ Nhóm tác giả sử dụng cột SPE là RP-18

ADS (25mm × 4mm, đường kính 25 µm, kích thước lỗ trống là 60Å) Cột HPLC là cột XDB C8 (150 mm × 4,6 mm, 5 µm)

Quy trình tách parabens, triclosan và các phenol khác từ sữa được thực hiện qua ba giai đoạn Giai đoạn đầu tiên (từ 0-3 phút), với các van 10 cổng tại vị trí 1-2,

và tốc độ dòng 1 mL/phút Giai đoạn thứ hai (từ 3-5phút), van 10 cổng được chuyển sang vị trí thay thế (từ 1-10), và các chất phân tích còn lại trong cột SPE được tách

khi chất phân tích ra khỏi cột, dung dịch tẩy rửa được bơm vào cột với tốc độ dòng 0,25 mL/phút bằng bơm SPE Trong giai đoạn thứ ba (từ 5-15 phút), van 10 cổng chuyển trở lại vị trí ban đầu, và các chất phân tích được chuyển đến cột HPLC bằng bơm HPLC với tốc độ dòng là 0,75 mL/phút Sử dụng chương trình gradient như sau: từ 5 đến 13phút, pha động từ 70% MeOH đến 90% MeOH; từ 13 đến 14 phút, pha động là 100% MeOH; từ 14 đến 15phút, pha động là 50% MeOH Rửa giải cột SPE với 100% MeOH từ 5 đến 10 phút và cân bằng cột với 20% MeOH:

phương pháp đối với 5 parabens phân tích là 0,1 ng/mL

3 μm) và một tiền cột (dài 20 mm) Hệ thống HPLC được ghép nối với một máy khối phổ ba tứ cực để phân tích các parabens (bao gồm: methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben, benzylparaben) trong dược phẩm

Cột được giữ ở nhiệt độ phòng, tốc độ pha động 0,3 mL/phút và thể tích bơm mẫu là 10 μL Sử dụng pha động là MeOH (kênh A) và HCOOH 0,02% (kênh B) Chương trình gradient của cột được thiết lập như sau: 3 phút đầu tiên sử dụng pha động có 5% kênh A và sau đó tăng tuyến tính từ 5% đến 85% kênh A trong 2 phút, duy trì 85% kênh A trong 1 phút Sau đó gradient tăng từ 85% đến 98% kênh A trong 2 phút và duy trì ở 98% A trong 7 phút Thành phần pha động giai đoạn sau

đó quay trở lại điều kiện ban đầu trong 1 phút và được tiếp tục trong 7 phút Giới

hạn phát hiện (LOD) của các parabens nằm trong khoảng 0,019-0,3 ng/mL, và giới hạn định lượng (LOQ) trong khoảng 0,06-0,8 ng/mL

 Sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết hợp đầu dò khối phổ (UPLC-MS/MS)

Tác giả Nieto A và cộng sự [16] phân tích 2 chất kháng sinh và 4 parabens là

methylparaben, ethylparaben, propylparaben và butylparaben có trong bùn thải bằng phương pháp UPLC kết hợp với đầu dò khối khổ trên hệ thống HP 1200 (Agilent Technologies, Waldbronn, Đức) Hệ thống được trang bị buồng ion hóa tia điện (ESI), máy bơm, vòi phun tự động Sử dụng cột sắc ký Zorbax (5,0 cm × 4,6 mm,

Thành phần pha động gồm kênh A là acid acetic (pH 3,0) và kênh B là MeOH Chế độ rửa giải gradient như sau: ban đầu là 60% kênh B, đến phút thứ 6 tăng lên 100% kênh B, giữ trong 4 phút và cuối cùng trở về 60% kênh B trong 3 phút Tất cả các chất phân tích được rửa giải trong thời gian 9 phút Điều kiện tối ưu

Phương pháp nghiên cứu có khoảng tuyến tính rất rộng: từ 0,25-250 µg/L đối với methylparaben, butylparaben, và từ 0,1-250 µg/L đối với ethylparaben, propylparaben Giới hạn phát hiện (LOD) thấp nhất là 1,75 µg/kg đối với ethyl paraben và propyl paraben, cao nhất là 3 µg/kg đối với methylparaben Giới hạn định lượng (LOQ) đối với ethylparaben và propylparaben là 2,5 µg/kg, đối với methylparaben và butylparaben là 6,3 µg/kg

Phương pháp sắc ký khối phổ GC-MS là phương pháp có độ nhạy và độ tin cậy cao, từ lâu đã được sử dụng để định lượng parabens

Tác giả Alcudia Leon M.C và các cộng sự [5] sử dụng hệ thống sắc ký khí

khối phổ HP 6890-5973N (của hãng Agilent) để phân tích các parabens bao gồm: methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben có trong nước Hệ thống

điều khiển và thu thập dữ liệu được thực hiện trên phần mềm HP1701CA MS Chem Station, với cột mao quản silica được phủ 5% diphenyl siloxane và 95% dimethyl siloxane (30 m × 0,25 mm, độ dày màng phim 0,25 µm) Nhiệt độ MS source là

Khí mang là Helium được bơm vào cột với tốc độ 1mL/phút Detector khối phổ phát hiện các ion có m/z là 121 và 138 Phương pháp phân tích có giới hạn phát hiện các parabens trong khoảng 23,2-86,1 ng/L

Như vậy, chúng ta thấy có rất nhiều phương pháp khác nhau đã được ứng dụng để phân tích các parabens Dựa vào tham khảo tài liệu, kết hợp với điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn phương pháp UPLC-MS/MS để phân tích parabens, vì phương pháp này có các ưu điểm là: tốc độ phân tích nhanh, tiêu tốn ít dung môi, độ nhạy và độ phân giải cao

1.3.4.1 Nguyên tắc chung của phương pháp sắc ký lỏng

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc chất lỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng - lỏng) Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

* Pha tĩnh trong sắc ký lỏng

Trong sắc ký lỏng, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3-7 µm

Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-HPLC)

trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức

- Sắc ký pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân

Ưu điểm của sắc ký pha đảo là tách và phân tích các chất có độ phân cực rất

đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực Hơn nữa, trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế

* Pha động trong sắc ký lỏng

Trong sắc ký lỏng pha động là thành phần được cho đi qua cột liên tục để phân tách các hợp chất trong một hỗn hợp, có những yêu cầu sau:

- Pha động phải trơ với pha tĩnh

- Bền vững, ổn định và không bị phân huỷ trong quá trình chạy sắc ký

- Hoà tan được mẫu

- Phải có độ tinh khiết cao, có độ nhớt thấp và phù hợp với detector

Có thể chia pha động làm hai loại: pha động có độ phân cực cao và pha động

có độ phân cực thấp Để phân tích một nhóm chất, người ta thường phối hợp 2 hay

3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này người ta gọi là gradient pha động

* Detector trong sắc ký lỏng:

Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp Tuỳ

thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp

- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS)

- Detector huỳnh quang: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang

- Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: Các cation, anion, các hợp chất có tính dẫn điện…

- Detector khối phổ: thường được dùng để nhận biết và xác định các hợp chất khi chúng rất khó tách bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ, chẳng hạn như các chất có khối lượng phân tử lớn, các hợp chất không bền nhiệt và các hợp chất phân cực

* Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp đầu dò khối phổ

Hình 1 10 Sơ đồ cấu tạo hệ thống UPLC-MS/MS

1.3.4.2 Một số đại lƣợng đặc trƣng của sắc ký lỏng [2]

Khi được nạp vào cột sắc ký, các chất phân tích sẽ bị giữ lại trên cột trong một khoảng thời gian nhất định Đó chính là thời gian lưu của nó, tính từ lúc mẫu được nạp vào cột cho đến lúc chất tan được rửa giải ra khỏi cột ở điểm có nồng độ cực đại

tRi = to + t’Ri

đường cong phía trước tại vị trí 1/10 chiều cao pic

 B: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đưòng cong phía sau tại vị trí 1/10 chiều cao pic

Độ phân giải là đại lượng đặc trưng biểu thị độ tách 2 chất ra khỏi nhau Độ phân giải nếu lớn hơn 1,5 thì 2 pic tách nhau hoàn toàn, trong khi độ phân giải bé hơn 0,75 thì không tách được Trong phân tích định lượng độ phân giải bằng 1 được chấp nhận, và khi đó độ xen phủ 2 pic là khoảng 4%

Công thức tính độ phân giải:

1.4 Các phương pháp xử lý mẫu

Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phương pháp định lượng đó là phương pháp xử lý mẫu Nhiều phương pháp xử lý khác nhau đã được

ứng dụng để phân tích parabens: phương pháp chiết pha rắn SPE [10], phương pháp chiết vi lượng lỏng-lỏng phân tán DLLME [26], chiết có sự hỗ trợ của sóng siêu âm UAE [17], [18], chiết lỏng có hỗ trợ áp suất PLE [7], [4], [16], chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn SFE [22]

Tác giả Cristina Moreta và cộng sự [10] xử lý mẫu dược phẩm bằng phương

pháp chiết pha rắn (SPE) Mẫu phân tích được xử lý theo quy trình sau: cân 0,05 g đến 0,1 g mẫu, thêm 0,2 mL hỗn hợp chất nội chuẩn 1mg/mL và 4,5 mL dung dịch MeOH Lắc đều hỗn hợp bằng máy lắc nghịch đảo trong 30 phút Quay ly tâm ở

5000 vòng/phút trong 15 phút và sau đó tách lấy phần dịch Các mẫu không chứa dầu được phân tích bằng HPLC-MS/MS Các mẫu lỏng và softgel chứa dầu tiếp tục được làm sạch bằng chiết pha rắn trước khi phân tích

mg/3mL) của hãng Phenomenex (Hoa Kỳ) để tinh lọc mẫu Cho 4 ml của dung dịch chuẩn chứa 100 ng/mL hỗn hợp các chất cần phân tích và 50 ng/mL chất nội chuẩn

hoạt hóa bằng 4 ml hỗn hợp aceton/MeOH (20:80) và 4 ml hexane Sau đó, cột được rửa sạch bằng 4 ml hexane và sấy khô bằng chân không trong 10 phút Chất phân tích được rửa giải bằng 3 ml aceton/MeOH (20:80)

Nhóm tác giả cũng đồng thời thử nghiệm cột Oasiss HLB (3cc, 60 mg) của hãng Water (Hoa Kỳ) cho việc tinh lọc dịch chiết Dịch chiết được cô đặc tới 2 ml

MeOH và 3 ml nước Sau khi nạp mẫu, cột được rửa bằng 3 ml dung dịch MeOH 10% trong nước và 3 ml nước Sau đó, sấy khô cột trong chân không trong 10 phút

và chất phân tích được rửa giải bằng 3 ml MeOH

Phương pháp chiết vi lượng lỏng-lỏng phân tán (DLLME) được tác giả

Usama Alshana và cộng sự [26] sử dụng để chiết parabens trong mẫu sữa mẹ và

mẫu thực phẩm Quá trình thực hiện như sau: Chuyển 1,0 ml dung dịch mẫu tới ống

ly tâm polypropylene hình nón có thang chia độ Thêm 100 µl axit photphoric đậm đặc, 200 µl chloroform và 1,0 ml ACN, rồi định mức tới 8,0 mL bằng nước và lắc xoáy trong 1 phút Sau đó quay ly tâm 4000 vòng/phút, trong vòng 3 phút Phần dung dịch được chuyển tới vi ống khóa lò xo 1,0 ml Sau khi lắc xoáy trong 10s và quay ly tâm 4000 vòng/phút, trong 1 phút, parabens được chiết ngược trong 80 µl BES (dung dịch natri hydroxit 50 mM, pH 12,7) để bơm trực tiếp vào máy điện di mao quản

Phương pháp chiết có sự hỗ trợ của sóng siêu âm (Ultrasonic Assisted Extraction UAE) cũng được ứng dụng trong phân tích các parabens Năng lượng của sóng siêu âm, cùng với điều kiện nhiệt độ cao thúc đẩy nhanh quá trình phá hủy cấu trúc mẫu, giúp giảm thời gian xử lý mẫu và năng cao hiệu quả quá trình chiết mẫu

Tác giả Nunez L và cộng sự [17], [18] áp dụng phương pháp chiết có hỗ trợ

sóng siêu âm (UAE) để chiết parabens có trong nền mẫu đất và trầm tích Mẫu phân tích được cho vào ống thủy tinh có chứa polyethylene ở cuối ống, sau đó chiết 2 lần bằng dung môi ACN với thể tích dung môi thêm vào lần lượt là 7 ml và 3 ml, rung siêu âm với tần số 50-60 Hz trong bể rung trong thời gian 15 phút Dung dịch chiết sau khi tách riêng được bay hơi đến thể tích 1ml, sau đó đem phân tích bẳng phương pháp LC–MS/MS

Chiết lỏng có hỗ trợ áp suất (Pressurized Liquid Extraction PLE) được ứng dụng để chiết parabens trong các nền mẫu khác nhau như: bụi trong nhà [7], trong đất [4], bùn cống [16]

Tác giả Canosa P và cộng sự [7] phân tích 4 parabens là methylparaben,

ethylparaben, propylparaben, butylparaben, và triclosan (TCS) có trong bụi trong nhà Sau khi thu thập bụi, tiến hành chiết PLE qua hai giai đoạn Trong 10 phút đầu, các chất hữu cơ có độ phân cực thấp hơn parabens và triclosan (TCS) được loại bỏ

Tiếp theo, chất phân tích được thu hồi bằng ethyl acetate trong 3 chu trình, ở nhiệt

etyl acetate (khoảng 15 ml) được làm bay hơi xuống thể tích 2 ml, sau đó lọc và phân tích bằng phương pháp GC-MS/MS

Tác giả Albero B và cộng sự [4] áp dụng phương pháp chiết có hỗ trợ áp

suất (PLE) để nghiên cứu các hợp chất hữu cơ gây ô nhiễm có trong đất, trong đó có

là 120 bar, dung môi chiết là ethyl acetate

Tác giả Nieto A và cộng sự [16] phân tích hàm lượng của 4 parbens (bao

gồm methylparaben, ethylparaben, propylparaben và butylparaben) và 2 chất kháng sinh có trong bùn thải bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) Quá

140 bar Dung môi chiết là dung dịch hỗn hợp MeOH:nước với tỉ lệ 50:50

Một phương pháp khác là chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical

fluid extraction SFE) được tác giả Shu Ping Wang và cộng sự [22] áp dụng Nhóm

phẩm Phương pháp này có ưu điểm là thân thiện với môi trường, không độc hại đối với sức khỏe của con người, và hiệu quả chiết rất cao Tuy nhiên, chiết suất bằng chất lỏng siêu tới hạn đòi hỏi chi phí đầu tư máy móc ban đầu rất lớn, không phù hợp với điều kiện thực tế của các phòng thí nghiệm trong nước

Tóm lại, có rất nhiều phương pháp chiết khác nhau đã được ứng dụng trong quá trình phân tích các parabens Để tách các parabens ra khỏi nền mẫu mỹ phẩm và thực phẩm chức năng, chúng tôi lựa chọn phương pháp chiết có sự hỗ trợ sóng siêu

âm (UAE) Vì phương pháp này cho hiệu quả tách tốt, không đòi hỏi máy móc phức tạp, phù hợp với điều kiện máy móc thực tế của phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng và chuẩn hóa phương pháp định lượng 7 parabens nêu trên bằng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp với đầu dò khối phổ

- Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng parabens trên một số mẫu

mỹ phẩm, thực phẩm chức năng

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Các loại mỹ phẩm sử dụng ngoài da: sữa rửa mặt, kem dưỡng da, khăn ướt v.v., các mẫu thực phẩm chức năng dạng siro, viên nang cứng, viên nang mềm v.v

- Khảo sát tìm các điều kiện phân tích 7 parabens bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết hợp với đầu dò khối phổ (UPLC-MS/MS)

- Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu, tách chiết các parabens ra khỏi nền mẫu mỹ phẩm và thực phẩm chức năng

- Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

- Áp dụng quy trình khảo sát phân tích các mẫu thực

 Các loại hóa chất, dung môi khác:

- Methanol (Merck, 99,9%)

- Acid formic HCOOH (Merck 99,8-100%)

- MeOH (>95%, Trung Quốc)

-EtOH (>95%, Trung Quốc)

- Nước cất 2 lần

 Pha dung dịch chuẩn:

- 7 parabens nghiên cứu đều là các hợp chất có tính phân cực, nhưng do độ phân cực khác nhau, dẫn đến khả năng tan trong nước của chúng khác nhau Tham khảo các tài liệu và khảo sát thực tế tại phòng thí nghiệm chúng tôi lựa chọn MeOH

để pha dung dịch chuẩn gốc Vì dung môi nước chỉ hòa tan tốt methylparaben, propylparaben và isopropylparaben, với các paraben còn lại, sau khi pha một thời gian ngắn xuất hiện tình trạng bị lắng cặn

- Cân 0,01 gam từng chất chuẩn trên cân phân tích có độ chính xác ± 0,0001 gam, hòa tan và định mức 50 ml bằng MeOH Khối lượng cân thực tế và nồng độ các chuẩn tổng hợp trong Bảng 2.1:

Bảng 2 1 Bảng nồng độ dung dịch chuẩn gốc của 7 parabens

Dung dịch chuẩn được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 40C trong 3 tháng Dung dịch làm việc được pha loãng trong nước

- Máy lắc vortex (IKA, Đức)

- Máy nước cất 2 lần (HAMILTON, Anh)

- Máy ly tâm Miko 220R, có chế độ ly tâm lạnh, tốc độ tối đa 6000 vòng/phút (Hettich, Đức)

- Bể rung siêu âm có chế độ gia nhiệt (Elma, Đức)

- Cân phân tích có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg (Kern, Đức)

- Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01g)

2.5 Phương pháp nghiên cứu

Các parabens được phân tích bằng phương pháp UPLC-MS/MS, trong đó các phân tử chất phân tích được ion hóa bằng kỹ thuật ESI Do vậy, trước tiên các thông

số cho detector MS được khảo sát sao cho cường độ của pic ion sơ cấp là lớn nhất, sau đó tiến hành khảo sát các điều kiện đo trên máy HPLC

Các parabens được tách ra khỏi nền mẫu bằng phương pháp chiết có hỗ trợ sóng siêu âm (UAE)

2.5.1 Xác định các điều kiện phân tích

2.5.1.1 Xác định các thông số cho detector khối phổ

Xác định các điều kiện cho khối phổ được thực hiện tự động bằng phần mềm IntelliStart Hai thông số cần tối ưu là: Cone Voltage (điện thế cone): chọn giá trị tại

đó cường độ pic của ion sơ cấp (ion mẹ) là lớn nhất Collision energy (năng lượng

va chạm): chọn giá trị ứng với cường độ pic của mỗi mảnh là lớn nhất Mỗi một ion con sẽ có một giá trị Collision energy tối ưu tương ứng

Cone Voltage được khảo sát trong khoảng từ 2-100 V, Collision energy khảo sát trong khoảng từ 2-80 V

2.5.1.2 Khảo sát điều kiện đo sắc ký

Đối với phương pháp sắc ký lỏng, thành phần pha động ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả tách chất Pha động phải đảm bảo yêu cầu sao cho các pic chất cần phân tích trong sắc ký đồ không bị chập với các pic nhiễu khác, khả năng tách rõ ràng, ít bị doãng pic, thời gian lưu không được quá dài Dựa vào các tài liệu tham

và HCOOH, kênh B là ACN Để xác định các điều kiện đo sắc ký, chúng tôi tiến hành khảo sát lần lượt các yếu tố sau:

- Khảo sát chương trình rửa giải gradient

- Khảo sát thành phần dung dịch đệm

Để đánh giá hiệu quả phân tích, chúng tôi dựa vào độ phân giải của các píc sắc ký được tính theo công thức trong mục (1.3.4.2)

2.5.1.3 Khảo sát các điều kiện chiết mẫu

Dựa theo tài liệu tham khảo [17], [18] và điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm, xây dựng một quy trình phân tích mẫu dự kiến như sau: mẫu được đồng nhất kỹ Sau đó cân mẫu vào ống ly tâm nhựa 50 ml Thêm 30 mL dung môi chiết mẫu vào ống ly tâm trên Lắc ống nghiệm để mẫu và dung môi được đảo trộn đều Rung siêu âm để tăng khả năng hòa tan của chất phân tích Để nguội đến nhiệt độ phòng, rồi ly tâm với tốc độ cao để phân tách phần dung dịch và lắng chặt phần cặn Phần dịch trong được gạn vào bình định mức 50 ml, phần cặn được chiết lặp lại với

15 ml dung môi chiết ở trên Định mức đến vạch bằng dung môi chiết Sau đó lọc

và đem phân tích trên hệ thống UPLC-MS/MS

Hình 2 1 Lược đồ quy trình phân tích mẫu theo dự kiến

Ly tâm 6000 vòng/phút /5 phút

Lọc

Rung siêu âm (nhiệt độ, thời gian)

+ Dung môi chiết

Cân mẫu vào ống ly tâm 50ml

+ Dung môi

chiết

Dựa theo quy trình dự kiến, chúng khảo sát các điều kiện chiết mẫu, bao gồm:

- Khảo sát loại dung môi chiết

- Khảo sát thành phần dung môi chiết

- Khảo sát thời gian rung siêu âm

- Khảo sát nhiệt độ rung siêu âm

Để đánh giá hiệu quả quá trình chiết mẫu, đối với các parabens đã có sẵn trong nền mẫu thực, chúng tôi tính toán hàm lượng chất phân tích trong mẫu dựa vào công thức:

Đối với các parabens không có trong nền mẫu thực, chúng tôi tiến hành khảo sát trên nền mẫu thêm chuẩn, hiệu quả của quá trình chiết được đánh giá dựa và hiệu suất thu hồi, tính theo công thức sau:

Trong đó: R%: Độ thu hồi (%)

2.5.2 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

2.5.2.1 Xây dựng đường chuẩn

Tham khảo các tài liệu [16] chúng tôi nhận thấy, khoảng tuyến tính không có nhiều ý nghĩa trong thực tế, phương pháp UPLC-MS/MS có khoảng tuyến tính rất rộng (từ 0,25-250 µg/L) Do vậy chúng tôi không xác định lại khoảng tuyến tính,

mà tiến hành xây dựng đường chuẩn cho mỗi chất phân tích trong khoảng nồng độ làm việc từ 0,04-1,28 ppm, là khoảng nồng độ phù hợp với hàm lượng parabens có thể gặp trong mẫu phân tích

Chúng tôi xây dựng đường chuẩn với 5 điểm chuẩn Mẫu chuẩn được chuẩn

bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc lần lượt là 5000; 2000; 1000; 500 và

250 lần Sau đó tiến hành đo trên hệ thống UPLC-MS/MS với các điều kiện khảo sát đã được xác định

Tham khảo tài kiệu [3], để đáng giá đường chuẩn, chúng tôi tính độ chệch tương đối của điểm chuẩn được tính theo công thức:

- Cách xác định: Tiến hành thí nghiệm lặp lại 6 lần Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD% của hàm lượng chất phân tích Các công thức tính toán liên quan như sau:

Giá trị trung bình

n

i x

xn

i tb







xu hướng của giá trị trung tâm (giá trị thực)

SD nói lên mức độ dao động của các

bình, thể hiện sự sai lệch phân tán của một dãy kết quả thí nghiệm so với giá trị trung bình của nó

Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%)

% 100

tb

x

SD RSD

Biểu thị sự biến động, phân tán của các kết quả thí nghiệm

trị giá trong bảng ở hàm lượng chất tương ứng, độ chụm thay đổi theo nồng độ chất phân tích Nồng độ chất càng thấp thì kết quả càng dao động nhiều (không chụm) nghĩa là RSD% càng lớn

2.5.2.3 Độ thu hồi (độ đúng)

Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng (μ) Đối với đa số mẫu phân tích, giá trị thực không thể biết một cách chính

xác, tuy nhiên nó có thể có một giá trị quy chiếu được chấp nhận là đúng (gọi chung

là giá trị đúng)

Có nhiều cách tính độ đúng như cách dùng so sánh với phương pháp chuẩn, tính độ thu hồi, sử dụng vật liệu chuẩn v.v., trong nghiên cứu này chúng tôi xác định độ đúng thông qua việc xác định hiệu suất thu hồi [3]

Hiệu suất thu hồi của phương pháp xử lý mẫu là một trong những đại lượng quan trọng để đánh giá hiệu quả của phương pháp phân tích Nó cho biết lượng chất

bị mất đi trong quá trình xử lý mẫu Đánh giá hiệu suất thu hồi là đánh giá độ tin cậy của phương pháp xử lý mẫu đã chọn

Chúng tôi tiến hành như sau: Thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử hoặc mẫu trắng, phân tích các mẫu thêm chuẩn đó, làm lặp lại 6 lần bằng phương pháp khảo sát Độ thu hồi được tính theo công thức sau đây:

- Đối với mẫu thử:

Trong đó: R%: Độ thu hồi (%)

- Đối với mẫu trắng thêm chuẩn: tính theo công thức trong mục (2.5.1.3)

Độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần lặp lại Sau khi tính độ

ở các nồng độ khác nhau có kỳ vọng khác nhau Thông thường độ thu hồi tính

được phải nằm trong khoảng cho phép của AOAC ở nồng độ chất tương ứng 2.5.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)

* Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà có

tín hiệu sắc ký lớn gấp 3 lần tín hiệu đường nền (S/N = 3) Đây là một thông số đặc