Trong ñó, nấm men và vi khuẩn lactic là hai tác nhân vi sinh vật có vai trò quan trọng quyết ñịnh ñến chỉ tiêu chất lượng về hương vị của hạt cà phê sau lên men.. Xuất phát từ bản chất c
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
HOÀNG THỊ HỒNG ÁNH
NGHIÊN CỨU VAI TRÒ VI KHUẨN LACTIC TRONG
QUÁ TRÌNH LÊN MEN TẠO HƯƠNG CÀ PHÊ HẠT TƯƠI
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG
Mã s ố : 6 5 0
TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
Đ à Nẵng, năm 2010
MỞ ĐẦU
1 Lý do lựa chọn ñề tài
Hiện nay, “cà phê chồn” là loại cà phê ñắt giá và ñược ưa chuộng nhất trên thế giới về hương vị Tuy nhiên, loại cà phê này khá hiếm, người ta chỉ thu ñược khoảng 224kg trong một năm Vậy ñiều
gì ñã khiến cho loại cà phê chồn này có giá trị sử dụng cao như vậy? Chính hệ vi sinh vật yếm khí trong ñường ruột của con chồn ñã tạo ra hương vị ñặc biệt của cà phê
Quả cà phê tươi sau khi thu hoạch có vị ngọt dịu và màu ñỏ ở phần vỏ ngoài, hoàn toàn không có hương thơm Hương và màu sắc của hạt cà phê chúng ta cảm nhận ñược chỉ hình thành sau khi “ủ” Ủ
là quá trình lên men yếm khí nhờ hệ vi sinh vật tự nhiên bao gồm: nấm men, nấm mốc và vi khuẩn Trong ñó, nấm men và vi khuẩn lactic là hai tác nhân vi sinh vật có vai trò quan trọng quyết ñịnh ñến chỉ tiêu chất lượng về hương vị của hạt cà phê sau lên men Nhiều nghiên cứu khẳng ñịnh sự có mặt của nấm mốc, nấm men, vi khuẩn (lactic, axetic, coliform) và một số vi khuẩn gram âm Trong ñó, nhiều chủng vi khuẩn lactic trong khối hạt ủ ñược phân lập và ñịnh tên
Xuất phát từ bản chất của quá trình lên men yếm khí quả cà phê tươi xảy ra trong hệ thống tiêu hóa của con chồn, chúng tôi chọn
vi khuẩn lactic làm ñối tượng nghiên cứu quá trình lên men trên quả
cà phê tươi sau thu hoạch, nhằm góp phần “công nghiệp hóa” giai ñoạn lên men, cải thiện chất lượng về hương vị thay vì chỉ lên men cà phê thóc như hiện nay Vì mục ñích ñó, chúng tôi chọn ñề tài:
“Nghiên cứu vai trò của vi khuẩn lactic trong quá trình lên men tạo hương cà phê hạt tươi”
Trang 22 Mục ñích nghiên cứu
- Nghiên cứu vai trò của vi khuẩn lactic tham gia vào quá
trình tạo hương dựa trên khả năng chuyển hoá ñường tạo thành các
axit hữu cơ Sản phẩm axit hữu cơ tham gia phản ứng este với rượu –
sản phẩm tạo hương chính cho cà phê nhân
- Lựa chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng chuyển
hóa ñường mạnh ñể ứng dụng cho quá trình lên men cà phê hạt tươi
- Từ kết quả ứng dụng, ñề xuất quy trình lên men mới thay
thế quy trình lên men thóc như hiện nay và ứng dụng vào giai ñoạn
lên men tại huyện EaH’leo – Daklak
3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Quả cà phê Robusta thu hái tại huyện EaH’leo, tỉnh Daklak
- Các vi khuẩn lactic ñược tuyển chọn trong quá trình lên men
tự nhiên cà phê
- Nấm men rượu vang từ bộ sưu tập giống của viện Công nghệ
sinh học Việt Nam
4 Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp vi sinh vật
- Phương pháp hóa lý
- Phương pháp hóa học
- Phương pháp xử lý số liệu
5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài
5.1 Ý nghĩa khoa học
- Phân lập và tuyển chọn ñược các chủng vi khuẩn lactic sinh
axit lactic cao
- Xác ñịnh vai trò tạo hương cho hạt cà phê của các vi khuẩn
lactic thực nghiệm trên chỉ tiêu xác ñịnh
5.2 Ý nghĩa thực tiễn
- Ứng dụng vi khuẩn lactic lên men cà phê quả tươi tận dụng ñược nguồn dinh dưỡng có trong vỏ quả chuyển hóa thành các chất tạo hương nhằm chủ ñộng nâng cao chất lượng về hương của cà phê
- Ứng dụng kết quả nghiên cứu vào giai ñoạn ủ cà phê tươi ở huyện EaH’leo, Daklak
6 Cấu trúc luận văn
Luận văn gồm các phần:
Mở ñầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và thảo luận Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo Phụ lục
Trang 3Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về cây cà phê
1.1.1 Nguồn gốc
1.1.2 Cá c giống cà phê
1.1.2.3 Cà phê mít (Coffea Excelsa Chev)
1.1.3 Cấu tạo, thành phần hóa học của cà phê nhân
1.2 Hệ vi sinh vật tham gia quá trình lên men hạt cà phê
1.2.1 Nấm men
1.2.1.1 Sự tạo thành rượu etylic trong môi trường axit (pH =
4,5) và trong ñiều kiện yếm khí
1.2.1.2 Sự tạo thành glycerin trong môi trường kiềm
1.2.1.3 Sự tạo thành rượu cao trong ñiều kiện thành phần dinh
dưỡng của môi trường lên men có chứa nhiều axit amin khác nhau
1.2.2 Vi khuẩn lactic
1.2.2.1 Đặc ñiểm vi khuẩn lactic
1.2.2.2 Môi trường sống
1.2.2.3 Các quá trình trao ñổi chất của vi khuẩn lactic
1.3 Môi trường dinh dưỡng và môi trường thực nghiệm
nuôi cấy chủng giống
1.3.1 Môi trường dinh dưỡng cơ bản
1.3.2 Môi trường thực nghiệm nuôi cấy chủng giống
1.4 Nuôi cấy thuần chủng và hỗn hợp giống
1.4.1 Nuôi cấy thuần chủng giống
1.4.2 Nuôi cấy hỗn hợp chủng giống
1.5 Sinh tổng hợp hương cà phê
1.5.1 Khả năng tạo hương của vi khuẩn lactic
1.5.2 Một số hợp chất tạo hương trong cà phê
1.6 Quy trình lên men cà phê thóc
1.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước thuộc lĩnh vực của ñề tài
1.7.1 Những nghiên cứu ngoài nước
1.7.2 Những nghiên cứu trong nước
Trang 4Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu và hệ vi sinh vật
Quả cà phê chín ñược thu hái tại các vườn cà phê thuộc
huyện EaH’leo, tỉnh Daklak, chủ yếu là giống Robusta
- Vi khuẩn lactic ñược phân lập và tuyển chọn từ khối cà phê
lên men tự nhiên
- Nấm men rượu ñược sử dụng từ bộ sưu tập viện Công nghệ
sinh học Quốc gia
2.1.2 Các môi trường phân lập, nhân giống vi khuẩn
2.1.3 Hóa chất thí nghiệm
2.1.4 Phương tiện thí nghiệm:
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Chuẩn bị môi trường
2.2.2 Phân lập và thuần chủng các chủng lactic
2.2.3 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào vi
khuẩn
2.2.4 Đặc tính sinh lý, sinh hóa
2.2.5 Phương pháp xác ñịnh khả năng sinh trưởng, phát
triển của vi khuẩn lactic
2.2.6 Phương pháp xác ñịnh số lượng tế bào sống/1ml canh
trường
2.2.7 Phương pháp xác ñịnh chỉ số este
2.2.8 Phương pháp phân tích phương sai
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả lựa chọn môi trường
Phương pháp thực hiện theo mục…, tất cả các khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn lactic như hình dáng khuẩn lạc tròn, nhỏ, màu trắng hay vàng ngà mọc trên ñĩa petri có chứa môi trường MRS II, MRS III, MRS IV, MRS V ñược phân lập và thuần chủng Các chủng ñược ñem nuôi cấy trong môi trường MRS lỏng có bổ sung nước vắt và tiến hành ño OD sau 48h Ký hiệu các khuẩn lạc là C1, C2, C3, C4, C5,
C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13 Kết quả trình bày ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy ñến sự sinh trưởng
và phát triển của vi sinh vật
Stt Chủng MRS I MRS II MRS III MRS VI MRS V
Trang 513 C13 320 295 308 289 251
Đánh giá kết quả phát triển của các chủng vi sinh vật trên 5
môi trường cho thấy: tại môi trường dinh dưỡng MRS I không bổ
sung thêm nước vắt cà phê tất cả 7 chủng phát triển mạnh nhất Tiếp
ñó là môi trường MRS III; MRS II; MRS VI; MRS V
Do ñó, chúng tôi chọn môi trường III làm môi trường giữ giống
và nuôi vi khuẩn cho quá trình nghiên cứu
Các chủng nghi ngờ là vi khuẩn lactic trên tiếp tục ñược giữ
giống và nuôi cấy trên môi trường MRS III ñể tiến hành xác ñịnh
hình thái và ñịnh tính
3.2 Kết quả xác ñịnh hình thái của vi khuẩn
Các chủng C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13
ñược thử catalase, nhuộm màu Gram và quan sát hình dạng tế bào
theo phương pháp ở mục 2.2.3 chương 2 Kết quả ñược trình bày ở
bảng sau:
Bảng 3.2: Đặc ñiểm hình thái các chủng vi khuẩn phân lập
từ cà phê lên men
Chủng Hình thái khuẩn lạc
Hình dạng
tế bào
Nhuộm Gram Catalase
C1
Màu trắng sữa, tròn, lồi,
C2
Màu trắng trong, tròn, dẹt,
C3
Trắng trong, mép phẳng,
khuẩn lạc to
Hình que
C4 Trắng sữa, dẹt, cấu trúc Hình cầu + -
ñồng nhất
C5
Trắng sữa, tròn, mép phẳng
Hình que
C6
Tròn, bề mặt trơn, mép răng cưa
Hình que
C7
Trắng trong, mép nhẵn, bề
C8
Trắng sữa, bề mặt xù xì, mép lượn sóng Hình chuỗi + +
C9
Trắng sữa, nhân hơi vàng, cấu trúc ñồng nhất
Que ngắn,
C10 Trắng ñục, ñều, không lồi Hình que + +
C11 Trắng ñục, ñều, hơi lồi Hình oval + +
C12 Vàng nhạt, tròn ñều, lồi Hình que
C13 Trắng ñục, mép răng cưa Hình que
Kết quả ở bảng (3.2) cho thấy có 7 chủng có thể là vi khuẩn lactic,
C3, C4, C5, C6, C9, C12, C13 (Catalase ( - ); gram (+))
Các chủng này ñược thử khả năng chuyển hóa ñường thành axit lactic, từ ñó lựa chọn các chủng có khả năng chuyển hóa ñường cao
3.3 Khả năng chuyển hóa ñường thành axit lactic và khảo sát ñộng thái sinh trưởng của các chủng vi khuẩn
3.3.1 Kết quả ñịnh tính khả năng sinh axit lactic
Trang 6Kết quả cho thấy tất cả 7 chủng phân lập C3, C4, C5, C6, C9,
C12, C13 có khả năng tạo axit lactic (làm chuyển màu tím của dung
dịch thuốc thử sang màu vàng chanh như mẫu ñối chứng) Xin xem
kết quả ở bảng 3.3
Bảng 3.3 Định tính khả năng sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn
Chủng khảo sát Kết quả
Ghi chú +: Sinh axit lactic
3.3.2 Kết quả ñịnh lượng axit lactic của các chủng vi khuẩn
Bảng3.4 : Lượng axit lactic tạo thành của các chủng vi khuẩn
Lượng axit tạo thành (mg/l) Stt Tên
Từ bảng kết quả thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy các chủng
C5, C12 có khả năng sinh axit lactic cao nhất, vì vậy, chúng tôi chọn 2 chủng ñó ñể tiếp tục khảo sát ñộng thái sinh trưởng
3.3.3 Khảo sát ñộng thái sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn lựa chọn
Hình 3.3 Động thái sinh trưởng của 2 chủng C5 và C12
Trong khoảng thời gian từ 0 – 36h mật ñộ tế bào tăng lên rõ rệt bởi ñây là giai ñoạn các chủng vi khuẩn lactic trong giai ñoạn thích ứng và sinh trưởng, phát triển về sinh khối, nên giá trị OD620nm ño ñược cũng là giá trị sinh khối tích lũy ñược trong thời gian 36h nuôi cấy Khoảng thời gian từ 48 – 72h, giá trị sinh khối của hai chủng C5,
C12 có tăng nhưng không ñáng kể, ñiều ñó thể hiện các chủng vi khuẩn lactic bước qua giai ñoạn phát triển cân bằng và chuyển dần qua giai ñoạn suy vong
0 50 100 150 200 250 300 350 400
0h 12h 24h 36h 48h 60h 72h
Trang 7Dựa vào kết quả ño ñược, chúng tôi khẳng ñịnh 36h là mốc
thời gian hai chủng C5 và C12 phát triển mạnh nhất và tại thời ñiểm
ñó, chúng tôi xác ñịnh lượng tế bào sống/ml canh trường theo
phương pháp 2.4, phụ lục 2 Kết quả trình bày ở bảng 3.5
Bảng 3.5 : Số tế bào sống/ml canh trường (CFU/ml) tương ứng
với ñộ pha loãng thập phân
Số lượng khuẩn
lạc trên ñĩa 11 18 3 7 31 42 16 23
Số vi khuẩn/1ml
canh trường
(CFU/ml)
18 x 107 51 x 108
Vậy, sau 36h nuôi cấy trên môi trường MRS III, sinh khối vi
sinh vật ñạt giá trị cao nhất và tại thời ñiểm ñó, chủng C5 tương ứng
số tế bào là 18x107 và C12 là 51x108 Chúng tôi chọn thời ñiểm này
bổ sung vào khối lên men cà phê hạt
3.4 Nghiên cứu khả năng tạo este của các chủng giống
3.4.1 Nuôi cấy thuần chủng
3.4.1.1 Bố trí thí nghiệm
- Mẫu M1, M2 là các mẫu cà phê có bổ sung vi khuẩn tương
ứng là C5, C12 Mẫu ñối chứng là mẫu không bổ sung vi khuẩn
3.4.1.2 Kết quả
Hình 3.5 Khả năng lên men tạo este của các chủng vi khuẩn
So sánh chỉ số este hai mẫu có bổ sung vi khuẩn với mẫu ñối chứng (ĐC) cho thấy, chỉ số este trong hai mẫu cao hơn so với mẫu ñối chứng
Qua bảng biểu cũng cho thấy mẫu bổ sung chủng C5 có chỉ số este cao hơn hai mẫu còn lại Nhằm thử khả năng lên men chuyển hóa ñường của hai chủng C5 và C12 khi nuôi cấy hỗn hợp như thế nào, chúng tôi ñã tiến hành lên men hỗn hợp hai chủng này và so sánh với mẫu ñối chứng là mẫu không bổ sung vi khuẩn
3.4.2 Nuôi cấy hỗn hợp chủng vi khuẩn C 5 , C 12
3.4.2.1 Bố trí thí nghiệm
M1: mẫu bổ sung hỗn hợp vi khuẩn C5 : C12 (1:1)
M2: Mẫu ñối chứng là mẫu không bổ sung vi khuẩn
3.4.2.2 Kết quả
229.75a
222.08b
212.38c
200 205 210 215 220 225 230
Mẫu lên men
Trang 8Hình 3.7 Khả năng tạo este của hỗn hợp chủng vi khuẩn C5 và C12
Dựa vào bảng kết quả chúng ta thấy, khi bổ sung hỗn hợp hai
chủng giống C5 và C12 vào khối lên men, chỉ số este (239,86) cao hơn
so với mẫu ñối chứng (208,15) và mẫu chỉ bổ sung giống thuần
chủng(229,75)
Như ñã biết, vi khuẩn lactic lên men dị hình sản phẩm chủ yếu
tạo ra là axit lactic Theo lý thuyết, phản ứng este chỉ xảy ra khi có
mặt của axit và rượu Do ñó, ñể có ñược lượng rượu cao phân tử cao
trong quá trình lên men có ñịnh hướng, chúng tôi sử dụng phương án
sử dụng hỗn hợp hai chủng vi khuẩn C5 và C12 cùng với nấm men
rượu vang (từ bộ sưu tập giống của viện Công nghệ sinh học quốc
gia) ñể ñánh giá khả năng tạo este Quá trình thực nghiệm và kết quả
ñược trình bày ở hình 3.8 và 3.9
3.4.3 Nuôi cấy hỗn hợp chủng vi khuẩn C 5 , C 12 với nấm
men
3.4.3.1 Bố trí thí nghiệm
239.86
208.15
190
200
210
220
230
240
ñối chứng) M2: mẫu bổ sung hỗn hợp vi khuẩn C5 + C12 và nấm men 3.4.3.2 Kết quả
Hìn
Hình 3.9: Khả năng tạo este của hỗn hợp vi khuẩn và nấm men
Kết quả cho thấy, mẫu bổ sung nấm men có chỉ số este cao hơn mẫu không bổ sung (380,11>243,56) Chúng tôi chọn mô hình này ñể nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng ñến chỉ số este
3.5 Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng ñến chỉ số este
3.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ hỗn hợp vi khuẩn bổ sung lên men ñến chỉ số este
Để xác ñịnh tỷ lệ vi khuẩn thích hợp cho hạt cà phê sau lên men có hàm lượng este cao, chúng tôi tiến hành bổ sung hỗn hợp vi khuẩn/khối lượng cà phê hạt tươi lên men ứng với các tỷ lệ 2%, 4%,
6%, 8%
243.56
380.11
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Mẫu lên men
Trang 9Để xác ñịnh tỷ lệ vi khuẩn thích hợp cho hạt cà phê sau lên
men có hàm lượng este cao, chúng tôi tiến hành bổ sung hỗn hợp vi
khuẩn/khối lượng cà phê hạt tươi lên men ứng với các tỷ lệ 2%, 4%,
6%, 8%
Hình 3.11 Ảnh hưởng tỷ lệ vi khuẩn bổ sung ñến chỉ số este
Kết quả thể hiện ở hình 3.11 cho thấy khi bổ sung 6% tỷ lệ hỗn
hợp vi khuẩn thì chỉ số este cao nhất là 369,72; và thấp nhất khi bổ
sung tỷ lệ 2% là 311,05
Chúng tôi lựa chọn tỷ lệ bổ sung vi khuẩn/khối lượng hạt cà
phê tươi thích hợp nhất là 6% (v/w) ñể tiến hành nghiên cứu tiếp
theo
3.5.2 Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ nấm men bổ sung ñến chỉ
số este
3.5.2.1 Chuẩn bị mẫu
Để xác ñịnh tỷ lệ nấm men thích hợp bổ sung vào khối lên men
cà phê kết hợp với hỗn hợp vi khuẩn lactic cho hạt cà phê có hàm
311,05d
356,38b
369,72a
340,47c
280 290 300 310 320 330 340 350 360 370
Tỷ lệ vi khuẩn (%)
lượng este cao, chúng tôi tiến hành bổ sung nấm men/ khối lượng hạt
cà phê ứng với các tỷ lệ 2%, 4%, 6%(v/w)
3.5.2.2 Kết quả
Mẫu hạt cà phê sau khi lên men ñược ñem phân tích, kết quả trình bày ở hình 3.13
Hình 3.13 Ảnh hưởng tỷ lệ nấm men bổ sung và hỗn hợp
vi khuẩn ñến chỉ số este
Qua biểu ñồ, ta có thể nhận thấy, khi tăng tỷ lệ nấm men bổ sung, chỉ số este càng giảm
Dựa vào kết quả thực nghiệm, chúng tôi chọn tỷ lệ bổ sung nấm men là 2%, khi ñó chỉ số este ñạt giá trị cao nhất (528,12) ñể tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng thời gian lên men ñến chỉ số este
3.5.3 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian lên men ñến chỉ số este trong hạt cà phê sau lên men
3.5.3.1 Bố trí thí nghiệm
528,12a
453,52b
418,26c
371,22d
0 100 200 300 400 500 600
Tỷ lệ nấm men bổ sung (%)
Trang 10Để khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men ñến chỉ số este chúng
tôi tiến hành lấy mẫu phân tích sau 3, 4 và 5 ngày lên men Kết quả
phân tích ñược thể hiện ở hình 3.15
3.5.3.2 Kết quả
Hình 3.15 Ảnh hưởng thời gian lên men ñến chỉ số este
Từ kết quả thu ñược chúng tôi nhận thấy, sau 4 ngày lên men
chỉ số este ñạt cao nhất (531,23) trong 3 khoảng thời gian khảo sát
Sau 5 ngày, chỉ số este có giá trị thấp nhất (489,17) Chính vì vậy,
chúng tôi chọn thời ñiểm dừng quá trình lên men là sau 4 ngày
3.6 So sánh hiệu quả lên men tạo hương cà phê hạt tươi với
cà phê thóc
3.6.1 Sơ ñồ bố trí thí nghiệm
Để so sánh hiệu quả tạo hương của hai phương pháp lên men
cà phê hạt tươi và cà phê thóc, chúng tôi tiến hành lên men hai mẫu
song song
501,11b
531,23a
489,17c
460 470 480 490 500 510 520 530 540
Thời gian lên men (ngày)
M2: mẫu lên men cà phê hạt tươi có bổ sung hỗn hợp vi khuẩn
và nấm men
3.6.2 Kết quả
Sau 4 ngày lên men, lấy mẫu hạt ñem rửa sạch và tiến hành phân tích chỉ số este
Kết quả thể hiện ở hình 3.17
Hình 3.17 Chỉ số este theo hai phương pháp lên men
Kết quả ở bảng biểu thể hiện chỉ số este của phương pháp lên men cà phê thóc thấp hơn rất nhiều so với lên men cà phê hạt tươi (211,15 <565,11)
Bằng việc phân lập, lựa chọn nguồn vi khuẩn lactic có sẵn trong môi trường lên men cà phê tự nhiên và ứng dụng trở lại ñể chủ ñộng cho quá trình lên men tạo hương, sau khi khảo sát thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng việc lên men cả vỏ có bổ sung nguồn vi khuẩn kết hợp với nấm men thì chỉ số este của hạt cà phê nhân sau
211,15
565,11
0 100 200 300 400 500 600
Mẫu lên men
