Nghiên cứu Phân lập nhóm vi khuẩn Lactic Acid có tính chất đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Pangasianodon hypophthanlmus

Vaccine được cho là phương pháp hiệu quả nhất trong phòng ngừa một số bệnh gây ra bởi vi khuẩn và virus, nhưng chưa được sử dụng phổ biến có thể là do giá thành quá cao, thời gian nghiên

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Sản lượng cá tra tăng rất nhanh từ 52.248 tấn trong năm 2000 đến 1.128.014tấn trong năm 2008, ước tính sản lượng tăng sấp xỉ 22 lần trong vòng 08 năm Sản

lượng cá tra ngày càng gia tăng đi đôi với sự suy thoái môi trường do nước thải và

bùn ao nuôi cá tra thâm canh thải trực tiếp ra sông, dẫn đến bùng phát dịch bệnh, gâythiệt hại cho người dân Phương pháp phòng và trị bệnh truyền thống đã lạm dụng sửdụng kháng sinh và hóa chất diệt khuẩn đã tạo ra những chủng vi khuẩn gây bệnhkháng thuốc và tăng độc lực Để thay thế dần dần phương pháp phòng bệnh truyềnthống, phương pháp phòng và trị bệnh bằng liệu pháp sinh học ngày càng được ưachuộng như vaccine, các chất tăng cường hệ miễn dịch (immunostimulants),probiotics Nghiên cứu về vaccine ứng dụng trên cá tra vẫn đang được nhiều nhàkhoa học quan tâm Vaccine được cho là phương pháp hiệu quả nhất trong phòng

ngừa một số bệnh gây ra bởi vi khuẩn và virus, nhưng chưa được sử dụng phổ biến

có thể là do giá thành quá cao, thời gian nghiên cứu lâu và thường gây sốc cho cá.Những thành công đáng chú ý là việc sử dụng các chất tăng cường hệ miễm dịchthân thiện với môi trường và có phổ phòng ngừa bệnh rộng Hơn thế nữa, phươngpháp trị liệu sinh học bằng vi sinh vật có lợi (probiotic) được mong đợi và trở thànhcông cụ phòng ngừa, điều trị nhiều bệnh hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản thông

qua khả năng cải thiện môi trường nước và ức chế vi sinh gây bệnh Đặc biệt là các

vi sinh vật có lợi có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu (Quorum sensing) của các vikhuẩn gây bệnh nhằm làm giảm độc và đồng thời ức chế sự phát triển của chúng.Trong khuôn khổ của đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu phân lập nhóm vi khuẩnlactic từ hệ tiêu hóa cá tra thịt và giống, nước ao nuôi cá tra có đặc tính phân hủy

phân tử tín hiệu và đối kháng Edwardsiella ictaluri Và thực phẩm lên men truyền

thống

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lâp các dòng vi khuẩn có tính chất đối kháng với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, gây bệnh cho cá tra nuôi ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long.

1.3 Nội dung đề tài

- Thu thập mẫu cá Tra ở 3 tỉnh thuộc đồng bằng sông Cửu Long: Tiền Giang,Vĩnh Long, Đồng Tháp

- Sàng lọc các mẫu có khả năng phân hủy phân tử tín hiệu N-acyl homoserinelactone (AHL)

- Dùng một số phương pháp để đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi

khuẩn phân lập đối với vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ E ictaluri.

- Khảo sát khả năng phân hủy HHL và đối kháng E ictaluri của các vi khuẩn

nhận từ ngân hàng vi sinh vật

- Bước đầu mô tả hình thái, nhộm gram các chủng có khả năng phân hủy AHL

và đối kháng

1.4 Phạm vi nghiên cứu đề tài

- Phân lập từ hệ vi sinh vật từ hệ tiêu hóa của cá tra nuôi và cá tra giống

- Phân lập từ hệ vi sinh vật nước của cá tra nuôi

- Phân lập từ hệ vi sinh vật trong thực phẩm lên men truyền thống

- Sàng lọc các chủng vi khuẩn phân lập và các chủng từ ngân hàng vi sinh khả

năng phân hủy phân tử tín hiệu AHLs và đối kháng Edwardsiella ictaluri.

CHƯƠNG 2 TỔNG QUÁT TÀI LIỆU 2.1 Một số đặc điểm sinh học của cá Tra

2.1.1 Phân loại

Bộ cá nheo Siluriformes

Họ cá tra Pangasiidae Giống cá tra dầu Pangasianodon Loài cá tra Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage 1878)

2.1.2 Phân bố

Cá tra phân bố ở lưu vực sông Mê Kông, có mặt ở cả 4 nước Lào, Việt Nam,Campuchia, Thái Lan Ở Thái Lan còn gặp chúng ở lưu vực sông Mê Kông và Chaophraya Ở nước ta cá bột và cá giống vớt được chủ yếu trên sông Tiền, cá trưởngthành chỉ thấy trong các ao nuôi, rất ít khi tìm thấy trong tự nhiên

2.1.3 Đặc điểm hình thái và sinh thái

Cá thân dài, không vẩy, màu sắc đen xám trên lưng, bụng hơi bạc, miệng rộng, có hai

đuôi râu dài

Cá sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống được ở vùng nước hơi lợ (10 - 14 %

độ muối), có thể chịu đựng được nước phèn với pH ≥ 4 (pH dưới 4 thì cá bỏ ăn, bị

sốc), ít chịu đựng được nhiệt độ thấp dưới 150C, chịu nóng tới 390C

2.1.4 Đặc điểm dinh dưỡng

Cá hết noãn hoàn thì thích ăn mồi tươi sống, vì vậy chúng ăn thịt lẫn nhau ngay trong

bể ấp, thậm chí cá vớt trên sông vẫn thấy chúng ăn nhau trong đáy vớt cá bột Chúng

ăn các loại phù động vật có kích thước vừa cỡ miệng của chúng

Khi cá lớn, tính ăn tạp thiên về động vật và dễ chuyển đổi loại thức ăn Trong aonuôi cá Tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn, kể cả thức ăn bắt buộc

như: mùn, bã hữu cơ, cám, rau, phân hữu cơ, động vật đáy,…

2.1.5 Đặc điểm sinh trưởng

Cá trong tự nhiên, có thể sống trên 20 năm Đã gặp cỡ cá trong tự nhiên 18 kghoặc có mẫu dài tới 1,8m Trong ao nuôi cá bố mẹ cho đẻ đạt tới 25 kg ở cá 10 tuổi

Nuôi trong ao 1 năm cá đạt 1 - 1,5 kg/con (năm đầu tiên), những năm về sau cá tăng

trọng nhanh hơn, có khi đạt 5 - 6 kg/năm

2.1.6 Đặc điểm sinh sản

Tuổi thành thục: Cá Tra đực thành thục ở tuổi thứ 2 và cá cái ở tuổi thứ 3 trởlên

Cá Tra không có cơ quan sinh dục phụ (thứ cấp), nên nhìn hình dáng ngoài

khó phân biệt đực - cái

Ở thời kì thành thục, tuyến sinh dục ở cá đực phát triển lớn gọi là buồng tinh,

ở cá cái gọi là buồng trứng

Mùa vụ thành thục của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 - 6 (dương lịch),

cá đẻ tự nhiên trên sông ở những khúc sông có điều kiện sinh thái phù hợp Cá không

đẻ ở phần sông của Việt Nam Ở Campuchia, bãi đẻ của cá nằm từ khu vực ngã tư

giao tiếp 2 con sông Mê Kông và Tonlesap, từ Sombor, tỉnh Crache trở lên

Trong sinh sản nhân tạo, ta có thể nuôi thành thục sớm và cho đẻ sớm hơntrong tự nhiên (tháng 3)

Trong tự nhiên không gặp tình trạng tái phát dục Chỉ có trong điều kiện nuôinhân tạo, cá Tra có thể tái phát dục 1 - 2 lần trong năm

Số lượng trứng đếm được trong buồng trứng của cá ta gọi là sức sinh sản tuyệt

đối Sức sinh sản tuyệt đối của cá Tra có thể từ 200.000 đến vài triệu trứng

2.2 Các bệnh thường gặp ở Cá Tra

Bệnh là nguyên nhân gây thất thoát cá Tra nuôi Nếu không điều trị kịp thời,bệnh sẽ lây lan nhanh chóng và dẫn đến kết quả không như mong muốn Hiện nay,

do quy định sử dụng kháng sinh trên cá rất khắc khe nên người nuôi sử dụng phương

pháp phòng bệnh là chính, hạn chế tối đa việc sử dụng thuốc, hóa chất trong danhmục cấm của Bộ Thủy Sản

2.2.1 Nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Aeromonas

Tác nhân gây bệnh: Nhóm vi khuẩn gây bệnh chủ yếu thuộc giống

Aeromanas: A hyrophila, A caviae, A sobria Vi khuẩn có mặt trong nước có nhiều

chất hữu cơ Cá con dễ mẫn cảm hơn cá trưỡng thành, có thể gây chết đến 80%

Dấu hiệu bệnh lý: Cá bị bệnh sẫm màu từng vùng ở bụng, xuất hiện từngmảng đỏ trên cơ thể, hoại tử đuôi, vây, xuất hiện các vết thương trên lưng, các khối utrên bề mặt cơ thể, mắt lồi, mờ đục và sưng phù, xoang bụng chứa dịch, nội tạng hoạitử

2.2.2 Nhiễm khuẩn do Pseudomonas (Bệnh đốm đỏ)

Tác nhân gây bệnh : Pseudomonas fluorescens, P.anguillise, P.chlororaphis

Dấu hiệu bệnh lý: Xuất huyết từng đốm nhỏ trên da, xung quanh miệng vànắp mang, phía mặt bụng, bề mặt cơ thể chảy máu, tuột nhớt nhưng không xuất huyết

vây và hậu môn Pseudomonas spp gây nhiễm khuẩn huyết thường xâm nhập vào cơ

thể cá qua các thương tổn ở mang, da, vẩy

2.2.3 Nhiễm khuẩn huyết do Edwardsiella (Edwarsiellosis)

a Tác nhân gây bệnh: Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella tarda gây ra.

b Dấu hiệu bệnh lý

Xuất hiện những vết thương nhỏ trên da (phía mặt lưng), đường kính khoảng3-5m Những vết thương này sẽ phát triển thành những khối u rỗng bên trong cơ và

da bị mất sắc tố Cá mắc bệnh sẽ mất chức năng vận động do vây đuôi bị rách, gẫy

Có thể xuất hiện những vết thương bên dưới biểu bì, cơ, khi ấn vào sẽ phát ra khí cómùi hôi Các vết thương này sẽ gây hoại tử vùng cơ xung quanh Biết xuất hiện khichất lượng nước trong môi trường nuôi xấu, nuôi với mật độ dày Nhiệt độ thích hợp

để phát triển khoảng 300C

c Đặc điểm sinh hóa

The Hawke et al (1981) Edwardsiella ictaluri là loài thuộc Enterobacteria

cea, gram âm, hình que ngắn kích thước 0.75x1.5-2.5μm di động yếu ở 25-300C,

không di động khi nhiệt độ cao hơn, Catalase dương tính, cytochrome oxidase âm

tính và lên men glucose (Shott,1989) Không sinh ra H2S và Indole âm tính Vi

khuẩn Edwardsiella ictaluri phát triển chậm trên môi trường BHI (36-48 giờ tại

28-300C)

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri còn gây bệnh trên một số loài cá trong điều kiện thí nghiệm như: Chinook salmon Oncarhynchus tshauytscha và Rainbow trout Oncorhynchus mykiss (Lương Trần Thục Đoan, 2006).

Ở Việt Nam, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh chủ yếu trên cá tra (ở

tất cả các giai đoạn phát triển) Tỷ lệ hao hụt lớn trên cá tra giống, nhưng gây thiệthại về kinh tế lớn nhất ở giai đoạn cá tra thịt cỡ 300-500g (Từ Thanh Dung và ctv,

2004) Theo Ferguson et al (2001), bệnh này được ghi nhận xuất hiện ở ĐBSCL

vào cuối năm 1998 và có tên là BNP (Bacilliaty Necrosis of Pangaius)

Từ Thanh Dung (2005) cũng phân lập vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá

tra nuôi bè ở Việt Nam, với dấu hiệu có nhiều nốt trắng trên gan

2.2.4 Bệnh ký sinh trùng

Bệnh trùng bánh xe (Trichodinosis)

+ Dấu hiệu bệnh lý: Thân cá có lớp nhớt màu trắng hơi đục, mang cá đầynhớt Cá thường nổi đầu và tập trung nơi có nước chảy, đôi khi nhô đầu lên mặt nướclắc mạnh đầu Cá bệnh nặng thường lờ đờ, đảo lộn vài vòng, chìm xuống đáy rồichết Trùng bánh xe ký sinh chủ yếu trên da, mang, các gốc cây

Bệnh trùng quả dưa (Ichthyopthisiosis)

+ Dấu hiệu bệnh lý: Trùng quả dưa ký sinh trên da, mang và vây Trùng bámthành các hạt lấm tấm rất nhỏ, đường kính lớn nhất bằng 0,5-1mm, có thể thấy đượcbằng mắt thường Da và mang cá có nhiều nhớt, màu sắc nhợt nhạt Cá nổi đầu từng

đàn trên mặt nước, bơi lờ đờ do trùng bám nhiều ở mang, phá hoại biểu mô mang

làm cá ngạt thở

2.3 Tình hình nuôi cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long

2.3.1 Tình hình nuôi cá tra

Trong các năm qua, nghề nuôi thủy sản trong nước đã có bước phát triển

nhanh và ngày càng có vị trí nổi bật Sản lượng nuôi trồng thủy sản nước ngọt năm

2002 đã đạt 450.000 tấn, chiếm 46% sản lượng nuôi trồng và khai thác thủy sản nội

địa Trong các loài cá nuôi nước ngọt, cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài

cá nuôi nước ngọt truyền thống được nuôi chủ yếu trong bè, ao và đăng quần với các

mức độ thâm canh, bán thâm canh và qui mô nông hộ ao hồ nhỏ ở hầu hết ở các tỉnhNam bộ, trong đó tập trung chủ yếu ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, và Cần Thơ.Sản lượng nuôi cá tra ước tính đạt khoảng 300.000 tấn năm 2004, đạt 400.000 tấn

năm 2005, đạt trên 800.000 tấn năm 2006, đạt 1.000.000 tấn năm 2007 và 1.128.000

tấn năm 2008 (Đồ thị 1) (Sáng et al., 2007)

Đồ thị 1 Sản lượng nuôi cá tra từ năm 2000-2008 (Vietnam association of Seafood

Exporters and Producers-VASEP, 2008

Tuy nhiên, tình hình sản xuất và tiêu thụ cá tra trong mấy năm qua đang thểhiện sự thiếu bền vững Có rất nhiều nguyên nhân chủ quan, khách quan khác nhau

đang được Chính phủ, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, các Bộ ngành, cácđịa phương, các tổ chức Hiệp hội nuôi cá và chế biến xuất khẩu đang chung tay triển

khai các giải pháp đồng bộ để khắc phục một cách hữu hiệu (Sáng et al., 2007)

Trong đó, vấn đề về môi trường bị nhiễm dẫn đến dịch bệnh bùng phát đã tác động

nghiệm trọng đến người nuôi và đồng thời giảm chất lượng sản phẩm của cá tra

2.3.2 Nghiên cứu về bệnh gan thận mủ

Bệnh do ký sinh trùng:

Cryptobia spp., Ichthyophthyrius multifiliis, Trichodina, Epistylis.

640.000 tấn sản phẩm cá tra philê, đạt kim ngạch gần 1,5 tỷ USD, tăng hơn 48% sovới năm 2007 Chỉ trong vòng khoảng 10 năm, từ năm 1998 đến năm 2008, từ mộtloài cá bản địa, cá tra đã trở thành sản phẩm chiến lược quốc gia, với sản lượng nuôi

tăng gấp 65 lần, xuất khẩu sang hơn 140 nước, chiếm hơn 50% tổng sản lượng thủy

sản xuất khẩu Việt Nam, đóng góp khoảng 2% GDP của cả nước (Thủy sản ViệtNam, số 13/2009) Với sự phát triển ngày càng cao của cá tra cùng thị trường to lớncho xuất khẩu, hàng ngàn nông dân đã chạy theo lợi nhuận từ con cá tra một cách vô

điều kiện, với năm 2008 là đỉnh điểm của phong trào nuôi cá tra ở ĐBSCL Ngườinuôi đã ồ ạt mở rộng diện tích nuôi, tăng mật độ nuôi một cách tự phát, cung cấp mộtlượng lớn thức ăn dẫn đến môi trường trong ao nuôi dễ dàng bị ô nhiễm, là điều kiện

để bệnh bộc phát, gây thiệt hại cho người nuôi Nghề nuôi cá tra trong những năm

gần đây có tỉ lệ hao hụt khá cao (khoảng 40-50%), cao gấp đôi so với các năm trước(www.vasep.com.vn) Các bệnh thường gặp trên cá tra bao gồm bệnh do vi khuẩn

(bệnh gan thận mủ, bệnh đốm đỏ do Pseudomonas, bệnh nhiễm trùng máu do Edwardsiella tarda), nấm (nấm thủy mi, ) và ký sinh trùng (trùng bánh xe, trùng

quả dưa, sán lá đơn chủ, sán song chủ, ) Theo kết quả điều tra của Nguyễn Thanh

Phương (2007) về các bệnh do tác nhân vi khuẩn xuất hiện trong các ao nuôi cá tra

thâm canh ở tỉnh An Giang, 68,3% số hộ điều tra nhận thấy bệnh đỏ mỏ đỏ đuôi,61% số hộ ghi nhận bệnh gan-thận-mủ, 51,2% số hộ ghi nhận bệnh phù đầu, 24,4%

số hộ ghi nhận bệnh vàng da Theo thống kê của Lý Thị Thanh Loan (2008), tần suấtxuất hiện bệnh năm 2007 ở các tỉnh ĐBSCL bao gồm bệnh gan thận mủ: 52,80%;xuất huyết: 42,50%; phù đầu, phù mắt: 20,70%; vàng da: 21,60% Trong đó bệnhgan thận mủ (hay bệnh đốm trắng nội tạng) gây thiệt hại nhiều nhất cho người nuôi.Bệnh này xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào cuối năm 1998 Khi cánhiễm bệnh, tỉ lệ chết tăng cao (10-90%), có thể lên đến 100% tùy thuộc vào cáchquản lý và kích cỡ cá nuôi, đồng thời trên gan, thận và tụy tạng xuất hiện nhiều đốmtrắng đường kính 1-3 mm bên trong chứa dịch màu trắng đục Khi cá bệnh người

nuôi thường dùng hóa chất hoặc thuốc kháng sinh để chữa trị Tuy nhiên người ta đã

phát hiện rằng tác nhân gây bệnh, vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (theo kết quả định danh của Crumlish et al., 2002), đã kháng với khá nhiều loại kháng sinh như:

Bactrime (100%), Colistin (97,9%), Florphenicol (42,5%), Amoxicillin (40,4%),Tetracyclin (31,9%), Doxycyclin (27,7%) (Nguyễn Hữu Thịnh và Trương ThanhLoan, 2007) Nguyễn Thanh Phương (2007) xác định khả năng kháng thuốc kháng

sinh của 8 chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá tra bệnh mủ gan, cho

thấy cả 8 chủng đều cho kết quả kháng với Colistin, Oxolinic acid, Streptomycin,Cefepime, Sulfa+trime, Ceftriaxone, Cefazolin, Gentamycin, Aztreonam, Cefixim,

Cefotaxime, Oxytetracycline và Amoxicillin Hơn thế sản phẩm cá tra sau thu hoạchthường không được ưa chuộng do sự tích lũy thuốc, hóa chất trong thịt, tạo các dòng

vi khuẩn kháng thuốc và gây ô nhiễm môi trường nước Ngoài ra tồn dư chất khángsinh trong thịt cá tra sẽ ảnh hưởng đến vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm, và làmgiảm uy tín của sản phẩm cá tra xuất khẩu ra thị trường nước ngoài

Để giải quyết vấn đề trên, chúng ta phải tìm các giải pháp thay thế cho việc

chữa trị bằng kháng sinh và thuốc hóa học Hiện nay biện pháp sử dụng vaccine đểphòng bệnh đang được đánh giá là có hiệu quả và kinh tế Từ năm 2005, ViệnNghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II đã phối hợp với Công ty Thuốc thú y Trung

ương II (Navetco) thực hiện đề tài cấp Bộ “Nghiên cứu vaccine phòng bệnh nhiễm

khuẩn cho cá tra, cá basa, cá mú, cá giò, cá hồng Mỹ nuôi công nghiệp”, trong đó đối

tượng được quan tâm đặc biệt là cá tra Sau ba năm thực hiện, việc nghiên cứu

vaccine phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra đã đạt được một số kết quả khả quan và

có triển vọng áp dụng vào thực tế Hiện nay loại vaccine này đã nhận được lời mờihợp tác từ công ty cổ phần Vĩnh Hoàn (Đồng Tháp), công ty nuôi và xuất khẩu cá tralớn thứ ba của Việt Nam Ngoài ra, các nghiên cứu hợp tác giữa tập đoàn Bayer vàcông ty sản xuất vaccine Pharmaq của Nauy trên bệnh gan thận mủ của cá tra cũng

đã bước đầu khẳng định tác nhân gây bệnh là vi khuẩn E ictaluri, hiện đang tiếp tục

nghiên cứu để chế tạo vaccine

Tuy nhiên, các loại vaccine nói trên là vaccine bất hoạt (sử dụng khángnguyên là tế bào vi khuẩn giết bằng formalin 0,4%), có một số nhược điểm là tỉ lệbảo hộ chưa cao, thời gian bảo hộ khá ngắn (hai tháng, trong khi một vụ nuôi cá trakéo dài tới 5-6 tháng), đòi hỏi phải bổ sung một số chất bổ trợ để làm tăng hiệu quả

của vaccine Biện pháp phòng bệnh tổng hợp luôn luôn đòi hỏi sự kết hợp của nhiềucách tiếp cận khác nhau: quản lý môi trường nuôi, quản lý chất lượng con giống,

tăng cường sức khỏe vật nuôi, sử dụng các hợp chất kích thích miễn dịch, vaccine bất

hoạt, vaccine sống nhược độc, các chế phẩm sinh học có nguồn gốc thảo dược, cácchế phẩm vi sinh vật

Hiện nay, một số chế phẩm vi sinh đã được ứng dụng trong sản xuất giống và

nuôi thương phẩm cá tra nhằm thay thế cho việc sử dụng kháng sinh Các chế phẩmnày được bổ sung vào trong thức ăn dưới dạng men vi sinh, đồng thời được bổ sungvào nước để xử lý môi trường Gần đây, chế phẩm sinh học Bokashi được chiết xuất

từ lá trầu của nhóm nghiên cứu Khoa Thủy sản, trường Đại học Nông Lâm Huế đượcxem là một trong những hướng nghiên cứu đột phá trong việc phòng và trị bệnh chotôm cá Thành phần hệ vi sinh vật trong chế phẩm này bao gồm vi khuẩn lactic(50%), vi khuẩn quang hợp (20%), nấm men (20%), xạ khuẩn (5%), nấm sợi (5%).Qua kết quả thử nghiệm của Công ty TNHH Hải Nông Phát thành phố Hồ Chí Minhtrên một số ao nuôi cá tra, basa từ tháng 4/2006 đến nay đã đạt được những thànhcông nhất định trong việc phòng bệnh gan thận mủ (Nguyễn Khoa Diệu Hà, 2009)

b Bệnh do Edwardsiella ictaluri gây ra trên cá da trơn và một số nghiên cứu về biện pháp phòng bệnh

Bệnh gan thận mủ trên cá tra xuất hiện lần đầu tiên vào cuối năm 1998, tácnhân gây bệnh lúc đầu được xác định bởi nhóm nghiên cứu của trường Đại học

Stirling phối hợp với trường Đại học Cần Thơ là Bacillus sp (Ferguson et al., 2001).

Đến năm 2002 nhóm nghiên cứu này đã đính chính lại tác nhân gây bệnh gan thận

mủ trên cá tra là vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Crumlish et al., 2002) E ictaluri

được báo cáo đầu tiên trên cá nheo Mỹ, Ictalurus punctatus, vào năm 1979 (Hawke,

1979) E ictaluri gây bệnh nhiễm khuẩn đường ruột cấp tính trên cá da trơn, hội

chứng này được gọi tắt là ESC (Enteric Septicaemia of Catfish) và có thể dẫn đến tỉ

lệ chết cao ở cá nheo Mỹ (Austin & Austin, 1999)

Bệnh này được tìm thấy tại bất cứ nơi nào nuôi cá nheo tại nước Mỹ Bệnhxảy ra ở tất cả các kích cỡ cá nuôi nhưng tập trung ở giai đoạn cá hương và cá giống

(USDA/APHIS, 2003) Sự thiệt hại cho nghề nuôi công nghiệp của cá da trơn do

ESC được ước tính hàng năm khoảng 4-6 triệu USD từ năm 1990 và đã tăng nhanhsau đó Khoảng 70% các hộ nuôi được khảo sát vào năm 1996 cho thấy nguyên nhân

từ ESC đã gây ra thiệt hại cao nhất cho các hộ nuôi cá da trơn, với 57% số hộ nuôi bịthiệt hại nặng (USDA/APHIS, 1997) Bệnh xảy ra theo mùa, đặc biệt xảy ra thườngxuyên khi nhiệt độ nước nằm trong khoảng 20 – 29oC (Tucker et al., 2004) Cá bịbệnh ESC thường giảm ăn, lờ đờ, bơi dạng xoay vòng, xuất huyết xung quanh vùngmiệng và phần bụng Nhiều vết lở loét nhỏ màu trắng có thể xuất hiện trên bề mặt da

Cá nhiễm bệnh thường lồi mắt và bụng trương to (Tucker et al., 2004)

Có khá nhiều nghiên cứu trên thế giới trong lĩnh vực sản xuất vaccine phòng

bệnh do E ictaluri gây ra trên cá da trơn Shoemaker và ctv (1999) nghiên cứu ảnh

hưởng của ba loại vaccine sống cải tiến dưới dạng đông khô (Immuno X+5,

Immuno2 X+5, Serial 1A) và một loại vaccine sống truyền thống (RE-33) Cá nheo

Mỹ (Ictalurus punctatus) được gây miễn dịch bằng phương pháp ngâm ở các ngày

tuổi khác nhau (từ 7 ngày tuổi đến 31 ngày tuổi) Kết quả cho thấy hiệu lực củavaccine đã thể hiện được ngay từ khi cá được gây miễn dịch ở giai đoạn 7 ngày tuổi

và 10 ngày tuổi Tỉ lệ sống của cá 7 ngày tuổi được gây miễn dịch dao động trongkhoảng 58,4 – 77,5%, đối với cá 10 ngày tuổi thì dao động trong khoảng 64,1 –

78,9% Ba năm sau đó, nhóm tác giả này cũng đã nghiên cứu phương pháp in ovo đối

với việc sử dụng các loại vaccine sống cải tiến này, khi gây miễn dịch từ giai đoạntrứng của cá nheo Mỹ, bằng phương pháp ngâm trong thời gian 10 phút Kết quả chothấy phương pháp gây miễn dịch này là khá hiệu quả, với tỉ lệ bảo hộ khoảng 59,7%(Shoemaker et al., 2002)

Trong những năm gần đây, một số nhóm nghiên cứu đã quan tâm đến việc pháttriển các chế phẩm vi sinh (probiotic) và một số chế phẩm sinh học khác bổ sung vào

thức ăn để phòng bệnh ESC ở cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus).

Shelby và ctv (2007) bổ sung hai loại chế phẩm vi sinh có chứa Pediococcus sp.

và Enterococcus sp (riêng lẻ hoặc phối hợp với nhau) vào thức ăn của cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) giống và cho ăn trong vòng 5-8 tuần Sau đó tiến hành đo các

chỉ tiêu: tăng trọng, hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) và các thông số miễn dịch nhưprotein huyết thanh, immunoglobulin, lysozyme, complement Các số liệu về vi sinhcho thấy hai chủng vi khuẩn probiotic vẫn tồn tại được trong thức ăn sau khi bổ sungtrong thời gian bảo quản trong vòng 4 tuần Tuy nhiên các tác giả không tìm thấy sựkhác biệt nào về tăng trọng, đáp ứng miễn dịch cũng như tính kháng bệnh của cá sauthời gian cho ăn thức ăn có bổ sung probiotic.

Aboagye và ctv (2008) thử nghiệm ảnh hưởng của chế phẩm vi sinh

Lymnozyme đến tỉ lệ sống của cá nheo Mỹ sau khi được gây nhiễm thực nghiệm với

Edwardsiella ictaluri Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở nghiệm thức có bổ sung

Lymnozyme vào nước hàng ngày liên tục trong hai tuần, tỉ lệ chết của cá sau khi gây

nhiễm Edwardsiella ictaluri (45%) giảm một cách có ý nghĩa thống kê (p = 0,002) so

với nghiệm thức đối chứng (80%)

Các nhà khoa học Nauy và Mỹ đã nghiên cứu hiệu quả kháng khuẩn của hailọai peptide tổng hợp cecropin B và cecropin P1 đối với một số chủng vi khuẩn gây

bệnh trên cá, trong đó có E ictaluri (Kjuul et al., 1999) Nồng độ ức chế tối thiểu

(MIC) của cecropin B dao động từ 0,3-1,3 µM Các dẫn xuất của cecropin B đã đượcbiết đến có họat tính kháng khuẩn đối với nhiều lòai vi khuẩn gây bệnh, và có khả

năng tăng cường tính đề kháng của cá nheo Mỹ gây cảm nhiễm với E ictaluri (Kelly

et al., 1993)

Prebiotic là những hợp chất bổ sung vào thức ăn, có tác dụng kích thích sinh

trưởng và họat tính của hệ vi khuẩn có lợi hịện diện trong hệ tiêu hóa của vật chủ(Delzenne & Roberfroid, 1994) Prebiotic thường được sử dụng kết hợp với probiotic

(gọi là synbiotic) Các hợp chất đường mạch ngắn đang được sử dụng phổ biến như

là prebiotic bổ sung vào thức ăn thủy sản, trong số đó bao gồm: Inulin, oligosaccharide (FOS), transgalacto-oligosaccharide, lactulose (Mahious, 2005),isomalto-oligosaccharide (IMOS) (Li et al., 2009) Hiệu quả về dinh dưỡng và sứckhỏe của một số oligosaccharide đã được chứng minh trên cá (Glencross et al., 2003;

fructose-Li & Gatlin, 2005; Pryor et al., 2003) Isomalto-oligosaccharide ở nồng độ 0,2% sử

dụng kết hợp với vi khuẩn probiotic Bacillus OJ (108 CFU/g thức ăn) bổ sung vào

thức ăn cho tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) đã giúp điều chỉnh hệ vi sinh vật

đường ruột, tăng cường phản ứng miễn dịch và khả năng đề kháng đối với virus đốm

trắng, thông qua hiệu ứng tương hỗ của hai loại chế phẩm này (Li et al., 2009)

Mannan-oligosaccharide (MOS), một loại prebiotic chiết xuất từ nấm men, đã

được chứng minh là có hiệu quả tăng cường đáp ứng miễn dịch và tính đối kháng đối

với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri trên cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus (Welker et

al., 2007)

2.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng probioic trong nuôi trồng thủy sản trên thới giới và tại Việt nam

2.4.1 Tình hình nghiên cứu probiotic trên thế giới

Sản lượng nuôi trồng thủy sản hiện nay chiếm đến 40% tổng sản lượng thủysản, với tổng giá trị vào khỏang 78 tỉ USD (FAO, 2008) Vai trò quan trọng của nuôitrồng thủy sản ngày càng gia tăng đáng kể, do sản lượng khai thác thủy sản đã trởnên bão hòa và nhu cầu tiêu thụ hải sản ngày càng tăng Tuy nhiên, vấn đề dịch bệnh

đang gây tổn thất rất lớn cho nghề nuôi thủy sản Những bệnh gây ra bởi Vibrio spp.,

Aeromonas spp., Pseudomonas spp., Streptococcus spp., xảy ra rất phổ biến và dẫn

đến tỉ lệ chết cao của tôm cá nuôi (Watson et al., 2008)

Khi người nuôi gặp phải vấn đề dịch bệnh, thông thường biện pháp đối phóđầu tiên là sử dụng các hóa chất diệt khuẩn hoặc kháng sinh Việc sử dụng những

hóa chất này đã đem lại hiệu quả trong việc phòng và trị bệnh trên vật nuôi (Schwarz

et al., 2001; Phillips et al., 2004) Tuy nhiên, việc lạm dụng hóa chất diệt khuẩn vàkháng sinh trong nông nghiệp cũng như trong nuôi trồng thủy sản đã dẫn đến sự xuấthiện các dòng vi khuẩn kháng thuốc (Schwarz et al., 2001; Akinbowale et al., 2006).Những thiệt hại lớn nhất đã xảy ra cho nghề nuôi tôm trên thế giới, khi việc nuôi tômthiếu quy họach cộng với việc lạm dụng kháng sinh đã đưa đến hiện tượng vi khuẩnkháng thuốc và suy giảm về năng suất nuôi ở nhiều nước châu Á (Karunasagar et al.,1994; Moriarty, 1999) Nghiêm trọng hơn, những dòng vi khuẩn kháng thuốc có thể

truyền những gen kháng thuốc cho vi khuẩn gây bệnh ở người, đe dọa đến sức khỏe

con người (Witte, 2000; Schwarz et al., 2001)

Nhận thức được về những mối nguy do việc sử dụng kháng sinh không kiểmsóat, Hoa Kỳ, nhiều nước châu Âu và một số nước châu Á đã ban hành những đạoluật về kiểm sóat việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản,tiến đến việc ngưng sử dụng kháng sinh (Delson et al., 2005; Martin, 2005) Thứctỉnh trước những mối đe dọa do việc sử dụng kháng sinh cũng như do vi khuẩn gâybệnh mang đến cho người nuôi, những biện pháp thay thế đang được tìm kiếm

Trong đó có việc sử dụng vaccine, các chất kích thích miễn dịch, các peptide kháng

khuẩn, prebiotic (hợp chất tiền sinh học), probiotic (chế phẩm vi sinh) Trong đó,việc sử dụng chế phẩm vi sinh đang ngày càng được quan tâm và ứng dụng rộng rãi

Probiotic ban đầu được định nghĩa là “chế phẩm vi sinh vật sống bổ sung vào

thức ăn, có ảnh hưởng có lợi đối với vật chủ thông qua việc cải thiện cân bằng hệ

đường ruột (Fuller, 1989) Tuy nhiên trong nuôi trồng thủy sản, probiotic không chỉđược bổ sung vào thức ăn mà còn được bổ sung vào môi trường nước (Moriarty,

1998) Trong những năm gần đây, có rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng vi khuẩnprobiotic có thể làm tăng cường khả năng kháng bệnh của tôm/cá thông qua việc ứcchế vi khuẩn gây bệnh, nâng cao hiệu quả của hệ miễn dịch hoặc cải thiện chất lượng

nước (Verschuere et al., 2000) Năm 2002, Irianto và Austin đề nghị một định nghĩa

ngắn gọn nhưng đầy đủ “probiotic là cả tế bào hoặc một thành phần của vi sinh vậtsống có ảnh hưởng có lợi đối với sức khỏe của vật chủ”

Trong một số trường hợp, những vi khuẩn ứng cử viên sau khi sàng lọc in vitro

sẽ được kiểm tra in vivo ở qui mô nhỏ về đặc tính an toàn đối với vật chủ(Chythanya et al., 2002; Hjelm et al., 2004) và khả năng bảo vệ vật chủ khi gây cảmnhiễm ngược với tác nhân gây bệnh (Irianto & Austin, 2002; Lategan et al., 2004).Trong một số nghiên cứu khác, các ứng cử viên sau khi sàng lọc sẽ tiếp tục đượckiểm tra những đặc tính khác như khả năng chịu đựng muối mật (Chabrillon et al.,2006), khả năng kích thích hệ miễn dịch (Irianto & Austin, 2003), cạnh tranh vị tríbám (Chabrillon et al., 2006), cạnh tranh chất dinh dưỡng (Gram et al., 1999) Trong

thực tế, những nghiên cứu này là cần thiết để kiểm tra các vi khuẩn probiotic ứng cửviên có thể hiện những cơ chế tác động nào khác hay không Ngoài ra, những thửnghiệm in vivo là rất cần thiết, bởi vì một chủng vi khuẩn đối kháng với vi khuẩnkhác ở điều kiện in vitro, không nhất thiết là sẽ thể hiện đặc tính đối kháng đó khi có

sự hiện diện của vật chủ

2.4.2 Tình hình sử dụng các chế phẩm probiotics trong hoạt động nuôi trồng thuỷ sản ở Việt Nam

Những năm gần đây, để giảm thiểu những bất lợi do sử dụng hóa chất trongnuôi trồng thủy sản, việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm sinh học để phòngbệnh và cải thiện môi trường trong quá trình nuôi tôm ở nước ta đang phát triểnmạnh (FICen, 2007) Hiện nay có hàng trăm loại chế phẩm sinh học được sử dụngtrong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản, bao gồm chế phẩm trộn vào thức ăn và chế phẩm

xử lý nước Đa số các chế phẩm có nguồn gốc ngoại nhập hay sử dụng công nghệ từ

nước ngoài để sản xuất phân phối tại Việt Nam Tuy nhiên, yếu tố lợi nhuận được đặtlên hàng đầu, chưa thật sự quan tâm đúng mức đến quyền lợi của người sử dụng.Chưa kể đến tác dụng của chế phẩm ra sao bởi vì những chế phẩm ngoại nhập hay

chủng vi sinh vật từ nước ngoài đưa vào Việt Nam có phù hợp với điều kiện của ViệtNam hay không thì việc đưa một lượng đáng kể chủng vi sinh vật vào Việt Namcũng là một mối nguy hiểm tiềm tàng, xét về khía cạnh an toàn sinh học (Lương ĐứcPhẩm, 2007)

Giá bán của các loại chế phẩm này khá cao, nên đã gây khó khăn cho người nuôitrồng thủy sản trong việc lựa chọn một sản phẩm vừa đạt chất lượng vừa có giá thành

rẻ Với lý do đó,việc đẩy mạnh nghiên cứu để sản xuất probiotic dùng trong chănnuôi và nuôi trồng thủy sản là một yêu cầu tất yếu Tuy nhiên sản phẩm tinh chế thìgiá thành còn cao nên ở nước ta hiện nay vẫn sử dụng nguồn nguyên liệu chủ yếu làcác loại phụ phẩm của ngành nông nghiệp Do đó giá thành của probiotic giảmxuống nhiều và cũng giúp cho vật nuôi tiêu hóa tốt hơn, giảm tỉ lệ bệnh và góp phầncải thiện môi trường

Viện Sinh học Nhiệt đới đã thành công trong việc nghiên cứu và sản xuất chếphẩm probiotic BioII gồm hỗn hợp các vi sinh vật sống và enzyme tiêu hóa dùngtrong nuôi trồng thủy sản Chế phẩm này đã được khảo nghiệm trên ao nuôi tôm sú ởcác tỉnh cho kết quả khả quan và được Công ty thuốc thú y và nuôi trồng thủy sản

đưa ra thị trường (Võ Thị Hạnh và ctv, 2004)

Các nhà khoa học tại Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên đã nghiên cứu vàsản xuất thành công chế phẩm EBS2 để bổ sung vào thức ăn trong nuôi trồng thủysản EBS2 có vai trò quan trọng như những vitamin kích thích trong quá trình sinh

trưởng của các đối tượng nuôi trồng thủy sản Kết quả thử nghiệm với cua biển cho

thấy trong 22 ngày đầu lô cua dùng thức ăn tổng hợp có bổ sung EBS2 đạt tốc độ

tăng trưởng 3,5% Trong khi đó lô không bổ sung EBS2 có tốc độ tăng trưởng là

0,9% và lô dùng thức ăn tự nhiên có tốc độ tăng trưởng là 0,5% (Phòng hóa sinhbiển, 2001)

Ngoài ra, chế phẩm sinh học Biochie bao gồm một số chủng thuộc chi

Bacillus (Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis) và Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus) Chúng có chức năng phân hủy hợp chất

hữu cơ bằng cách tiết ra các enzyme như protease, amylase Chúng còn có khả năngtổng hợp chất kháng khuẩn làm giảm số lượng vi sinh vật gây bệnh phát triển quá

mức như Vibrio, Aeromonas… Sử dụng chế phẩm sinh học Biochie để xử lý nước

nuôi tôm cá có tác dụng làm giảm lượng bùn hữu cơ, giảm chu kỳ thay nước và cảithiện môi trường (tăng oxi hòa tan, giảm COD, BOD) Bên cạnh đó, còn có tác dụnggiảm đáng kể tỷ lệ chết, tỷ lệ còi cọc, tăng sản lượng và giảm mùi hôi của ngư trường(Vũ Thị Thứ và ctv, 2004a)

Ngoài những chế phẩm probiotic trên, chế phẩm sinh học BioF có chứa chủng

Lactobacillus acidophillus được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản có tác dụng tăng khả năng hấp thụ thức ăn và hạn chế bệnh do Aeromonas, Vibrio… gây ra Những

nghiên cứu gần đây đã cho thấy khi bổ sung BioF vào thức ăn tôm làm tăng tỷ lệsống và đặc biệt tăng đáng kể sản lượng tôm trong ao Kết quả bước đầu cho thấy sử

dụng BioF để nuôi tôm giống rất hiệu quả, tôm tăng trưởng nhanh, khoẻ, đồng đều(Vũ Thị Thứ và ctv, 2004b).

Chế phẩm EM được giáo sư Teruo Higa-Nhật Bản phát minh năm 1980, được

ứng dụng trong các lĩnh vực nông - ngư nghiệp trên thế giới Tuy nhiên, chế phẩm

EM ở dạng lỏng được nhân giống từ EM gốc của Nhật Bản với mật độ tế bào vi sinhvật có lợi cho nuôi trồng thủy sản thấp (< 107CFU/ml) nên hiệu quả sử dụng không

cao Để góp phần hoàn thiện và nâng cao hiệu quả chế phẩm EM, phòng Vi sinh ứng

dụng - Viện Sinh học Nhiệt đới đã nghiên cứu sản xuất ra chế phẩm VEM sử dụng

bổ sung với chế phẩm BioII Chế phẩm VEM (Vietnamese effectivemicroorganisms) gồm tập hợp các vi sinh vật hữu ích có trong chế phẩm EM Ngoài

ra, còn có thêm một số lòai vi khuẩn Bacillus spp được chọn lọc và vi khuẩn quang

dưỡng, không chỉ có tác dụng cải thiện môi trường nước nuôi trồng thủy sản mà còn

cạnh tranh và đối kháng với các loài vi khuẩn gây bệnh tôm, cá (Võ Thị Hạnh và ctv,2004)

Tại Bạc Liêu, nhiều hộ nuôi tôm đã áp dụng phương pháp nuôi có bổ sungchế phẩm vi sinh Mô hình này bước đầu mang lại hiệu quả khá cao Ưu điểm của

mô hình nuôi tôm sử dụng chế phẩm vi sinh là tạo nên môi trường sạch, chi phí thấp,tôm phát triển nhanh và hạn chế dịch bệnh, nhất là bệnh đốm trắng, đầu vàng, phântrắng (FICen, 2007)

Tại xã Tân Hưng Đông - huyện Cái Nước – Tỉnh Cà Mau, việc áp dụng môhình nuôi tôm bằng chế phẩm EM.ZEO bước đầu mang lại hiệu quả khả quan, giữ

cho môi trường của ao luôn sạch, tôm khoẻ mạnh mà hoàn toàn không sử dụng các

hoá chất độc hại, kháng sinh Trong suốt quá trình nuôi, tôm phát triển tốt và không

bị nhiễm bệnh Đây là mô hình nuôi tôm công nghiệp mang tính bền vững vì quytrình của dự án sử dụng chủ yếu vi sinh EM.ZEO (FICen, 2007)

Việc sử dụng các chế phẩm vi sinh đã mang lại nhiều lợi ích cho người nuôi

như: Sẽ giảm được vất vã, tăng lợi nhuận và ý thức hơn về việc bảo vê môi trườngxung quanh; đối với vật nuôi thì mang lại sự khỏe mạnh, sức đề kháng tốt hơn với

bệnh tật, tốc độ tăng trưởng nhanh hơn,…và cải thiện được môi trường nuôi Tuy

nhiên, người nuôi cần chú ý đến những thông tin về sản phẩm có thể hỏi ý kiến của

các chuyên gia, tránh lạm dụng quá mức hay sử dụng các chế phẩm vi sinh khôngphù tại Việt Nam

2.5 Ứng dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản

2.5.1 Định nghĩa probiotic

Đã có khá nhiều định nghĩa cho thuật từ này của các tác giả khác nhau như:

Probiotic là những vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm men mà có thể thêm vào thựcphẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đường ruột của sinh vật chủ (Parker,1974)

Van De Kerkove (1979) Barows và Deam (1985), Lestradet (1995) cũng chorằng probiotic được sử dụng như một liệu pháp trong việc chũa tri bệnh tiêu chảy hay

như là cách phòng bệnh ở người và động vật để giảm đến mức tối thiểu sự phát triển

tán của vi sinh vật đường ruột, sự kháng lại liệu pháp sinh học và sự di căn củachứng viêm dạ dày và ruột

Havenaar (1992) đã mở rộng định nghĩa về probiotic : “ Probiotic được định

nghĩa như là các chủng riêng lẻ hay hổn hợp các vi sinh vật sống có ảnh hưởng có lợicho sinh vật chủ bằng cách cải thiện những đặc tính của vi sinh vật bản địa”

Riêng đối với động vật thủy sản vốn có mối quan hệ gần gủi với môi trường

xung quanh Mầm bệnh nguy hiểm có thể tồn tại tự do trong môi trường nước và

tăng trưởng độc lập với vật chủ (Hansen và Olafsen;Verschuere et al., 2000) đượcđộng vật thủy sản ăn vào liên tục thông qua quá trình điều tiết thẩm thấu và bắt mồi

Dựa trên mối quan hệ phức tạp mà một loại vi sinh vật nước có với môi trường xung

quanh, định nghĩa probiotic trong nuôi trồng thủy sản cũng cần thay đổi Verschuere

và ctv (2000) đưa ra định nghĩa mới nhất “ Probiotic là chất bổ trợ vi khuẩn của môitrường xung quanh hoặc hệ vi khuẩn có liên quan đến vật chủ, đảm bảo việc cải thiện

chất lượng thức ăn hoặc làm tẳng giá trị dinh dưởng của nó, nâng cao đáp ứng củavật chủ đối với mầm bệnh hoặc cải thiện chất lượng nước”

Có nhiều cơ chế phức tạp tồn tại bên trong probiotic bao gồm : khả năng bámdính trên biểu mô ruột, sản xuất hợp chất ức chế, cạnh trnh hợp chất hoặc năng lượng

có sẵn, cạnh tranh vị trí bám, tăng cường đáp ứng miễn dịch, cải thiện chất lượng

nước, tương tác với tảo, nguồn dinh dưỡng đa_ vi lượng và đóng góp hệ enzyme cho

quá trình tiêu hóa (Ohene et al., 2007)

2.5.2 Các thành phần của probiotic

Các chủng loại vi sinh vật sử dụng trong probiotcs được xác định có sự hiệndiện của cả vi khuẩn gram âm, vi khuẩn gram dương, bacteriophages, nấm men và cảnấm đơn bào (Irianto va Austin, 2002)

a Vi khuẩn gram âm

Pseudomonas fluorescens được chứng minh là có khả năng ức chế Saprolenia

và A salmocinida trên các loài cá có vây và ngăn chặn các mầm bệnh trên tôm từ Vibrio spp, đồng thời có tác dụng làm giảm tỷ lệ chết trên cá hồi (Irianto và Austin,

2002)

Một vi khuẩn gram âm khác cũng có tác dụng cải thiện chất lượng của ấu

trùng cua, hàu và cá bơn, đó là V proteolyticus Chủng này cải thiện quá trình tiêu

hóa protein ở cá bơn khi được cung cấp qua con đường cho ăn, Alteromonas làm

tăng tỷ lệ sống của ấu trùng pacific oyster (Irianto và Austin, 2002)

b Vi khuẩn gram dương

Cá vi sinh vật gram dương, hiếu khí và sinh bào tử như chủng Bacillus spp

được sử dụng như probiotics nhằm mục đích nâng cao chất lượng nước ao nuôi do ức

chế hệ vi sinh vật gây hại trong nước và làm giảm số lượng mầm bệnh Một lợi íchtrực tiếp trong việc sử dụng trực khuẩn này là làm giảm việc sử dụng kháng sinh, hóachất trong việc nuôi trồng thủy sản (Irianto và Austin, 2002)

Ngoài các chủng Bacillus, vi khuẩn lactic trong các chế phẩm probiotics được

ứng dụng khá nhiều trong nuôi trồng thủy sản như sử dụng chế phẩm chứa

Lactobacillus bulgaricus, L acidophillus, L sporogenes, L casei, L plantarum, Streptococcus thermophillus (Venkat et al., 2004) Lợi ích của việc sử dụng vi khuẩn

lactic trong chế phẩm probiotics là làm giảm tỷ lệ chết cảu ấu trùng cá (Irianto và

Austin, 2002) đồng thời tăng hiệu quả hấp thu thức ăn (Venkat et al., 2004).

c Bacteriophages

Hiện nay có rất nhiều tranh cãi về vai trò của bacteriophages trong chế phẩmprobiotics Tuy nhiên, trong một số nghiên cứu, các nhà khoa học đã nuôi cấy được

bacteriophages từ cá thơm, Plecoglssus altivelis và thông qua con đường cho ăn,

người ta đã nhận thấy rằng bacteriophages chống lại sự nhiễm P plecoglossicida trên

cá thơm và từ đó họ đi đến kết luận rằng bacteriophages làm giảm nhanh chống số

lượng tế bào vi khuẩn P plecoglossicida trong thận của ca thơm và trong môi trường

nước (Irianto và Austin, 2002)

d Nấm men

Nấm men được ứng dụng trong probiotic phổ biến nhất là chủng

Saccharomyces cerevisiae Với sự hiện diện của nấm men, nó sẽ bám dính vào ruột,

làm nâng cao sự tiết enzyme amylase và kích thích các enzyme màng ở ấu trùng sau

27 ngày tuổi (Irianto và Austin, 2002)

e Vi tảo

Vi tảo Tetraselmis suecica, được sử dụng làm thức ăn cho các loài tôm thuộc

họ tôm he và các loài cá thuộc họ cá hồi đã phát hiện ra rằng loài nấm này làm giảmmật độ bệnh do vi khuẩn Trên cơ sở đó, một số tác giả cũng đã đưa ra phương thứchoạt động của vi nấm này chống lại các tác nhân gây bệnh dựa vào sự hiện diện củacác hợp chất kháng khuẩn không chuyên biệt trên tế bào vi tảo (Irianto và Austin,2002)

2.5.3 Cơ chế tác động của pobiotic

a Tạo các hợp chất có khả năng ức chế

Những loài vi khuẩn khác nhau có thể giải phóng ra một số hợp chất hóa học

có khả năng tiêu diệt hoặc kiềm hãm các cộng đồng vi khuẩn khác để đấu tranhgiành lấy năng lượng hay các chất hóa học (Fredrickson và Stephanopoulos,

1981).Có rất nhiều nghiên cứu in vitro đã chứng minh khả năng ức chế vi khuẩn gây

bệnh của một số chủng vi khuẩn được chọn lựa bổ sung vào môi trường ương nuôi

ấu trùng Nhưng cần phải nhấn mạnh những hợp chất ức chế hay đối kháng với các

vi khuẩn khác trong các nghiên cứu in vitro không đảm bảo rằng những chủng probiotic có tiềm năng này vẫn còn có hiệu quả trong các nghiên cứu in vivo trong

cùng một điều kiện ứng dụng (Gram et al., 2001) Vì vậy, chỉ có một số nghiên cứu,hầu hết là trên ấu trùng của giáp xác và nhuyễn thể đã công nhận hiệu quả ức chế vikhuẩn gây bệnh của một số chủng vi khuẩn probiotic khi ứng dụng trong thựcnghiệm

Maeda và Liao (1992) đã thử nghiệm hiệu quả một số chủng vi khuẩn được

tách chiết từ môi trường nuôi tôm sú lên sự phát triểu của ấu trùng tôm Trong số bảychủng được thử nghiệm, chủng PM-4, được bổ sung cùng với tảo khuê đã cho tỉ lệsống và tỉ lệ lột xác của ấu trùng cao so với những lô thí nghiệm khác chỉ được bổsung tảo khuê Trong một thí nghiệm kiểm soát sinh học, Maeda (1994) sau đó đã

chứng minh rằng chủng PM-4 có khả năng kiềm chế sự phát triển của Vibrio spp.

bằng cách tạo ra các hợp chất có đặc tính kháng khuẩn Riquelme et al (1997) cũng

đã lựa chọn các chủng vi khuẩn có lợi xuất hiện ở điều kiện tự nhiên có khả năng làm

tăng tỉ lệ tăng trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng điệp Chi Lê Argopecten purpuratus.

Mười một trong số 506 chủng vi khuẩn đã sản xuất ra hợp chất có khả năng ức chế

Vibrio anguillarum có liên quan đến mầm bệnh của ấu trùng (VAR: Vibrio anguillarum-related) Một trong số những chủng này (thuộc nhóm Vibrio sp.) có thể

bảo vệ ấu trùng của con điệp Chi Lê chống lại mầm bệnh từ VAR trong một sự gây

nhiễm sau đó Tương tự, chủng Roseobacter sp (BS107) cũng tiết ra hợp chất kháng khuẩn chống lại Vibrio anguillarum Hoạt tính kháng khuẩn hoạt động cao nhất sau khi nuôi cấy chủng V.anguillarum 48 giờ trong dịch nổi của BS107 Trong thực

nghiệm, dịch nổi không tế bào của chủng BS107 thúc đẩy một cách đặc hiệu tỉ lệ

sống của ấu trùng điệp Chi Lê (Ruiz-Ponte et al,1999) Chủng Aeromonas media

A199 đã bảo vệ ấu trùng con hầu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas) khi chúng được cảm nhiễm với Vibrio tubiashii Hơn nữa, A199 còn thể hiện hoạt tính đối

kháng chống lại một dãy rộng các vi khuẩn gây bệnh trên cá, nhóm giáp xác và

nhuyễn thể trong nghiên cứu in vitro (Gibson et al., 1998) Sau đó, trong một nghiên cứu in vitro, Lategan et al (2006) đã tìm thấy sự sản xuất ra một hợp chất ngoại bào

có khả năng ức chế có đặc tính hoạt động như chất được tiết ra từ chủng A199 Hợpchất ức chế này được xác định là indole 2,3-benzopyrrole, hợp chất này có hoạt tính

kháng khuẩn kháng nấm rộng Lactobacillus brevis (108 CFU/ml) được sử dụng để

kiểm soát sự phát triển của Vibrio alginolyticus trong môi trường nuôi Artemia Trong một nghiên cứu in vitro khác, các sản phẩm ngoại bào được tiết ra từ L.breví cũng có thể ức chết sự phát triển của V.alginolyticus (Villamil et al., 2003).

Trong tất cả các nghiên cứu trên, hiệu quả của probiotic được đo bằng sự cảithiện tỉ lệ tăng trưởng và tỉ lệ sống của ấu trùng thông qua các khảo sát trong phòngthí nghiệm Tuy nhiên, không có một nghiên cứu nào tập trung vào việc xác định

nồng độ các hợp chất kháng khuẩn trong các nghiên cứu in vivo nhằm thiết lập mối

quan hệ nồng độ phản ứng Một số nghiên cứu có kiểm soát với các chủng probiotic

đột biến bị làm mất khả năng sản xuất ra các hợp chất có khả năng ức chế nên được

thực hiện nhằm giải thích cơ chế tác động in vivo.

b Đấu tranh giành lấy các chất hóa học và năng lượng có sẵn

Đấu tranh giành lấy các chất dinh dưỡng hay năng lượng có sẵn có thể đóng

một vai trò quan trọng trong việc hình thành hệ vi sinh vật đường ruột hay trong môi

trường nuôi thủy sản Đã có ba nghiên cứu thực nghiệm về lĩnh vực này được ghi

nhận, các nghiên cứu này được thực hiện trong các hệ thống nuôi thức ăn tự nhiênnghèo chất hữu cơ và trong ương cá bơn bột Rico-Mora et al (1998) đã chọn mộtchủng vi khuẩn (SK-05) có khả năng phát triển trên cơ chất nghèo hữu cơ, và khi cấy

vào dung dịch nuôi tảo khuê (Skeletonema costatum) chúng có thể ngăn cản sự phát triển của Vibrio alginolyticus khi vi khuẩn này được cấy vào Hiệu quả ức chế V.alginolyticus của SK-05 đã được chứng minh trong điều kiện in vitro, các tác giả

đã công bố rằng chủng này có thể lấn át hoàn toàn V.alginolyticus bởi khả năng cạnh

tranh hấp thu các chất tiết của tảo khuê với vi khuẩn Verschuere và cộng sự (1999)

đã chọn chín chủng vi khuẩn có khả năng ảnh hưởng lên tỉ lệ sống và tỉ lệ sinh

trưởng của Artemia nauppli Khi bổ sung các chủng vi khuẩn này vào môi trường

nuôi cấy Artemia đã giúp cho Artemia có thể chống lại sự tấn công của vi khuẩn gây bệnh Vibrio proteolyticus CW8T2 (Verschuere et al, 2000a) Dựa vào việc không tìm

thấy hợp chất ngoại bào nào có liên quan trong các kết quả nghiên cứu dịch nổi củanhững chủng vi khuẩn được chọn này, các nhà nghiên cứu đã mặc nhiên công nhậnhiệu quả bảo vệ của chủng vi khuẩn được chọn là do sự tranh giành các hợp chất hóahọc hoặc năng lượng có sẵn mà không phải là do việc sản xuất ra các hợp chất ứcchế Tuy nhiên, các tác giả lại không đề cập đến những thí nghiệm sử dụng vi khuẩn

đã chết để xác định có phải ảnh hưởng của dinh dưỡng có liên quan đến khả năng

bảo vệ này hay không Siderophore là những tác nhân với trọng lượng phân tử nhỏ

có khả năng gắn kết phân tử sắt có thể hòa tan được sắt bị kết tủa hoặc tách nó rakhỏi hỗn hợp chất này, do đó có lợi cho sự phát triển của vi khuẩn (Neilands, 1981).Các chủng vi khuẩn không gây hại có khả năng sản xuất ra siderophore có thể được

sử dụng như probiotic để cạnh tranh với các vi khuẩn gây bệnh khi tính sinh bệnh có

liên quan đến việc sản xuất siderophore và đấu tranh giành lấy các phân tử sắt trongmôi trường thiếu sắt trong giai đoạn cần thiết (Verschuere et al., 2000b) Chủng

vibrio E có thể cải thiện khả năng đề kháng đối với vi khuẩn gây bệnh vibrio P,

Vibrio splendidus của cá bơn bột Sự mô tả in vitro cho thấy rằng, vibrio E có thể

phát triển trong môi trường đã bị tách hết sắt trong khi vẫn sản xuất ra siderophorebởi phương pháp nhuộm chrome azurol S trong khi vibrio P thì không Hơn nữa, cá

bơn bột được cho ăn rotifer được làm giàu chất siderophore deferoxamine của vibrio

E đã đạt được tỉ lệ sống cao hơn sau khi gây nhiễm với vibrio P, so với lô đối chứng

(Gatesoupe, 1997) Từ những kết quả có liên quan trong các thí nghiệm in vitro và in vivo, các nhà khoa học đã kết luận rằng hiệu quả probiotic của vibrio E có thể một

phần là do sự đấu tranh giành lấy phân tử sắt với tác nhân gây bệnh

c Sự đóng góp về mặt dinh dưỡng

Một số tài liệu đã chứng minh rằng đối với một số loài động vật thì hệ thống

vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quan trọng trong dinh dưỡng của vật chủ Vìvậy, nhiều cách khác nhau trong việc thay đổi hệ thống vi khuẩn đường ruột để đạt

được những hiệu quả có lợi như tăng sự tăng trưởng và khả năng tiêu hóa của vật

chủ, đã được khảo sát trên gia súc và trên người (Burr et al, 2005) Một vài nghiêncứu đã chứng minh ảnh hưởng về mặt dinh dưỡng của vi khuẩn probiotic lên sự pháttriển và tỉ lệ sống của ca, nhóm giáp xác và nhuyễn thể Ấu trùng của con hầu vô

trùng (Crassostrea gigas) được cho ăn tảo giáp vô trùng (Isochrysis galbana) có bổ

sung thêm dòng vi khuẩn CA2, đã làm tăng tỉ lệ sống (từ 21% đến 22%) và tốc độ

tăng trưởng (từ 16% đến 21%) so với lô đối chứng (Douillet và Langdon, 1993)

Việc sử dụng thực phẩm vô trùng cho ấu trùng hào vô trùng có thể ngăn chặn sự xâmnhập của các vi khuẩn đường ruột khác, do đó những hiệu quả được ghi nhận có thểqui cho chủng CA2 Tuy nhiên, tác giả không kiểm tra trường hợp cho ấu trùng hàu

ăn tảo được bổ sung vi khuẩn chết để có thể khẳng định hiệu quả cải thiện tốc độtăng trưởng và tỉ lệ sống là do probiotic hay do dinh dưỡng

Nấm men được biết đến trong dinh dưỡng động vật bởi vì chúng đóng vai trò

như một nguồn sản xuất polyamin, có thể nâng cao khả năng hoạt động của hệ thống

ruột trưởng thành (Peulen et al., 2000) Gần đây, một số chủng nấm men rất có hiệuquả khi bổ sung vào khẩu phần ăn của cá đang biến thái Tovar-Ramirez et al (2002,

2004) đã nghiên cứu về enzym đường ruột được tiết ra từ cá vượt chẽm bột châu Âu

(Dicentrarchus labrax) khi cho ăn khẩu phần gồm hỗn hợp nhiều dòng nấm men khác nhau của Saccharomyces cerevisiae và Debaryomyces hansenii Sự tăng trưởng

và tỉ lệ sống của ấu trùng ăn khẩu phần ăn hỗn hợp này cao hơn so với lô đối chứng.Các tác giả này còn cho là hiệu quả phụ thuộc vào liều lượng của nấm men đối vớihành vi ấu trùng, có thể được giải thích là do số lượng polyamine được tiết ra bởinấm men trong khoang ruột của ấu trùng Tuy nhiên, họ không chứng minh đượchiệu quả probiotic của nấm men là do sự kích thích của enzym tiêu hóa của vật chủhay hiệu quả kích thích miễn dịch Tương tự, Wache et al (2006) đã kiểm tra hiệu

quả của hai chủng nấm men S.cerevisiae và một chủng D.hansenii như là nguồn thực phẩm bổ sung cho cá bột hồi cầu vòng (Onchorynchus mykiss) Các chủng S.cerevisiae var.boulardii và D.hansenii dường như kích thích sự trưởng thành của

hệ thống tiêu hóa của cá bột hồi cầu vòng thông qua việc gia tăng hàm lượng enzym

tiêu hóa theo một cơ chế mà đến nay vẫn chưa được biết đến Ấu trùng của Artemia

vô trùng được nuôi trong dung dịch có chứa mười chủng vi khuẩn (chết hoặc sống)

kết hợp với bốn loại thức ăn tự nhiên vô trùng khác nhau (hai dòng nấm men bánh

mì S.cerevisiae và hai dòng vi tảo Dunaliella tertiolecta), khác nhau về giá trị dinh

dưỡng của chúng (Marques et al, 2005) Khi kết hợp loại thức ăn tự nhiên có chấtlượng trung bình hay kém (như nấm men ) và vi khuẩn đã chết, chỉ có 5.9% tổng

khối lượng sinh khối được sử dụng gây ảnh hưởng mạnh mẽ lên tỉ lệ sống của

Artemia Những ảnh hưởng này bị giảm thậm chí mất đi khi nguồn thức ăn có chất

lượng cao được sử dụng, có thể là nhờ việc cải thiện tình trạng dinh dưỡng và sức

khỏe nói chung của Artermia Thêm vào đó, một vài nghiên cứu trên vi khuẩn probiotic (ví dụ như GR8, dòng vi khuẩn Cytophaga sp.) được bổ sung vào khi còn sống đã cải thiện một cách hiệu quả sự phát triển của Artermia, cao hơn nhiều so với

bổ sung khi chết, không phụ thuộc vào loại thức ăn chính Điều này cho thấy sự

tương tác dương tính giữa vật chủ và vi sinh vật không liên quan đến giá trị dinh

dưỡng của vi khuẩn hay của các loài ăn lọc như Artemia Những thí nghiệm đã được

miêu tả, đặc biệt là với các động vật vô trùng, cho thấy rằng sự chăm sóc tốt nhất cầnphải được thực hiện trong điều kiện thí nghiệm được bố trí để có thể làm phân biệthiệu quả dinh dưỡng thuần túy của sinh khối vi khuẩn khi được bổ sung so với mối

tương tác dương tính giữa vật chủ và vi sinh vật

β-(Marques et al, 2006a,c) Hai dòng nấm men thuần chủng đột biến đẳng gen, mnn9,

được dùng làm thức ăn cho Artemia vô trùng.

Dòng mnn9 mang thể đột biến vô hại đã làm giảm nồng độ mannoprotein gắn

trên màng tế bào và làm nâng cao nồng độ của chitin và glucan (Magnelli et al.,

2002) Dòng nấm men này có thể giúp Artemia chống lại dòng vi khuẩn cơ hội (Vibrio proteolyticus) và dòng vi khuẩn gây bệnh bắt buộc (V campbellii) Các nhà

khoa học này cho rằng sự thay đổi thành phần màng tế bào (mật độ β-glucan cao) đã

giúp Artemia chống lại cả hai chủng Vibrio chứ không phải nhờ giá trị dinh dưỡng tốt hơn của dòng mnn9 Các nghiên cứu theo hướng này có thể bổ sung dữ liệu về

miễn dịch để bắt đầu làm rõ các cơ chế có liên quan

e Cải thiện chất lượng nước ao nuôi

Các chế phẩm probiotic cũng có tác dụng cải thiện môi trường nước ao nuôitrồng thủy sản (Verchuere et al., 2000) Trong nhiều nghiên cứu, chất lượng môi

trường nước ao nuôi được cải thiện khi bổ sung probiotic, đặc biệt là khi bổ sung chế

phẩm có chứa các chủng Bacillus sp vì Bacillus là vi khuẩn gram dương rất hiệu quả

trong việc biến đổi các chất hữu cơ thành CO2 so với vi khuẩn gram âm (Verchuere

et al., 2000) Hơn nữa, các chế phẩm probiotic cũng có khả năng tạo nên sự cânbằng giữa NH3/NO2/NO3 trong nước với sự hiện diện của các vi khuẩn nitrate hóa

như Nitrosomonas sp và Nitrobacter sp Trong điều kiện môi trường nước ao nuôi

có nồng độ NH3 cao, Nitrosomonas sp sẽ chuyển đổi NH3 thành NO2 , sau đó

Nitrobacter sp sẽ chuyển đổi NO2 thành NO3 , là hợp chất không gây độc cho vật

nuôi (Sahu et al., 2008) Các chủng vi khuẩn nitrate hóa sẽ tiết ra polymer cho phép

chúng gắn kết trên bề mặt và hình thành nên biofilm Và chính biofilm này đã làm

giảm đến 50% tỷ lệ ammonia và nitrite trong môi trường ao nuôi (Sahu et a.l, 2008).

Ngoài các vi khuẩn nitrate hóa, các chủng vi khuẩn phân hủy sulfur, methane cũng

xó tác dụng cải thiện môi trường nước ao nuôi trồng thủy sản (Sahu et al., 2008).

f Can thiệp vào hệ thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh

Trong thập kỷ gần đây, cụm từ “quorum sensing”được nhắc đến như một quátrình thông tin giữa tế bào với tế bào vi khuẩn Các phân tử dấu hiệu quorum sensing

như AHL (N-acyl homoserin lactone) có liên quan đến quá trình điều hòa các nhân tốgây độc ở nhiều vi khuẩn gây bệnh Sự phá vỡ hệ thống quorum sensing được xem là

một liệu pháp chống lại sự xâm nhiễm mới trong nuôi trồng thủy sản Furanone bị

halogen hóa được tạo ra bởi tảo biển đỏ Delisea pulchra được xem là một chất ức

chế quorum sensing đầy hứa hẹn Khi bổ sung hợp chất này với nồng độ đầy đủ bảo

vệ Branchionus, Artemia không bị ảnh hưởng bởi Vibrio (Tinh et al, 2007).

2.6 Bẻ gãy quá trình quorum sensing – cách tiếp cận mới trong việc kiểm sóat hệ vi sinh trong nuôi trồng thủy sản

2.6.1 Định nghĩa quá trình quorum sensing

Vi khuẩn có thể giao tiếp với nhau sử dụng các phân tử tín hiệu hóa học.Chúng tiết ra, tiếp nhận và phản ứng đối với sự tích lũy của những phân tử tín hiệunày Việc phát hiện các phân tử tín hiệu trong môi trường cho phép vi khuẩn phânbiệt giữa các quần thể vi khuẩn mật độ thấp và mật độ cao, và kiểm sóat việc biểu thị

gen đối với sự thay đổi về mật độ tế bào Quá trình này gọi là “quorum sensing”, cho

phép một quần thể vi khuẩn kiểm sóat có phối hợp sự biểu thị gen của cả quần xã.Nhiều kiểu hình ở vi khuẩn được điều khiển bởi quorum sensing, bao gồm sự cộng

sinh, độc lực, sự sản xuất kháng sinh, sự tạo thành màng sinh học v.v… (Schauder &

Gram dương, quá trình quorum sensing được điều khiển bởi các phân tử oligopeptide

có chiều dài 5 đến 17 amino acid (Meritt et al., 2003)

Phân tử AHL đựợc chứng minh có liên quan đến các quá trình quorumsensing ở các vi khuẩn gây bệnh Gram âm ở người và thực vật, ví dụ như

Pseudomonas aeruginosa (Rumbaugh et al., 2000), Erwinia carotovora, Agrobacterium tumefaciens (Whitehead et al., 2001), cũng như ở Vibrio harveyi

(Manefield et al., 2000) và những vi khuẩn gây bệnh khác trên cá (Bruhn et al.,2005)

2.6.2 Sự phân hủy sinh học quá trình quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh

Khả năng phân hủy phân tử AHL dường như phân bố rộng rãi trong vương quốc vikhuẩn Những enzyme có thể ức chế phân tử AHL đã được khám phá ở các lòai vikhuẩn thuộc nhóm ß-Proteobacteria (Zhang et al., 2002), α-Proteobacteria (Uroz et

al., 2003) và γ-Proteobacteria (Uroz et al., 2003) cũng như ở một số lòai thuộc nhóm

vi khuẩn Gram dương (Dong et al., 2002) Những lòai vi khuẩn này có thể khóa hệthống quorum sensing của những lòai vi khuẩn cạnh tranh để đạt được ưu thế chọnlọc Ví dụ như, đó là trường hợp của những vi khuẩn sinh sống ở gần các vi khuẩn

điều khiển quá trình tiết ra chất kháng sinh thông qua quorum sensing (Pierson et al.,

1998) Quá trình ức chế thật sự các hợp chất tín hiệu có thể được xúc tác bởi hai lọaienzyme: AHL lactonase và AHL acylase Bên cạnh đó, enzyme acylase của các sinhvật bậc cao cũng có thể ức chế các phân tử AHL (Xu et al., 2003)(Xu et al., 2003)

a Enzyme AHL lactonase

Dong và cộng sự (2000) sàng lọc hơn 500 chủng vi khuẩn thu từ thực địa vàphòng thí nghiệm về họat tính ức chế phân tử AHL Trong số này, 24 chủng cho cáchọat độ enzyme khác nhau trong việc lọai bỏ phân tử AHL Enzyme chịu tráchnhiệm cho việc ức chế AHL (AiiA) được phân lập từ chủng vi khuẩn có họat tính cao

nhất, chủng Bacillus 240B1 Enzyme ở dạng tinh khiết ở nồng độ 50 mg/l, làm giảm

nồng độ của N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone từ 20 µM xuống khỏang 5

µM sau 10 phút Khi chạy quang phổ ion hóa phun điện tử của sản phẩm thủy phâncho thấy enzyme AiiA làm mở vòng lactone để tạo thành N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine (Dong et al., 2001) Những nghiên cứu tiếp theo cho thấy các gen mã

hóa enzyme lactonase phân bố rộng rãi ở nhiều lòai Bacillus (Dong et al., 2004).

Những enzyme đồng dạng này cho thấy 90% tương đồng về trình tự ở mức độ acidamin

Bằng chứng đầu tiên cho thấy sự ức chế bằng enzyme đối với phân tử AHL cóthể được sử dụng như một biện pháp kiểm sóat sinh học được báo cáo trong nghiêncứu của Dong và cộng sự (2000) Trong nghiên cứu này, sự thể hiện của enzyme

AiiA ở vi khuẩn Erwinia carotovora làm giảm việc tiết ra enzyme phân hủy thành tế

bào bởi vi khuẩn gây bệnh xuống chỉ còn 10% và hầu như ức chế được các triệuchứng bệnh thối củ ở những thực vật mẫn cảm Trong một nghiên cứu in vivo tiếptheo, Molina và cộng sự (2003) thử nghiệm hiệu quả của việc sử dụng một chủng

Bacillus phân hủy AHL trong việc kiểm sóat sinh học đối với bệnh ở thực vật Chủng

Bacillus này có thể làm giảm bệnh thối củ gây ra bởi E carotovora xuống còn 15%

và bệnh mụn cây ở cà chua gây ra bởi Agrobacterium tumefaciens xuống còn 10% Việc phân hủy phân tử AHL bởi chủng Bacillus mang lại một sự bảo vệ hiệu quả

tương đương hoặc tốt hơn so với việc sản xuất kháng sinh bởi một chủng kiểm sóat

sinh học Pseudomonas chlororaphis Hơn nữa, việc phân hủy các phân tử AHL

không chỉ có tác dụng phòng bệnh mà còn có tác dụng trị bệnh Gần đây, những kết

quả tương tự đã đạt được với chủng Bacillus thuringiensis (Dong et al., 2004).

b Enzyme AHL acylase

Cùng một thời điểm khi Dong và cộng sự (2000) phát hiện chủng Bacillus có

khả năng phân hủy AHL, Leadbetter và Greenberg (2000) phân lập được một chủng

vi khuẩn có thể sử dụng phân tử AHL như là nguồn cacbon và nitơ Chủng vi khuẩn

này có tên là V paradoxus VAI-C, được nuôi cấy làm giàu trong một môi trường có

chứa 500 mg/l N-(3-oxohexanoyl)-L-homoserine lactone như là nguồn cacbon và

nitơ duy nhất Trong các thí nghiệm sử dụng AHL được dán nhãn phóng xạ, các nhà

nghiên cứu đã suy ra rằng V paradoxus cắt đứt phân tử AHL bằng một enzyme AHL

acylase, giải phóng ra homoserine lactone và một acid béo Sau đó, acid béo được sửdụng như nguồn cacbon thông qua đường dẫn ß-oxidation Cần có thêm nhiều nghiêncứu trong tương lai để làm sáng tỏ bằng cách nào vi khuẩn đã lấy được nitrogen từhomoserine lactone Gần đây, Flagan et al (2003) phân lập một chủng vi khuẩn

Arthrobacter sp VAI-A, có khả năng phân hủy và sử dụng các sản phẩm phân hủy

chứa nitrogen của phân tử tín hiệu AHL Điều đáng quan tâm, là tốc độ tăng trưởng

phụ thuộc nồng độ AHL và năng suất của hỗn hợp hai chủng Arthrobacter sp và V paradoxus VAI-C thì cao hơn so với các chủng này nuôi riêng lẻ Điều này cho thấy

rằng một cộng đồng nhiều lòai vi khuẩn có thể có một ảnh hưởng hiệp trợ trong quátrình chuyển đổi và khóang hóa tín hiệu quorum sensing

Gần đây, Lin và cộng sự (2003) phân lập một chủng vi khuẩn ức chế AHL,

Ralstonia sp XJI2B từ một màng sinh học đa lòai Enzyme chịu trách nhiệm trong

việc ức chế AHL (AiiD) được tinh chế và sau đó được ủ với phân tử oxohexanoyl)-L-homoserine lactone Việc chạy quang phổ ion hóa phun điện tử đối

N-(3-với sản phẩm thủy phân cho thấy rằng enzyme AiiD thủy phân liên kết amid của

phân tử AHL Sự thể hiện của enzyme AiiD ở vi khuẩn P aeruginosa tái tổ hợp

PAO1 ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh và làm giảm tỉ lệ chết của giun

tròn Caenorhabditis elegans xuống còn 15%, so với chủng vi khuẩn không tái tổ

hợp

2.6.3 Những triển vọng của việc bẻ gãy quá trình quorum sensing

Những kết quả đạt được bằng cách sử dụng những kỹ thuật bẻ gãy hệ thốngquorum sensing của vi khuẩn gây bệnh cho thấy rằng đây là một biện pháp đầy hứahẹn thay thế cho việc sử dụng kháng sinh trong việc chống lại sự nhiễm khuẩn Cáchtiếp cận mới này cũng có thể có giá trị trong nuôi trồng thủy sản, khi mà mối liên hệgiữa quorum sensing và sự thể hiện yếu tố độc lực ở một số vi khuẩn gây bệnh ở

động vật thủy sản đã được chứng minh Tuy nhiên, vẫn còn thiếu những số liệu vềảnh hưởng của quorum sensing đến độc lực của các vi khuẩn gây bệnh trong thủy

sản Nghiên cứu cơ bản trong lĩnh vực quorum sensing chắc chắn sẽ cung cấp những

sự hiểu biết chính xác hơn về cơ chế mà sự biểu hiện của các gen điều khiển bởiquorum sensing được kích họat hay bị ức chế Cho đến hiện nay, đa số các nghiêncứu đã được tiến hành đối với hệ thống quorum sensing do AHL làm trung gian củacác vi khuẩn gây bệnh gram âm trên người và thực vật Tuy vậy, có thể mong đợinhững kỹ thuật bẻ gãy hệ thống quorum sensing của những vi khuẩn gây bệnh khác

sẽ được phát triển trong tương lai

CHƯƠNG 3.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu

- Thời gian thực hiện : 05/04/2010 – 28/06/2010

- Địa điểm thu mẫu : Các ao nuôi cá tra giống và thương phẩm thuộc tỉnh Tiền

Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Sinh Học Thực Nghiệm – Viện Nghiên Cứu

Nuôi Trồng Thủy Sản II

3.2 Vật Liệu Nghiên Cứu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các quần thể vi sinh vật thu nhập được từ hệ vi sinh vật trong hệ tiêu hóa của cá trakhỏe mạnh, hệ sinh vật trong môi trường nước và bùn trong ao nuôi cá Tra từ các

vùng nuôi: Đồng Tháp, Vĩnh Long, Tiền Giang Hệ vi sinh vật giàu vi khuẩn lactic

acid của thực phẩm lên men truyền thống và sữa Tổng cộng có 50 mẫu nguyên liệu,sau quá trình sàng lọc qua môi trường chuyên biệt cho vi khuẩn lactic, kết quả thu

được 64 khuẩn lạc

Bảng 3.2.1.1 Danh sách mẫu dùng phân lập vi khuẩn lactic

STT

D Thực phẩm lên men truyền thống và sữa tươi (14 khuẩn lạc)

N.TD: nước ao cá thịt đồng thápN.G.TG: nước ao cá giống tiền giang

YA: yourgut, DC: dưa cải, RG: rau giáCF: cà pháo

KC: kim chi

Bảng 3.2.1.2 Danh sách các chủng vi khuẩn mua từ ngân hàng vi sinh vật (Trường

Đại Học Quốc Gia Hà Nội, Viện Vi Sinh và Công Nghệ Sinh Học)

STT

Tên loài Môi trường nuôi Ký hiệu chủng

6 Saccharomyces cerevisiae TSA or TSB +

glucose

VTCC-Y-0011

b Hỗn hợp 2 loại phân tử quorum sensing (AHL) (phân tử tín hiệu quorum

sensing ở vi khuẩn Gram âm)

+ N-butyryl homoserine lactone;

+ N-hexanoyl homoserine lactone

c Vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ trên các cá tra do vi khuẩn Edwardsiella

- Cân điện tử SHIMADZU AY220

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA®RH basic KT/C

- Tủ lạnh sâu -80oC

- Tủ lạnh thường

- Nồi hấp vô trùng (HIRAYAMA).

- Máy cất nước hai lần (Hammilton)

- MRSA: Lactobacillus MRS Agar made in India

- MRS: Lactobacillus MRS Broth made in India

- BHIA: Brain Heart Infusion Agar

- BHI: Brain Heart Infusion BrothBảng 3.2.2.1 Thành phần môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar)

Bảng 3.2.2.2 Thành phần môi trường BHI (Brain Heart Infusion Broth)

Bảng 3.2.2.4 Thành phần môi trường MRS (Brain Heart Infusion Broth)

- Pha môi trường BHIA (0.52g/ml)

- Chuẩn bị đĩa petri

- Hấp tiệt trùng dụng cụ chứa môi trường và đĩa petri ở 121oC trong 20 phút

- Lau cồn quanh mặt trong của tủ cấy vô trùng

- Thắp đèn cồn để tránh nhiễm vi khuẩn vào đĩa môi trường

- Đợi khi nhiệt độ bình môi trường nguội đến 60oC rồi cho vào tủ cấy vô trùngcùng với đĩa petri để chuẩn bị đổ đĩa Không đổ đĩa khi môi trường nóng hơn

60oC để tránh hơi nước đọng trên nắp đĩa và mặt thạch

- Sát trùng tay bằng cồn trước khi đổ đĩa

- Quay tròn bình để trộn đều môi trường, tránh lắc mạnh sinh bọt khí

- Thao tác đổ môi trường ra đĩa:

Hình 3.2.3.1 Cách đổ đĩa thạch

- Đổ khoảng 20ml môi trường vào đĩa thạch

- Nếu thấy có bọt khí trên mặt thạch thì dùng que cấy nung đỏ trên ngọn lử

đèn cồn châm vỡ bọt khí Thao tác này cần thực hiện khi thạch còn nóng, chưa đông

- Để yên cho thạch đông, tránh làm rung đĩa petri để bề mặt thạch được phẳng,

đồng đều

- Để cho đĩa thạch đông chắc trong đĩa và nguội đến nhiệt độ phòng

- Gói giấy báo, ghi tên môi trường và ngày đổ đĩa bên ngoài rồi cho vào tủlạnh hoặc có thể dùng ngay để cấy vi khuẩn