NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA TIỀN XỬ LÝ LẠNH VÀ MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS TRÊN BAO PHẤN

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA TIỀN XỬ LÝ LẠNH VÀ MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS TRÊN BAO PHẤN HOA MƯỚP ĐẮNG MOMORDICA CHARANTIA L.. Mục đích của bài báo là nghiên cứu sự ảnh hưởng c

Trang 1

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA TIỀN XỬ LÝ LẠNH VÀ MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS TRÊN BAO

PHẤN

HOA MƯỚP ĐẮNG (MOMORDICA CHARANTIA L.)

RESEARCH ON THE IMPACTS OF REFRIGERATION AND ENVIRONMENTAL TREATMENT TO THE POSSIBILITY OF THE

CALLUS ON THE PEPPER FLOWERS (MOMORDICA CHARANTIA L.)

Tóm tắt: Mướp đắng là cây vừa có giá trị thực phẩm vừa có giá trị dược

liệu Mục đích của bài báo là nghiên cứu sự ảnh hưởng của một số yếu tố

ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát sinh callus từ bao phấn Mướp đắng invitro.

Bao phấn qua tiền xử lý lạnh ở (4oC) trong thời gian 1 ngày cấy trên môi trường MS có bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,75 và 2mg/l 2,4-D

và 2mg/l KIN tạo callus hiệu quả đạt tỷ lệ phát sinh callus 77.78%

Từ khóa: Mướp đắng, tiền xử lý lạnh.

Abstract: Bitter gourd is one of the most nutritional and medicinal plant.

In order to establish a more perfect regeneration system from anther culture, the effect of low temperature pretreatment, ayxin and cytokinin on callus induction in anther culture of bitter gourd were investigated Pretreatment at 4°C for 1 day, callus induction rate was the highest Anther on MS medium supplemented with 0.8% agar, pH 5.75 and 2 mg / l 2,4-D and 2 mg / L KIN formed more and better callus (77.78%).

Key words : Bitter melon, Pre-pretreated premixes.

Trang 2

1 Đặt vấn đề

Mướp đắng (Momordica charantia L.) thuộc họ bầu bí (Cucurbitaceae) , là loại dây leo hàng năm [12] Cây có nguồn gốc từ Ấn

Độ, Nam Trung Quốc và được trồng rộng rãi ở các vùng nhiệt đới trên khắp thế giới như Philippines, Malaysia, Australia, các nước Châu Phi, Tây

Á và Mỹ La Tinh [17], [21], [10], [9], [8] Tại Việt Nam, cây được trồng

ở hầu hết các tỉnh từ đồng bằng đến trung du [4] Theo Trung tâm rau màu châu Á AVRDC năm 2007, tổng diện tích trồng mướp đắng ở nước ta là 12.000 ha, Philppines 12.000 ha, Thái Lan 3.000 ha, Indonesia 8.000 ha [5] Tại Pakistan mướp đắng được sản xuất 9,92 tấn/ha, Trung Quốc 18,9 tấn/ha và trung bình các nước Châu Á là 13,7 tấn/ha (FAOSTAT 2011) [18]

Mướp đắng là một loại rau ăn quả giàu chất sắt, carbonhydrate, protein,vitamin C, B1, B2, PP, chất khoáng, protit, lipit, đường, chất xơ, canxi, photpho, caroten [20] Từ quả mướp đắng có thể chế biến thành nhiều món ăn khác nhau, là một trong ngũ vị được con người ưa thích (đắng-cay-chua-chát-ngọt) [3] Bên cạnh đó, quả mướp đắng còn có tính hàn nên trong dân gian thường dùng để trị các bệnh mụn nhọt, giải nhiệt, sáng mắt, cảm nắng, giảm ho Trong mướp đắng có chất Alkaloid có công dụng lợi tiểu, giúp lưu thông máu tốt, chống viêm, hạ sốt và tăng cường sức khỏe thị lực Loại dầu có trong hạt mướp đắng rất giàu cis(c) 9, trasn(t) 11 và axit linonic t13, Chanrantin, polypeptide-p, và vicine…, những hợp chất này không chỉ làm giảm đường huyết mà còn cải thiện việc dung nạp glucose và giảm cholesterol, triệt tiêu các mầm bệnh gây ung thư

tá tràng và nhiều chứng bệnh nan y khác [1], [5] [6], [4]

Mướp đắng là cây vừa có giá trị thực phẩm vừa có giá trị dược liệu nên đang dần được người nông dân trồng với diện tích lớn và thu nhập cao Nhưng các giống đang sử dụng hiện nay chủ yếu là giống địa phương tuy

Trang 3

có khả năng thích nghi cao, chống chịu sâu bệnh tốt, song năng suất lại thấp Ngoài ra, các giống nhập từ các công ty nước ngoài tuy là các giống lai F1 có năng suất và độ đồng đều cao, nhưng giá thành hạt giống cao và nhiều giống chưa qua khảo nghiệm tính thích ứng đã ảnh hưởng đến hiệu quả sản xuất Một số giống lai nước ngoài được nhập nội trồng liên tục qua nhiều năm đã làm suy giảm nguồn gen Nên việc tạo giống trong nước theo yêu cầu của sản xuất và phù hợp với sinh thái vùng canh tác, cho năng suất cao ngày càng trở nên cần thiết

Bên cạnh đó công tác tạo giống lai thuần chủng hiện nay bằng phương pháp truyền thống thường tốn rất nhiều thời gian và công sức Thông qua thụ phấn cưỡng bức và chọn lọc liên tục 7-8 thế hệ mới nhận được các dòng thuần để đánh giá khả năng kết hợp của giống Phương pháp này trong nhiều trường hợp vẫn không cho các dòng bố mẹ đồng hợp tử ở các cặp allen

Vì vậy, việc áp dụng kĩ thuật nuôi cấy in vitro tạo giống cây mướp

đắng từ bao phấn sẽ rút ngắn được thời gian tạo dòng thuần tuyệt đối xuống còn một thế hệ, từ đó cho phép giảm chi phí, tăng hiệu quả của quá trình tạo giống mướp đắng có năng suất cao, khả năng thích nghi và chống chịu với điều kiện tại Việt Nam [14], [13]

Trên thế giới, quá trình tạo cây mướp đắng đơn bội in vitro mới chỉ

được nghiên cứu từ năm 2008, tuy có đạt được một số thành tựu nhưng hiện vẫn chỉ dừng lại ở giai đoạn tạo callus mà chưa cho phép thu được cây trên thực tế Trên thế giới, năm 2010, T Yang và cộng sự qua nghiên cứu

đã tạo được callus từ bao phấn cây mướp đắng, sau khi xử lý lạnh ở 4oC trong 1 ngày trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 0,5mg/l

Năm 2015 M Usman và cộng sự cũng đã nghiên cứu thành công tạo callus

từ bao phấn cây mướp đắng trên môi trường MS có bổ sung NAA kết hợp với BAP ( 3,22+0,88 µm/l) Bao phấn trước khi nuôi cấy tạo callus phải

Trang 4

qua 2 giờ xử lý lạnh ở 4oC

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn trên tôi chọn đề tài “ Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng phát sinh callus từ bao phấn cây

mướp đắng (Momordica charantia L.) invitro”.

2 Đối tượng và phương pháp

2.1 Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu là cây khổ qua lai F1 Diago 26 trồng tại thôn Bầu Tròn xã Đại An huyện Đại Lôc tỉnh Quảng Nam

Vật liệu nghiên cứu là là các bao phấn thu từ giống cây khổ qua lai F1 Diago 26

2.2 Phương pháp

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) đến sự phát sinh callus đơn bội

Thu hái nụ hoa mướp đắng vào buổi sáng từ 6h đến 7h sáng Nụ hoa được đặt trong đĩa pestri hay túi polyethylene Khử trùng nụ hoa mướp đắng sau đó tách lấy bao phấn cấy vào môi trường MS có bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,75 và 2,4-D; KIN; NAA; BAP nồng độ thay đổi (0-2) mg/l đơn lẻ hoặc kết hợp Đánh giá khả năng phát sinh callus sau

1 tuần, 2 tuần và 3 tuần nuôi cấy thông qua các chỉ tiêu đánh giá sau:

Tỷ lệ phát sinh callus (%) = x 100

Số callus/mẫu (%) = x 100

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của tiền xử lý lạnh (4 o C) đến khả năng phát

sinh callus đơn bội

Trang 5

Chọn thời gian tiền xử lý lạnh (4oC) (0 ngày; 1 ngày; 2 ngàu; 3 ngày;

4 ngày) ảnh hưởng tốt nhất đến khả năng phát sinh callus Thu hái nụ hoa đặt trong đĩa pestri hay túi polyethylene Tiền xử lý lạnh (4oC) rồi khử trùng sau đó tách lấy bao phấn cấy vào môi trường nuôi cấy có khả năng phát sinh callus tốt nhất Đánh giá khả năng phát sinh callus sau 1 tuần, 2 tuần và 3 tuần nuôi cấy thông qua các chỉ tiêu đánh giá sau:

Tỷ lệ phát sinh callus (%) = x 100

Số callus/mẫu (%) = x 100

2.2.3 Xử lí số liệu

Mỗi thí nghiệm được tiến hành trên 30 mẫu bố trí lặp lại 3 lần Số liệu được xử lí thống kê được xử lí bằng cách sử dụng phần mềm phân tích

thống kê SPSS theo phương pháp Turkey với α = 0,05.

3 Kết quả và biện luận

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) đến sự phát sinh callus đơn bội

Trong quá trình tạo callus khi nuôi cấy bao phấn, việc bổ sung một hoặc nhiều chất ĐHST là yếu tố không thể thiếu khi sử dụng bất kỳ một loại môi trường nào Trong đó Auxin là nhóm kích thích sinh trưởng được các nhà khoa học sử dụng chủ yếu để kích thích sự phận bào và sinh trưởng của mô sẹo Mỗi chất riêng lẻ hoặc kết hợp với nhau sẽ cho hiệu quả phát sinh callus khác nhau Sử dụng giống khổ qua lại F1 Diago 26, khử trùng mẫu bằng Cồn 70o 30 giây; NaOCl 5% 3 phút; HgCl2 0.1% 3 phút, nụ hoa có kích thước 3-5 mm để thí nghiệm Kết quả phát sinh callus của chất ĐHST được thể hiện ở các bảng sau:

Trang 6

Bảng 3.1 Sự ảnh hưởng của 2,4-D; KIN; BA đến sự phát sinh callus.

2,4-D

(mg/l)

KIN (mg/l)

BA (mg/l)

Tỷ lệ phát sinh callus (%)

Số callus/bình (%)

Thời gian phát sinh callus (tuần)

Hình thái callus

-Chú thích: Dấu “–“: không có hiện tượng phát sinh callus.

Qua bảng kết quả bảng 2.1 cho ta thấy các chất ĐHST 2,4-D; KIN;

BA ở các nồng độ đơn lẽ khác nhau thì không cho phát sinh callus đơn bội Theo Y Tang và các cộng sự đã thành công việc tạo callus đơn bội cây mướp đắng trên môi trường MS có bổ sung 0.5mg/l 2,4-D nhưng phần lớn callus đều bị hóa nâu [22] Nhưng ở thí nghiệm này không cho phát sinh callus trên môi trường MS có bổ sung 0.5mg/l 2,4-D có thể là do khác kiểu gen và điều kiện ngoại cảnh trồng giống cây

Qua kết quả trình bày ở bảng 2.2 cho thấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D kết hợp với KIN có ảnh hưởng đến sự phát sinh callus mướp đắng Ở nồng độ 1mg/l 2,4-D kết hợp với 0.5mg/l KIN thì sau 2 tuần cho tỷ lệ phát sinh callus 28.89% số callus/bình rất thấp 13.33% với callus màu vàng đậm, ở nồng độ 1mg/l 2,4-D kết hợp với 1mg/l KIN thì sau 3 tuần cho tỷ lệ

Trang 7

phát sinh callus 17.78% số callus/bình 10.67% với callus màu vàng đậm Khi tăng nồng độ 2,4-D lên 2mg/l và nồng độ KIN lên 2mg/l thì sau 1 tuần

có sự cảm ứng callus cao nhất 66.67% số callus/bình 66.67% callus màu vàng Ở các nồng độ 2,4-D kết hợp KIN còn lại không thấy có sự phát sinh callus nào

Bảng 3.2 Sự ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với KIN đến sự phát sinh

callus.

2,4-D

(mg/l)

KIN (mg/l)

Nhỏ gọn, kết khối, màu vàng đậm

1 1 17.78 c 10.67 b 3 khối, màu vàngNhỏ gọn, kết

đậm

Nhỏ gọn, kết khối, màu vàng

Trang 8

-2 3 - - -

-Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác có ý

nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p<0,05 Dấu “–“: không có hiện tượng phát sinh callus

Kết quả thí nghiệm cho thấy bổ sung 2.4-D kết hợp KIN vào môi trường tạo callus là rất có hiệu quả Nồng độ phối hợp thích hợp nhất là 2mg/l 2,4-D và 2mg/l KIN cho sự cảm ứng callus đạt 66.67% chỉ sau 1 tuần Môi trường tạo callus hiệu quả từ nuôi cấy bao phấn cây mướp đắng

là MS có bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,75 và 2mg/l 2,4-D và 2mg/l KIN

Bảng 3.3 Sự ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với TDZ đến sự phát sinh

callus.

2,4-D

(mg/l)

TDZ

(mg/l)

Trang 9

-1 1 - - -

TDZ là chất ĐHST thuộc nhóm cytokinin có tác dụng tích cực trong việc kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian sinh trưởng của mô phân sinh và hạn chế sự già hóa của tế bào [7] Nên trong nghiên cứu này tôi đã

sử dụng TDZ kết hợp với 2,4-D để phát sinh callus bao phấn, kết quả được thể hiện ở bảng 3.2 cho thấy khi TDZ ở nồng độ 0.5mg/l kết hợp với 0.1mg/l 2,4-D sau 3 tuần phát hiện sự phát sinh callus với tỷ lệ 37.78% số callus/bình là 18%, callus nhỏ gọn, kết khối, màu vàng

Ở các nồng độ 2,4-D kết hợp với l TDZ khác thì không có sự phát sinh callus

Bảng 3.4 Sự ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA đến sự phát sinh callus.

2,4-D

(mg/l)

BA (mg/l)

Trang 10

-1 0.5 - - -

Qua kết quả bảng 2.4 cho thấy khi bổ sung 1mg/l 2.4-D kết hợp với 1.5 mg/l BA thì phát hiện có sự phát sinh callus sau 2 tuần với tỷ lệ khá cao 40% số callus/bình là 42.67% với callus nhỏ gọn, kết khối, màu vàng Nhưng ở các nồng độ 2.4-D kết hợp BA thì không có sự phát sinh callus

Sự kết hợp của auxin và cytokinin tạo nhiều thuận lợi đạt được hiệu quả cảm ứng callus tối đa trên một số loài [19, 15] Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự phát sinh callus bao phấn ở một số loài thực vật khác cũng được nghiên cứu [22, 2] Ở dưa chuột khi bổ sung 2,4-D kết hợp với BA thì cho

tỷ lệ phát sinh callus bao phấn cao từ 40 đến 55% [2] và ở nghiên cứu ngày cũng cho kết quả tương tự

Bảng 3.5 Sự ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA đến sự phát sinh callus.

BA

(mg/l)

NAA

(mg/l)

Trang 11

-0.2 0.4 - - -

-0.2 0.6 51.11 36.88 3 khối, màu vàng Nhỏ gọn, kết

-Chú thích: Dấu “–“: không có hiện tượng phát sinh callus

Theo kết quả nghiên cứu của M Usman và cộng sự, nuôi cấy invitro

cây mướp đắng trên môi trường MS có bổ sung 0.2mg/l BA và 0.6mg/l NAA trong 2 ngày tiền xử lý lạnh 4oC với nụ hoa có kích thước 13-15mm thì cho kết quả tốt nhất là 71% [18] Ở nghiên cứu này tuy kết quả không cao nhưng đã phát sinh callus trên môi trường tối ưu nhất với tỷ lệ phát sinh callus 51.11% số callus/bình 36.88% sau 3 tuần nuôi cấy Còn ở các nồng độ BA và NAA khác thì không thấy có hiện tượng phát sinh callus chứng tỏ ở đây có sự khác nhau về giống loài, mẫu chưa qua tiền xử lý và thể hiện tính cảm ứng rất nhạy cảm của callus của bao phấn hoa mướp đắng, đòi hỏi độ chính xác cao về nồng độ chất kích thích sinh trưởng

Hình 3.1 Sự ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng phát sinh callus

Trang 12

của nụ hoa mướp đắng trên các môi trường khác nhau: MS có bổ sung 3%

sucrose, 0,8% agar, pH = 5,75 (A) 1mg/l 2,4-D và 0.5mg/l KIN sau 2 tuần nuôi cấy (B) 1mg/l 2,4-D và 1mg/l KIN sau 3 tuần nuôi cấy (C) 2mg/l 2,4-D và 2mg/l KIN sau 1 tuần nuôi cấy (D) 0.1mg/l 2,4-D và 0.5mg/l TDZ sau 3 tuần nuôi cấy (E) 1mg/l 2,4-D và 1.5mg/l BA sau 2 tuần nuôi cấy (F) 0.2mg/l BA và 0.6mg/l NAA sau 3 tuần nuôi cấy Thanh ngang tỷ

lệ 0.1cm

Bảng 3.6 Sự ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với BA và KIN đến sự phát

sinh callus.

2,4-D

(mg/l)

BA

(mg/l)

KIN (mg/l)

Nhỏ gọn, kết khối, màu vàng hơi xanh

Nhỏ gọn, kết khối, màu vàng hơi xanh

-Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác có ý

nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p<0,05 Dấu “–“: không có hiện tượng phát sinh callus

Ở tổ hợp 0.5mg/l 2,4-D 1mg/l BA và 1mg/l KIN tỷ lệ bao phấn tạo callus cao nhất đạt 31.11% và số callus/bình đạt 38.67% sau 2 tuần nuôi cấy với callus nhỏ gọn, kết khối, màu vàng hơi xanh Khi tăng nồng độ KIN lên 1.5mg/l thì vẫn phát sinh callus nhưng tỷ lệ thấp hơn 22.22% số callus/bình đạt 14.67% sau 3 tuần nuôi cấy với callus nhỏ gọn, kết khối,

Trang 13

màu vàng hơi xanh Ở các tổ hợp 0.5mg/l 2,4-D 1mg/l BA và 0.5mg/l KIN

và 0.5mg/l 2,4-D 1mg/l BA và 2mg/l KIN thì không có hiện tượng phát sinh callus

Hình 3.2 Callus phát sinh trên môi trường MS có bổ sung 2,4-D kết

hợp với BA và KIN (A) 0.5mg/l 2,4-D 1mg/l BA và 1mg/l KIN sau 2 tuần nuôi cấy (B) 0.5mg/l 2,4-D 1mg/l BA và 1.5mg/l KIN sau 3 tuần nuôi cấy.

Thanh ngang tỉ lệ 0.1cm

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của tiền xử lý lạnh (4 o C) đến khả năng phát sinh callus đơn bội

Đối với phần lớn các loại cây trồng việc xử lý bao phấn trước khi nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả nuôi cấy bao phấn Theo nghiên cứu của Kumar và cộng sự năm 2002 trên hai giống dưa chuột Green Long và Calypso cho thấy mẫu hoa trước khi nuôi cấy được xử lý lạnh ở 4oC trong hai ngày có ảnh hưởng tốt đối với nuôi cấy bao phấn dưa chuột [11]

Nhưng với cây bí (Cucurbita pepo) xử lý lạnh ở 4oC trong 4 ngày là mức

xử lý lạnh tối ưu (Metwally, 1998) [16] Như vậy, việc xử lý lạnh hoặc xử

lý nhiệt đối với bao phấn hay cây cho bao phấn trước khi nuôi cấy không chỉ tác dụng trực tiếp đối với sự hình thành callus mà còn tác động gián tiếp đến tỷ lệ tái sinh cấy Sử dụng giống khổ qua lại F1 Diago 26, khử

Định dạng
Số trang	18
Dung lượng	739,22 KB