Sử dụng công nghệ sinh học hiện đại là Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân nhanh giống cây Nưa trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng, tạo ra số lượng lớn cây nưa giống trong thời gian ngắn,. cCây nưa được tạo ra trong quy trình này có chất lượng cao, sạch bệnh, đồng đều và khỏe mạnh., Đđáp ứng được nhu cầu sản xuất và phục vụ bảo tồn.
Trang 1VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
SẢN PHẨM NHIỆM VỤ
Nhiệm vụ:
KHAI THÁC VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN CÁC LOÀI NƯA
(Amorphophallus spp.) GIÀU GLUCOMANNAN
SẢN PHẨM SỐ 6:
QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ NHÂN NHANH
GIỐNG CÂY NƯA (Amorphophallus spp.) BẰNG
CÔNG NGHỆ NUÔI MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
Tác giả: TS Lê Xuân Đắc
Trang 2VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
SẢN PHẨM NHIỆM VỤ
Nhiệm vụ:
KHAI THÁC VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN CÁC LOÀI
NƯA (Amorphophallus spp.) GIÀU GLUCOMANNAN
SẢN PHẨM SỐ 6:
QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ NHÂN NHANH
GIỐNG CÂY NƯA (Amorphophallus spp.)
BẰNG CÔNG NGHỆ NUÔI MÔ TẾ BÀO
THỰC VẬT
TS Lê Xuân Đắc PGS TS Trần Huy Thái
2
Trang 3MỤC LỤC
MỤC LỤC 3
THÔNG TIN CHUNG 2
Nguồn gốc xuất xứ: 2
Điều kiện áp dụng: 2
QUY TRÌNH KỸ THUẬT 3
1 Tên quy trình 3
2 Mục đích của quy trình 3
3 Các thuật ngữ và chữ viết tắt 3
4 Cơ sở khoa học 3
5 Vật liệu và phương pháp 5
6 Các bước tiến hành 5
7 Sản phẩm của quy trình 7
8 Mức độ lặp lại 7
9 Sơ đồ tổng quát Quy trình nhân nhanh giống cây Nưa (Amorphophallus spp.) bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật 8
TÀI LIỆU THAM KHẢO 9
Trang 5THÔNG TIN CHUNG
Nguồn gốc xuất xứ:
Quy trình là sản phẩm nghiên cứu khoa học của đề tài “Khai thác và phát
triển nguồn gen các loài Nưa (Amorphophallus spp.) giàu glucomannan”
Mã số:
Điều kiện áp dụng:
tại các cơ quan, tổ chức, cá nhân… nghiên cứu về nhân giống cây Nưa bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật trên đối tượng củ Nưa Củ các loài Nưa có chất lượng cao, khi có nhu cầu nhân giống nhanh với số lượng lớn trong thời gian ngắn phục vụ sản xuất có thể áp dụng quy trình này
Trang 6QUY TRÌNH KỸ THUẬT
1 Tên quy trình
Quy trình nhân nhanh giống cây Nưa (Amorphophallus spp.) bằng công
nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
2 Mục đích của quy trình
Sử dụng công nghệ sinh học hiện đại là Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân nhanh giống cây Nưa trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng,
trong quy trình này có chất lượng cao, sạch bệnh, đồng đều và khỏe mạnh., Đđáp ứng được nhu cầu sản xuất và phục vụ bảo tồn
3 Các thuật ngữ và chữ viết tắt
AMNA2: Môi trường nhân nhanh cây Nưa;
ARNA3: Môi trường tạo cây Nưa hoàn chỉnh;
BAP: 6-Benzyl Amino Purin;
MS: Môi trường dinh dưỡng cơ bản Murashige và Skoog (1962);
NAA: α-Naphthalen Acetic Acid;
Nuôi cấy mô tế bào: Kỹ thuật nuôi cấy mô hoặc tế bào trong ống nghiệm ở
điều kiện vô trùng
4 Cơ sở khoa học
Chi Nưa (hay Khoai Nưa) - Amorphophallus thuộc họ Ráy (Araceae), bộ
Ráy (Arales), lớp Một lá mầm (Monocotyledone) Trên thế giới chi Nưa có khoảng 200 loài phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới thuộc châu Phi và Đông Nam Á Ở Việt Nam chi này bao gồm khoảng 25 loài Hiện nay, nhiều loài Nưa được nghiên cứu và triển khai trồng với diện tích lớn ở nhiều nước như Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, New Zealand (Nguyễn Văn Dư, 2005; An et al., 2010; Chen et al., 2006, Douglas et al., 2005) Trong chi Nưa, một số loài củ có chứa nhiều bột glucomannan, loại bột này được dùng nhiều trong thực phẩm và thực phẩm chức năng có thể điều chỉnh nồng độ đường, làm giảm tỷ lệ mỡ trong máu,
3
Trang 7làm giảm sự thèm ăn ở người béo phì Ở Việt Nam có phân bố của một số loài Nưa có hàm lượng glucomannan tương đối cao, có triển vọng phát triển thành nguồn nguyên liệu sản xuất bột glucomannan, trong số đó có loài Nưa krausei (Amorphophallus krausei) Cây Nưa không chỉ có giá trị về mặt thực phẩm mà còn có ý nghĩa trong việc chống xói mòn đất, duy trì ổn định thảm thực vật giúp
cân bằng hệ sinh thái (Nguyễn Văn Dư, 2005; Đỗ Tất Lợi, 2005; An et al.; 2010,
Joyce and Barbara, 2005)
Trong tự nhiên, cây Nưa được nhân giống từ hạt hoặc sinh sản sinh dưỡng bằng cách củ mẹ sinh ra các củ con Tuy nhiên, ở Việt Nam số lượng mỗi loài Nưa ngoài tự nhiên không lớn, nên lượng củ giống phục vụ cho sản xuất khá là hạn chế Bên cạnh đó, việc sử dụng cây giống bằng hạt cũng khó khăn vì các loài Nưa thường vài năm mới ra hoa một lần, việc tìm và thu lượm hạt để phục vụ sản xuất ít khả thi Vì vậy, muốn phát triển nguồn nguyên liệu củ cây Nưa để sản xuất bột glucomannan cho công nghiệp chế biến thực phẩm và thực phẩm chức năng thì vấn đề nghiên cứu các biện pháp để nhân giống cây Nưa là rất quan trọngcần thiết Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật rất quan trọng của công nghệ sinh học thực vật Những thành tựu mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đạt được đã chứng tỏ khả năng ứng dụng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nhân nhanh và bảo tồn các loài thực vật quý hiếm, các giống cây trồng có giá trị kinh tế cao (Nguyễn Thanh Danh và CS, 2005; Nguyễn Văn Dư, 2012; Nguyễn Văn Vịnh, 2005; Hu et al., 2008)
Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn trên cho thấy, việc nghiên cứu và xây
dựng quy trình nhân nhanh giống cây Nưa (Amorphophallus spp.) bằng công
nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật để phục vụ sản xuất và bảo tồn giống là rất cần thiết Quy trình này nhằm nhân nhanh cây Nưa bằng trong ống nghiệm để tạo ra được một số lượng lớn và đồng đều cá thể cây Nưa trong thời gian ngắn và đảm bảo cây Nưa sạch bệnh có chất lượng cao
Trang 85 Vật liệu và phương pháp
5.1 Vật liệu
Củ các loài Nưa sạch bệnh, có chất lượng cao, đã được tuyển chọn
Các thiết bị, hóa chất thuộc Hhệ thống phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhà lưới, vườn ươm…
Trong quy trình này có thể áp dụng được cho 3 loài Nưa, gồm: Nưa vân nam, Nưa krausei, Nưa đầu nhăn
5.2 Phương pháp sử dụng
Quy trình này sử dụng các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân nhanh giống cây Nưa trong ống nghiệm
- Phương pháp tạo nguyên liệu vô trùng trong ống nghiệm;
- Phương pháp tạo đa chồi để nhân nhanh trong ống nghiệm;
- Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh;
- Phương pháp trồng cây trong bầu đất
6 Các bước tiến hành
Bước 1: Tạo nguyên liệu vô trùng trong ống nghiệm
- Thời gian: 5 - 6 tuần
- Chọn các mẫu là củ Nưa sạch bệnh, có chất lượng cao, đã được tuyển chọn Giâm củ trong cát ẩm để kích thích nảy chồi, sau khoảng 2 - 3 tuần khi củ xuất hiện chồi mầm dài 1 - 2cm
- Dùng nước xà phòng loãng rửa sạch mẫu chồi 2 - 3 lần; Dùng dao chuyên dụng cắt bỏ các phần ngoài của đỉnh sinh trưởng, cắt lấy đỉnh sinh trưởng có kích thước khoảng 2 - 3 cm để khử trùng
- Dùng nước xà phòng loãng rửa sạch mẫu chồi 2 - 3 lần; Dùng dao chuyên dụng cắt bỏ các phần ngoài của đỉnh sinh trưởng, tách lấy đỉnh sinh trưởng của chồi có kích thước khoảng 2 - 3 cm để khử trùng
5
Trang 9- Chồi sau khi tách khỏi củ mẹ được cho ngay vào bình chuyên dụng để khử trùng, sử dụng bình pirex 250 ml Các thao tác được thực hiện trong điều kiện vô trùng của box cấy vô trùng
- Khử bằng cồn 70% trong 30 giây, khử trùng bằng dung dịch javel (NaClO 1%) trong 10 phút, lắc nhẹ liên tục Rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần Cấy đỉnh sinh trưởng vào bình nuôi cây có chứa môi trường dinh dưỡng: MS cơ bản + 20g/l đường + 8g/l agar Mật độ cấy 1 - 2 mẫu/ bình tam giác 250 ml
Bước 2: Tạo đa chồi để nhân nhanh trong ống nghiệm
- Thời gian: 4 - 5 tuần
- Sau khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng khoảng 5 - 6 tuần, đỉnh sinh trưởng phát triển thành các chồi non dài khoảng 2 - 3cm Dùng dao cắt bỏ phần lá và cuống lá, cắt chồi theo chiều dọc thành 3 - 4 mẫu;
- Cấy các mẫu vào bình nuôi cây có chứa môi trường nhân cây AMNA2:
MS cơ bản + 30g/l đường sucrose + 8g/l agar + 2 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA
- Sau 4 tuần từ 1 mẫu nuôi cấy sẽ tạo ra 4 - 8 chồi con, tách các chồi lớn hoặc cụm chồi nhỏ để cấy tiếp trên môi trường nhân cây hoặc tạo cây hoàn chỉnh Mật độ cấy 6 -7 chồi/ bình tam giác 250 ml
Bước 3: Tạo cây hoàn chỉnh
- Thời gian: 4 - 5 tuần
- Chọn những chồi to khỏe của cụm chồi đang nuôi trên môi trường nhân chồi, có chiều cao 1,5 - 2,0 cm Dùng mũi dao tách riêng rẽ từng chồi, giữa nguyên cả phần lá và gốc
- Cấy từng chồi đơn lẻ trên môi trường tạo cây hoàn chỉnh ARNA3: MS cơ bản + 30g/l đường sucrose + 8g/l agar + 0,3 mg/l NAA Mật độ cấy 8 -10 chồi/ bình tam giác 250 ml
Bước 4: Trồng cây trong bầu đất
- Thời gian: 3 - 4 tuần
Trang 10- Cây con trên môi trường tạo cây hoàn chỉnh ARNA3 sau 3- 4 tuần có đầy
đủ lá và rễ, chiều cao cây 5 - 7 cm, có từ 4 - 7 rễ dài từ 3 - 5 cm Dùng panh gắp nhẹ để lấy cây từ trong bình nuôi ra ngoài Rửa sạch agar bám quanh rễ, xử lí cây con trong dung dịch chống nấm mốc 5 phút trước khi trồng trong bầu
- Bầu là túi hoặc cốc bằng nilon màu đen có đục lỗ thoát nước có kích thước 7 x 10 cm Giá thể để trồng cây trong bầu là trấu hun : đất (tỷ lệ 1:4)
- Cây con được trồng vào bầu, phần gốc sâu cách bề mặt 1cm, dùng tay ấn nhẹ vừa phải Đặt các bầu cây vào khay, dùng bình phun sương tưới nhẹ đủ ẩm, dùng tấm nilon màu trắng trong có đục lỗ để che kín toàn bộ khay Đặt khay trong nhà lưới có mái che Hàng ngày tưới phun sương 2 - 3 lần Sau 7 ngày cây bắt đầu
ra rễ mới, bỏ che nilon, tưới cây bình thường Sau 30 ngày, chuyển cây trồng trên vườn ươm hoặc đồng ruộng
7 Sản phẩm của quy trình
Sản phẩm của Quy trình nhân nhanh giống cây Nưa bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là cây Nưa giống được trồng trong bầu đất và trấu hun,
có chất lượng cao, sạch bệnh, đồng đều khỏe mạnh Cây cao 10 - 13 cm, cây cứng cáp, bộ lá màu xanh đậm Đạt tiêu chuẩn để trồng trên vườn ươm cấp 2 hoặc đồng ruộng để thu củ giống nguyên chủng
8 Mức độ lặp lại
Quy trình có thể dễ dàng thực hiện tại các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô
tế bào thực vật hoặc các cơ sở có đủ điều kiện đang nhân giống cây các loại cây trồng bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
7
Trang 119 Sơ đồ tổng quát Quy trình nhân nhanh giống cây Nưa
(Amorphophallus spp.) bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật
4 - 5 tuần
Bước 1: Tạo
nguyên liệu
vô trùng
trong ống
nghiệm
Bước 2: Tạo
đa chồi để
nhân nhanh
trong ống
nghiệm
Bước 3: Tạo
nguyên liệu vô
ống nghiệm
Bước 4: Tạo
nguyên liệu vô
Chọn lọc củ Nưa sạch bệnh, có chất lượng cao Giâm
trong cát ẩm 2 - 3 tuần
Rửa sạch mẫu, cắt tách đỉnh sinh trưởng kích thước 2
- 3 cm Khử trùng bằng cồn 70% trong 30 giây, bằng dung dịch javel (NaClO 1%) trong 10 phút
Cấy đỉnh sinh trưởng trên môi trường: MS cơ bản + 20g/l đường + 8g/l agar Mật độ 1 - 2 mẫu/ bình
Cắt chồi thành 3 - 4 mẫu; Cấy mẫu trên môi trường nhân cây AMNA2: MS cơ bản + 30g/l đường sucrose + 8g/l agar + 2 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA Mật độ 6 -7 chồi/ bình
Cây con có đủ lá và rễ, cao 5 - 7 cm, trồng vào bầu nilon (7 x 10 cm) Giá thể trấu hun : đất (1:4).
Chọn chồi to khỏe, chiều cao 1,5 - 2,0 cm Cấy chồi trên môi trường tạo cây hoàn chỉnh ARNA3: MS cơ bản + 30g/l đường sucrose + 8g/l agar + 0,3 mg/l NAA Mật độ 8 - 10 chồi/ bình.
Tiếp tục cấy trên môi trường AMNA2 để nhân nhanh
5 - 6 tuần
4 - 5 tuần
4 - 5 tuần
3 - 4 tuần
4 - 5 tuần
Trang 12TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Nguyễn Thanh Danh, Lê Xuân Đắc, Lê Thị Xuân, Hà Hồng Hải, Kết quả
bước đầu nhân giống in vitro cây Vù hương (Cinamomum balansae Licomte) bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi hạt xanh góp phần bảo tồn đa dạng sinh học,
Hội nghị toàn quốc: Nghiên cứu cơ bản trong Khoa học sự sống, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2005, 450-453
2 Nguyễn Văn Dư, Araceae Juss - họ Ráy, Danh lục các loài thực vật Việt
Nam, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, 2005, 3: 871-897.
3 Nguyễn Văn Dư, Nghiên cứu trồng và phát triển cây Nưa konjac
(Amorphophallus konjac K Koch) và một số loài khác trong chi Nưa (họ Ráy – Araceae) ở Việt Nam hướng tới việc lấy củ làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm và thuốc điều trị bệnh tiểu đường, mỡ máu và béo phì, Báo cáo tổng
kết đề tài Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội, 2012
4 Lê Xuân Đắc, Nguyễn Văn Dư, Nhân nhanh cây Nưa (Amorphophallus
krausei) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật, Tạp chí Khoa học và
Công nghệ Nhiệt đới, 2014, 6(3): 37-55
5 Đỗ Năng Vịnh, Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Nông Nghiệp, Hà
Nội, 2005
6 Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học
526-527
7 An NT, Thien DT, Dong NT, Dung PL, Du NV, Characterization of
glucomannan from some Amorphophallus species in Vietnam, Carbohydrate
Polymers, 2010, 80(1): 308-311
8 Anil SR, Siril E A., Beevy SS (2012), In vitro propagation strategies for
Elephant Foot Yam (Amorphophallus paeoniifolius (Dennst.) Nicolson,
Journal of Root Crops, 38(2): 97-108
9 Chen HL, Cheng HC, Liu YJ, Liu SY, Wu WT, Konjac acts as a natural
laxative by increasing stool bulk and improving colonic ecology in healthy
adults, Nutrition, 2006, 22: 1112-1119.
10.Douglas, JA, Follett JM, Waller JE, Reseach on Konjac (Amorphophallus
konjac) production in New Zealand Acta Hort, 2005, (ISHS) 670:173-180.
9
Trang 1311 Hu JB, Gao XX, Liu J, Xie CH, Li JW, Plant regeneration from petiole
callus of Amorphophallus albus and analysis of somaclonal variation of regenerated plants by RAPD and ISSR markers, Botanical Studies, 2008, 49:
189-197
12 Joyce K, Barbara S, Glucomannan and obesity: A critcal review, Alternative
therapies, 2005, 11(6): 30-34
13 Murashige T, Skoog F, A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco tissue cultures, Physiol Plant, 1962, 15: 475 - 497.