Luận văn Nghiên cứu ứng dụng enzym protease để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men

Tuy nhiên ở Việt Nam hiện nay các nhà máy sản xuất bia vẫn chưa ứng dụng men bia thải ra ngoài một cách hiệu quả, men thải ra từ các nhà máy bia được sử dụng chủ yếu làm thức ăn chăn nuô

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo – Tiến Sỹ Quản Lê

Hà - Người đã trực tiếp hướng dẫn và dìu dắt em trong suốt quá trình thực

Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm Hoá sinh đã

hỗ trợ em thực hiện một số thí nghiệm trong thời gian triển khai đề tài

Em xin chân thành cảm ơn sự động viên, chia sẻ, giúp đỡ của gia đình, bạn bè trong suốt thời gian vừa qua

Hà Nội, ngày 29 tháng 05 năm

2008

Sinh viên

Trịnh thị Thuỳ

DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Hình dạng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae

Hình 1.2 Cấu tạo tế bào nấm men Saccharomyces

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của NaCl đến sự phân bố độ ẩm của nấm

bảng 1.2 Thành phần của nấm men trích ly sản xuất bằng phương pháp thuỷ phân

Bảng 3.1 Kết quả đo độ ẩm

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ flavourzyme đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

Bảng 3.3 Ảnh hưỏng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm Flavourzyme

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ neutrase đến khả năng thuỷ phân

protein nấm men

Bảng 3.8 So sánh khả năng thuỷ phân của flavourzyme, neutrase, phương pháp tự phân nấm men

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Nấm men Saccharomyces và ứng dụng 2

1.1.1 Giới thiệu về Saccharomyces 2

1.1.1.1 Hình dạng và kích thước tế bào nấm men 2

1.1.1.2 Cấu tạo tế bào nấm men 3

1.1.1.3 Thành phần hoá học của tế bào nấm men 6

1.1.2 Các ứng dụng của nấm men trong ngành công nghiệp thực phẩm 8

1.1.2.1 Ứng dụng trong sản xuất các đồ uống lên men 8

1.1.2.2 Ứng dụng để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men 9

1.1.2.3 Ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm bánh mì 10

1.1.2.4 Thu nhận enzym 10

1.1.2.5 Thu nhận protein 10

1.1.2.6 Sử dụng sinh khối nấm men làm thức ăn chăn nuôi 10

1.1.2.7 Ứng dụng nấm men tạo các sản phẩm chữa bệnh 11

1.1.3 Ứng dụng của dịch thuỷ phân nấm men 11

1.1.3.1 Sử dụng làm chất điều vị 11

1.1.3.2 Sản xuất một số sản phẩm truyền thống 12

1.1.3.3 Sử dụng làm môi trường vi sinh vật 13

1.1.3.4 Bổ sung vào quá trình nấu bia 14

1.1.3.5 Sử dụng tạo ra một số sản phẩm chữa bệnh 14

1.1.3.6 Sử dụng làm thức ăn chăn nuôi 16

1.2 Tổng quan về protease 16

1.2.1 Khái quát về protease 16

1.2.1.1 Phân loại protease 16

1.2.1.2 Nguồn gốc protease 18

1.2.1.3 Các yếu tố chính ảnh hưởng đến hoạt động của enzym 21

1.2.2 Ứng dụng của protease trong thuỷ phân protein 23

1.2.2.1 Ứng dụng trong điều chế các dịch đạm thuỷ phân 24

1.2.2.2 Ứng dụng trong sản xuất nước mắm 24

1.2.2.3 Ứng dụng trong quá trình sản xuất bia 24

1.2.2.4 Ứng dụng trong chế biến thịt cá 25

1.2.2.5 Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác 25

1.2.3 Một số chế phẩm enzym protease từ vi sinh vật 25

1.2.3.1 Chế phẩm neutrase 0.8L 25

1.2.3.2 Chế phẩm enzym Flavourzyme 28

1.3 Các phương pháp thủy phân nấm men 29

1.3.1 Phương pháp hoá học 29

1.3.1.1 Thuỷ phân bằng axit 29

1.3.1.2 Thuỷ phân bằng kiềm 30

1.3.2 Phương pháp enzym 30

1.3.2.1 Phương pháp tự phân nấm men 30

1.3.2.2 Phương pháp thuỷ phân có bổ sung enzym protease 30

1.3.3 Phương pháp thuỷ phân enzym kết hợp với axit: 31

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Nguyên vật liệu 32

2.1.1 Nấm men 32

2.1.2 Các chế phẩm enzym 32

2.1.3 Các loại hoá chất sử dụng trong đề tài 32

2.1.4 Thiết bị sử dụng 33

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 33

2.2.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzym protease 33

2.2.2 Phương pháp rửa nấm men 35

2.2.3 Phương pháp xác định độ ẩm 35

2.2.4 Nghiên cứu thuỷ phân nấm men 35

2.2.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzym protease 35

2.2.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thuỷ phân 36

2.2.4.3 Nghiên cứu xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo 36

2.2.4.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men của enzym 37

2.2.5 Phương pháp ninhydrin xác định hàm lượng axit amin 37

2.2.6 Phương pháp sắc ký bản mỏng 39

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Xác định độ ẩm của nấm men lọc chân không 40

3.2 Xác định hoạt độ enzym protease 40

3.2.1 Xác định hoạt độ enzym protease trong chế phẩm Flavourzyme 500MG 40

3.2.2 Xác định hoạt độ enzym protease trong chế phẩm neutrase 0.8L 41 3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân protein nấm men

bằng chế phẩm flavourzyme 500MG 41

3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ flavourzyme 41

3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thuỷ phân 43

3.4 Nghiên cứu xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo 44

3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men 46

3.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm neutrase 0.8L 48

3.6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ thuỷ phân 48

3.6.2 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzym neutrase và thời gian thuỷ phân 50

3.7 So sánh hiệu quả thuỷ phân bằng chế phẩm enzym neutrase, flavourzyme và phương pháp tự phân 51

KẾT LUẬN 55

KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

MỞ ĐẦU

Ngành công nghệ sản xuất bia ở Việt Nam ngày càng phát triển Sản lượng bia ở Việt Nam đã tăng từ 1,29 tỷ lít vào năm 2003; 1,37 tỷ lít năm 2004; 1,5 tỷ lít năm 2005 và đạt 1,7 tỷ lít vào năm 2006 Nấm men bia là một tác nhân quan trọng không thể thiếu tham gia trực tiếp vào quá trình lên men bia Sau khi lên men, một lượng lớn nấm men thải ra Trung bình

cứ sản xuất ra được 100 lít bia sẽ thải ra môi trường 2 lít men có thuỷ phần 88% Men bia có hàm lượng protein cao trung bình khoảng 50% (tính theo chất khô), trong thành phần protein có đầy đủ các acid amin, đặc biệt là các acid amin không thay thế Ngoài ra, nó còn chứa các chất khoáng, giàu vitamin nhóm B, nhóm D và các chất kích thích sinh trưởng Trong 1 g chất khô của nấm men chứa 300 μg vitamin B1, 40 μg vitamin B2, 50μg vitamin

B6, 600μg vitamin PP, 80μg axit pantoteic, 25μg axit folic, 1μg biotin và 500μg inozit Trên thế giới, nấm men bia được quan tâm nghiên cứu tận dụng với nhiều mục đích khác nhau như làm thực phẩm, làm nguồn thuốc

bổ giàu axit amin và vitamin Tuy nhiên ở Việt Nam hiện nay các nhà máy sản xuất bia vẫn chưa ứng dụng men bia thải ra ngoài một cách hiệu quả, men thải ra từ các nhà máy bia được sử dụng chủ yếu làm thức ăn chăn nuôi, khả năng khai thác các thành phần có giá trị sinh học trong men bia

để tạo ra các sản phẩm ứng dụng cho con người còn rất hạn chế Hơn nữa, nếu không được sử dụng triệt để thì nguồn bã nấm men này còn là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường Xuất phát từ những điều đó cùng với sự gợi ý của giáo viên hướng dẫn, để góp phần tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cho người bằng nguồn tận thu nấm men bia, em tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzym protease để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men”

Nội dung chính bao gồm:

- Nghiên cứu tìm điều kiện thích hợp để thuỷ phân nấm men bia bằng các chế phẩm enzim Neutrase và Flavourzyme (điều kiện nhiệt độ, nồng độ enzim, thời gian) và so sánh với quá trình tự phân nấm men

- Nghiên cứu xử lý tế bào bằng chế phẩm enzym cereflo

- Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình xử lý nhiệt tế bào đến khả năng thuỷ phân protein nấm men của enzym

- Định tính một số thành phần axit amin quan trọng trong sản phẩm thuỷ phân

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Nấm men Saccharomyces và ứng dụng

1.1.1 Giới thiệu về Saccharomyces

Saccharomyces thuộc họ Saccharomycetaceae, lớp Ascomycetes,

ngành nấm Là vi sinh vật có cấu tạo đơn bào, không di động, có khả năng sinh sản nhanh, sinh sản chủ yếu bằng phương pháp nảy chồi Sinh khối của chúng rất giàu protein, vitamin và lipit Tế bào nấm men thuộc loại Eucaryot (nhân thật), có khả năng hô hấp yếm khí tuỳ tiện

Chúng phân bố rất rộng rãi trong thiên nhiên nhất là trong đất, có thể nói đất là môi trường tự nhiên để giữ giống nấm men và đặc biệt là trên bề mặt của rất nhiều loại lá cây, các loại quả hay các loại cây lương thực thực phẩm khác

Nấm men có khả năng lên men các loại đường để tạo thành rượu trong điều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng tạo thành sinh khối tế bào Vì thế, nấm men được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để sản xuất rượu, bia, nước giải khát lên men, sản xuất men bánh mì, sản xuất protein sinh khối, tạo hương nước chấm, sản xuất chất béo,… [18], [23], [25], [26], [34]

1.1.1.1 Hình dạng và kích thước tế bào nấm men

Nấm men thuộc các loài khác nhau thường có hình dạng khác nhau Ngay trong cùng một loài, hình dạng tế bào cũng thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện sống và tuổi đời Trong môi trường đặc biệt thì nấm men có hình dạng rất ổn định Đa số nấm men có hình ovan, hình bầu dục, hình tròn

Nấm men có hình tròn, hình trứng như Saccharomyces cerevisiae, hình elip như Saccharomyces ellipsoideus, hình quả chanh như Saccharomyces

apiculatus, đôi khi có hình chai như Saccharomyces ludwigii

So với các vi sinh vật khác (đối với vi khuẩn chẳng hạn), nấm men có kích thước tương đối lớn Một số nấm men được sử dụng trong công nghệ thực phẩm thường có kích thước khoảng 3 ÷ 5 × 5 ÷ 10µm [34] Kích thước này cũng thay đổi nhiều tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường sống,…

Tế bào nấm men trong tự nhiên có thể đứng riêng lẻ hoặc sau khi nảy chồi

vẫn dính vào nhau tạo thành chuỗi

Hình 1.1 Hình dạng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae

Hiện nay trên Thế Giới và ở Việt Nam đang sử dụng hai loại nấm men

bia, đó là nấm men nổi (Saccharomyces cerevisiae) và nấm men chìm (Saccharomyces carlbergensis), là tế bào hình cầu hay hình trứng, có kích

thước 2.5-10 µm chiều rộng và 4.5-21 µm chiều dài

1.1.1.2 Cấu tạo tế bào nấm men

Nấm men là sinh vật đơn bào, hiển vi, tế bào cơ bản giống như ở động vật, thực vật So sánh cấu tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hoá nhảy vọt từ nhân sơ đến nhân chuẩn Cùng với sự tiến hoá về nhân và cơ chế phân chia nhân (nhân có màng, có các thể nhiễm sắc, phân bào có tơ,…),

ở cơ thể nhân chuẩn xuất hiện nhiều thể không thấy ở thể nhân sơ như: Ti thể, lục lạp,… [26]

Hình 1.2 Cấu tạo tế bào nấm men Saccharomyces

Tế bào nấm men có thành phần và cấu tạo phức tạp Trong tế bào có các cấu tử tiểu thể và có thể chia thành: Các cơ quan nội bào hay cơ quan

tử của tế bào và các chất chứa trong tế bào hay các thể vùi của tế bào

(inclusion)

Thành tế bào

Thành tế bào dày khoảng 25 nm và chiếm khoảng 25-30 % khối lượng khô tế bào, là lớp vỏ bao quanh tế bào nấm men, tạo hình dáng tế bào Thành tế bào gồm 3 lớp: Lớp trong cùng cấu tạo từ β-glucan không tan trong kiềm, lớp giữa cấu tạo từ β-glucan hoà tan, lớp ngoài cùng là mannan photphoryl Giữa hai lớp màng phía ngoài có chứa các enzym invertaza, photphataza axit, β-glucosidaza, proteaza,…Thành tế bào chứa khoảng 15 kitin cần thiết cho sẹo nảy chồi

Glucan (chủ yếu) và mannan chiếm tới 90% chất khô của vỏ tế bào Glucan là một polyme phức tạp, có cấu tạo phân nhánh từ các tiểu phần là D-glucoza, phân nhánh có liên kết β-1,6 và β-1,3 Glucan là thành phần chính cấu tạo nên vỏ tế bào, nếu thành phần này bị phá hỏng thì tế bào bị phá

vỡ hoàn toàn Mannan là polyme phân nhánh của đường D-mannanoza, mỗi phân tử thường chứa từ 200-400 gốc mannanoza, có phân tử lượng là 5.9×104, không phải là thành phần quyết định của vỏ tế bào Nếu bỏ phần mannan hình dáng tế bào không bị biến đổi

Thành tế bào nấm men chứa 6-7 % protein, phần protein của nó thường liên kết vững chắc với phần hidratcacbon và tạo thành các phức chất giàu lưu huỳnh Ngoài protein, thành tế bào nấm men còn chứa lipit, đường khử, nitơ, các axitamin, và các chất khoáng,…Thành phần hoá học của thành tế bào nấm men có thể thay đổi phụ thuộc vào chủng, điều kiện môi trường sống và tuổi đời [26], [34]

Màng nguyên sinh chất: Màng nguyên sinh chất là một lớp màng rất

mỏng, dày không quá 0.1nm, dính chặt với tế bào chất, nằm sát vách tế bào Màng nguyên sinh chất có cấu tạo 3 lớp: Lớp giữa là lipid và photpholipid, hai lớp còn lại là protein Hai lớp này đóng vai trò quan trọng

trong quá trình vận chuyển các chất hoà tan và hoạt động của các enzym

Nguyên sinh chất: Nguyên sinh chất của tế bào nấm men là một hệ thống

keo cấu tạo bởi protit, lipit, lipoit, polysacarit, muối khoáng, nước Nguyên sinh chất nằm ngay bên dưới thành tế bào, dày khoảng 80A0, có độ nhớt cao (gấp 800 lần độ nhớt của nước) và chứa tất cả các cấu trúc cơ bản của

tế bào

Nhân tế bào: Khác với vi khuẩn, tế bào nấm men có nhân thật Mỗi tế bào

nấm men có một nhân hình tròn hoặc hình bầu dục, được bao bọc bởi một màng nhân Trong nhân là nhân con Hình dáng và kích thước của nhân có thể thay đổi phụ thuộc vào tuổi và trạng thái sinh lý tế bào Trong các tế bào nấm men đang hoạt động mạnh, nhân có kích thước khá lớn Cũng như các sinh vật khác, nhân tế bào nấm men có cấu tạo bởi protein, AND, ARN

và nhiều enzym Nhân quyết định tính di truyền và tham gia điều khiển mọi hoạt động sống của tế bào Trong nhân có chứa nhiễm sắc thể, có quá trình

giảm phân khi sinh sản và đôi khi cũng có thể phân cắt theo kiểu trực phân

Không bào: Không bào có tính thẩm thấu cao, là nơi tích luỹ các sản phẩm

trao đổi chất Glycogen có thể chiếm tới 12 % chất khô của tế bào Trehaloza là một hydratcacbon dự trữ, có thể chiếm tới 16 % lượng chất khô trong tế bào Chính không bào là nơi chứa axit amin tự do Ngoài ra không bào còn chứa purin, ortophotphat polyme hoá và các enzym thuỷ

phân

Ty thể: Ty thể nấm men chứa AND, ARN, ARN polymeraza, các enzym

hô hấp, chúng suy biến thành các tiền ty thể (promitochondries) trong quá trình lên men khi môi trường chứa hơn 5 % glucoza Màng ty thể có chứa

lipid, photpholipid, ergosterol

1.1.1.3 Thành phần hoá học của tế bào nấm men

Thành phần hoá học của tế bào nấm men tuỳ thuộc điều kiện môi trường nuôi, thành phần chất dinh dưỡng, tình trạng sinh lý của tế bào Trong tế bào có chứa hầu hết các chất cần thiết như protein, glucid, lipid, các enzym, các axit nucleic, chất khoáng [26]

Cũng như các cơ thể sống khác, thành phần cơ bản và chủ yếu của tế bào nấm men là nước (khoảng 70-75 % khối lượng chung) Thành phần sinh khối khô của nấm men như sau (%):

Chất vô cơ 5-10 Cacbon 25 – 50 Nitơ 4.8 – 12 Protein (N × 6.25) 30 -75 Lipid 2 – 5 Thành phần hoá học của tế bào nấm men nếu tính theo các nguyên tố cấu thành sẽ là (% theo trị số trung bình): C – 47, H – 65, O – 31, N – 5 ÷

10, P – 1.6 ÷ 3.5 Hàm lượng các nguyên tố không phải đa lượng: Ca – 0.3

÷ 0.8, K – 9.5 ÷ 2.5, Mg - 0.1 ÷ 0.4, Na - 0.06 ÷ 0.2, S – 0.2 Các nguyên tố

vi lượng (mg/kg): Fe 90 ÷ 350, Cu – 20 ÷ 135, Zn – 100 ÷ 160, Mo – 15 ÷

65 [26]

a Nước trong tế bào nấm men

Nấm men ép có chứa 70 – 75 % là nước, và 25 – 30 % còn lại là chất khô

Nước bao gồm phần nước ngoài tế bào (ngoại bào) là phần nước nằm trong khoảng trống giữa tế bào, và nước trong tế bào (nội bào) là phần nước nằm trong tế bào chất của tế bào Lượng nước khác nhau còn tuỳ chủng nấm men, kỹ thuật nuôi và phương pháp thu tế bào Ví dụ: khi nuôi trong môi trường có NaCl, lượng nước trong tế bào giảm, điều này thể hiện

ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của NaCl đến sự phân bố độ ẩm của nấm men

Phương pháp nuôi Phân bố trong nấm

men, %

Phân bố độ ẩm trong

men ép

lượng chất

Thêm NaCl vào môi

Thay đổi độ ẩm của nấm men sẽ kéo theo thay đổi tỉ lệ nước nội bào

và nước ngoại bào Khi loại bỏ 85 % lượng nước từ nấm men ở nhiệt độ dưới 500C hầu như không ảnh hưởng đến hoạt động của chúng [25]

b Chất khô trong tế bào nấm men

Chất khô của tế bào nấm men gồm có (tính theo % khối lượng nấm men ép): 23 – 28 là chất hữu cơ và 5 – 7 là tro Chất hữu cơ ở đây gồm có: Protein 13-14%, glycogen 6 – 8 %, xenluloza 1.8 – 2 %, Chất béo 0.5 – 2

%

Protein

Trong các chất hữu cơ của tế bào nấm men thì protein là thành phần có giá trị nhất Thành phần protein nấm men phụ thuộc vào loài giống, thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy [26], [38]

Nấm men có hàm lượng protein nguyên liệu trung bình khoảng 50 % (tính theo chất khô), trong đó có khoảng 45 % protein hoàn chỉnh Các dẫn xuất của axit nucleic như bazơ purin và pyrimidin, các axit amin tự do đều được coi là protein nguyên liệu Trong thành phần protein có đầy đủ các axit amin và đặc biệt là axit amin không thay thế Hàm lượng các axit amin trong

tế bào nấm men ở giai đoạn cuối lên men như sau (mg/g men khô): Lizin – 7.5; arginin – 1.3; histidin – 11.0; axit asparaginic – 2.9; serin – 2.7; glyxin – 1.5; axit glutamic – 3.9; alanin – 8.7; prolin – 2.0; tirozin – 2.8; metionin – 2.9; lơxin – 5.4; sistein - vết,… [26]

Vitamin

Nấm men có thể tổng hợp được tất cả các vitamin trong chừng mực nào đó (nhiều hoặc ít), ngoại trừ biotin (vitamin H) Thực tế cho thấy, tế bào nấm men rất giàu vitamin, nhất là vitamin nhóm B và tiền vitamin D2

là ergosterol

Hàm lượng vitamin trong tế bào nấm men như sau (μg/g chất khô): Inozit 6000 – 15000; biotin (vitamin H) 0.6 ÷ 0.7; riboflavin (vitamin B2)

30 ÷ 60; axit pantotenic (vitamin B3) 2.0 ÷ 19.0; thiamin (vitamin B1) 24 ÷ 50; pyridoxine (vitamin B6) 14 ÷ 39; nicotinamit (vitamin B5) 370 ÷ 750

Chất béo: Chất béo trong tế bào nấm men có các axit oleic, linoelic,

palmitic Trong chất béo có tới 30 – 40 % phosphatit

Tro: Trong tro nấm men thấy có các oxyt sau đây (%): P2O5 25 ÷ 60; CaO – 1 ÷ 8; MgO – 4 ÷ 6; Na2O – 0.5 ÷ 2; SO3 - 0.5 ÷ 6; SiO2 – 1 ÷ 2; Fe2O3 – 0.05 ÷ 0.7

Các nguyên tố vi lượng: Chúng tham gia vào thành phần của nhiều enzym,

vitamin và nhiều hợp chất khác nữa trong quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm của tế bào Các nguyên tố vi lượng (mg/kg): Fe 90 ÷ 350, Cu – 20 ÷

135, Zn – 100 ÷ 160, Mo – 15 ÷ 65

Glycogen: Là những chất dự trữ nguồn cacbon (hydratcacbon của nấm men)

Khi trong môi trường thiếu nguồn cacbon dinh dưỡng, glycogen sẽ được huy động tham gia vào quá trình tiêu hoá của nấm men và giải phóng ra nước, khí cacbonic

Trehaloza: Hợp chất thường kết hợp với hàng loạt hạt glycogen làm nguồn

dự trữ cacbon rất cơ động Ở cùng một giá trị pH, hàm lượng Trehaloza tăng thì nitơ giảm

Như vậy, protein là thành phần chủ yếu trong chất khô tế bào nấm men Nếu ta tận dụng thuỷ phân nguồn thứ phẩm này thải ra từ các nhà máy bia sẽ thu được dịch thuỷ phân protein nấm men có giá trị dinh dưỡng rất cao, với các thành phần axit amin không thay thế như lizin, metionin,…bổ sung vào thực phẩm thiếu hụt các axit amin này (như các

protein có nguồn gốc thực vật,…) và tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị khác

1.1.2 Các ứng dụng của nấm men trong ngành công nghiệp thực phẩm

1.1.2.1 Ứng dụng trong sản xuất các đồ uống lên men

Lên men là một trong những kỹ thuật lâu đời nhất trong chế biến thực phẩm và mang tầm quan trọng kinh tế to lớn Các sản phẩm lên men phổ biến là rượu, bia, nước giải khát,…Các sản phẩm này ngày càng nhiều và dường như chưa bao giờ đáp ứng đủ nhu cầu của con người

Nấm men đóng vai trò là tác nhân lên men, nó hấp thụ các hydratcacbon thấp phân tử và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường vào tế bào, rồi thực hiện quá trình trao đổi chất trong điều kiện kỵ khí qua một chuỗi các biến

đổi phức tạp tạo thành sản phẩm mà chủ yếu là rượu etylic, CO2 và một số sản phẩm phụ khác

Nấm men thường được sử dụng trong quá trình lên men rượu là

Saccharomyces

1.1.2.2 Ứng dụng để tạo sản phẩm thuỷ phân nấm men

Men được hoà với nước theo tỉ lệ thích hợp, có thể bổ sung enzym thuỷ phân hoặc không, giữ ở 50 – 550C, đây là nhiệt độ thích hợp cho enzym protease có sẵn trong tế bào nấm men và enzym protease bổ sung vào hoạt động thuỷ phân protein thành các đạm thấp phân tử, đồng thời giải phóng ra nhiều thành phần có giá trị khác Dịch thuỷ phân chứa rất nhiều axit amin đặc biệt là các axit amin không thay thế, peptid, vitamin nhóm B, các hydratcacbon,…

bảng 1.2 Thành phần của nấm men trích ly sản xuất bằng phương

pháp thuỷ phân [27]

Các axit amin (% so với khối lượng ban đầu) Các vitamin

(mg/kg, ppm) Alanin 3.4 Isoleucin 2.0 prolin 1.9

20-30 Asparagin 3.8 Lizin 3.2 Treonin 1.9 Riboflavin 50-

70 Cistin 0.3 Methionin 0.5 Tirozin 0.8 Piridoxin 25-

35 Glycin 1.6 Ornithin 0.3 Histidin 0.9 Niacinamd 600 Axit

trầm trọng hơn là đói protein nói chung Vì vậy, việc tận dụng nguồn protein nấm men để tạo ra dịch thuỷ phân có giá trị dinh dưỡng và giá trị sinh học cao mà lại an toàn cho người và gia súc là rất cần thiết

1.1.2.3 Ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm bánh mì

Sinh khối nấm men làm nở bột mì là sinh khối men Saccharomyces

cerevisiae còn sống, còn hoạt tính lên men rượu, khi trộn với bột mì sẽ lên

men rượu, giải phóng ra CO2 làm phồng gluten (protein trong bột mì), bột nhào nở làm cho bánh mì xốp

1.1.2.4 Thu nhận enzym

Thu nhận enzym superoxit dismutaza: Sử dụng công nghệ nghiền tế

bào Saccharomyces cerevisiae kết hợp với xử lý kiềm [6]

Thu nhận chế phẩm invertase: Tự phân nấm men bia ở 500C, pH 5.5, thời gian 50 giờ Khi đó hoạt tính invertase thu được là 120.9 U/g chất khô nấm men [23]

1.1.2.6 Sử dụng sinh khối nấm men làm thức ăn chăn nuôi

Trong hoàn cảnh nhiều nước trên thế giới (chủ yếu ở châu Phi và châu Á) còn bị đói protein trầm trọng, các nước châu Âu hằng năm vẫn phải nhập đậu tương cho chăn nuôi, thì protein vi sinh vật là một nguồn hấp dẫn Sinh khối nấm men làm nguồn protein – vitamin bổ sung vào thức ăn

chăn nuôi, đây là các tế bào của các giống Saccharomyces, Candida,… đã

sấy khô, đã chết, không còn hoạt tính lên men rượu Protein vi sinh vật đặc biệt giàu lizin, đây là một lợi thế khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Men

bia khô có thành phần protein 44.5 %, chất béo 1.2 %, xơ 1.3 %, nước 10.9

%

Cho thức ăn tinh ngô, cám, khoai vào thùng, chum, pha nước vừa đủ sền sệt Trộn 2 – 4 % bánh men đã bóp vụn, bổ sung thêm ure 200 g và lân 150g/100kg bột, khuấy đều, đậy lại, ủ ấm và cứ 6-8 giờ đảo 1 lần Sau vài ngày, men sẽ mọc trắng, có mùi thơm Thức ăn được ủ men bia làm tăng protein lên 9-14 % Thức ăn ủ men trộn vào khẩu phần của lợn con 40 %, lợn choai 50-60 %, lợn nái chửa hai tháng cuối và lợn nái mới đẻ không trộn thức ăn ủ men này vì có thể thiếu khoáng, nhất là canxi cho cấu tạo phát triển xương của thai và lợn con [18]

1.1.2.7 Ứng dụng nấm men tạo các sản phẩm chữa bệnh

Men bia sống thường được sử dụng làm thuốc trong các trường hợp cơ thể mệt mỏi, kiệt sức, thiếu máu, kém ăn, chậm tăng trưởng, stress, rối loạn thần kinh Khi kết hợp với selen, nó tạo thành phân tử selen hữu cơ có tác dụng ra tăng hiệu năng chống các gốc tự do, làm chậm quá trình lão hoá và

là yếu tố quan trọng trong nhóm các chất chống oxy hoá cần thiết cho sức khoẻ

Men bia sống có tác dụng chống nhiễm trùng bằng cách tăng cường hệ thống miễn dịch Các loại thuốc uống chứa men bia thường kết hợp men bia 400 g với men bia selen – 75 mg, silice 25 mg, giúp tăng cường sức khoẻ, chống nhiễm trùng (trong các trường hợp bị cảm, ho, nóng sốt) Men bia còn được sử dụng làm thực phẩm bổ sung cho phụ nữ mang thai và cho con bú

Men bia sống dùng làm thuốc thường có 20 tỷ tế bào sống Saccharomyces cerevisiae/1g, chứa trong 2 viên nang với hàm lượng 16 axit amin, 17 vitamin, 14 muối khoáng Nó được xem là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao và là vectơ dẫn đường cho sự hấp thu các loại vitamin khác vào cơ thể [14]

Chế phẩm YeaSacc 1026 bao gồm các tế bào nấm men của dòng men

Saccharomyces cerevisiae 1026, là một dạng men sống dùng để trộn vào

thức ăn Có tác dụng kích thích tăng trưởng và hoạt động của các loại vi khuẩn có lợi cho đường ruột [1]

1.1.3 Ứng dụng của dịch thuỷ phân nấm men

1.1.3.1 Sử dụng làm chất điều vị

Sử dụng một lượng nhỏ dịch thuỷ phân nấm men vào một số thực phẩm như súp, nước xốt, trứng, snack, bánh quy,…sẽ góp phần tích cực vào việc tăng giá trị cảm quan và giá trị dinh dưỡng cho sản phẩm Đây là kết quả của các axit amin và các peptide phân tử lượng thấp trong dịch thuỷ phân nấm men

1.1.3.2 Sản xuất một số sản phẩm truyền thống

Dịch thuỷ phân nấm men giàu axit amin đặc biệt là các axit amin không thay thế, vitamin nhóm B, khoáng,… được sử dụng để tạo rất nhiều sản phẩm thơm ngon, bổ dưỡng như vegemite, marmite, oxo, cenovis, recipe,…

1) MARMITE: Sản phẩm này có xuất xứ từ nước Anh, thành phần chính

của Marmite là YE Sản phẩm dính, có dạng sệt, màu nâu, vị mạnh, cực kỳ mặn, có vị thịt Mùi vị của nó được so sánh với nước tương (xì dầu) Ngoài ra, marmite còn có một sản phẩm tương tự ở New Zealand, Úc

Marmite là món ăn truyền thống ở Anh, được ăn với bánh mỳ, bánh bích quy Các nhà hàng Trung Quốc, Singapore sử dụng marmite trong các món xào thịt lợn để làm tăng vị ngọt cho thức ăn Nó cũng được cho vào cháo yến

để bổ sung hương thơm cho cháo

Hình 1.3 Sản phẩm Marmit

Thông tin dinh dưỡng của Marmite loại 100g được sản xuất ở Anh:

- Năng lượng: 219 kcal - Protein: 38.4 g

- Cacbonhydrat: 19.2 g - Đường: 0.5 g

- Chất béo: 0.1 g - Natri: 4.3g

- Thiamin: 5.8 mg - Riboflavin: 7 mg

- Niacin: 160 mg - Axit folic: 2500µg

- Vitamin B12: 15 μg

2) VEGEMITE: Là sản phẩm được làm từ YE, trông rất mịn, dính Sử

dụng để phết lên bánh sandwich, bánh mì nướng, bánh bích quy,…Sản phẩm

có vị mặn, hơi đắng, có vị mạch nha, gần giống vị canh thang thịt bò Vegemite được coi là món ăn truyền thống ở Úc, New Zealand Vegemite rất giàu vitamin nhóm B

Hình 1.4 Sản phẩm Vegemite

Thông tin dinh dưỡng của vegemite loại 5g:

- Năng lượng 9.76 kcal - Protein: 1.3g

khoảng 6-13 %

1.1.3.3 Sử dụng làm môi trường vi sinh vật

Chiết lấy phần trong từ dịch thuỷ phân nấm men, bỏ cặn, trung hoà và đun sôi Từ dịch men thuỷ phân ta có thể pha thành môi trường thạch - nước men - đường (nước men được thêm 0.5 % muối ăn, 1- 2 % glucoza và

2 % thạch) pH 6,8 Thanh trùng ở 0.5at trong 30 phút Có thể thay glucoza bằng 5 % sacaroza, pH = 6.0 – 6.5 [26]

Dịch men thuỷ phân có thể cô đặc thành cao men, đem dùng dần để pha môi trường với tư cách là nguồn nitơ hữu cơ (peptone, peptid, axit amin, nucleotide,…) và nguồn vitamin đặc biệt là vitamin nhóm B

Thành phần môi trường để nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae sinh

tổng hợp protease là môi trường lỏng có các thành phần như sau: dextrin 2.5 g, bột đậu nành 5 g, saccharose 3 g, Na2CO3 0.9 g, NaHCO3 0.3 g,

Na3PO4 0.3 g, chất chiết nấm men 0.1 g, đong vừa đủ 100ml nước Môi trường này thích hợp cho nấm mốc phát triển và sinh tổng hợp protease [13]

1.1.3.4 Bổ sung vào quá trình nấu bia

Chất chiết nấm men được xem là nguồn nitơ tốt nhất bổ sung vào dịch nha trong sản xuất bia với kỹ thuật lên men nồng độ cao đối với dịch nha

220 pt, hàm lượng chất chiết nấm men cần bổ sung là 40 mg/lit Làm giảm thời gian lên men, nồng độ cồn trong bia non tăng lên [22]

1.1.3.5 Sử dụng tạo ra một số sản phẩm chữa bệnh

Thuốc ống uống BIOFIL: Đây là sản phẩm của công ty cổ phần Dược

- Vật tư Y tế Thanh Hoá, đi từ nguyên liệu sinh khối nấm men bia Qua quá trình lắng lọc tinh chế, thuỷ phân axit kiềm với men đặc hiệu, áp dụng công nghệ mới tạo sản phẩm ống uống BIOFIL 10 ml đóng hộp 10 ống và hộp

20 ống Là thuốc bổ dưỡng giàu axit amin và vitamin nhóm B Với giá bán bằng 30 % thuốc nước ngoài cùng loại Với mức sản xuất năm 2004, làm lợi cho xã hội và người tiêu dùng 19.500 triệu đồng [29]

Ngoài các thành phần có giá trị trong dịch chiết nấm men như đã nêu ở trên thì phần bã rắn không bị thuỷ phân bao gồm chủ yếu là thành tế bào cũng có rất nhiều ứng dụng

- β–glucan là hỗn hợp sinh học tự nhiên bao gồm β 1-3, 1- 6 glucan và manna oligosaccharide được chiết suất từ thành tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae β–glucan giúp kích thích hệ thống miễn dịch tự

nhiên, tăng cường hoạt động của các đại thực bào và kích thích tiết nhiều

cytokines (chất hoạt hoá tế bào) nhằm tiêu diệt các mầm bệnh xâm nhấp từ bên ngoài Vì vậy, β-glucan đã được ứng dụng để bào chế các loại thuốc chữa vết thương, thuốc chống u bướu

β–glucan giúp giảm hệ số chuyển đổi thức ăn, kích thích tiêu hoá, phòng các bệnh đường ruột, nhiễm trùng do vi khuẩn, virut, làm giảm cholesterol trong máu β–glucan là giải pháp thay thế kháng sinh trong phòng trị bệnh vật nuôi an toàn và hiệu quả β–glucan chịu được nhiệt độ

1200C nên có thể dùng làm thức ăn ép viên [29] Hiện nay, trên thị trường

có một số sản phẩm: BETA CLUCAN 25, BETA GLUCAN 40

Thực phẩm bổ sung B complex (100 viên) 205.700 vnd Mỗi viên cung cấp đầy đủ 7 loại vitamin B từ tự nhiên (B1, B2, B3, B5, B6, axit folic

và B12) cần thiết cho cả phụ nữ và nam giới Tất cả được chiết xuất từ nấm

men

1.1.3.6 Sử dụng làm thức ăn chăn nuôi

Tuy thành phần của các axit amin trong protein nấm men không cân đối và có giá trị sinh học như axit amin từ protein động vật, nhưng giá trị dinh dưỡng của nó cũng gần giống protein động vật Sử dụng dịch thuỷ phân nấm men sẽ góp phần bổ sung các axit amin không thay thế bị thiếu hụt trong thức ăn hàng ngày như lizin, metionin,…Ngoài ra, các vitamin nhóm B, các hydratcacbon, các chất kích thích sinh trưởng,…làm vật nuôi lớn rất nhanh Hiện nay, trên thị trường có các sản phẩm của Altech sử dụng trong nuôi thuỷ sản,…

1.2 Tổng quan về protease

1.2.1 Khái quát về protease

Enzym protease là nhóm men thuỷ phân liên kết peptit (-CO-NH-) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự

Trong các enzym công nghiệp, enzym thuỷ phân chiếm 75 % và protease chiếm khoảng 60 % tổng lượng enzym được tiêu thụ trên thế giới

1.2.1.1 Phân loại protease

Người ta phân loại nhóm enzym này theo nhiều cách khác nhau [8]

- Dựa vào vị trí của liên kết peptit ở nội mạch hay ở đầu mạch thì enzym protease được chia thành 2 nhóm: endopeptidase và exopeptidase

- Dựa vào quá trình thuỷ phân có thể chia thành proteinase và peptidase Sơ đồ ước lệ của quá trình thuỷ phân protein có thể biểu diễn như sau:

Proteinase peptidase

protein → albumoza → pepton → polypeptit → peptit → axit amin

Proteinase: Là enzym thuỷ phân liên kết peptit ở giữa chuỗi mạch

polypeptit Vì vậy, nó cắt phân tử protit thành những đoạn protein có phân

tử lượng nhỏ hơn (pepton, polypeptit) Enzym này xúc tác cho quá trình thuỷ phân liên kết peptit bên trong phân tử protit Hoạt độ tối ưu đạt được khi pH = 4.6 – 4.9, nhiệt độ tối ưu là 50 – 600C, nhóm enzym này chỉ bị vô

hoạt khi nhiệt độ lớn hơn 700C Ở 500C, dưới tác dụng của enzym này sản phẩm tạo thành chủ yếu là các pha thấp phân tử (peptit, polypeptit), còn ở

600C thì sản phẩm chủ yếu thuộc nhóm phân tử lượng trung bình

Peptidase: Là nhóm enzym không ít hơn 2 cấu tử Thuỷ phân liên kết peptit

ở 2 đầu của phân tử protit Đầu tiên tạo thành các dipeptit rồi thành axit amin tự do Trong quá trình thủy phân mối liên kết peptit ở đầu amin hoặc đầu cacboxyl sẽ dần dần bị thuỷ phân Các enzym này có tính đặc hiệu rất cao Ví dụ: Dipeptidase thì thuỷ phân dipeptit, còn polypeptidase thì thuỷ phân polypeptit có từ 3 axit amin trở lên Aminopeptidase chỉ thể hiện hoạt lực xúc tác khi cơ chất có nhóm – NH2 tự do, còn cacboxylpeptidase chỉ hoạt động thuỷ phân khi cơ chất có nhóm –COOH tự do Tất cả các peptidase kém bền nhiệt hơn proteinase nhưng lại hoạt động tốt trong môi trường kiềm Hoạt động tốt nhất ở pH = 7 – 8 và nhiệt độ khoảng 40 – 420C Trong dung dịch nước, enzym này hoạt động yếu dần khi tăng nhiệt độ lên

500C và biến tính phi thuận nghịch nhanh chóng ở nhiệt độ 600C

- Dựa vào tính chất của môi trường hoạt động có thể chia thành: protease kiềm tính (pH = 8 - 11), protease trung tính (pH = 6.0 – 7.5) và protease axit tính (pH < 6.0) Tuy nhiên cách phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng, không thực sự chính xác vì pH tối thích của mỗi enzym còn phụ thuộc vào bản chất của cơ chất và nhiều yếu tố khác nữa

- Dựa vào nhóm chức năng ở trung tâm hoạt động có 4 loại: serine protease, cysteine protease, aspartic protease và metallo protease Đây là

cách phân loại phổ biến hiện nay

+ Serine protease: Là những proteinase có nhóm –OH của gốc serin trong trung tâm hoạt động có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzym Enzym thuộc nhóm này thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng Lớp enzym này được chia thành 2 nhóm nhỏ hơn đó là chymotrypsin và substilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzym của động vật có vú như: chymotrypsin, trypsin, elastase hay kallikrein Nhóm enzym substilisin gồm các enzym của vi khuẩn như substilisin

+ Cysteine protease: Là những proteinase có nhóm – SH trong trung tâm hoạt động Các enzym thuộc nhóm này thường hoạt động mạnh ở pH trung tính, có tính đặc hiệu rộng và chỉ hoạt động được khi nhóm –SH không bị bao vây như papain, bromelain,…

+ Aspartic protease: Là những enzym có chứa nhóm cacboxyl trong trung tâm hoạt động, thường hoạt động mạnh ở pH trung tính như pepsin, renin, cathepsin,…

+ Metallo protease: Là nhóm enzym được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động mạnh nhất ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác

- Chymotrypsin: Được tìm thấy ở dịch tuỵ Nó đặc hiệu với mối liên kết peptit có các nhóm cacboxyl của các axit amin thơm như phenylalanine, tryrosine hoặc tryptophan

- Pepsin: Là một proteinase axit, hoạt động thích hợp ở pH = 1.3 – 2.2 Thu được từ dịch dạ dày heo Enzym này thuỷ phân mối liên kết peptit giữa hai axit amin ưa béo Được sử dụng trong quá trình làm lạnh bia và mục đích tiêu hoá

- Renin: Là protease giống pepsin được sinh ra ở dạng tiền enzym không hoạt động trong ngăn thứ tư của dạ dày bê, và được chuyển thành dạng renin hoạt động do sự hoạt động của pepsin hoặc do quá trình tự xúc tác của chúng Renin làm biến đổi casein thành paracasein đây là chất kết tủa để hình thành vụn sữa đông trong điều kiện có canxi trong môi trường

Do đa số nguồn protease động vật phải thu nhận từ nội tạng, không mang lại hiệu quả kinh tế cao nên các nghiên cứu về chúng rất hạn chế so với protease từ thực vật và vi sinh vật

 protease thực vật

Protease thực vật được phát hiện muộn hơn protease động vật (bắt đầu

từ cuối thế kỉ 18) Việc sử dụng thực vật làm nguồn protease bị chi phối bởi

nhiều yếu tố như thổ nhưỡng, khí hậu Các protease có trong đu đủ (papain), trong dứa (bromelin), trong các cây sung, si thuộc họ ficus (fixin)

là những protease thực vật được biết đến nhiều nhất [2], [8]

- Papain: Là enzym được tách từ nhựa đu đủ, rất bền với nhiệt Nó chịu được nhiệt độ 700C ở pH 7.0 tới 30 phút, dưới dạng bột nó chịu được

1000C trong 3 giờ Nhiệt độ tối thích 60 – 700C và pH tối thích thường giữa 5.0 và 7.0

- Bromelin: Thu được từ thân cây và dịch chiết của cây dứa Enzym này có tính chất như một cystein proteinase Enzym này có nhiệt độ tối thích là 50 – 600C, pH tối thích là 5 – 8 Nhiệt độ bất hoạt của enzym này là 700C, thấp hơn so với papain Bromelin được sử dụng nhiều trong y dược và công nghiệp, được dùng thay cho papain

- Focin: Thu được từ mủ một loại sung có màu vàng kem đến màu hồng và pH axit (pH = 3- 4)

- Keratinase: Một vài nhóm thực vật sản xuất các protease thuỷ phân được lông và tóc Sự phân giải lông và tóc có tầm quan trọng trong sản xuất axit amin thiết yếu Lysine và để tránh sự tắc nghẽn của hệ thống nước thải Nhiều công bố ở trong nước và trên thế giới đã phát hiện được nguồn protease trong hạt, thịt quả, thân của các loại cây khác nhau

Các enzym protease có mặt ở nhiều loài thực vật và phân bố trong các

mô khác nhau Nhưng cho đến nay, ở Việt Nam các tác giả chỉ tập trung nghiên cứu ở dứa và đu đủ Vì vậy việc mở rộng phạm vi nghiên cứu trên các loài thực vật khác nhau là rất cần thiết

 Protease vi sinh vật

Protease vi sinh vật được phát hiện từ năm 1918, nhưng được chú ý nghiên cứu nhiều hơn từ năm 1950 Protease vi sinh vật chiếm khoảng 40

% tổng lượng enzym bán trên thế giới [2], [8], [33]

Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endoprotease hoặc exoprotease Còn vi sinh vật có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi sinh vật có tính đặc hiệu khác thường, chúng có thể phân huỷ tới 80 % liên kết peptit có trong phân tử protein Nó không những phá huỷ hoàn toàn và nhanh chóng các liên kết peptit mà còn

có khả năng phá huỷ chậm một số liên kết không đặc trưng khác Như vậy

trong từng trường hợp cụ thể, cần nghiên cứu chọn lọc loài vi sinh vật thích hợp và những điều kiện tối ưu cho hoạt độ của nó

Các protease vi sinh vật có thể được thu nhận từ vi khuẩn và nấm

- Vi khuẩn: Hầu hết các protease thương mại, chủ yếu là kiềm tính và

trung tính được sản xuất từ vi sinh vật thuộc chi Bacillus như Bacillus

subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, B.licheniformis, B.cereus Các

protease trung tính vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 - 8) và có khả năng chịu nhiệt độ thấp Các proteinase kiềm tính của vi khuẩn có khả năng hoạt động ở pH kiềm tính và có tính đặc hiệu rộng, nhiệt độ thích hợp của chúng khoảng 600C

- Nấm: Nấm tạo ra nhiều loại enzym hơn so với vi khuẩn Chẳng hạn

như Aspergillus oryzae sinh ra các protease trung tính, kiềm tính và axit

tính Các proteinase của nấm hoạt động trong vùng pH khá rộng (pH 4 - 11) và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất cao Tuy nhiên, chúng có tốc độ phản ứng thấp hơn và mức độ chịu nhiệt kém hơn so với các enzym của vi khuẩn

Như vậy, các chế phẩm protease được sản xuất từ vi sinh vật rất đa dạng, phong phú về chủng loại và tính chất Các proteinase của vi khuẩn có tốc độ phản ứng nhanh và độ bền nhiệt lớn

Protease vi sinh vật được chia làm 3 nhóm: Protease kiềm tính, protease trung tính, protease axit tính

Protease kiềm tính: Có nhiều loài vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp

protease kiềm tính Quan trọng nhất là các loài thuộc chi Bacillus như

Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus firmus,…Các

loài nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp protease kiềm tính được sử dụng

rộng rãi nhất là A niger, A oryzae, A flavus, A sojae,…Protease kiềm

tính bền ở nhiệt độ cao và bền trong môi trường kiềm pH = 9 – 11 Protease

kiềm tính của B subtilis thuỷ phân hàng loạt các liên kết peptit Protein

được thuỷ phân ở mức độ nhiều hơn so với protease trung tính

Protease trung tính: Vi sinh vật sinh tổng hợp nhóm protease này là các

loài vi khuẩn B.subtilis, B.cereus, B megaterium, Pseudomonas

aeruginosa, Streptomyces griseus, và nấm mốc A oryzae, A sojae,…Protease trung tính thường không ổn định và các ion Ca2+, Na+, Cl-

có tác dụng làm tăng tính ổn định của các enzym này Khoảng pH tối thích

thường hẹp, ở điều kiện nhiệt độ 370C hoạt độ protease là 100 % thì ở nhiệt

độ 500C, sau 30 phút, hoạt độ enzym giảm xuống còn 80 % Cũng sau khoảng thời gian đó, ở 600C hoạt độ chỉ còn 20 % và ở 700C thì chỉ sau 10 phút enzym bị vô hoạt hoàn toàn

Protease trung tính của B subtilis thuỷ phân mối liên kết peptit vốn

được tạo thành từ nhóm cacboxyl của alanin, serin, histidin và nhóm amin của valin, loxin hay phenylalanine

Protease axit tính:

- Các vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp protease nhóm này là loài

Alcaligenes, Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Pseudomonas, Serratia, Streptococcus, Streptomyces Trong các loài thuộc chi Bacillus

phổ biến là B.subtilis, B polymyxa, B.mensentericus

- Các loài nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzym làm đông sữa:

Aspergillus, Candida, Corilus, Endothia, Enthomophthora, Mucor, Penicillium, Rhizopus, Sclerotium, Torulopsis Trong số đó chỉ có ba loại

được sử dụng rộng rãi để sản xuất enzym là Mucor pusillus varlindt (nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt) và Endothia parasita, Mucor miehei

(phương pháp bề sâu)

Protease axit có pH tối thích 4.0 – 5.5 Như vậy, các chế phẩm enzym được sản xuất từ các nguồn khác nhau thì khác nhau về điều kiện hoạt động như pH, nhiệt độ, cơ chất đặc hiệu, đặc hiệu liên kết phân cắt Vì vậy việc lựa chọn chế phẩm áp dụng trong

sản xuất phải được cân nhắc để đạt được mục đích công nghệ đặt ra

1.2.1.3 Các yếu tố chính ảnh hưởng đến hoạt động của enzym

 Ảnh hưởng của nồng độ enzym

Nói chung trong điều kiện thừa cơ chất vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzym [2]

v = k [E]

Trong đó v: vận tốc phản ứng [E]: Nồng độ enzym Cũng có trường hợp khi nồng độ enzym quá lớn vận tốc phản ứng tăng chậm

 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Ở nồng độ cơ chất thấp, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào

nồng độ cơ chất

khi nồng độ cơ chất đã đủ lớn đến một mức nào đó, nếu tiếp tục tăng

thì vận tốc phản ứng sẽ không tăng theo

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Ở các nhiệt độ khác nhau, hoạt độ của enzym cũng khác nhau Nhiệt

độ ứng với hoạt độ enzym cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu của enzym Mỗi enzym có giá trị nhiệt độ tối ưu khác nhau Tuy nhiên nhiệt độ tối ưu của mỗi enzym không cố định mà có thể thay đổi tuỳ cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng,…

Nhiệt độ mà enzym bị mất hoàn toàn hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn, thường nhiệt độ tới hạn khoảng 700C Ở nhiệt độ tới hạn enzym bị biến tính, ít có khả năng phục hồi được hoạt độ Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 00C hoạt độ enzym tuy bị giảm nhưng lại có thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bình thường

 Ảnh hưởng của pH môi trường

pH môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzym vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzym và ảnh hưởng đến độ bền protein enzym Đa số enzym bền trong giới hạn pH giữa 5.0 và 9.0

pH tối ưu cho hoạt động của nhiều enzym vào khoảng 7.0 Tuy nhiên cũng có một số enzym có pH tối ưu rất thấp (pepsin, proteinaza axit của vi sinh vật,…) hoặc khá cao (substilizin có pH tối ưu > 10) pH tối ưu của một enzym cũng không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ,…

 Ảnh hưởng của chất kìm hãm và chất hoạt hoá

Tính hoạt động của một số enzym protease còn phụ thuộc vào sự có mặt của các ion kim loại và một số hợp chất khác Một số trong những chất

đó có tác dụng làm tăng tính hoạt động của enzym, còn một số khác lại có tác dụng kìm hãm hoạt động của các enzym [8]

Protease của Aspergillus awamori 78 – 2 bị kìm hãm bởi các ion Co2+,

Fe2+, Cu2+, Hg2+, Ca2+, Mg2+,Mn2+, Zn2+, Ni2+ và EDTA (etylen diamin tetraaxetic)

Protease I, II,III của Aspergillus oryzae không bị kìm hãm bởi các ion

Ba2+, Ca2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+, nhưng bị kìm hãm bởi các ion kim loại khác như Cu2+, Co2+,Cd2+,Fe3+ Protease của Bacillus subtilis bị mất hoạt tính bởi

hợp chất tạo phức và khi nồng độ ure cao, ngoài ra nó bị kìm hãm bởi EDTA Conovalov và Dorokhow nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần nước quả đến hoạt độ của enzym protease nhận thấy ion Na+ và Ca2+ là chất hoạt hoá enzym protease Đường có tác dụng kích thích enzym protease, ngược lại axit có tác dụng ức chế enzym protease Chất chát có nồng độ 0.02 % có tác dụng kìm hãm sự hoạt động của enzym protease

1.2.2 Ứng dụng của protease trong thuỷ phân protein

Với nguồn gốc thu nhận phong phú đa dạng, protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp: Công nghiệp thực phẩm, Công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược,…Trong đó ứng dụng rộng rãi nhất của protease là trong ngành công nghiệp thực phẩm

1.2.2.1 Ứng dụng trong điều chế các dịch đạm thuỷ phân

Hiện nay, sử dụng protease để thu dịch thuỷ phân protein được ứng dụng rất rộng rãi như sản xuất nước giải khát, thức ăn kiêng, xì dầu, điều chế các dịch đạm thuỷ phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm, bổ sung vào thức ăn gia súc,…hoặc các sản phẩm thuỷ phân protein thực phẩm chứa các peptit chống tăng huyết áp, làm giảm đau, kích thích miễn dịch, peptit tăng khả năng hấp thụ canxi,…Khó khăn gặp phải trong thuỷ phân protein là tạo ra các peptit đắng Thuỷ phân thái quá protein thường dẫn đến hình thành các sản phẩm thuỷ phân có vị đắng cao

Các serine proteinase của Bacillus subtilis đặc hiệu ở vị trí amino axit thơm

hoặc amino axit kỵ nước Vì vậy, chúng có khả năng làm giảm vị đắng của dịch thuỷ phân

Nấm men cũng là một nguồn protein đang được nghiên cứu nhiều để tạo sản phẩm thuỷ phân Do lượng men thải ra từ công nghiệp bia rượu ngày càng tăng mà con người vẫn chưa tận dụng hết được

Các protease sử dụng trong chế biến dịch đạm thuỷ phân như Neutrase, Flavourzyme, Viscozyme, Protamex, Alcalas

1.2.2.2 Ứng dụng trong sản xuất nước mắm

Để sản xuất nước mắm ngắn ngày từ cá, người ta phải tiến hành ủ lên men ít nhất từ 6 tháng đến một năm Nhưng với công nghệ enzym, người ta

có thể nghiền sơ bộ cá nguyên liệu đồng thời phối trộn với các chế phẩm protease Như vậy, thời gian thuỷ phân giảm xuống chỉ còn 30 ngày

Sử dụng enzym protease (Neutrase) với tỷ lệ 0.025% với cá tươi, 0.035% với cá ướp 10-15% muối và 0.075% với cá mặn 25-30% muối Đưa enzym vào chế biến chượp cá mặn hầu như không làm tăng giá thành sản phẩm vì hiệu suất sử dụng đạm cao Đạm thuỷ phân bình quân tăng 10.7%, đạm sử dụng trong sản xuất bình quân tăng 13.8% Hiệu suất sử dụng đạm tăng 2.6% Tiêu hao nguyên liệu giảm 12.1% [21]

1.2.2.3 Ứng dụng trong quá trình sản xuất bia

Việc ứng dụng các chế phẩm proteolitic trong sản xuất bia giúp cho người sản xuất có thể sử dụng hoàn toàn protein đại mạch do các enzym này chuyển protein thành trạng thái hoà tan, ổn định vào dịch đường, cho phép nâng cao giá trị sinh học của bia

Enzym protease sản xuất từ chủng Aspergillus oryzae 938/2 theo

phương pháp bề mặt có hoạt lực 145 U/ml có tác dụng tốt đến quá trình lên men của nấm men ở tỷ lệ sử dụng nguyên liệu thay thế 50 %, hàm lượng tổng nitơ hoà tan tăng 16-28 %, nitơ amin tự do tăng 18-26 % Làm giảm giá thành 100.900 đồng cho 1000 lít bia, mà chất lượng bia vẫn đạt chỉ tiêu hoá lý và cảm quan tương đương mẫu dùng 30 % nguyên liệu thay thế Việc ứng dụng các chế phẩm enzym protease vào quá trình sản xuất bia có những ưu điểm sau: Tăng tỉ lệ nguyên liệu thay thế (từ 30 % lên 50 %), giảm thời gian lên men chính (1 ngày), giống nấm men kết lắng tốt cho hiệu suất thu hồi tăng 2.5 %, bia thành phẩm đạt các chỉ tiêu hoá lý quy định, nâng cao hiệu quả kinh tế [12]

1.2.2.4 Ứng dụng trong chế biến thịt cá

Trong công nghiệp thịt cá, protease giúp làm mềm thịt nhờ thuỷ phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt mềm và có vị tốt hơn Protease dùng trong công nghiệp chế biến thịt thường là protease thực vật như: papain, bromelin, fixin,… và enzym vi sinh vật từ nấm mốc, xạ khuẩn

1.2.2.5 Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác

Trong sản xuất bột giặt, enzym chiếm 0.2-2 % khối lượng và chiếm

5-10 % giá thành nguyên liệu Công dụng của protease là phân huỷ vết bẩn dạng protein trên vải như máu, lòng đỏ trứng, sữa, nước rau, đậu, nước xốt thức ăn,… [36]

1.2.3 Một số chế phẩm enzym protease từ vi sinh vật

1.2.3.1 Chế phẩm neutrase 0.8L

Neutrase 0.8L là chế phẩm protease thương mại của hãng Novo Nordisk Đan mạch, được sản xuất nhờ quá trình lên men chìm chủng

Bacillus amyloliquefaciens [17]

Neutrase thuộc loại metallo proteinase xúc tác thuỷ phân các liên kết

peptit ở bên trong phân tử protein, polypeptit,…

Neutrase là một protease trung tính, trong khi hầu hết các chế phẩm thương mại khác đều chứa cả phần proteinase kiềm tính Dải pH hoạt động 5,5 – 7,5; dải nhiệt độ hoạt động 45 - 550C Chế phẩm này không chứa amylase, chứa một lượng β-glucanase không xác định Cần ion kẽm cho hoạt động của nó, ion Ca2+ có tác dụng làm bền enzym, enzym bị ức chế

bởi EDTA Neutrase bị vô hoạt ở 850C trong 2 phút Sự ổn định của neutrase ở nhiệt độ nhất định phụ thuộc vào loại và nồng độ cơ chất

Neutrase 0.8L có màu nâu sáng, trạng thái lỏng Nhiệt độ bảo quản 0–

100C, bảo quản trong bao bì khô, kín, tránh ánh sáng mặt trời, vi sinh vật tổng số ≤ 50000 TB/g, coliform ≤30 TB/g Neutrase 0.8L có hoạt độ là 0.8AU/g (Anson Units per gram) Các thành phần của enzym neutrase dễ dàng hoà tan trong nước

Vị trí hoạt động của neutrase khi tham gia xúc tác thuỷ phân cơ chất

có chứa nhóm hydroxyl Serine195, imidazol của histidin57, và nhóm cacboxyl của Aspartic102

Hình 1.6 Vị trí xúc tác của neutrase

 Cơ chế xúc tác của enzym neutrase

Trung tâm hoạt động của enzym gồm 3 gốc Asp102, His57, Ser195

Khi cho enzym và cơ chất tiếp xúc với nhau thì tâm ái nhân của enzym

sẽ tương tác trực tiếp với nguyên tử tích điện dương của liên kết bị thuỷ phân

Cụ thể là dưới sự giúp đỡ của gốc Asp102, His57 sẽ cho ra một proton, nguyên tử oxy của nhóm – OH của gốc Ser 195 của enzym nhận thêm một electron

Gốc này sẽ tương tác trực tiếp với nguyên tử C của nhóm CO của liên kết peptit cần phân cắt và tạo phức chất trung gian giữa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzym

Tiếp đến, phức chất này sẽ bị phá huỷ do sự sắp xếp lại các liên kết, khi này một phần của cơ chất được tách ra ngoài, 1 phần còn lại của cơ chất vẫn liên kết với gốc Ser của trung tâm hoạt động của enzym và tạo ra chất mới Acyl-enzym, chất này được hình thành giữa nhóm CO với nguyên tử oxy của nhóm –OH của gốc Ser 195 của enzym

Dưới sự trợ giúp của Asp102, His57 sẽ cho phân tử nước 1 proton, nguyên tử oxy của nước sẽ tấn công vào Acyl-enzym, để hình thành một phức chất trung gian mới

Phức chất này giải phóng sản phẩm thứ 2, lúc này liên kết giữa C của

CO của phần còn lại của cơ chất với nguyên tử oxy của nhóm –OH của gốc Ser195 bị phá vỡ Enzym giải phóng ra và bắt đầu hành trình mới

1.2.3.2 Chế phẩm enzym Flavourzyme

Flavourzyme là chế phẩm protease thương mại của hãng Novo

Nordisk Đan mạch được sản xuất từ chủng Aspergillus oryzae [17]

Flavourzyme là một hỗn hợp peptidase, vừa có hoạt tính endoprotease, vừa có hoạt tính exoprotease Có thể thuỷ phân trên 70 % mối liên kết peptit, sản phẩm thuỷ phân của flavourzyme thơm ngon, không có vị đắng khi thuỷ phân ở mức độ vừa phải Sản phẩm không có các chất độc hại,

hàm lượng muối thấp

Nhiệt độ tối ưu cho hỗn hợp enzym cũng như cho exopeptidase là

500C Thuỷ phân trong điều kiện axit nhẹ hoặc trong điều kiện trung tính, dải pH hoạt động 5.0 – 7.0; pH tối ưu cho exopeptidase 7.0 Flavourzyme

bị vô hoạt ở nhiệt độ 850C trong 5 phút hoặc ở 1200C trong 5 giây

Flavourzyme 500 MG có màu nâu, có 2 loại: