Bước đầu nghiên cứu phương pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ xanh (pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc kháng sinh nhóm β lactam bằng kỹ thuật PCR

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN TUẤN ANH Tên đề tài : BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH TRỰC TRÙNG MỦ XANH Peudomonas aeruginosa KHÁNG THUỐC KHÁN

i

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN TUẤN ANH

Tên đề tài :

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN NHANH

TRỰC TRÙNG MỦ XANH (Peudomonas aeruginosa) KHÁNG THUỐC

KHÁNG SINH NHÓM β-LACTAM BẰNG KỸ THUẬT PCR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Khóa học : 2011 - 2015 Giảng viên hướng dẫn : 1 BS Nguyễn Thị Huyền

THÁI NGUYÊN – 2015

i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy và đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt những năm học vừa qua

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

TS Nguyễn Văn Duy, Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và hướng dẫn tận tình tôi trong quá trình thực hiện đề tài

BS Nguyễn Thị Huyền, CN Trần Trung Anh và các KTV Nguyễn Thị Thủy, Trương Thùy Vi, Dương Minh Phương, Khoa Vi sinh vật, Bệnh viện

đa khoa Trung Ương Thái Nguyên đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi tận tình và đã cung cấp cho tôi các chủng vi sinh vật để thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn ở bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi học tập làm việc và hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 28 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

ii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Các cặp mồi sử dụng trong đề tài nghiên cứu 18Bảng 3.2: Các hóa chất sử dụng trong đề tài nghiên cứu 18Bảng 3.3: Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong đề tài nghiên cứu 19

Bảng 4.1: Bảng khảo sát tỷ lệ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc

trên bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 30

Bảng 4.2: Kiểu hình của 9 chủng Pseudomonas aeruginosa phân lập được tại

Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 33

Bảng 4.3: Nồng độ DNA tổng số tách chiết từ 9 chủng Pseudomonas aeruginosa 38

Bảng 4.4: So sánh sự có mặt của gene kháng metallo β-lactamase với kiểu

hình kháng β-lactam của các chủng Pseudomonas aeruginosa thu thập được

41

iii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 4.1: Khảo sát tỷ lệ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên.… 31

Hình 4.2: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết DNA tổng số của

một số mẫu Pseudomonas aeruginosa 36

Hình 4.3: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi OPRLR 38Hình 4.4: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng multiplex PCR sử dụng cặp mồi blaIMPF-blaIMPR và blaVIMF-blaVIMR 40

OPRLF-iv

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

Từ, thuật ngữ viết tắt Nghĩa đầy đủ của từ, thuật ngữ

CIAA Hỗn hợp gồm 24 chloroform : 1 isoamylalcohol

vùng DNA đặc hiệu in vitro

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay – Kỹ thuật

hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme

v

MỤC LỤC

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2.Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 3

1.3.Ý nghĩa của đề tài 3

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Tổng quan về trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) 5

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) 5

2.1.2 Đặc điểm sinh học 6

2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 8

2.2.1 Tình hình kháng thuốc của Pseudomonas aeruginosa trên thế giới 8

2.2.2 Tình hình kháng thuốc của Pseudomonas aeruginosa trong nước 9

2.3 Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn 11

2.3.1 Cơ chế enzyme khử hoạt tính của thuốc kháng sinh 11

2.3.2 Cơ chế thay đổi đích của thuốc kháng sinh 11

2.3.3 Cơ chế ngăn sự xâm nhập của kháng sinh vào trong tế bào 12

2.3.4 Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa 13

2.4 Các phương pháp phát hiện Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc 14

2.4.1 Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên đĩa thạch 14

2.4.2 Kỹ thuật xác định nồng độ tối thiểu của kháng sinh (MIC) 15

2.4.3 Kỹ thuật PCR 15

Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 17

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 17

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành 17

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 17

vi

3.2.2 Thời gian nghiên cứu 17

3.3 Vật liệu nghiên cứu 17

3.3.1 Các cặp mồi sử dụng trong đề tài 17

3.3.2 Hóa chất sử dụng trong đề tài 18

3.3.3 Dụng cụ, thiết bị 19

3.4 Nội dung nghiên cứu 19

3.5 Phương pháp nghiên cứu 19

3.5.1 Phương pháp phân lập Pseudomonas aeruginosa từ bệnh nhân 19

3.5.2 Phương pháp xác định kháng sinh đồ 24

3.5.3 Phương pháp nghiên cứu phát hiện Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR 25

Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Khảo sát tỷ lệ kháng thuốc kháng sinh của các chủng Pseudomonas aeruginosa trên các bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 29

4.2 Kết quả phân lập chủng Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc kháng sinh tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên 32

4.3 Thử nghiệm khả năng phát hiện nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc 35

4.3.1 Tách chiết DNA tổng số 35

4.3.2 Kiểm định các chủng Pseudomonas aeruginosa 37

4.3.3 Nghiên cứu khả năng phát hiện nhanh vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc 39

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Kiến nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1

Phần 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) là một trong những

nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện Chúng gây nên những bệnh lí với nhiều mức độ khác nhau như viêm phổi, nhiễm khuẩn vết thương, nhiễm khuẩn huyết nặng với tỉ lệ tử vong khá cao

Tỉ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện do trực trùng mủ xanh (P aeruginosa) đã

tăng dần trong những năm gần đây trên thế giới và cả Việt Nam Cùng với sự gia tăng về tỉ lệ nhiễm khuẩn khả năng kháng kháng sinh cũng tăng cao Theo báo cáo của CDC ước tính rằng mỗi năm ở Hoa Kì có hơn hai triệu người mắc bệnh với bệnh nhiễm trùng kháng thuốc kháng sinh thì có ít nhất 23.000

người chết và có khoảng 51.000 ca nhiễm bệnh liên quan đến P aeruginosa Trong các ca nhiễm bệnh liên quan đến P aeruginosa có hơn 6000 (13%) là

đa kháng thuốc, với khoảng 400 ca tử vong do nhiễm trùng (Fatima A và cs,

2012) [22] Theo kết quả một nghiên cứu khác (2013), trong 112 mẫu P aeruginosa phân lập được từ bệnh nhân điều trị bỏng tại một bệnh viện năm

2012 cho thấy tỷ lệ kháng tương đối cao như Gentamicine (59,6%), Piperacillin (36,8%) và Ciprofloxaxin (33,3%) (Joseph N M và cs, 2013) [26]

Ở Việt Nam, một nghiên cứu ở 36 bệnh viện các tỉnh phía Bắc từ Trung Ương đến địa phương trong năm 2006 – 2007 đã công bố có tới 7,8% bệnh nhân mắc nhiễm trùng bệnh viện (HAIs) Có 3 loại nhiễm khuẩn bệnh viện chính gồm viêm phổi, nhiễm khuẩn vết mổ và nhiễm khuẩn tiêu hóa trong đó

P aeruginosa là nguyên nhân chính (chiếm 31,5%) (Nguyễn Văn Hùng và cs,

2008) [8] Theo kết quả nghiên cứu từ 4 bệnh viện tại Hà Nội: Việt Đức,

Tình hình đề kháng đa kháng sinh của P aeruginosa được ghi nhận trong

những nghiên cứu trên cho thấy sự gia tăng về tình hình nhiễm khuẩn bệnh

viện do P aeruginosa cũng như khả năng kháng lại kháng sinh của vi khuẩn

này gây nên, làm tăng tỉ lệ bệnh tật, tăng tỉ lệ tử vong và tăng chi phí điều trị

Để phát hiện P aeruginosa kháng thuốc phương pháp thường được sử

dụng hiện nay là nuôi cấy trên môi trường thạch kết hợp với các thử nghiệm hóa sinh và làm kháng sinh đồ Đây là phương pháp phức tạp và tốn nhiều

thời gian, chậm cho kết quả (4 - 6 ngày) Sự phát hiện chậm P aeruginosa

kháng thuốc là một trong những nguyên nhân làm chậm hướng điều trị và góp phần làm giúp cho những tác nhân gây bệnh này có cơ hội lây lan trong cộng đồng, ảnh hưởng đến sức khỏe của nhiều người

Với sự phát triển của sinh học phân tử, các vùng gene đặc hiệu cho tính kháng thuốc của các loài vi sinh vật đã được hiểu biết ngày càng đầy đủ Nhờ

đó, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã được ứng dụng trong việc phát hiện nhanh và đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh trong mẫu phân tích dựa trên các dấu hiệu phân tử mang tính đặc hiệu Các kỹ thuật này bao gồm kỹ thuật PCR, ELISA, DNA arrays…

PCR là kỹ thuật cho phép phát hiện tác nhân gây bệnh kháng thuốc chỉ trong một phép phân tích Đây là kỹ thuật đơn giản, không yêu cầu thiết bị phức tạp nên rất thuận lợi trong việc áp dụng thực tiễn chẩn đoán

Xuất phát từ thực tiễn đời sống, trên cơ sở căn cứ vào năng lực nghiên cứu của Khoa CNSH và CNTP - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên - Đại học

Thái Nguyên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Bước đầu nghiên cứu

3

phương pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ xanh (Pseudomonas

aeruginosa) kháng thuốc kháng sinh nhóm β-lactam bằng kỹ thuật PCR”

Trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát mức độ

kháng thuốc kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa tại các bệnh nhân điều

trị tại Bệnh viện Đa khoa Thái Nguyên trong thời gian từ tháng 12 năm 2014

đến tháng 5 năm 2015 và bước đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong

phát hiện nhanh vi khuẩn này kháng các thuốc kháng sinh thuộc nhóm

β-lactam

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

- Mục tiêu của đề tài

Bước đầu nghiên cứu được phương pháp phát hiện nhanh trực trùng mủ

xanh (Pseudomonas aeruginosa) kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR

- Yêu cầu của đề tài

+ Khảo sát được tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

kháng thuốc trên bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương

Thái Nguyên

+ Phân lập được vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc

+ Bước đầu nghiên cứu được phương pháp phát hiện nhanh

Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc bằng kỹ thuật PCR

1.3 Ý nghĩa của đề tài

- Ý nghĩa trong khoa học

Bước đầu xây dựng thành công một kỹ thuật PCR phát hiện

Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc

- Ý nghĩa trong thực tiễn

+ Phục vụ công tác điều trị, khám chữa bệnh Tạo tiền đề cho việc xây

dựng bộ kit chẩn đoán nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc dựa trên

kỹ thuật PCR

4

+ Kết quả nghiên cứu cung cấp góp phần bổ sung các phương pháp

chẩn đoán nhanh và đặc hiệu Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc, phục vụ

cho việc bảo vệ sức khỏe cộng đồng

5

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)

2.1.1 Lịch sử nghiên cứu trực trùng mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)

Năm 1872, P aeruginosa được Schroeter mô tả lần đầu tiên với tên gọi

là Bacterium aeruginosa (Lê Huy Chính và cs, 2001) [3]

Năm 1900, Migula đã nghiên cứu và phân loại vi khuẩn này vào chi

Pseudomonas; từ đó vi khuẩn này mang tên Pseudomonas aeruginosa (Lê

Năm 2003, theo kết quả giám sát của Bộ y tế về các vi khuẩn gây bệnh

thường gặp ở Việt Nam thì P aeruginosa là vi khuẩn đứng đầu trong số các

vi khuẩn đó chiếm tỷ lệ 22,3% (Lê Đăng Hà và cs, 2003) [5]

Lê Thu Hồng, Hoàng Ngọc Hiện (bộ môn vi sinh - Học viện quân y)

đã nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng P aeruginosa đa giá, tinh chế và

đánh giá hiệu quả điều trị tại chỗ của chế phẩm trên động vật và bệnh nhân bỏng (Lê Thu Hồng và cs, 2002) [7]

Nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh phân lập tại bệnh viện Thống Nhất (8/2002 - 8/2005) của Hoàng Kim Tuyến và cộng

sự đã chứng minh được P aeruginosa là nguyên nhân hàng đầu gây viêm

phổi tại bệnh viện với tỷ lệ kháng thuốc khá cao (>60%) (Hoàng Kim Tuyến

và cs, 2006) [13]

6

2.1.2 Đặc điểm sinh học

- Hình thái và cấu tạo

Trực khuẩn Gram âm, hình que, thẳng, hơi cong, hai đầu tròn, kích thước 0.5 - 1μm x 1 - 5 μm, đứng một mình hay thành đôi hoặc kết hợp thành chuỗi ngắn Di động nhờ tiên mao đơn cực, ít khi có vỏ, không sinh bào tử (Balcht và

cs, 1994) [18]

- Cấu trúc tế bào

+ Vỏ Polysaccharide

Pseudomonas aeruginosa tiết ra chất nhầy có cấu tạo là polysaccharide

gồm nhiều tiểu phần mannuronic acid và glucuronic acid hay còn được gọi là alginate Các dạng alginate này kết hợp với nhau tạo thành dạng cấu trúc biofilm giúp bảo vệ che chở vi khuẩn tồn tại được trong môi trường tự nhiên cũng như tránh được hệ miễn dịch của cơ thể vật chủ

+ Màng sinh chất:

Hầu hết các chủng P aeruginosa có khả năng tổng hợp một loại protein

trên bề mặt màng sinh chất (pr F) Protein F vận chuyển có chọn lọc các chất qua lại màng trong giới hạn khoảng 500Da Vì vậy, nó làm giảm tính thấm

của màng, ngăn không cho các chất có hại đi vào bên trong tế bào giúp cho P aeruginosa có khả năng đề kháng cao với nhiều loại kháng sinh (Mutharia L

M và cs, 1982) [33]

+ Tiên mao:

Pseudomonas aeruginosa có một tiên mao duy nhất ở một cực, tiên

mao giúp cho vi khuẩn di động Về cấu tạo hoá học, tiên mao được cấu tạo bởi các protein gọi là Flagellin Các Flagellin mang tính chất kháng nguyên gọi là kháng nguyên lông H

+ Tiêm mao:

Vật chất di truyền của P aeruginosa là một phân tử DNA trần, dạng

vòng tồn tại trong nguyên sinh chất Kích thước DNA từ 5,2 - 7 triệu cặp base

chứa khoảng 65% là (Guanine + Cytosine) Ngoài ra, P aeruginosa cũng có

chứa vật chất di truyền ngoài nhân đó là các plasmid Các plasmid chứa các đoạn gene như TEM, OXA, PSE mã hóa sinh ra enzyme β-lactamase làm phá

huỷ vòng β-lactam của chất kháng sinh dẫn tới P aeruginosa kháng lại với

hầu hết các kháng sinh thuộc nhóm này Do vậy mà rất khó khăn trong việc

lựa chọn thuốc điều trị nhiễm khuẩn do P aeruginosa gây ra

- Tính chất nuôi cấy

Trực trùng mủ xanh (P aeruginosa) mọc dễ dàng trên các môi trường

nuôi cấy thông thường, hiếu khí như thạch dinh dưỡng, thạch máu, canh thang nhưng thích hợp nhất là môi trường SS (shigella salmonella) Nhiệt độ thích hợp 37oC nhưng phát triển được ở nhiệt đố 5 - 42oC, pH thích hợp 7,2 - 7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5 - 9,0 (Đái Duy Ban và cs, 2009) [1]

Trên môi trường đặc: Có thể gặp 2 loại khuẩn lạc: một loại to, nhẵn, dẹt, trung tâm hơi lồi (khuẩn lạc S) Một loại xù xì bờ không đều (khuẩn lạc R), đôi khi có loại khuẩn lạc nhầy Trên môi trường thạch máu đa số gây tan máu Trong các nuôi cấy từ bệnh phẩm thường gặp loại khuẩn lạc thứ nhất Trong các nuôi cấy từ môi trường thường gặp loại khuẩn lạc thứ hai

Trong môi trường lỏng vi khuẩn mọc thành váng ở trên

8

2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.2.1 Tình hình kháng thuốc của Pseudomonas aeruginosa trên thế giới

Lateef A (2005), khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn trên các mẫu

bệnh phẩm, thực phẩm, nước uống cho thấy: P aeruginosa được tìm thấy

trong các mẫu bệnh phẩm, dược phẩm, đất bị nhiễm dầu, nước (nước sông,

nước giếng và nước máy) Kết quả: 3,46% P aeruginosa phân lập từ đất đề

kháng với 5 loại kháng sinh Trong bệnh phẩm, 7,69% đề kháng 6 loại kháng sinh, 30,77% đề kháng 7 loại kháng sinh, 23,1% đề kháng với 8 loại kháng sinh (ampicillin, chloramphenicol, cloxacillin, erythromycin, penicillin, tetracycline, streptomycin, gentamicin) Trong dược phẩm, loại vi khuẩn này cũng có hiện tượng đề kháng đa kháng sinh từ 2, 4 đến 8 loại kháng sinh khác nhau (augmentin, amoxycillin, tetracycline, cotrimoxazole, nalidixic acid,

ofloxacin, nitrofurantoin) Trong nước, 6,7% P aeruginosa kháng lại 4 loại

kháng sinh, 8,5% kháng với 5 loại kháng sinh (augmentin, amoxycillin, tetracycline, cloxacillin, cotrimoxazole) (Lateef A và cs, 2005) [28]

Ngoài ra, một số nghiên cứu khác trên bệnh phẩm cũng cho thấy khả năng

đề kháng kháng sinh của P aeruginosa khá cao Gales A C (1997-1999),

6631 chủng P aeruginosa được phân lập chủ yếu trên bệnh nhân viêm đường

hô hấp tại 3 vùng khác nhau (Châu Âu, Cannada, Châu Mỹ Latin) Trong đó

218 mẫu P aeruginosa đa kháng thuốc – đề kháng với nhiều loại kháng sinh

thông dụng (piperacillin, ceftazidime, imipenem, and gentamicin), với tỉ lệ 8,2% ở Châu Mỹ Latin, 0,9% ở Cannada (Gales A C và cs, 2001) [23]

Oguntibeju O O và Nwobu R A U (2004), nghiên cứu P aeruginosa trên những bệnh nhân bị nhiễm trùng vết thương thấy rằng: tỉ lệ P aeruginosa

xâm nhiễm vào phụ nữ cao hơn đàn ông (tỉ lệ 3 : 2) và tìm thấy nhiều hơn trên các bệnh nhân là trẻ em và người già Khảo sát tính nhạy cảm kháng sinh của

20 chủng P aeruginosa phân lập được cho thấy tính nhạy cảm của vi khuẩn

9

này với một số kháng sinh, tỉ lệ là colistin (100%), gentamicin (75%), streptomycin (30%), và tetracycline (10%) (Oguntibeju O O và cs, 2004) [34] Theo nhiều tác giả, fosfomycin là một kháng sinh rất hữu hiệu trong

điều trị các nhiễm trùng do P aeruginosa gây ra Đặc biệt, fosfomycin có

hiệu quả khi kết hợp với các kháng sinh như oxfloxacin (Mirakhur A và cs, 2003) [31]

Theo Hirulkar N B và Soni B (2011), nghiên cứu phân lập P aeruginosa trong nước uống Trong số 22 mẫu được phát hiện nhiễm P aeruginosa khi

được phân lập cho thấy kháng 55% là Ciprofloxacin, tiếp theo là Gentamicin (51%), Nitrofurantoin (51%), Erythromycin (50%), Cotrimoxazole (50%), Ofloxacin (50%), tetracycline (46%), tfloxacin (46%), Cefalexin (46%), Metronidazole (46%), Ampicillin (41%), Penicillin (41%) và Amoxycillin (41%) (Hirulkar N B và cs, 2011) [25]

Theo nghiên cứu của Joseph N M và cộng sự (2013), từ 112 mẫu P aeruginosa phân lập được từ bệnh nhân điều trị năm 2012 Kết quả tỷ lệ kháng

Gentamicine (59,6%), Piperacillin (36,8%) và Ciprofloxaxin (33,3%) (Joseph N

M và cs, 2013) [26]

2.2.2 Tình hình kháng thuốc của Pseudomonas aeruginosa trong nước

Các nghiên cứu trong nước về tình hình nhiễm P aeruginosa trong nước

uống chưa được nghiên cứu Hầu hết khả năng gậy bệnh và tính đề kháng kháng sinh của loại vi khuẩn này chủ yếu được phân lập trên bệnh phẩm Quá trình theo dõi mức độ đề kháng trong năm 1997 của Võ Thị Chi Mai và cộng

sự trên các tác nhân trong nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn đường hô hấp và

nhiễm khuẩn đường tiết niệu thì P aeruginosa là nguyên nhân chính Hơn thế

nữa, hầu hết 374 dòng trực trùng mủ xanh phân lập từ máu (16), nước tiểu (47) và đờm (311) kháng nhiều loại kháng sinh Ðối với cephalosporins thế hệ

3, đến 62,5% kháng cefotaxime và 38,9% kháng ceftazidime Các vi khuẩn

10

này kháng amikacin 10,8% và tobramycin 59% Trên fluoroquinolones, tỉ lệ kháng ofloxacin là 58,3%, kháng norfloxacin 55,2% và kháng ciprofloxacin 43,8% (Võ Thị Chi Mai và cs, 1997) [11]

Nghiên cứu về tình trạng nhiễm khuẩn bệnh viện tại Bệnh viện Đa khoa (BVĐK) tỉnh Quảng Ngãi và Bệnh viện Đa khoa khu vực Bồng Sơn từ năm

2003-2004 cho thấy P aeruginosa đứng hàng thứ 3 với tỷ lệ 18,8%, gặp chủ

yếu ở bệnh phẩm mủ, chỉ nhạy với amikacin, axepim, ceftazidin, ceftriaxon Kết quả kiểm tra mẫu nước y tế tại 2 bệnh viện cho thấy: năm 2003 mẫu nước tại BVĐK khu vực Bồng Sơn không có vi khuẩn gây bệnh, năm 2004 các mẫu nước ngâm dây máy hút, rửa tay, nước tắm bé lấy từ sô đựng nước của

cả 2 bệnh viện (nước cất dùng làm ẩm bình ôxy, ngâm dây thở, hút đàm) đều

bị nhiễm P aeruginosa và Pseudomonas sp Hai loại vi khuẩn gây bệnh trong mẫu nước chủ yếu là P aeruginosa (71,4%) và trực khuẩn đường ruột gram

âm (28,6%) (Hồ Việt Mỹ và cs, 2004) [12]

Trong một nghiên cứu của Lê Bảo Huy và cộng sự (2005), tác nhân gây bệnh viêm phổi bệnh viện chủ yếu là vi khuẩn Gram âm chiếm 86,15% trong

đó P aeruginosa chiếm 41,15% Vi khuẩn này đã đề kháng cao đối với những

kháng sinh chuyên trị và hay dùng ở Việt Nam (nhất là các khoa ICU: khoa điều trị tích cực): imipenem (66,7%), ticarcillin/a.clavulanic (45%), ceftazidime (74,1%), cefepime (77,8%), ciprofloxacin (96,3%) (Lê Bảo Huy và cs, 2005) [9] Theo nghiên cứu của Hoàng Doãn Cảnh và cộng sự (2014), trong tổng số 28

chủng P aeruginosa phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm ở Viện Pasteur, TP Hồ Chí Minh P aeruginosa có mức độ kháng với các kháng sinh: CS(10,7%), FOS

(24%), ATM(36%), AN (42,9%), CIP(48,2%), FEP (45,8%), IPM (46,2%), GM (55,6%), CFP(54,2%), TCC (54,2%), TM(54,2%), PIP(60,7%), CFS (62,5%),

SSS(64%) Tỉ lệ này thể hiện sự đa kháng thuốc của P aeruginosa và mức độ

11

kháng kháng sinh của P aeruginosa là khá cao (trên 40%) (Hoàng Doãn Cảnh và

cs, 2014) [2]

2.3 Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn

2.3.1 Cơ chế enzyme khử hoạt tính của thuốc kháng sinh

Vi khuẩn sản xuất enzyme có thể thay đổi hoặc làm giảm tác dụng của kháng sinh, bằng cách này chúng phá hủy hoạt tính của kháng sinh Cơ chế

này được biết đến nhiều nhất và sớm nhất với penicillinase phá hủy vòng

β-lactam, biến penicillin thành penicilloic acid, làm mất tác dụng của thuốc (Guardabassi L và cs, 2006) [24] Sau đó hàng loạt các enzyme β -lactamase

có khả năng ức chế hoặc phân hủy các kháng sinh mạnh như cephalosporin và carbapenem được phát hiện

Hiện nay đã xác định được hơn 890 loại enzyme kháng kháng sinh của vi khuẩn, nhiều hơn số lượng các loại kháng sinh đã được sản xuất và phần lớn các gene mã hóa các enzyme này nằm trên các plasmid có thể truyền dễ dàng trong quần thể vi khuẩn cùng và khác loài (Anton Y P và cs, 2010) [17]; (Bush K và cs, 2010) [19] β –lactamase phổ rộng, gọi là carbapenemases có khả năng làm giảm tác dụng của kháng sinh carbapenem và có thể chịu trách

nhiệm kháng với imipenem và meropenem, loại enzyme này có trong P aeruginosa và trực khuẩn gram âm khác (Mulvey M R và cs, 2009) [32]

2.3.2 Cơ chế thay đổi đích của thuốc kháng sinh

Mỗi chất kháng sinh có đích tác động, điểm gắn kết khác nhau ở vi khuẩn Các đích cho kháng sinh có thể bị thay đổi hoặc được bảo vệ bởi sự gắn kết của một protein, do đó thuốc không thể gắn vào và tác động đến vi khuẩn Cơ chế đề kháng này xảy ra với hầu hết kháng sinh Kháng sinh nhóm β-lactam tác động bằng cách gắn vào cấu trúc trên thành tế bào vi khuẩn gọi

là penicillin binding protein (PBP) (Mulvey M R và cs, 2009) [32]

12

2.3.3 Cơ chế ngăn sự xâm nhập của kháng sinh vào trong tế bào

Làm giảm mức độ thấm của kháng sinh qua thành tế bào vi khuẩn trong trường hợp kháng tetracycline hoặc làm mất hệ thống vận chuyển qua màng trong trường hợp kháng kháng sinh nhóm aminoglycosid Việc thâm nhập của các kháng sinh nhóm beta-lactam được thực hiện qua các kênh vận chuyển (porin), vi khuẩn biến đổi làm mất các kênh vận chuyển và làm hạn chế sự tác động của nhóm kháng sinh này (Anton Y P và cs, 2010) [17]

Vách tế bào của vi khuẩn Gram âm bao gồm màng bên trong và bên ngoài, hoạt động như một rào cản chống thấm Để vận chuyển các chất cần thiết thông qua màng ngoài, các tế bào vi khuẩn sản xuất ra protein ngoài màng (porins) Protein ngoài màng này cho phép khuếch tán các phân tử (bao gồm cả thuốc kháng sinh vào trong tế bào Các đột biến làm thay đổi cấu trúc của protein ngoài màng tạo ra một rào cản làm cho các kháng sinh không thể

khuếch tán vào trong tế bào Cơ chế này có ở P aeruginosa và các trực khuẩn

Gram âm khác có thể kháng thuốc kháng sinh thuộc nhóm β-lactam (Livermore D M và cs, 2001) [29]

Cơ chế bơm thuốc ra (efflux pumps): hệ thống bơm thoát dòng có tác dụng chuyển kháng sinh ra ngoài, làm giảm nồng độ thuốc trong tế bào của vi khuẩn Trước đây, cơ chế này được biết đến như là một trong những cơ chế chính của vi khuẩn đề kháng với kháng sinh nhóm tetracycline (tetracycline,

minocycline, doxycyc-line) mã hóa bởi gene Tet (Tet-pump) Hiện nay, cơ

chế này được đề cập đến như là một cơ chế đề kháng nhiều nhóm kháng sinh

(đa đề kháng) với các bơm được mã hóa bởi các gene MefA/E (đề kháng nhóm macrolides), AmrAB-OprA, MexXY-OprM và AcrD (đề kháng nhóm aminoglycosides), MexAB-OprM (đề kháng nhóm β-lactam), AcrAB- TolC và Mex (đề kháng nhóm flouroquinolones) (McGowan JE Jr., 1983)

[30]

13

2.3.4 Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa

2.3.4.1 Cơ chế enzyme khử hoạt tính của kháng sinh

Theo Daniel J W và cộng sự (2013) enzyme khử hoạt tính của kháng sinh nhóm β-lactam được chia ra thành các nhóm (Daniel J W và cs, 2013) [21]:

Nhóm AmpC cephalosporinase: Các AmpC của P aeruginosa là một enzyme cảm ứng tự nhiên Sự gia tăng AmpC của P aeruginosa có thể gây ra

sự đề kháng với hầu như tất cả các kháng sinh nhóm β-lactam

Nhóm AmpC cephalosporinase phổ rộng: các enzyme này có thể biểu hiện tăng hoạt động thủy phân để chống lại các cephalosporin và imipenem Nhóm β-lactamase: bao gồm các emzyme plasmid mã hóa TEM-1, TEM-

2, và SHV-1 Nhóm β-lactamases dễ dàng thủy phân penicillin và cephalosporin Nhóm β-lactamase phổ rộng (ESBL): là biến thể của nhóm β-lactamase

Có thể thủy phân penicillin, cephalosporin, oxyimino-cephalosporin (ceftazidime và cefotaxime) và các monobactam aztreonam

Nhóm Penicillinases: được xác định trong P aeruginosa bao gồm PSE-1,

PSE-3, PSE-4, PSE-5, CARB-3, và CARB-4 Các enzyme này bị ức chế bởi clavulanate Tuy nhiên, chúng thủy phân hiệu quả ticarcillin và chúng cung

cấp cho P aeruginosa khả năng kháng với ticarcillin-clavulanate

Nhóm OXA-type Penicillinases: bị ức chế bởi clavulanate và tazobactam

Có tác dụng thủy phân hiệu quả với loxacillin và oxacillin

Nhóm OXA-type β-lactamase phổ rộng: có khả năng thủy phân

oxyimino-cephalosporin và aztreonam và tăng khả năng kháng thuốc cho P aeruginosa

Nhóm OXA-type Carbapenemases: các OXA-type carbapenemases có ái lực cao với carbapenems, chúng thủy phân không hiệu quả các chất và khó để đánh giá ý nghĩa lâm sàng của chúng

14

Nhóm Carbapenemases: Có khả năng thủy phân các penicillin, cephalosporin

và aztreonam nhưng chúng bị ức chế bởi tazobactam và clavulanic acid

Nhóm Metallo β-lactamase: cung cấp sức đề kháng đối với penicillin, ức chế sự kết hợp giữa penicillin và carbapenems

2.3.4.2 Cơ chế ngăn sự xâm nhập của kháng sinh vào trong tế bào

Các OprD porin của P aeruginosa là một porin chất nền cụ thể tạo điều

kiện cho sự khuếch tán các amino acid cơ bản các peptide nhỏ và carbapenems vào trong tế bào Khi các OprD giảm xuống hoặc bị mất đi tính

nhạy cảm của P aeruginosa đối với carbapenems cũng giảm (Daniel J W và

cs, 2013) [21]

lactam tự do khuếch tán vào tế bào P aeruginosa Tuy nhiên enzyme lactamase gặp phải trở ngại lớn trong quá trình xâm nhập vào trong tế bào P aeruginosa do sự bơm đẩy ra khỏi tế bào Có 3 cơ chế bơm đẩy β-lactam cụ

β-thể là: MexAB-OprM, MexCD-OprJ và MexXY (Daniel J W và cs, 2013) [21]

2.4 Các phương pháp phát hiện Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc 2.4.1 Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên đĩa thạch

- Nguyên lý: Kháng sinh trong khoang giấy sẽ được khuếch tán vào

môi trường thạch Mueller Hinton (MH) đã cấy các chủng P aeruginosa thử nghiệm Mức độ nhạy cảm của P aeruginosa với kháng sinh được biểu

hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh (CLSI, 2010) [20]

- Ưu điểm: Đây là kỹ thuật đơn giản, giá thành rẻ, được sử dụng phổ biến để điều trị và giám sát dịch tễ học

- Hạn chế: kỹ thuật này chỉ phát hiện được mức độ nhạy cảm nồng độ kháng sinh cho biết trước

15

2.4.2 Kỹ thuật xác định nồng độ tối thiểu của kháng sinh (MIC)

- Nguyên lý: Các chủng vi khuẩn thử nghiệm được nuôi cấy trên các đĩa thạch Mueller Hinton (MH) hoặc canh thang có chứa nồng độ kháng sinh khác nhau Nồng độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn được

xác định khi mật độ khuẩn lạc ≤ 3

- Ưu điểm: Đây là kỹ thuật chuẩn thức được áp dụng nhằm xác định nồng độ kháng sinh nhỏ nhất ức chế sự phát triển của vi khuẩn, kết quả giúp các bác sỹ lựa chọn và tính toán liều kháng sinh cho bệnh nhân (CLSI, 2010)

[20]

- Hạn chế: Kỹ thuật này có giá thành cao, phức tạp, đầy đủ trang thiết bị

và cán bộ có kinh nghiệm để thực hiện

2.4.3 Kỹ thuật PCR

- Nguyên lý: Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý tổng hợp DNA trong tế bào được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn Quá trình tổng hợp DNA được bắt đầu theo chu trình: hai sợi DNA làm khuôn mẫu bị tách ra dưới tác dụng của nhiệt độ Hai đoạn mồi oligonucleotide từ 20 - 40 nucleotide sẽ gắn vào các vị trí bổ sung trên đoạn DNA mẫu Trong điều kiện của PCR, hai mồi sẽ được kéo dài về hai phía, tạo ra đoạn DNA mới bổ sung với đoạn khuôn mẫu

- Ưu điểm: Với một cặp mồi đặc hiệu một đoạn DNA nào đó sẽ được tổng hợp sau mỗi chu kỳ nhiệt của PCR Hàng triệu bản sao sẽ được tổng hợp trong thời gian ngắn và chúng ta có thể phát hiện được các đoạn gene đặc hiệu cần khuếch đại trên thạch điện di Kỹ thuật PCR hiện đang được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như Y học, sinh học và nông nghiệp với nhiều mục đích khác nhau như phát hiện các căn nguyên gây bệnh do vi khuẩn hay phát hiện các gene kháng kháng sinh (Kumarasamy K K và cs, 2010) [27]

- Hạn chế: Cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại

Để có đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại

16

Kích thước DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb Khả năng ngoại nhiễm lớn (do thao tác nhiều lần)

17

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc phân lập từ

bệnh nhân điều trị tại bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên từ tháng

12 năm 2014 đến tháng 5 năm 2015

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu

Các chủng Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc thu thập được từ người

bệnh điều trị tại bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên từ từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 5 năm 2015

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu

- Khoa vi sinh vật, Bệnh viện đa khoa Trung Ương Thái Nguyên

- Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên

3.2.2 Thời gian nghiên cứu

Từ 12/2014 – 05/2015

3.3 Vật liệu nghiên cứu

3.3.1 Các cặp mồi sử dụng trong đề tài

Đề tài nghiên cứu này sử dụng 3 cặp mồi bao gồm: cặp mồi

OPRLF-OPRLR sử dụng để định danh vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, cặp mồi

blaIMPF-blaIMPR đặc hiệu cho gene kháng metallo β-lactamase họ IMP và cặp mồi blaVIMF-blaVIMR đặc hiệu cho gene kháng metallo β-lactamase họ VIM Tất cả các cặp mồi trên được sử dụng dựa theo công bố của Aghamiri

Bảng 3.1: Các cặp mồi sử dụng trong đề tài nghiên cứu

Tên mồi Trình tự nucleotide (5’→3’) Tm ( o C)

Kích thước sản phẩm PCR (bp)

3.3.2 Hóa chất sử dụng trong đề tài

Bảng 3.2: Các hóa chất sử dụng trong đề tài nghiên cứu

19

3.3.3 Dụng cụ, thiết bị

Bảng 3.3: Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong đề tài nghiên cứu

12 Micropipet các loại Gillson, Pháp

3.4 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc

trên bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Đa khoa Trung Ương Thái Nguyên

- Phân lập vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc

- Nghiên cứu phát hiện nhanh Pseudomonas aeruginosa kháng thuốc

bằng kỹ thuật PCR

3.5 Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp phân lập Pseudomonas aeruginosa từ bệnh nhân

Phương pháp phân lập Pseudomonas aeruginosa từ bệnh nhân được

thực hiện dựa trên kỹ thuật xét nghiệm vi sinh lâm sàng của TS BS Phạm

Hùng Vân (Phạm Hùng Vân, 2006) [14]

20

* Nhuộm soi sơ bộ

Sau khi lấy được bệnh phẩm, đem nhuộm soi để quan sát hình thể, tính chất bắt màu, kích thước và cách sắp xếp của vi khuẩn Thông qua kết quả nhuộm soi sơ bộ có thể định hướng cho việc nuôi cấy

Phương pháp nhuộm: Sử dụng kỹ thuật nhuộm Gram dựa theo kỹ thuật

do nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram phát triển năm 1884

- Soi dưới kính hiển vi quang học ở vật kính dầu với độ phóng đại 100

- Nhận định kết quả:

+ Cầu khuẩn Gram dương bắt màu tím

+ Trực khuẩn Gram âm bắt màu đỏ, hình que

* Kỹ thuật nuôi cấy

Sau khi lấy bệnh phẩm, tùy theo từng loại bệnh phẩm mà tiến hành nuôi cấy trên các môi trường thích hợp Tất cả các kỹ thuật nuôi cấy phải được thực hiện trong box cấy vô trùng

- Bệnh phẩm là nước tiểu, mủ, mẫu nước, mẫu lấy từ mặt phẳng các dụng cụ y tế: Nuôi cấy trên môi trường thạch máu

- Bệnh phẩm là dịch mũi họng: Nuôi cấy trên môi trường thạch máu

và thạch chocolate sau đó để tủ ấm CO2 (5 - 7%)

Tiến hành nuôi cấy:

- Đối với bệnh phẩm mủ, dịch mũi họng, mẫu lấy từ mặt phẳng các dụng cụ y tế ta có quy trình nuôi cấy như sau:

+ Đánh dấu bệnh phẩm và số mẫu vào mặt sau hộp thạch những thông tin trùng khớp nhau

+ Tay trái cầm đĩa môi trường, khử khuẩn nơi định mở trên ngọn lửa đèn cồn, dùng ngón cái và ngón giữa tay trái đẩy nắp hộp lồng lên

+ Tay phải cầm que cấy lấy một ít bệnh phẩm, ria cấy trên bề mặt môi trường theo kỹ thuật cấy 3 vùng

21

+ Đậy nắp hộp lồng, khử trùng que cấy

+ Nuôi cấy trong tủ ấm trong 18 - 24 giờ, nhiệt độ 37oC

- Đối với bệnh phẩm nước tiểu, trước khi nuôi cấy phải tiến hành pha loãng 100 lần trong nước muối sinh lý, cách làm như sau:

+ Lấy pipet vạch chuẩn hút ra 0,5 ml nước tiểu cho vào ống nghiệm 1 (chứa 4,5 ml nước muối sinh lý) tạo thành nước tiểu pha loãng 10-1, tiếp tục dùng pipet hút ra 0,5 ml dung dịch ở ống nghiệm 1 vừa pha cho vào ống nghiệm

2 (chứa 4,5 ml nước muối sinh lý) sẽ thu được nước tiểu pha loãng 10-2

Cách cấy nước tiểu:

+ Lấy pipet Pasteur hơ trên ngọn lửa đèn cồn, bẻ cong đầu que cấy tạo thành góc 90oC

+ Dùng pipet vạch chuẩn lấy ra một giọt bệnh phẩm đã pha loãng 10-2 cho vào môi trường nuôi cấy

+ Dùng phần đầu của pipet Pasteur, dàn bệnh phẩm trên bề mặt môi trường + Nuôi cấy trong tủ ấm 37oC từ 18 - 24 giờ

Cách cấy mẫu nước:

+ Nhỏ một giọt nước vào môi trường nuôi cấy

+ Dùng tăm bông vô trùng dàn đều trên bề mặt môi trường

+ Nuôi cấy trong tủ ấm 37oC trong 18 - 24 giờ

* Kỹ thuật xác định tính chất hóa sinh của P aeruginosa

Bộ kít chạy tính chất sinh vật hoá học của P aeruginosa bao gồm có 10

ống chứa các loại môi trường:

+ Oxidase (+) + Ống 5: Môi trường Urê indol + Ống 1: Môi trường Xitrat Simmon + Ống 6 và 7: Môi trường Clarklubs + Ống 2: Môi trường Kligler + Ống 8: Môi trường LDC

+ Ống 3: Môi trường Manitol + Ống 9: Môi trường ADH

+ Ống 4: Môi trường thạch mềm + Ống 10: Môi trường ODC