ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG DẤU ẤN MIỄN DỊCH TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH BẠCH CẦU CẤP

Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng được thành lập theo quyết định số 5898/QĐ-UBNDngày 15/8/2015 của UBND thành phố Đà Nẵng, trên cơ sở tổ chức lại Khoa Ung bướuthuộc Bệnh viện Đà Nẵng và tiếp nh

CƠ SỞ THỰC TẬP: BỆNH VIỆN UNG BƯỚU ĐÀ NẴNG

Đà Nẵng – Năm 2017

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

I NỘI DUNG VÀ TIẾN ĐỘ THỰC TẬP 1

II CÁC KẾT QUẢ CỤ THỂ 2

1 Giới thiệu về cơ sở thực tập 2

1.1 Giới thiệu chung về bệnh viện 2

1.1.1 Lịch sử thành lập 2

1.1.2 Mục tiêu, nhiệm vụ 3

1.1.3 Cơ cấu và tổ chức 3

1.2 Giới thiệu về khoa xét nghiệm – truyền máu 6

1.2.1 Chức năng, nhiệm vụ 6

1.2.2 Cơ cấu tổ chức khoa xét nghiệm – truyền máu 8

1.3 Giới thiệu về đơn vị thực tập: Miễn dịch – Di truyền – Sinh học phân tử 8

1.3.1 Nhân sự 8

1.3.2 Lãnh đạo đơn vị 9

1.3.3 Các kĩ thuật đã triển khai 10

2 Ứng dụng dấu ấn miễn dịch trong chẩn đoán bệnh Bạch cầu cấp 10

2.1 Bệnh bạch cầu cấp 10

2.1.1 Giới thiệu 10

2.1.2 Nguyên nhân 11

2.1.3 Đối tượng 11

2.2 Mục đích của dấu ấn miễn dịch tế bào 12

2.3 Phương pháp 12

2.3.1 Nguyên lý hoạt động của máy tế bào dòng chảy 16

2.3.2 Các bộ phận chính của máy flow cytometry 16

2.4 Quá trình thực hiện 18

2.4.1 Hóa chất thuốc thử 18

2.4.2 Nguyên lý xét nghiệm 19

2.4.3 Quy trình thực hiện 19

2.4.4 Tác dụng của các dung dịch trong quy trình nhuộm 22

3 Kết quả 25

4 Kết luận 27

Tài liệu tham khảo 28

III NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CƠ SỞ THỰC TẬP 29

I NỘI DUNG VÀ TIẾN ĐỘ THỰC TẬP

1 Tìm hiểu về cơ quan thực tập (09/01/2017 đến 15/01/2017)Tuần 1

2 Tìm hiểu kiến thức chuyên môn xétnghiệm (16/1/2017 đến 22/01/2017)Tuần 2

(23/01/2017 đến 05/02/2017)

4 Tìm hiểu trang thiết bị tại cơ quan (06/02/2017 đến 12/02/2017)Tuần 5

5 Tìm hiểu về một qui trình xét nghiệm (13/02/2017 đến 19/02/2017)Tuần 6

6 Thực nghiệm qui trình xét nghiệm (20/02/2017 đến 12/03/2017)Tuần 7-9

7 Viết báo cáo thực tập tốt nghiệp (13/03/2017 đến 19/03/2017)Tuần 10

II CÁC KẾT QUẢ CỤ THỂ

1 Giới thiệu về cơ sở thực tập

1.1 Giới thiệu chung về bệnh viện

1.1.1 Lịch sử thành lập

Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng ( Danang Cancer Hospital- DCH) là một bệnh việnchuyên khoa ung thư loại 1 hoàn chỉnh của thành phố Đà Nẵng, quy mô 500 giườngbệnh nội trú Bệnh viện được đặt tại Phường Hòa Minh, Quận Liên Chiểu, Thành phố

Đà Nẵng, trên diện tích 15 hecta

Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng được thành lập theo quyết định số 5898/QĐ-UBNDngày 15/8/2015 của UBND thành phố Đà Nẵng, trên cơ sở tổ chức lại Khoa Ung bướuthuộc Bệnh viện Đà Nẵng và tiếp nhận nguyên trạng tổ chức bộ máy, người lao động,trụ sở, cơ sở vật chất, trang thiết bị, tài chính, tài sản của Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng(thuộc Hội Bảo trợ phụ nữ và trẻ em nghèo bất hạnh thành phố)

Bệnh viện là đơn vị sự nghiệp công lập, chịu sự quản lý, chỉ đạo trực tiếp của Giámđốc Sở Y tế Đà Nẵng

Hình 1.1: Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng

1.1.2 Mục tiêu, nhiệm vụ

Mục tiêu:

Xây dựng một bệnh viện chuyên khoa ung bướu đạt trình độ cao, để làm tốtcông tác phòng chống ung bướu trong khu vực và từng bước phát triển bệnh viện thànhViện ung bướu

Bệnh viện sẽ đem lại lợi ích thiết thực cho bệnh nhân ung bướu trong khu vực.Đặc biệt, bệnh nhân ung bướu nghèo tại Đà Nẵng và khu vực Miền Trung có cơ hộiđược khám chữa bệnh miễn phí với chất lượng tốt

(6) Quản lý kinh tế trong bệnh viện

 Lãnh đạo thành phố Đà Nẵng giao cho bệnh viện 3 nhiệm vụ chính là: (1) Làm tốt công tác khám, chữa bệnh cho bệnh nhân ung thư trong khu vực, (2) Tầm soát và phát hiện sớm bệnh ung thư

(3) Triển khai các chương trình nghiên cứu khoa học về bệnh ung thư

1.1.3 Cơ cấu và tổ chức

Thầy thuốc nhân dân, bác sĩ Chuyên khoa 2 Nguyễn Út, phó Giám đốc Sở Y tế ĐàNẵng, kiêm nhiệm chức vụ Giám đốc Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng

Bệnh viện được đầu tư xây mới hoàn chỉnh các công trình hạ tầng với 3 khối nhàchính:

- Khối hành chính và hội trường,

- Khối điều trị nội trú

- Khối kỹ thuật nghiệp vụ

Tổng diện tích sàn khoảng 54.000m2

Diện tích xây dựng trung bình cho mỗi giường bệnh gần 110m2

Bệnh viện được thiết kế theo mô hình bệnh viện khách sạn với cảnh quan trongbệnh viện rất hài hòa, tiện nghi và thân thiện Mọi phòng bệnh đều có phòng vệ sinhriêng, hệ thống điều hòa trung tâm và hệ thống khí trung tâm Bệnh viện dành 1 khunhà nghỉ gần 50 phòng ( khoảng 400 giường) để người nhà bệnh nhân có điều kiệnnghỉ ngơi trong thời gian chăm sóc bệnh nhân tại bệnh viện Bệnh viện cũng có 1 khunhà dành cho nhân viên, sinh viên đến thực tập và khu nhà dành cho chuyên gia trong

và ngoài nước đến giúp đỡ bệnh viện

 Khoa nội soi và TDCN

 Khoa kiểm soát nhiễm khuẩn

 Khoa xét nghiệm-truyền máu

 Khoa giải phẫu bệnh

 Khoa kỹ thuật phóng xạ

Bệnh viện có hệ thống trang thiết bị hiện đại và đồng bộ, đáp ứng tốt nhu cầu khámchữa bệnh ung bướu Các hệ thống chẩn đoán và theo dõi điều trị ung bướu như máyCT-scan đa lát cắt, máy MRI 3.0T, máy tăng sáng truyền hình, máy siêu âm màu 4chiều, máy nội soi can thiệp, máy SPECT, PET-CT, máy đếm tế bào tự động 40 thông

số, máy xét nghiệm sinh hóa tự động, ELISA tự động, FACS, miễn dịch hóa tổ chức,máy cắt lạnh, hệ thống phân tích gen… Các hệ thống trang thiết bị xạ trị ung thư kỹ

thuật cao như máy xạ trị gia tốc, máy xạ phẫu, xạ trị áp sát liều cao, CT mô phỏng,…Các cơ sở điều trị hiện đại như 10 phòng mổ chuẩn, khu hậu phẫu 40 giường bệnh, khuhồi sức cấp cứu và chăm sóc giai đoạn cuối 50 giường bệnh và khu ghép tủy xương 6phòng ghép chuẩn…

1.2 Giới thiệu về khoa xét nghiệm – truyền máu

- Địa điểm: Tầng 2 – Khu nhà D – Bệnh Viện Ung bướu Đà Nẵng

Tổ 14 Phường Hòa Minh, Quận Liên Chiểu,TP Đà Nẵng

- Điện thoại: 02363.717361 ( Hành chính)

02363.717362 ( ThS.BS Lê Văn Hùng – Trưởng khoa)

Hình 1.2: Khoa xét nghiệm và truyền máu

1.2.1 Chức năng, nhiệm vụ

 Quản lý các hoạt động khoa học và công nghệ trong Bệnh viện:

- Quản lý các đề tài và các dự án khoa học công nghệ các cấp của Bệnh viện

- Tổ chức và quản lý các hình thức sinh hoạt khoa học công nghệ trong Bệnh viện

- Tổ chức và quản lý hoạt động của Thư viện chuyên khoa

 Quản lý và triển khai các chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ:

- Nghiên cứu và triển khai các chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trong côngtác dịch tể học, tầm soát, chẩn đoán, điều trị và phòng chống bệnh ung thư.

- Nghiên cứu dược lâm sàng các thuốc chống ung thư mới và ứng dụng các loại thuốcđông y trong điều trị bệnh nhân ung thư

- Nghiên cứu và đưa ra những tác động của môi trường và xã hội đến việc phòng chốngbệnh ung thư và các biện pháp giáo dục sức khoẻ phòng chống bệnh ung thư

 Ứng dụng và triển khai các dịch vụ khoa học kỹ thuật của Trung tâm, bệnh viện

- Ứng dụng và triển khai các dịch vụ khoa học kỹ thuật mới về chẩn đoán và điều trịcủa Bệnh viện

- Triển khai các dịch vụ đào tạo liên quan đến lĩnh vực chuyên môn của Trung tâm Tổchức đào tạo, đào tạo lại nhằm nâng cao trình độ cho cán bộ nhân viên của Trung tâm

và Bệnh viện

 Hợp tác trong và ngoài nước

- Thiết lập các mối quan hệ, hợp tác, ký kết các văn bản ghi nhớ, thoả thuận về đầu tưnghiên cứu khoa học với các Bệnh viện, trung tâm, cá nhân và tổ chức đơn vị trongnước và quốc tế

1.2.2 Cơ cấu tổ chức khoa xét nghiệm – truyền máu

1.3 Giới thiệu về đơn vị thực tập: Miễn dịch – Di truyền – Sinh học phân tử

1.3.1 Nhân sự

Hiện tại đơn vị có 05 nhân lực chuyên môn cơ hữu, 01 cố vấn kiêm nhiệm làPGS TS BS Nguyễn Hữu Toàn

STT HỌ VÀ TÊN CHỨC DANH CHUYÊN NGÀNH CHỨC VỤ

1 Lê Văn Hùng ThS.BS Y học phân tử Trưởng khoa

2 Hồ Ngọc Dương Cử nhân

KTYH Xét nghiệm KTV Trưởng

3 Hoàng Ngọc Thanh Cao đẳng

KTYH Xét nghiệm Nhân viên

TRƯỞNG KHOA

KTV TRƯỞNG

ĐƠN VỊ MIỄN DỊCH - DI TRUYỀN - SHPT

ĐƠN VỊ XÉT NGHIỆM TỔNG

4 Lê Thị Trân Nhi Thạc sỹ Công nghệ sinh học Nhân viên

5 Nguyễn Hương Trang Cử nhân

KTYH Xét nghiệm Nhân viên

- CN Hồ Ngọc Dương: Kỹ thuật viên Trưởng

Điện thoại:

Cơ quan: 05113.717.374

Di động: 0918.998199Email: duongdch@gmail.com

- PGS.TS.BS Nguyễn Hữu Toàn: Cố vấn chuyên môn

Điện thoại:

Cơ quan 0511 371 7 373

Di động 0935 219659Email: toannh@dch.com.vn

1.3.3 Các kĩ thuật đã triển khai

1 Xét nghiệm gene chẩn đoán Lao, HBV, HCV, vi khuẩn các loại

2 Xét nghiệm gene ung thư các loại

3 Xét nghiệm Di truyền (Nhiễm sắc thể)

Bệnh bạch cầu cấp là bệnh ung thư tủy xương – là tình trạng cấp tính của bệnh lý

ác tính tại tủy xương

Bệnh bạch cầu cấp xảy ra khi cơ thể bắt đầu tích tụ bạch cầu bất bình thường Vìvậy, số lượng và khả năng của tế bào máu trưởng thành bị giảm bớt Tế bào trở thành “bất bình thường” vì chúng không thể trưởng thành trọn vẹn Tình trạng không thểtrưởng thành trọn vẹn này là yếu tố chính gây ra bệnh bạch cầu cấp Những tế bào “embé”, hay còn non, tích tụ trong cơ thể, vì chúng không chết và không bị tiêu hao dần.Khi phát bệnh bạch cầu, các tế bào bệnh bạch cầu tích tụ trong tủy xương Cuốicùng tất cả bạch cầu, hồng cầu và tiểu cầu bình thường hết chỗ trú ngụ hay không đổimới nữa Tủy xương khỏe mạnh bị thay thế bằng những tế bào còn non, rồi cuối cùngnhững tế bào này nhập vào dòng máu và đi khắp nơi trong cơ thể Do đó, khi số lượng

tế bào còn non gia tăng, thì số lượng hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu giảm bớt

Bốn dạng bệnh bạch cầu chính là:

• Bệnh bạch cầu dòng tủy ác tính (Acute Myeloid Leukaemia - AML)

• Bệnh bạch cầu dòng tủy mãn tính (Chronic Myeloid Leukaemia- CML)

• Bệnh bạch cầu lympho ác tính (Acute Lymphoblastic Leukaemia - ALL)

• Bệnh bạch cầu lympho mãn tính (Chronic Lymphocytic Leukaemia - CLL)

 Bệnh Bạch cầu cấp (Acute Leukaemia) là bệnh tăng sinh ác tính các tế bào máuchưa biệt hóa hay đã biệt hóa một phần thành các tế bào đầu dòng của tế bào bạch cầu,xảy ra khi các tế bào trong thời kỳ phát triển ban đầu bị ảnh hưởng Do đó, các tế bàonày không trưởng thành được và hoàn toàn vô dụng Bệnh nhân bị bệnh bạch cầu dạngcấp tính dễ bị viêm nhiễm, chảy máu, thiếu máu, và hầu như phải được trị liệu ngay.Bạch cầu cấp, còn gọi là bệnh lơ xê mi cấp, là bệnh ung thư phổ biến nhất ở trẻ em trênthế giới, bệnh chiếm khoảng một phần tư các bệnh ung thư ở trẻ em dưới 15 tuổi Bạchcầu cấp thể lympho chiếm 75% các bệnh bạch cầu cấp

2.1.2 Nguyên nhân

Cho đến nay, y học đang tìm kiếm nguyên nhân cụ thể gây nên bệnh bạch cầucấp Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu ghi nhận các yếu tố liên quan đến bệnh lý này nhưsau:

- Hóa chất : Các chất nhóm Alkyl, nhóm benzen (những hóa chất có cấu trúc hóa họcnhân vòng)

- Tia xạ hay tia ion hóa: tỷ lệ bệnh bạch cầu cấp gặp nhiều ở những người tiếp xúc vớitia xạ lâu ngày hay ở trong vùng nhiễm xạ nặng

- Virus: nhiều nghiên cứu ghi nhận một số virus gây bệnh trên người một thời gian dàicũng gây ung thư Ví dụ: EBV gây ung thư vòm, HTLV1,2 gây bệnh bạch cầu cấpdòng lympho T…

- Bất thường nhiễm sắc thể: đây là nguyên nhân thường gặp trên bệnh nhân bạch cầucấp

- Yếu tố di truyền: có một số bệnh bẩm sinh di truyền như Hội chứng Down, hội chứngthiếu hụt miễn dịch bẩm sinh, hội chứng Poland… gây người bệnh dễ mắc thêm bệnhbạch cầu cấp

- Yếu tố môi trường: môi trường bị nhiễm độc do hóa chất, thuốc trừ sâu, tia xạ…gâynên tình trạng nhiễm độc nguồn nước, thức ăn…và các chất độc này gây đột biếnnhiễm sắc thể, gây ung thư máu

2.1.3 Đối tượng

Tiêu chuẩn chọn bệnh:

 Khám lâm sàng hướng đến bệnh bạch cầu cấp

- Cấp tính và sốt thường gặp nhất (50-60%)

- Thiếu máu: da xanh, niêm mạc nhợt nhạt, trẻ mệt mỏi tim đập nhanh, khó thở đôikhi có biểu hiện suy tim

- Giảm bạch cầu trung tính: sốt, viêm loét niêm mạc miệng, nhiễm khuẩn

- Giảm tiểu cầu: xuất huyết dưới da, chấm, nốt xuất huyết, bầm máu, chảy máu niêmmạc, đôi khi chảy máu nội tạng (tiêu hóa, nội sọ, phổi)

- Gan, lách, hạch to

- Các triệu chứng khác có thể gặp do tế bào ác tính xâm lấn các cơ quan phì đại lợirăng, lồi mắt, tăng áp lực sọ não, sưng tinh hoàn, buồng trứng, có u trung thất, đauxương khớp…

 Có kết quả huyết đồ

- Hồng cầu giảm

- Số lượng bạch cầu có thể thấp, bình thường hay tăng cao

- Tiểu cầu giảm khá rõ rệt ngay từ đầu

 Có kết quả tủy đồ chuẩn đoán bệnh bạch cầu cấp

- Số lượng tế bào tủy tăng, song có thể bình thường hoặc giảm

- Tăng sinh rất nhiều lymphoblast, thường có thể tới 60-90% tế bào tủy

- Có hiện tượng lấn át các tế bào tủy bình thường

2.2 Mục đích của dấu ấn miễn dịch tế bào

Kỹ thuật khảo sát dấu ấn miễn dịch trên các tế bào ung thư ( Leukemiaphenotyping) nhằm mục đích là xác định bản chất dòng tế bào ung thư này và mức độbiệt hóa của nó Trong một số trường hợp, kỹ thuật này giúp xác định một quần thể tếbào tăng sinh là bình thường hay ác tính

2.3 Phương pháp

- Sử dụng kỹ thuật phân tích tế bào dòng chảy để xét nghiệm bệnh bạch cầu cấp ( flowcytometry ): kỹ thuật phân loại tế bào dựa vào việc sử dụng ánh sáng huỳnh quang (đènargon) và phát triển thiết bị phân loại tế bào dựa trên kích hoạt huỳnh quang (FACS –Flourescent Activated Cell Sorter)

+ Sử dụng bộ kit Acute Leukemia Phenotyping khảo sát trên máy BD FACS Canto

II của hãng Becton Dickinson - Mỹ (hiện đại nhất Việt Nam hiện nay) cùng với

dàn kháng thể đơn dòng phong phú đủ để đáp ứng những yêu cầu chẩn đoán vànghiên cứu trong lĩnh vực huyết học.

Hình 2.1: Máy BD FACS Canto II

Hình 2.2: Bộ kit Acute Leukemia Phenotyping

Hình 2.3: Lọ chứa kháng thể đơn dòng

Dòng tế bào Kháng thể đơn dòng

Các dấu ấn non

CD34, CD38, CD117( dòng tủy)TdT và CD10 ( dòng lympho)HLA.Dr (dòng hạt và lympho T)

Dòng lympho B

CD19, cyCD22, smCD22, cyCD79a, CD79b, CD20,CD5, HLA.DR, CD38, CD138, CD23, CD24, CD25,

chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp và lympho

 Để đạt được kết quả chính xác và khách quan cần áp dụng một dàn kháng thểđơn dòng đủ lớn và bao quát để có thể phân biệt được các dòng tế bào vớinhau, đồng thời đánh giá được giai đoạn trưởng thành của từng dòng

2.3.1 Nguyên lý hoạt động của máy tế bào dòng chảy

Nguyên lý cơ bản của máy đếm tế bào dòng chảy ( flow cytometry - FC) lànguyên lý biến đổi điện trở của dòng hạt đi qua cửa sổ có tế bào quang điện và mộtđiện trường Nguyên lý này giúp phân tích sự khác biệt về kích thước các loại tế bàokhác nhau, nhưng không nhận diện chính xác từng loại tế bào

Các máy đếm tế bào hiện đang được sử dụng có thể chia làm hai loại:

- Máy đếm tế bào nguyên lý tổng trở: phân biệt từng loại tế bào dựa vào kích thước tếbào

- Các máy thế hệ sau: ứng dụng laser và xung điện đa chiều nên có tốc độ cao và phânloại tế bào chính xác hơn Với những máy sản xuất trước 1996 khả năng phân loạichính xác các thành phần bạch cầu nói chung không quá 90% Các máy model gầnđây, với việc áp dụng tổng hợp các cơ chế tổng trở, xung điện đa chiều, laser vàscatter nên khả năng nhận diện tế bào được nâng đến 95% Một số serie máy có thểphân biệt được các loại bạch cầu ưa a xít, ưa baso, hồng cầu lưới bằng việc kết hợpvới các phương pháp nhuộm men peroxydase, nhuộm RNA/DNA, nhuộm huỳnhquang, phân tích huyết sắc tố (CellDyn 4000 của hãng ABBOTT, SE-Advance củahãng Sysmex…)

2.3.2 Các bộ phận chính của máy flow cytometry

Hình 2.4 : Hệ thống Flow Cytormetry

Hệ thống tạo dòng chất lỏng (fluidics system)

Hệ thống tạo dòng chất lỏng gồm có 2 vùng chất lỏng có áp lực khác nhau.Dòng dịch lỏng bên ngoài (sheath fluid) còn được gọi là dung dịch tạo dòng bao: có tácdụng “nắn chỉnh” dòng dịch lỏng chứa mẫu bên trong (core fluid) còn gọi là dòng lõithành một dòng hẹp tới mức các tế bào/hạt vật chất trong mẫu chỉ có thể đi qua khe hẹp

đó từng cái một từ đó giúp tập trung tế bào/vật thể nhỏ có trong mẫu thành dòng tế bàođơn và vận chuyển dòng tế bào đơn này đi qua hệ thống quang học với tốc độ rất cao,khoảng 1000 tế bào/giây Điều chỉnh mức độ chênh lệnh áp lực giữa dòng bao và dònglõi có thể mở rộng hoặc thu hẹp tiết diện dòng lõi, phù hợp với yêu cầu phân tích (ví dụphân tích tế bào máu thì cần dòng lõi lớn, phân tích ADN thì cần dòng lõi hẹp) Nhờ cơchế này hệ thống mới có thể phân tích đồng thời nhiều đặc tính trên từng tế bào mộtcách chính xác, giảm được yếu tố nhiễu

Hệ thống quang học