Trong quá trình tách ARN từ mẫu mô và tế bào, có bốn vấn đề chính như sau: Vấn đề 1: ARN nhiễm ADN tổng số genomic DNA Nhận biết: Trong trường hợp này, trên ảnh điện di sẽ xuất hiện các
Trang 1Tách ARN (RNA isolation) là một trong những quy trình phức tạp, mỗi người sẽ có những phương pháp, thủ thuật riêng để tách ARN nguyên vẹn từ mẫu của họ Mặc
dù vậy ở mức độ nào đó, sự thành công của quá trình tách ARN rất khó dự đoán, tuy nhiên có một vài vấn đề thường xuyên xảy ra vẫn có thể được giải quyết hợp lý Trong quá trình tách ARN từ mẫu mô và tế bào, có bốn vấn đề chính như sau:
Vấn đề 1: ARN nhiễm ADN tổng số (genomic DNA)
Nhận biết: Trong trường hợp này, trên ảnh điện di sẽ xuất hiện các vệt smear khối lượng phân tử cao hoặc mẫu đối chứng– RT (bao gồm toàn bộ thành phần cần cho phản ứng RT-PCR, ngoại trừ enzyme reverse transcriptase) lên băng sau khi tiến hành PCR
Nguyên nhân: Bất cứ quy trình phân tách ARN nào cũng đều xuất hiện những vết ADN Điều này đúng khi xử lý mẫu với hỗn hợp dung môi TRIzol (phenol) và màng lọc xoay silica Nguyên nhân có thể do sự đứt gãy không hoàn toàn của ADN tổng số trong quá trình nghiền đồng thể (homogenization) Trong phương pháp sử dụng phenol, pH của phenol chính là yếu tố then chốt (cần pH acid) và kỹ năng thao tác với pipet ở pha nước sẽ quyết định mức độ nhiễm ADN
Giải pháp: ADN tổng số cần được làm đồng nhất hoàn toàn nhờ sử dụng các phương pháp như phá vỡ cấu trúc ADN bằng một máy đập hạt vận tốc cao (high velocity bead beater) hoặc một polytron rotor stator Mẫu sẽ được làm nóng trong suốt quá trình nghiền đồng thể nhưng làm lạnh mẫu trong guanidine sẽ khiến muối này kết tủa Do đó, cần cân bằng thời gian nghiền đồng thể với thời gian làm lạnh mẫu tới nhiệt độ phòng
Sử dụng DNase là cách tốt nhất để loại bỏ ADN tổng số (Hình minh họa) Bộ kit RTS DNase™ chứa enzyme DNase có hoạt độ cao, bền ở nhiệt độ phòng có thể loại bỏ ADN hiệu quả Sau bước loại ADN, resin được dùng để loại bỏ enzyme DNase mà không cần dùng nhiệt độ hay EDTA Kit này được khuyến khích sử dụng cho các mẫu giàu ADN tổng số (ví dụ mô lá lách), các mẫu đã được tinh sạch trước bước xử lý với DNase
Các phương pháp “on-column” (trong cột) có thể sử dụng với các mẫu nhiễm ít ADN tổng số
Trang 2Ảnh điện di: Sử dụng DNase loại bỏ ADN tổng số khỏi mẫu ARN
(Nguồn ảnh: https://mobio.com/dnasetm-max-kit-1076.html)
Vấn đề 2: ARN phân hủy/ ARN không nguyên vẹn
Nhận biết: Các băng rARN xuất hiện các vệt smear trên bản gel hoặc băng 18S đậm hơn nhiều so với băng 28S
Ảnh điện di: ARN bị phân hủy và ARN nguyên vẹn (M Marker, 1 ARN bị phân hủy
và 2 ARN nguyên vẹn lên băng 18S và 28S) (Nguồn ảnh: https://www.thermofisher.com)
Nguyên nhân: Sự phân hủy ARN diễn ra ở một vài thời điểm trong suốt quy trình
nên rất khó để xác định chính xác hiện tượng này xảy ra trong giai đoạn thu mẫu (collection), bảo quản (storage), tách chiết (extraction) hay phân tách (isolation) Giải pháp: Nếu vấn đề này xuất hiện trong quá trình bảo quản, hãy đảm bảo mẫu sau khi thu ngay lập tức được giữ trong nitơ lỏng hoặc ở -80oC; đối với mẫu là mô động vật, sử dụng RNALater và giữ ở -20oC
Nếu vấn đề xuất hiện trong quá trình tách chiết, hãy thêm beta-mercaptoethanol (BME) vào đệm ly giải (lysis buffer) Sử dụng 10 ul BME 14.3 M/ 1ml đệm BME sẽ bất hoạt RNases và giúp giữ ổn định mẫu trong suốt quá trình tách chiết
Nếu mẫu được lấy ra từ tủ đông và không nằm trong dung dịch bảo quản, không được rã đông Nhanh chóng làm đồng nhất mẫu trong BME Chú ý ly giải mẫu hoàn toàn
Sự phân hủy bởi RNase có thể xảy ra sau khi phân tách do vậy cần đảm bảo rằng nước sử dụng cho quá trình rửa giải (elution) và tái hòa tan (resuspension) không nhiễm RNase
Trang 3Vấn đề 3: Chất ức chế ARN
Nhận biết: Tỷ số 260/230 thấp (dưới 1.0) hoặc tỷ số 260/280 thấp
Nguyên nhân: Tỷ số 260/230 thấp cho thấy hỗn hợp chứa muối guanidine hoặc các chất ức chế hữu cơ như acid humic, polysaccharides Các muối guanidine bất hoạt RNase nhưng cũng ức chế các protein như enzyme RT Tỷ lệ 260/280 thấp chứng tỏ ARN nhiễm protein
Giải pháp: Trường hợp tỷ số 260/230 thấp, cách tốt nhất là rửa mẫu thêm nhiều lần Nếu TRIzol kết tủa, hãy rửa với ethanol để khử muối Trường hợp sử dụng cột silica, rửa thêm vài lần bằng ethanol 70-80% để loại bỏ muối Với các mẫu được tinh sạch chưa hoàn toàn, hãy dùng ethanol
Đối với các chất ức chế khác như acid humic và polysaccharides, cần tinh sạch lại mẫu trong một cột khác và rửa sạch trước khi rửa giải Một vài hợp chất sẽ không được loại bỏ khỏi ARN (hoặc ADN) bằng phương pháp thông thường vì chúng tương
tự acid nucleic Như vậy, nên cân nhắc sử dụng các kỹ thuật loại bỏ chất ức chế cho mẫu tự nhiên
Tỷ số 260/280 thấp chủ yếu là do sử dụng lượng mẫu đầu vào lớn khiến protein không được loại bỏ hoàn toàn Hãy làm sạch mẫu bằng phương pháp của bạn hoặc
sử dụng phenol:chloroform hoặc thêm các muối gắn, ethanol để gắn với một màng lọc silica khác Protein sẽ dễ dàng được loại bỏ Lần thí nghiệm sau, cần chú ý sử dụng lượng mẫu ít hơn
Vấn đề 4: Lượng ARN thu được thấp
Trang 4Lượng ARN thu được có sự khác biệt rõ ràng giữa các kiểu tế bào, các loại mô khác nhau Đối với ARN máu, hiệu suất thu được khác biệt tùy người
Nguyên nhân: Nếu lượng ARN thu được thấp hơn dự đoán và ARN vẫn nguyên vẹn thì sự phân hủy ARN không phải là nguyên nhân của hiện tượng này Khi đó, quá trình nghiền đồng thể có thể là chưa hoàn toàn Để phân tách ARN, bước ly giải đóng vai trò quan trọng Các mẫu mô được lưu giữ trong RNALater thường khó làm đồng nhất hơn Sai sót trong tính toán khối lượng mô hoặc số lượng tế bào có thể lý
do khiến lượng ARN thu được thấp Trong trường hợp này, số lượng tế bào thực tế có thể ít hơn tính toán
Giải pháp: Trường hợp ARN nguyên vẹn: chú ý vào phương pháp nghiền đồng thể, đảm bảo ADN tổng số bị phân cắt toàn bộ và ARN giải phóng hoàn toàn từ các tế bào vì bất cứ mảnh mô nào còn sót lại đều mang ARN
Sử dụng công cụ tính toán thật chính xác để định lượng chuẩn các mảnh mô hay đếm đúng số lượng tế bào
Nếu ARN bị phân hủy dẫn đến lượng thu được thấp, vấn đề có thể nảy sinh trong giai đoạn bảo quản hoặc nghiền đồng thể quá mạnh hay gia nhiệt quá lâu (nên tiến hành theo chu kỳ: gia nhiệt 30-45s -dừng 30s) Chú ý cắt các mẫu mô và nhanh chóng đưa chúng vào đệm ly giải guanidine lạnh (hoặc TRIzol) để ngăn chặn hoạt động của RNase
Với màng lọc xoay silica, cần đảm bảo quá trình rửa giải ở cột đủ để giải phóng ARN
ra khỏi màng Sử dụng thể tích nước lớn hơn trong quá trình rửa giải sẽ cho lượng ARN nhiều hơn
Trang 5Kết luận
Sự phân tách ARN từ các nguồn khác nhau đều tuân theo một quy trình tương tự Trong đó, quá trình nghiền đồng thể là bước đầu tiên và quan trọng nhất Quá trình này được thực hiện tốt sẽ giúp các tế bào nhanh chóng bị phá vỡ, RNases bị bất hoạt trong đệm ly giải và ADN tổng số phân hủy tới kích thước dễ dàng được rửa trôi Rna extraction
1. RNA EXTRACTIONRNA extraction is the purification of RNA from biological samples
2. Là s ựTinh s chạ arn t m u sinh h c.ừ ẫ ọ
3. 2 DNA -> mRNA -> protein Lots of information in mRNA: When is gene expressed? What is timing of gene expression? What is the level of gene
expression? (but what does an mRNA measurement really say about expression of the protein?)
4. Nhi u thông tin trong mrna : ề bi u hi nể ệ gen âu? Khi nào bi u hi n gen’? m c d bi u ở đ ể ệ ứ ộ ể
hi n gen? Nh ng nh ng o lệ ư ữ đ ường c a rna nói v nh ng bi u hi n gì c a prootein?ủ ề ữ ể ệ ủ
5. 3 RNA in a typical eukaryotic cell:10-5 micrograms RNA80-85% is ribosomal RNA15-20% is small RNA (tRNA, small nuclear RNAs)About 1-5% is mRNA variable in size but usually containing 3’ polyadenylation
6. Rna trong m u nhân chu n i n hìnhẫ ẩ đ ể
7
8. 4 The problem(s) with RNA:RNA is chemically unstable spontaneous cleavage
ofphosphodiester backbone via intramoleculartransesterificationRNA is susceptible to nearly ubiquitous RNA-degradingenzymes (RNases) RNases are released upon cell lysis RNases are present on the skin RNases are very difficult to inactivate disulfide bridges conferring stability no requirement for divalent cations foractivity
9. 5 Common sources of RNase and how to avoid theContaminated solutions/buffers USE GOOD STERILE TECHNIQUE TREAT SOLUTIONS WITH DEPC (when possible) MAKE SMALL BATCHES OF SOLUTIONSContaminated equipment USE “RNA-ONLY” PIPETS, GLASSWARE, GEL RIGS BAKE GLASSWARE, 300 °C, 4 hours USE “RNase-free” PIPET TIPS TREAT EQUIPMENT WITH DEPC
10.6 INHIBITORS OF RNASE′ DEPC: diethylpyrocarbonate Alkylating agent, modifying proteins and nucleic acids Fill glassware with 0.1% DEPC, let stand overnight at room temp or NaOH or H2O2 Solutions may be treated with DEPC (0.1%), then autoclave (DEPC breaks down to CO2 and ethanol) Vanadyl ribonucleoside complexes
Competitive inhibitors of RNAses, but need to be removed from the final preparation of RNA′ Protein inhibitors of RNAse horseshoe-shaped, leucine rich protein, found in cytoplasm of most mammalian tissues must be replenished following phenol extraction steps
11.7 Making and using mRNA (1)
12.8 Making and using mRNA (2)
13.9 BASIC STEPS IN ISOLATINGRNA FROM CLINICAL SPECIMENS Separate WBCs from RBCs, if necessary Lyse WBCs or other nucleated cells in presence of protein denaturants, RNase inhibitors Denature/digest proteins Separate proteins, DNA, and contaminants from RNA Precipitate RNA if necessary Resuspend RNA in final buffer
14.10 SELECTIVE CAPTURE OF MRNA′ Oligo dT is linked to cellulose matrix RNA is washed through matrix at high salt concentration Non-polyadenylated RNAs are washed through polyA RNA is removed under low-salt conditions (not all of the non-polyadenylated RNA gets removed′ Poly(U) sepharose chromatography′ Poly(U)-coated paper filters′ Streptavidin beads:′ A biotinylated oligo dT is added to
Trang 6guanidinium-treated cells, and it anneals to the polyA tail of mRNAs′ Biotin/streptavidin interactions permit isolation of the mRNA/oligo dT complexes
15.11 RNA ISOLATION METHODSCESIUM CHLORIDE GRADIENT′ Used mainly to get clean RNA for Northern blots′ Homogenize cells in guanidinium isothiocyanate and b-mercaptoethanol solution.′ Add to CsCl gradient and centrifuge for 12–20 hours; RNA will
be at the bottom of tube.′ Re-dissolve in TE/SDS buffer.′ Precipitate RNA with salt and ethanol, then rehydrate.′ Advantage: high quality′ Disadvantages: extremely
time-consuming, hazardous materials disposal issues
16.12 RNA ISOLATION METHODSGUANIDINIUM-BASED ORGANIC
ISOLATIONGUANIDINIUM THIOCYANATE-PHENOL-CHLOROFORM EXTRACTION IS THEMOST COMMON METHOD (TRIZOL METHOD) liquid-liquid′ Phenol/guanidinium (chaotropic ) solution disrupts cells, extraction solubilizes cell components, but maintains integrity of technique RNA.′ Add chloroform, mix, and centrifuge.′ Proteins/DNA remain at interface.′ RNA is removed with aqueous top layer.′ RNA is precipitated with alcohol and rehydrated.′ Advantage: faster than CsCl method better purity no RNA is lost′ Disadvantages: fume hood required, hazardous (Phenol and chloroform) waste disposal issues, chaotropic
17.13 RNA ISOLATION METHODS NONORGANIC SALT PRECIPITATION′
Cellmembranes are lysed and proteins are denatured by detergent (such as SDS) in the presence of EDTA or other RNase inhibitors.′ Proteins/DNA are precipitated with a high concentration salt solution.′ RNA is precipitated with alcohol and rehydrated.′
Advantages:
18. Fast and easy, nontoxic
19. Produces high quality RNA
20.14 RNA ISOLATION METHODSAFFINITY PURIFICATION OF RNAθ Lyse cells, and spin to remove large particulates/cell debrisθ Apply lysate (containing nucleic acids and cellular contaminants) to column with glass membraneθ Wash with alcohol to remove contaminants; nucleic acids stick to glass membrane while contaminants wash through Treat with DNase enzyme to remove contaminating DNA.θ Apply water to the column; purified RNA washes off the glass and is collectedθ Disadvantage θ cannot adsorb RNA transcripts shorter than 200 bp (siRNA and miRNA)
21.15 NUCLEIC ACID ANALYSIS′ DNA or RNA is characterized using several different methods for assessing quantity, quality, and molecular size
22. UV spectrophotometry
23. Agarose gel electrophoresis
24. Fluorometry
25. Colorimetric blotting
26.16 QUANTITY định lượngFROM UV SPECTROPHOTOMETRY Quang phổ′ DNA and RNA absorb h p th ấ ụmaximally at 260 nm.′ Proteins absorb at 280 nm.′ Background scatter gaiir n n phân tánề absorbs at 320 nm
27.17 QUANTITY FROM UV SPECTROPHOTOMETRY′ [DNA] =(A260 – A320) X dilution
Concentration cô đặc= µg of DNA or RNA per mL of hydrating solution hòa tan
28.18 QUANTITY FROM UV SPECTROPHOTOMETRY CALCULATING YIELD hi u su tệ ấ Multiply nhân the concentration of the DNA or RNA sample by the volume of hydrating solution added.Example for DNA: 150 µg/mL X 0.1 mL = 15 µg Concentration from Volume th tíchể of DNA yield UV Spec (µg DNA hydration per ml of hydrating solution solution)
29.19 QUALITY FROM UVSPECTROPHOTOMETRY A260/A280 = measure of purity (A260 – A320)/(A280 – A320) 1.7 – 2.0 = good DNA or RNA <1.7 = too much protein or other contaminant (?)
Trang 730.20 QUALITY FROM AGAROSE GEL ELECTROPHORESIS′ Genomic DNA:
31. 0.6% to 1% gel, 0.125 µg/mL ethidium bromide in gel and/or in running buffer
32. Electrophorese at 70–80 volts, 45–90 minutes.′ Total RNA:
33. 1% to 2% gel, 0.125 µg/ml ethidium bromide in gel and/or in running buffer
34. Electrophorese at 80–100 volts, 20–40 minutes
35.21 RNA SIZE AND QUALITY FROM AGAROSE GEL ELECTROPHORESIS′ Size: mRNA may be smaller or larger than ribosomal RNA (rRNA).′ Quality: High-quality RNA has these characteristics:
36. 28S rRNA band : 18S rRNA band = 2:1 intensity
37. Little to no genomic DNA (high MW band)′ Note: If 18S rRNA is more intense than 28S rRNA, or if both bands are smeared, RNA degradation is probable.′ Useradiolabelled poly dT in a pilot Northern hybridization should get a smear from 0.6 to 5 kb on the blot
38.22 CULTURED CELL RNA DNA 28S 18S 100 50 25 ng 5S rRNA, tRNA, Genomic DNA and other small Degraded RNA markers RNA molecules mRNA = background smear high → low MW
39.23 STORAGE CONDITIONS′ Store DNA in TE buffer at 4 ° C for weeks or at –20 ° C to –80 ° C for long term.′ Store RNA in RNase-free ultra pure water at –70 ° C
40.24 TROUBLESHOOTING NUCLEIC ACIDPREPARATION METHODS′ Purifying RNA: the key is speed′ Problem: No or low nucleic acid yield
41. Make sure that ample time was allowed for resuspension or rehydration of sample
42. Repeat isolation from any remaining original sample (adjust procedure for possible low cell number or poorly handled starting material)
43. Concentrate dilute nucleic acid using ethanol precipitation
44.25 TROUBLESHOOTING NUCLEIC ACIDPREPARATION METHODS′ Problem: Poor nucleic acid quality
45. If sample is degraded, repeat isolation from remaining original sample, if possible
46. If sample is contaminated with proteins or other substances, clean it up by re-isolating (improvement depends on the extraction procedure used)
Trang 8B ướ c 4: L u tr c a RNA Isolated ư ữ ủ
Bước cu i cùng trong m i RNA giao th c cách ly, dù cho t ng ho c mRNA chu n b , là resuspend ố ỗ ứ ổ ặ ẩ ị
t a RNA tinh khi t.ủ ế Sau khi c n th n chu n b m t m u RNA, i u quan tr ng là RNA b ình ch và ẩ ậ ẩ ị ộ ẫ đ ề ọ ị đ ỉ
c l u tr trong m t môi tr ng an toàn, RNase-mi n phí
đượ ư ữ ộ ườ ễ Chúng tôi khuyên b n nên l u tr RNA ạ ư ữ
-80 ° C trong dung dòch n s d ng, l l ng trong m t trong m t s các gi i pháp l u tr RNA
c thi t k cho m c ích này:
đượ ế ế ụ đ
• THE gi i pháp l u tr RNA (1 mM sodium citrate, pH 6,4 ± 0,2)ả ư ữ
• 0.1 mM EDTA (trong nước siêu s ch DEPC ạ đượ đ ềc i u tr )ị
• TE Buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.0)
• Gi i pháp RNAsecure ™ resuspensionả
TE và 0,1 gi i pháp mM EDTA thả ường được quy nh trong s cô l p và phân tích các giao th c RNAđị ự ậ ứ
thông thường Nh ng gi i pháp l u tr lý tữ ả ư ữ ưởng cho các nhà nghiên c u ã s d ng chúng, nh ng ứ đ ử ụ ư
mu n s ti n l i và an ninh c a h có cho premade và ch ng nh n RNase-mi n phí.ố ự ệ ợ ủ ọ ứ ậ ễ
Chúng tôi c ng ã gi i thi u THE Gi i pháp l u tr RNA, m t b ũ đ ớ ệ ả ư ữ ộ ộ đệm mang l i s n nh RNA l n ạ ự ổ đị ớ
h n 0,1 mM EDTA ho c TE.ơ ặ THE Gi i pháp l u tr RNA có hai tính n ng gi m thi u quá trình th y ả ư ữ ă ả ể ủ
phân c s c a RNA: pH th p, và sodium citrate, ho t ơ ở ủ ấ ạ động c hai nh là m t b ả ư ộ ộ đệm pH và m t tác ộ
nhân t o ph c (cation hóa tr hai xúc tác th y phân c s c a RNA).ạ ứ ị ủ ơ ở ủ THE Gi i pháp l u tr RNA ả ư ữ
tương thích v i t t c các ng d ng RNA thông thớ ấ ả ứ ụ ường nh phiên mã ngư ược, d ch trong ng nghi m,ị ố ệ
phân tích phía b c, và các xét nghi m b o v nuclease.ắ ệ ả ệ
Các RNAsecure ™ thu c th là m t thu c th nonenzymatic duy nh t cho s b t ho t không h i ố ử ộ ố ử ấ ự ấ ạ ồ
ph c c a RNases trong các ph n ng enzym.ụ ủ ả ứ Nó được cung c p m t n ng ấ ở ộ ồ độ 25X và có th ể được thêm vào các m u ẫ để làm b t ho t RNases.RNAsecure ™ resuspension Gi i pháp ch a các thành ấ ạ ả ứ
ph n ho t tính tầ ạ ương t nh các RNAsecure ™ Thu c th , nh ng ự ư ố ử ư được cung c p m t n ng ấ ở ộ ồ độ làm
vi c cho resuspension tr c ti p c a viên RNA.ệ ự ế ủ Để làm b t ho t RNases, viên RNA ấ ạ đượ ơ ửc l l ng trong dung d ch RNAsecure ™ resuspension và un nóng ị đ đến 60 ° C trong 10 phút M t tính n ng ộ ă độ đc áo
c a gi i pháp RNAsecure ™ là hâm nóng sau khi i u tr ban ủ ả đ ề ị đầu s kích ho t l i các ẽ ạ ạ đại lý RNase phá h y ủ để ả gi m thi u b t k ch t gây ô nhi m m i.ể ấ ỳ ấ ễ ớ
Chúng tôi liên t c phát minh ra cách ụ để làm cho phân tích RNA d dàng h n.ễ ơ Chúng tôi làm vi c ch t ệ ặ
ch v i khách hàng và ẽ ớ đồng nghi p c a chúng tôi ệ ủ để cung c p s n ph m ấ ả ẩ độ đc áo để ả gi i quy t ế
nh ng v n ữ ấ đề các nhà nghiên c u thứ ường xuyên g p ph i khi làm vi c v i các RNA.ặ ả ệ ớ công ngh ệ
Ambion® t ng RNAlater® Gi i pháp, b d ng c RNA cô l p, và gi i pháp l u tr RNA.ả ả ộ ụ ụ ậ ả ư ữ các gi i phápả
phân tích RNA Ambion® được thi t k ế ế để làm vi c cùng nhau ệ để đưa b n t t c các cách t b s u ạ ấ ả ừ ộ ư
t p m u ậ ẫ để phân tích ng d ng RNA c a b n.ứ ụ ủ ạ N u b n có ế ạ đề xu t cho các s n ph m b sung mà s ấ ả ẩ ổ ẽ
h u ích trong nghiên c u RNA c a b n, xin vui lòng liên h v i chúng tôi.ữ ứ ủ ạ ệ ớ
Hàng đầu
Trang 9B ướ c 3: đị nh l ượ ng RNA Isolated
RNA nh lđị ượng là m t bộ ước quan tr ng và c n thi t trọ ầ ế ước khi h u h t các phầ ế ương pháp phân tích RNA ây chúng ta th o lu n v ba phỞ đ ả ậ ề ương pháp thường được s d ng ử ụ để đị nh lượng RNA và l i ờ
khuyên cho vi c t i u hóa t ng phệ ố ư ừ ương pháp
UV ph ổ
Phương pháp truy n th ng ề ố để đ ánh giá n ng ồ độ RNA và độ tinh khi t là UV quang ph ế ổ Độ ấ h p th ụ
c a m u RNA pha loãng ủ ẫ đượ đ ạc o t i 260 và 280 nm N ng ồ độ axit nucleic được tính toán b ng cách ằ
s d ng lu t Beer-Lambert, d oán nh ng thay ử ụ ậ ự đ ữ đổi tuy n tính trong h p th v i n ng ế ấ ụ ớ ồ độ (Hình 3)
Hình 3 Beer-Lambert Lu t cho tính h p th tia c c tím c a axit nucleic.ậ ấ ụ ự ủ
S d ng phử ụ ương trình này, m t Aộ 260 đọc là 1,0 tương đương v i ~ 40 mg / mL s i ớ ợ đơn RNA A 260 / A
t lỷ ệ 280 được s d ng ử ụ để đ ánh giá độ tinh khi t RNA.ế A 260 / A t lỷ ệ 280 1,8-2,1 ch RNA tinh khi t.ỉ ế UV quang ph là phổ ương pháp được s d ng r ng rãi nh t ử ụ ộ ấ để đị nh lượng RNA.Nó là đơn gi n ả để ự th c
có m t s nhộ ố ượ đ ểc i m, nh ng chúng có th ư ể được gi m thi u b ng cách làm theo nh ng l i khuyên ả ể ằ ữ ờ
này:
• Phương pháp này không phân bi t ệ đố ử ữi x gi a RNA và DNA, và nó được khuy n khích ế đầu tiên i u tr m u RNA v i DNase RNase-mi n phí đ ề ị ẫ ớ ễ để ạ ỏ lo i b ô nhi m DNA.ễ
• ch t gây ô nhi m khác nh protein còn l i và phenol có th can thi p vào bài ấ ễ ư ạ ể ệ đọc h p th , vì ấ ụ
v y c n ph i c n th n trong quá trình thanh l c RNA ậ ầ ả ẩ ậ ọ để ạ ỏ lo i b chúng
• đọc m u ẫ được th c hi n trong cuvette th ch anh.ự ệ ạ cuvette b n và các h t b i gây ra tán x ẩ ạ ụ ạ
ánh sáng t i 320 nm, có th nh hạ ể ả ưởng đến h p th 260 nm.ấ ụ ở K t khi không ph i protein c ngể ừ ả ũ
không axit nucleic h p th 320 nm, th c hi n i u ch nh n n b ng cách ấ ụ ở ự ệ đ ề ỉ ề ằ đọ ừ ộc t m t kho ng ả
tr ng (pha loãng ch ) 320 nm, c ng nh 260 nm và 280 nm.ố ỉ ở ũ ư
• A 260 / A t lỷ ệ 280 là ph thu c vào c ụ ộ ả độ pH và s c m nh ion.ứ ạ Khi pH t ng, Aă 280 gi m trong khi ả
A 260 là không b nh hị ả ưởng i u này d n Đ ề ẫ đế ăn t ng A 260 / A t lỷ ệ 280 [1] B i vì nở ước thường có độ
pH axit, nó có th làm gi m Aể ả 260 / A t lỷ ệ 280 Chúng tôi khuyên b n nên s d ng m t gi i pháp ạ ử ụ ộ ả đệm
có độ pH ki m nh , ch ng h n nh TE (pH 8,0), nh m t ch t pha loãng (và nh m t tr ng) ề ẹ ẳ ạ ư ư ộ ấ ư ộ ố để
Trang 10b o ả đả đọm c chính xác và tái s n xu t.ả ấ M t ví d v s thay ộ ụ ề ự đổi trong A 260 / A t lỷ ệ 280t i các giá trạ ị
pH khác nhau được th hi n trong hình 4.ể ệ
• Hãy ch c ch n r ng pha loãng RNA c a b n n m trong kho ng tuy n tính c a quang ph k ắ ắ ằ ủ ạ ằ ả ế ủ ổ ế
c a b n.ủ ạ Thông thường ghi h p th nên r i gi a 0.1 và 1.0.ấ ụ ơ ữ Các gi i pháp cho bài ả đọc ngoài
ph m vi này không th o lạ ể đ ường m t cách chính xác.ộ Nói chung là l i l n nh t x y ra n ng ỗ ớ ấ ả ở ồ độ
th p.ấ
Hình 4 nh hẢ ưởng c a pH trên Aủ 260 / A t lỷ ệ 280
Thu c nhu m hu nh quang ố ộ ỳ
M t s thu c nhu m hu nh quang, ch ng h n nh cácộ ố ố ộ ỳ ẳ ạ ư Quant-iT ™ RiboGreen® RNA thu c thố ử , tri n lãm m t nâng cao hu nh quang l n khi b ràng bu c v i các acid nucleic.ể ộ ỳ ớ ị ộ ớ Ít nh t là 1 ng / mL ấ
RNA có th ể được phát hi n và nh lệ đị ượng b ng thu c th RiboGreen® v i m t fluorometer tiêu ằ ố ử ớ ộ
chu n, ẩ đầ đọu c hu nh quang microplate, ho c l c fluorometer.ỳ ặ ọ Để đị nh lượng chính xác RNA, ch a ư
bi t ế được âm m u ch ng l i m t ư ố ạ ộ đường cong chu n ẩ được s n xu t v i m t m u có n ng ả ấ ớ ộ ẫ ồ độ nh t, ấ
thường d a trên ự độ ấ h p th c a nó 260 nm.ụ ủ ở Các tuy n tính t nh lế ừ đị ượng v i RiboGreen® thu c ớ ố
th có th kéo dài ba ử ể đơ đặn t hàng c a các củ ường độ (1 ng / mL đến 1 mg / mL) khi hai n ng ồ độ
thu c nhu m khác nhau ố ộ được s d ng.ử ụ H n n a, xét nghi m Quant-iT ™ RiboGreen® RNA thu c ơ ữ ệ ố
th là tử ương đối không nh y c m v i các ch t ô nhi m axit nucleic phi thạ ả ớ ấ ễ ường được tìm th y trong ấ
các ch ph m axit nucleic, do tuy n tính ế ẩ ế được duy trì Phương pháp nh lđị ượng RNA có th ể đượ ốc t i
u hóa s d ng các m o sau ây:
• Ngoài RNA, Quant-iT ™ RiboGreen® RNA Thu c th có th liên k t v i DNA và phát ra ố ử ể ế ớ
hu nh quang.ỳ ó là khuy n khích Đ ế để đ ề i u tr các m u RNA v i DNase RNase-mi n phí ị ẫ ớ ễ để ạ ỏ lo i b
ô nhi m DNA trễ ước khi nh lđị ượng