Thiết Kế Baculovirus Tái Tổ Hợp Mang Gen Mã Hóa Protein M1 Của Virus Cúm AH5n1 Để Tạo Chủng Sản Xuất Vaccine Thế Hệ Mới Bằng Công Nghệ Virus-Like Particle

Các protein này khi được đồng biểu hiện ở một hệ thống tái tổ hợp như tế bào nấm men, tế bào động vật, tế bào thực vật hoặc tế bào côn trùng…sẽ tự động lắp ghép lại với nhau để hình thàn

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-

Nguyễn Thị Phương

THIẾT KẾ BACULOVIRUS TÁI TỔ HỢP MANG GEN MÃ HÓA PROTEIN M1 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐỂ TẠO CHỦNG SẢN XUẤT VACCINE THẾ HỆ MỚI BẰNG CÔNG NGHỆ VIRUS-

LIKE PARTICLE

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hà Nội – 2013

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-

Nguyễn Thị Phương

THIẾT KẾ BACULOVIRUS TÁI TỔ HỢP MANG GEN MÃ HÓA PROTEIN M1 CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐỂ TẠO CHỦNG SẢN XUẤT VACCINE THẾ HỆ MỚI BẰNG CÔNG

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Đồng Văn Quyền – Trưởng phòng Vi sinh vật học phân tử, Viện Công nghệ sinh học đã dìu dắt, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình Đồng thời, TS luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành các công việc chuyên môn tại phòng

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Đinh Duy Kháng và các anh chị, các bạn đồng nghiệp tại phòng Vi sinh vật học phân tử đã quan tâm, chia sẻ

và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ

và tạo điều kiện cho tôi sử dụng các thiết bị hiện đại để có thể thực hiện đề tài này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo tham gia công tác và giảng dạy tại Phòng đào tạo sau đại học, trường Đại học Thái Nguyên – Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và động viên để tôi có thể hoàn thành khóa học của mình

Hà Nội, ngày 11 tháng 11 năm 2013

Học viên

Nguyễn Thị Phương

MỤC LỤC

MỤC LỤC 4

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Khái quát về bệnh cúm gia cầm 3

1.1.1 Tình hình dịch bệnh trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam 4

1.1.3 Con đường lây nhiễm và triệu chứng bệnh 5

1.1.4 Chẩn đoán, phòng và điều trị bệnh do virus H5N1 7

1.2 Virus cúm A/H5N1 gây bệnh trên gia cầm 8

1.2.1 Đặc điểm cấu tạo 8

1.2.2 Cấu trúc hệ gen 9

1.2.3 Cơ chế gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ 12

1.2.4 Các kháng nguyên quan trọng của Virus cúm A/H5N1 14

1.3.1 Nguồn gốc, sự phát triển của vaccine 17

1.3.2 Vaccine VLP 20

1.3.2.1 Khái quát về VLP 20

3.2.2 Phương pháp tạo VLP 21

3.2.3 Đặc điểm của vaccine VLP 23

3.2.4 Cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch của VLP 24

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Vật liệu 27

2.2 Phương pháp 27

2.2.1 Tách chiết RNA tổng số 27

2.2.2 Phương pháp tổng hợp cDNA 28

2.2.3 Thiết kế hộp gen m1 của virus cúm A/H5N1 29

2.2.4 Phương pháp gắn đoạn DNA ngoại lai vào vector 30

2.2.5 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli 30

2.2.6 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 31

2.2.7 Phương pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn 32

2.2.8 Tinh sạch plasmid 32

2.2.9 Xác định trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động 32

2.2.10 Tách chiết DNA tổng số từ baculovirus tái tổ hợp 34

2.2.11 Chuẩn bị tế bào Sf9 cho quá trình đồng chuyền nạp 34

2.2.12 Phương pháp cấy chuyển tế bào côn trùng 35

2.2.13 Đồng chuyển nạp (co-transfection) 35

2.2.14 Kiểm tra sự có mặt gen m1 trong tế bào côn trùng Sf9 bằng PCR 36

2.2.15 Kiểm tra sự biểu hiện của protein M1 bằng Western blot 37

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Kết quả tách chiết RNA 38

3.2 Khuếch đại gen m1 38

3.2.2 Tách dòng gen m1 39

3.2.3 Thiết kế vector trung gian baculovirus mang hộp gen m1 43

3.3 Chuẩn bị tế bào côn trùng Spodoptera frugiperda (Sf9) 47

3.4 Đồng chuyển nạp tạo baculovirus tái tổ hợp mang hộp gen m1 48

3.5 Kiểm tra sự có mặt của gen m1 trong virus tái tổ hợp bằng phương pháp PCR 52

3.6 Kiểm tra sự biểu hiện của protein M1 ở tế bào Sf9 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC 65

LỜI CAM ĐOAN 68

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic APS Amonium persulphate Amonium persunphat ARN Ribonucleic Acid Axit ribonucleic

BSA Bovine Serum Albumin Albumin huyết thanh bò CPE Cytopathic effect Các tác động gây bệnh tế bào CBB Comassie Brillant Blue Comassie Brillant Blue dNTP 2’-deoxyribonucleoside 5’-

triphosphate

2’-deoxyribonucleozid triphosphat

E.coli Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli

EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic

Acid

Axit ethylen diamin tetraaxetic

EtBr Ethidium Bromite Ethidium Bromit

HA Hemagglutinin Hemagglutinin

KDa, Da Kilo Dalton, Dalton Kilo Dalton, Dalton

LB Lauria-betani medium Môi trường LB LBA Lauria broth containing

OD Optical density Mật độ quang học PBS Phosphate Buffered Saline Đệm PBS

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PVDF Polyvinylidene difluoride Polyvinylidin difluorit RNA Ribonucleic acid Axít ribonucleic RNP Ribonucleoprotein Ribonucleoprotein SDS Sodium dodecyl sulphat Natri dodexin sunphat SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphat-

Polyacrylamid gel electrophoresis

Điện di trên gel polyacrylamit có chứa SDS

TAE Tris - Acetate – EDTA Tris - Acetat – EDTA

Taq Thermus aquaticus Vi khuẩn Thermus aquaticus

TBS Tris Buffered Saline Đệm Tris

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đại dịch cúm gia cầm đã và đang là mối nguy hiểm đe dọa kinh tế chăn nuôi và sức khỏe cộng đồng Sự xuất hiện của chủng virus cúm độc lực cao H5N1 tại Hồng Kông vào năm 1997 và các biến chủng H5N1 khác trong những năm gần đây cùng với sự lây lan nhanh chóng của chúng ở Đông Nam

Á, châu Phi, Trung Đông và châu Âu đã cảnh báo mối đe dạo của một đại dịch cúm toàn cầu [30] Điều đặc biệt nguy hiểm là các chủng virus cúm gia cầm này đã biến đổi, dẫn đến tăng khả năng lây nhiễm sang người cũng như độc lực của virus Để ngăn chặn sự lan truyền của virus cúm và những thiệt hại do virus cúm gây ra, biện pháp hiệu quả nhất hiện nay vẫn là tiêm chủng vaccine [28] [10] Theo thông báo của Tổ chúc Y tế thế giới (WHO), nếu đại dịch cúm xảy ra, số người mắc trên toàn cầu có thể lên tới 2 tỷ Tuy nhiên, công nghệ sản xuất vaccine hiện nay bằng nuôi cấy virus trên trứng gà có phôi chỉ có thể tạo ra khoảng 300 triệu liều/năm, sẽ không thể đủ cung cấp cho toàn thế giới Chính vì vậy, việc phát triển các công nghệ mới để nhanh chóng tạo ra các vaccine an toàn, hiệu quả cao đang rất được quan tâm Công nghệ tạo hạt giả virus (virus-like particle, VLP) hiện được xem là công nghệ mới hứa hẹn bổ sung/thay thế các công nghệ truyền thống để tạo ra các vaccine thế hệ mới với hiệu lực cao hơn, an toàn hơn [2], [13]

VLP hay hạt giả virus được tạo ra bởi các protein cấu trúc của virus Các protein này khi được đồng biểu hiện ở một hệ thống tái tổ hợp như tế bào nấm men, tế bào động vật, tế bào thực vật hoặc tế bào côn trùng…sẽ tự động lắp ghép lại với nhau để hình thành lên các hạt có cấu trúc giống với cấu trúc

tự nhiên của virus Vaccine VLP có độ an toàn cao do không chứa vật liệu di truyền là DNA/RNA nên không có khả năng lây nhiễm, tuy nhiên lại tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh [5] Một ưu điểm quan trọng nữa của vaccine VLP

đó là thời gian sản xuất nhanh hơn so với các công nghệ sản xuất vaccine truyền thống, có thể đáp ứng kịp thời nhu cầu vaccine khi có đại dịch [6]

Matrix protein M1 là một protein quan trọng của virus cúm A/H5N1 có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP (ribonucleoprotein) và tham gia vào quá trình “nảy chồi” của virus [4], [41] Protein M1 cùng với HA (Hemagglutimin) và NA là những kháng nguyên quan trọng quyết định tính sinh miễn dịch của virus và là 3 cấu phần quan trọng để tạo VLP của virus cúm A/H5N1 [17] Với mục tiêu nghiên cứu phát triển vaccine VLP cúm

A/H5N1 bằng công nghệ VLP, chúng tôi thực hiện đề tài “Thiết kế

baculovirus tái tổ hợp mang gen mã hóa protein M1 của virus cúm A/H5N1

để tạo chủng sản xuất vaccine thế hệ mới bằng công nghệ Virus-like Particle”

Đề tài được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài cấp Viện Hàn

lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam “Nghiên cứu tạo chủng Baculovirus

tái tổ hợp mang gen kháng nguyên virus cúm phục vụ mục tiêu sản xuất chế phẩm miễn dịch thế hệ mới” Đề tài được thực hiện tại phòng Vi sinh vật học

phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát về bệnh cúm gia cầm

Cúm gia cầm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của

gia cầm do nhóm virus cúm A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra [25] Họ Orthomyxoviridae đã được phát hiện bao gồm 4 nhóm virus đó là: nhóm virus

cúm A (Influenza A); nhóm virus cúm B (Influenza B); nhóm virus cúm C (Influenza C) và nhóm Thogotovirus Các nhóm virus khác nhau bởi các kháng nguyên trên bề mặt capsid, ở virus cúm A và B là Hemagglutinin (HA),

ở virus cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion (HEF), và ở Thogotovirus là Glycoprotein (GP)

Nhóm virus cúm A (Influenza A) có biên độ vật chủ rộng và được chia thành nhiều phân type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên

bề mặt capsid của hạt virus [7], gồm có 16 phân type HA (từ H1 đến H6) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9) Sự tái tổ hợp giữa các phân type HA và NA sẽ tạo ra nhiều phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh Chủng virus cúm H5N1 có độc lực cao (HPAI) là chủng có khả năng lây nhiễm và tỷ

lệ gây tử vong cao trên 50% số gia cầm bị nhiễm [10]

2003 đến nay, chủng virus H5N1 cơ bản về cấu trúc vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực (tính gây bệnh), loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên - miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với nhiều

biến chủng H5N1 trước đây [51], chúng chính là thủ phạm gây ra dịch cúm trên gia cầm tại Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục quốc gia trên thế giới ở châu Á, châu Âu và châu Phi

Những năm gần đây dịch cúm A/H5N1 vẫn hoành hành ở nhiều nơi trên thế giới gây thiệt hại về người và kinh tế, đặc biệt ở những nước nghèo

và nước đang phát triển như: Bangladesh, Campuchia, Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Iran, Israel, Nhật Bản, Mông Cổ, Myanmar, Hàn Quốc, Hy Lạp,

và Việt Nam Tính đến tháng 8/2012 theo số liệu thống kê của WHO, từ năm

2003 đến 3/2012 đã có 594 người nhiễm bệnh cúm H5N1 tại trong đó 349 người đã tử vong Các quốc gia có số người nhiễm và tử vong cao nhất là Indonesia (134/186), Việt Nam (61/122), Ai Cập (60/168), Trung Quốc (28/43) [51]

Trong năm 2013, dịch cúm cũng bùng phát ở Campuchia và một số tỉnh miềm nam Việt Nam gây tử vong 9 người và phải tiêu hủy nhiều đàn gia súc Bên cạnh đó sự xuất hiện của dịch cúm A/H7N9 tại Trung Quốc với tỉ lệ gây

tử vong cao (27/127 trường hợp) đang trở thành mối lo ngại của nhiều quốc gia trong khu vực

1.1.2 Tình hình dịch bệnh tại Việt Nam

Việt Nam với vị trí địa lý giáp danh Trung Quốc là một quốc gia có nhiều dịch bệnh lớn xảy ra, kết hợp với khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho virus cúm A/H5N1 lây lan và phát triển thành đại dịch gây thiệt hại lớn về kinh tế và sức khỏe con người Dịch cúm gia cầm bùng phát lần đầu tiên tại Việt Nam vào cuối tháng 12/2003 ở các tỉnh phía Bắc và Long An, sau đó nhanh chóng lan tới 57/64 tỉnh thành trong cả nước Tổng số gia cầm bị mắc bệnh, chết và thiêu hủy hơn 43,9 triệu con Đặc biệt đã có 3 người nhiễm virus cúm A/H5N1 và cả 3 đã tử vong trong đợt dịch này

Sang đến năm 2004, dịch bệnh cúm gia cầm tái phát ở 17 tỉnh thành, số gia cầm tiêu hủy là 84.078 con và đã có tới 27 người mắc bệnh cúm A/H5N1 trong đó có 9 bệnh nhân tử vong Năm 2005 dịch cúm xảy ra trên 36 tỉnh thành trong cả nước gây thiệt hại 1,846 triệu gia cầm

Giai đoạn từ năm 2006 đến 2012 dịch bệnh tuy được khống chế và phòng ngừa những vẫn xảy ra rải rác ở nhiều nơi trên cả nước gây tổn thất nhiều cho ngành sản xuất chăn nuôi Đặc biệt theo báo cáo của tổ chức lương thực thế giới FAO năm 2012 [9], sự xuất hiện của nhiều biến chủng mới như calde 2.3.2.1 ở Bangladesh, Hàn Quốc, Nhật Bản, Myanmar, Nepanl, Indonesia và Việt Nam, calde 2.3.4 tại Trung Quốc là chủng virus chưa có vaccine phòng bệnh hiệu quả

Tháng 1/2013 dịch cúm gia cầm xuất hiện tại hai hộ gia đình ở Tây Ninh với tổng số gia cầm phải thiêu hủy là 3.438 con Đến tháng 2-3/2013 dịch bệnh tiếp tục xuất hiện ở Khánh Hòa, Cà Mau và Bình Định khiến nhiều gia cầm bị chết và thiêu hủy Ngoài ra có một cháu bé đã tử vong do nhiễm cúm virus cúm A/H5N1 Tháng 4/2013 virus cúm tiếp tục được phát hiện ở chim yến một loài động vật có giá trị kinh tế cao của Việt Nam Tháng 7/2013 virus cúm tiếp tục tấn công chim cút ở Tiền Giang khiến 10 nghìn con chim phải thiêu hủy Như vậy, trong 7 tháng đầu năm 2013 tuy cúm gia cầm không bùng phát thành đại dịch lớn nhưng nó vẫn diễn ra ở một số tỉnh thành phía Nam và gây thiệt hại kinh tế không nhỏ cho các hộ chăn nuôi [53]

1.1.3 Con đường lây nhiễm và triệu chứng bệnh

Các vật chủ tự nhiên của virus cúm A là các loài chim hoang dã (vịt trời) và gia cầm (vịt, gà, ngan, ngỗng ), chúng thường không bị gây bệnh hoặc chỉ nhiễm bệnh nhẹ bởi virus cúm A Một số biến thể cường độc (H5, H7) đã xuất hiện gần đây do tái tổ hợp nhiều gen khác nhau có thể gây dịch cúm nguy hiểm làm chết hàng loạt ở chim và gia cầm [23] Tuy nhiên, virus

cúm A đặc biệt là chủng virus A/H5N1 hiện đang lưu hành có thể xâm nhiễm gây bệnh ở các loài động vật có vú khác như hổ, mèo, ngựa, lợn và người Khi gia cầm nhiễm virus cúm, virus được nhân lên trong đường hô hấp và đường tiêu hóa Sự lây truyền bệnh được thực hiện theo hai phương thức [1] [39]

+ Lây trực tiếp: do con vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh + Lây gián tiếp: qua các hạt khí dung trong không khí với khoảng cách gần hoặc những dụng cụ chăn nuôi, phân, thức ăn, nước uống quần áo, giầy dép, phương tiện vận chuyển, lồng nhốt, chim, thú, côn trùng có mang mầm bệnh

Như vậy, virus cúm dễ dàng lây truyền tới vùng khác do con người, phương tiện vận chuyển, dụng cụ và thức ăn chăn nuôi Bệnh chủ yếu truyền ngang, chưa có bằng chứng cho thấy bệnh có thể truyền dọc (qua phôi thai) vì những phôi bị nhiễm virus thường chết mà không phát triển được

Khi gia cầm mắc bệnh cúm A/H5N1 thường có các biểu hiện thường gặp là: mào, yếm sưng to, phù quanh mí mắt; ở các xoang bị viêm cata, lắng đọng fibrin và có mủ; có thể viêm dính buồng trứng với xoang bụng; xuất huyết điểm trên bề mặt niêm mạc và tương mạc nội tạng, xuất huyết ở hầu hết đường ống tiêu hóa; tụy sưng to có những vạch vàng hoặc đỏ sẫm; túi Fabricius ở gà bị xung huyết và xuất huyết Ở người, virus xâm nhập vào niêm mạc phế nang, phế quản, chúng nhân lên và gây hủy hoại các biểu mô túi khí, gây xung huyết và tràn dịch phổi ở bệnh nhân Bên cạnh đó, virus có khả năng gây nhiễm khí quản, ruột, não và có thể xuyên qua nhau thai xâm nhập vào bào thai, gây mất cân bằng điều hòa miễn dịch do hiện tượng tăng cytokine không kiềm chế (cytokine storm) xảy ra dẫn đến cơ thể bị suy sụp và

tử vong [20]

1.1.4 Chẩn đoán, phòng và điều trị bệnh do virus H5N1

Để chẩn đoán bệnh cúm gia cầm và bệnh cúm ở người thường dựa chủ yếu và các dấu hiệu lâm sàng, dịch tễ học và các xét nghiệm phát hiện sự hiện diện của virus cúm trong cơ thể bệnh như phản ưng ngưng kết hồng cầu (HA hemagglutination test) hoặc các xét nghiệm huyết thanh miễn dịch học và phân lập virus [29] Hiện nay với sự phát triển của sinh học phân tử, các phương pháp real time PCR, RT-PCR (Reverse transcription PCR) và multiplex PCR đã được sử dụng trong chẩn đoán phát hiện virus cúm có độ chính xác và độ tin cậy cao

Việc tiêm phòng được xem là lựa chọn đầu tiên để chống lại sự xâm nhiễm và lây lan của dịch cúm Trên thế giới có nhiều quốc gia tham gia vào việc nghiên cứu sản xuất vaccine phòng cúm, chủ yếu tập trung ở những nước phát triển như: Mỹ, Pháp, Đức, Hà Lan, … Với mỗi loại vaccine, yêu cầu cơ bản là phải có tính miễn dịch bảo hộ, tính kháng nguyên, tính đặc hiệu và tính không độc Việt Nam đang trong giai đoạn sản xuất thử nghiệm vaccine phòng chống cúm A/H5N1 Các vaccine ngừa bệnh cúm mùa trước đây không có hiệu quả đối với cúm A /H5N1 mới Các vaccine phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới

Mỗi khi dịch cúm bùng phát, các quốc gia thường có những biện pháp kiểm soát vệ sinh như đeo khẩu trang, rửa tay bằng xà phòng đặc biệt là sau khi ho, hắt hơi Virus cúm A/H5N1 có sức đề kháng yếu, dễ bị bất hoạt bởi bức xạ mặt trời, tia cực tím và các chất tẩy rửa thông thường (xà phòng, chất tẩy natri hypochlorite 0,05%, Ethanol 70 %) Đồng thời tiến hành tiêu hủy gia súc bị nhiễm bệnh hoặc nghi là bị nhiễm tại khu vực có dịch Tuy nhiên, việc làm này là chưa đủ để ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh, đặc biệt là những khu đông dân cư và có mật độ động vật nuôi cao vì virus cúm A/H5N1

có thể tồn tại hàng giờ ở bên ngoài, đặc biệt khi thời tiết lạnh Trên thực tế, thế giới đã sử dụng phổ biến một số loại thuốc dùng trong điều trị cúm A như:

+ Amantadine và Rimantadine - loại thuốc cản trở sự hoạt động của kênh ion M2 Dẫn tới ức chế quá trình cởi bỏ lớp vở ngoài của virus và vRNP không được đưa vào nhân cài xen vào gemone của tế bào chủ

+ Leptomycine B- loại thuốc ngăn cản sự vận chuyển vRNP ra khỏi nhân tế bào

+ Zanamivir ( Relenza) và Tamiflu (Oseltmavir)- thuốc này có cấu hình không gian tương tự như NA Do vậy, chúng ngăn cản sự liên kết của NA với các thụ thể sialic acid, cản trở quá trình giải phóng virus, ức chế sự lan nhiễm virus

1.2 Virus cúm A/H5N1 gây bệnh trên gia cầm 1.2.1 Đặc điểm cấu tạo

Virus cúm H5N1 thuộc type A, họ Orthomyxoviridae Họ này gồm 4

nhóm virus: Nhóm virus cúm A, nhóm virus cúm B, nhóm virus nhóm C và nhóm Thogotovirus Chúng là tác nhân chủ yếu gây bệnh đường hô hấp trên ở người, động vật, gia cầm và chim Cúm C là loại thường gặp nhất ở người nhưng hiếm khi gây bệnh trầm trọng, cúm B thỉnh thoảng bùng phát thành dịch ở trẻ em, còn virus cúm A là loại có độc lực cao nhất có thể gây nên đại dịch nguy hiểm trên cả gia cầm và con người trên toàn cầu Virus họ này rất nhạy cảm với nhiệt độ, các dung môi hoà tan lipid, các loại hoá chất sát trùng

và oxi hoá, formaldehyt, và với các tia phóng xạ [25] [44]

Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 -120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng

250 triệu Da Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm lớp vỏ bọc ngoài envelope và

lõi là RNA sợi đơn âm - negative single strand (hình 1.1)

Hình 1.1 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mô hình (B), và phức hợp

ribonucleoprotein RNP (C) của virus cúm A

Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA của virus, bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc hiệu hóa gắn các protein màng của virus Trên bề mặt có khoảng

500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10 - 14 nm

có đường kính 4 - 6 nm, đó là những kháng nguyên bề mặt vỏ virus có bản

chất cấu tạo glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các dấu ấn phân tử

khác của virus [52] Phân tử NA và HA là hai loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm, tuy nhiên sự phân bố của chúng không đồng đều (tỉ lệ khoảng 1NA/4HA) [25] [45], protein M2 nằm xuyên qua màng lipid kép và hoạt động như kênh vận chuyển ion Xen giữa hạt virus và vỏ là lớp protein nền M1 (matrix)

1.2.2 Cấu trúc hệ gen

Hệ gen virus cúm A có vật chất di truyền là RNA sợi đơn âm (-) ssRNA,

bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt mã hóa cho 11 protein khác nhau của virus gồm: HA, NA, M (M1 và M2), NP, NS (NS1 và NS2), PA, PB1, PB1-F2 và PB2 [25] [35] Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc xoắn

bậc 2 α đối xứng dài 50 - 100 nm, đường kính 9 - 10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP) – có bản chất là lipoprotein để tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) Mỗi RNP kết hợp với 3 protein enzyme polymerase (PA, PB1 và PB2) chịu trách nhiệm trong quá trình phiên mã và sao chép RNA của virus Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptid tạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn, và tạo thành một sợi RNA duy nhất có tổng độ dài từ 10.000 - 15.000 bp (tuỳ theo từng chủng virus cúm A), chứa đựng khoảng 13,5 kb thông tin di truyền và có

cấu trúc xoắn α (α-helix) bên trong vỏ virus (hình 1.1) Hai đầu 5’- và 3’- sợi

RNA hệ gen virus có gắn thêm chuỗi nucleotide có tính bảo tồn cao giữa các phân type là: 5’-AGUAGAACAAGG… và 3’- UCG(U/C)UUUCGU CC [12] [47] [38]

- Phân đoạn 1 (gen PB2) có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp

protein enzyme PB2, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzyme polymerase của virus, chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA virus Protein PB2 có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 84 kDa có vai trò thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ của virus cúm A/H5N1

- Phân đoạn 2 (gen PB1) cũng có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp

enzyme PB1 - tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzyme polymerase trong quá trình tổng hợp RNA virus, chịu trách nhiệm gắn mũ RNA

- Phân đoạn 3 (gen PA) có kích thước 2233 bp, là phân đoạn gen bảo

tồn cao, mã hóa tổng hợp protein enzyme PA có khối lượng phân tử theo tính toán khoảng 83 kDa (trên thực tế là 96 kDa) PA là một tiểu đơn vị của polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus

- Phân đoạn 5 (gen NP) kích thước khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp

nucleoprotein (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận

chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ NP là một protein được glycosyl hóa, có đặc tính kháng nguyên biểu hiện theo nhóm virus, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA, có khối lượng phân tử khoảng 56 kDa

- Phân đoạn 4 (gen HA) có độ dài thay đổi tuỳ theo từng chủng virus

- Phân đoạn 6 (gen NA) là một gen kháng nguyên của virus, có chiều

dài thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở A/H6N2 là 1413 bp, ở A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 - 1410 bp) Đây là gen mã hóa tổng hợp protein NA, kháng nguyên bề mặt capsid của virus, có khối lượng phân tử khoảng 50 kDa Các nghiên cứu phân tử gen NA của virus cúm cho thấy phần đầu 5’- của gen này (hay phần tận cùng N của polypeptide NA) có tính biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng virus cúm A, sự thay đổi này liên quan đến quá trình thích ứng và gây bệnh của virus cúm trên nhiều đối tượng vật chủ khác nhau

- Phân đoạn 7 (gen M) có kích thước khoảng 1027 bp, mã hóa cho

protein M (matrix protein - M) của virus (gồm hai tiểu phần là M1 và M2 được tạo ra bởi những khung đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạn RNA), cùng với HA và NA có khoảng 3000 phân tử MP trên bề mặt capsid của virus cúm A, có mối quan hệ tương tác bề mặt với hemagglutinin Protein M1 là một protein nền, là thành phần chính của virus có chức năng bao bọc

RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình “nảy chồi” của virus

Protein M2 là chuỗi polypeptide bé, có khối lượng phân tử khoảng 11 kDa, là

protein chuyển màng - kênh ion (ion channel) cần thiết cho khả năng lây

nhiễm của virus, chịu trách nhiệm “cởi áo” virus trình diện hệ gen ở bào

tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ

- Phân đoạn 8 (gen NS) là gen mã hóa protein không cấu trúc (non

structural protein), kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 (còn gọi là NEP, nuclear export protein) Độc tính của virus có

sự liên quan với gen không cấu trúc (non-structural gene) đã được tìm thấy ở biến chủng A/H5N1/97, trong tự nhiên, việc đột biến xóa đi một phần gen có liên quan đến giảm độc lực NS1 có khối lượng phân tử là 27 kDa, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm và tác động lên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tế bào chủ NEP hay NS2, là gen hình thành từ hai đoạn gen (30

bp và 336 bp) mã hóa loại protein có khối lượng phân tử khoảng 14 kDa (trên thực tế là 12 kDa), đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới [20]

Như vậy, virus cúm A (cụ thể: cúm A/H5N1) có hệ gen được cấu trúc

từ 8 phân đoạn riêng biệt và không có gen mã hóa enzyme sửa chữa RNA, tạo điều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện các đột biến điểm trong các phân đoạn gen/hệ gen qua quá trình sao chép nhân lên của virus, hoặc trao đổi các phân đoạn gen giữa các chủng virus cúm đồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể dẫn đến thay đổi đặc tính kháng nguyên tạo nên các chủng virus cúm A mới [8] [42]

1.2.3 Cơ chế gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ

Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm [29] như sau:

- Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp của HA và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào đích, sau đó giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm (hình 1.2)

Hình1 2 Chu trình nhân lên của virus cúm A/H5N1 trong tế bào vật chủ

Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các RNA vận chuyển phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA transcription) Phức hợp protein – RNA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào [4]

- Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase Các sợi này không

được Adenine hóa (gắn thêm các Adenine - gắn mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng

kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’,

sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus (Hình 1.2)

- Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện

tượng “nảy chồi” của virus NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại

nhân tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của virus Sau cùng các RNP của

virus được hợp nhất với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt

vào màng tế bào chủ bởi liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid Các

NA phân cắt các liên kết này và giải phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác [26]

1.2.4 Các kháng nguyên quan trọng của Virus cúm A/H5N1

2.4.1 Kháng nguyên bề mặt HA

Protein hemagglutinin (HA) là một glycoprotein thuộc protein màng type I (lectin), có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà trong ống nghiệm (in vitro) Có 16 phân type HA đã được phát hiện (H1 - H16, phân type H16 mới

được tìm thấy ở virus gây bệnh cho Hải Âu đầu đen - Thụy Điển, ba phân type (H1, H2 và H3) thích ứng lây nhiễm gây bệnh ở người liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch sử [25] Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus và mỗi phân tử HA có dạng hình trụ, dài khoảng 130 ăngstron (Å), cấu tạo gồm 3 đơn phân (trimer), mỗi đơn phân (monomer) được tạo thành từ hai dưới đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa), liên kết với

nhau bởi các cầu nối disulfide (-S-S-) Các đơn phân sau khi tổng hợp đã

được glycosyl hóa (glycosylation) và gắn vào mặt ngoài capsid là dưới đơn vị

HA2, phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi dưới đơn vị HA1 chứa đựng

vị trí gắn với thụ thể thích hợp của HA trên bề mặt màng tế bào đích [45]

Sự kết hợp của HA với thụ thể đặc hiệu (glycoprotein chứa sialic acid) trên bề mặt màng tế bào, khởi đầu quá trình xâm nhiễm của virus trên vật chủ

giúp cho virus xâm nhập, hòa màng và giải phóng RNA hệ gen thực hiện quá trình nhân lên ở trong tế bào cảm nhiễm Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ thể chứa acid sialic của tế bào đích với

vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác nhau Protein HA là kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A, kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc hiệu với từng type HA, và tham gia vào phản ứng trung hòa virus, được coi là protein vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus, là đích của bảo vệ miễn dịch học nhằm ngăn chặn sự xâm nhiễm của virus ở cơ thể nhiễm, cơ sở điều chế các vaccine phòng cúm hiện nay [18] [14]

2.4.2 Kháng nguyên bề mặt NA (neuraminidase)

Protein neurominidase còn gọi là sialidase là một protein enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân type NA [3] Có 9 phân type (từ N1 đến N9) được phát hiện chủ yếu ở virus cúm gia cầm, hai phân type N1 và N2 được tìm thấy ở virus cúm người liên quan đến các đại dịch cúm trong lịch

sử [49] Trên bề mặt capsid của hạt virus có khoảng 100 phân tử NA xen giữa các phân tử HA và phân tử có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 dưới đơn vị giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt phẳng, và phần kị nước gắn vào lớp vỏ capsid

Protein NA có vai trò là một enzyme cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ, và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng

tế bào NA tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”,

đẩy nhanh quá trình cởi áo “uncoating” giải phóng hệ gen của virus vào trong

bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu [45]

2.4.3 Protein nền M1

Protein M1 là loại protein chiếm tỷ lệ cao nhất trong hạt virion virus, là một protein nền có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình “nảy chồi” của virus [4] M1 là một protein khá bền vững gồm 252 amino acid có trọng lượng khoảng 27,8 kDa Đơn phân của M1 là các cấu trúc hình que dài khoảng 60A0 Các nghiên cứu về protein M1 đã chỉ rằng M1 chứa hai cấu trúc cơ bản là α – Helicase (được đánh dấu từ H1 đến H9) và cấu trúc cặp tóc – loop (được đánh dấu từ L1 đến L8) Theo tính chất hóa sinh M1 được phân chia thành hai vùng acidamine tạo cấu trúc hình cầu Vùng thứ nhất từ acidamine số 1 đến 164 và vùng thứ hai từ acidamine 165 đến 252, hai vùng này được nối với nhau bởi vùng nhạy cảm với protease M1

là protein cấu trúc quan trọng của hạt virion và là kháng nguyên đặc hiệu tuýp, nó có vai trò quan trọng trong chu trình sống của virus[24], [47]

i, Tương tác với vRNP và NS2 và vận chuyển vRNP ra vào nhân, M1

là yếu tố điều chỉnh quá trình xuất nhập này Sau khi virus đi vào endosome dưới tác dụng của pH thấp do sự vận chuyển của ion H+ qua kênh ion M2 của virus và phức hợp M1-vRNP bị phân tách hoàn toàn cho phép vRNP đi vào nhân Ngược lại, khi các vRNP mới được tạo thành trong nhân thì M1 và NS2

sẽ đi vào nhân và kết hợp với vRNP cùng được vận chuyển ra khỏi nhân Sự tương tác của M1 với RNP đã được nghiên cứu khá rõ Hai domain trong M1 bám vào RNA được xác định ở hai vùng độc lập: ngón tay kẽm (a zinc finger

motif, ở vị trí amino acid 148 tới 162) và một chuỗi amino acid RKLKR (ở vị trí amino acid 101 tới 105)

ii, Điều hoà sao chép vRNP; vRNP chỉ được sao chép khi tách khỏi

M1

iii, Tương tác với protein vỏ của virus: HA, NA, M2 trong quá trình

nảy chồi

iv, Huy động các thành phần của virus tới vị trí lắp ráp và khởi đầu nảy

chồi M1 là yếu tố trung tâm trong việc lắp ráp các thành phần của virus Phân

tử M1 liên kết với vRNP, màng tế bào qua các đuôi hướng tế bào chất của cả hai glycoprotein bề mặt HA và NA, các phân tử M1 khác thì tạo thành một lớp dưới lớp vỏ bọc của virus Liên kết của M1 với màng dựa vào sự tổ hợp của cả hai tương tác tĩnh điện và kị nước cũng như sự tương tác của protein đặc hiệu với protein vỏ

v, Huy động các thành phần tế bào chủ cho việc hoàn thành nảy chổi và

giải phóng virus

vi, Tỉ lệ M1/NP của phân tử virus ảnh hưởng đến hình thái của virion

và sự lan truyền của virus khi được giải phóng

1.3 Vaccine phòng chống cúm 1.3.1 Nguồn gốc, sự phát triển của vaccine

Vaccine là chế phẩm có tính kháng nguyên dùng để tạo miễn dịch đặc hiệu chủ động, nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một hoặc một số tác nhân gây bệnh cụ thể [54] Các nghiên cứu mới còn mở ra hướng dùng vaccine để điều trị một số bệnh (vaccine liệu pháp, một hướng trong các miễn dịch liệu pháp) Thuật ngữ vaccine xuất phát từ vaccinia, loại virus gây bệnh đậu bò nhưng khi đem chủng tiêm cho người lại giúp ngừa được bệnh đậu

mùa (tiếng Latinh vacca nghĩa là "con bò cái")

Vaccine đầu tiên gắn với tên tuổi của Edward Jenner, một bác sĩ người Anh [50] Năm 1796, châu Âu đang có dịch đậu mùa, Jenner đã thực hiện thành công thử nghiệm vắc-xin ngừa căn bệnh này Thời của Jenner, các virus vẫn chưa được khám phá, còn vi khuẩn tuy đã được tìm ra nhưng vai trò gây bệnh của chúng chưa được biết Thời điểm 1798, khi Jener công bố kết quả thí nghiệm của mình, người ta chỉ hình dung là có các "mầm bệnh" gây nên

sự truyền nhiễm

Năm 1878, Louis Pasteur sau nghiên cứu dịch bệnh tả gây tàn sát trên

gà đã xác nhận các giả thuyết của Jenner là đúng và từ đó mở đường cho khoa miễn dịch học hiện đại Vaccine đã đẩy lùi nhiều bệnh tật trên thế giới như: triệt tiêu bệnh đậu mùa trên toàn cầu, thanh toán gần như hoàn toàn bệnh bại liệt, giảm đáng kể các bệnh sởi, bạch hầu, ho gà, bệnh ban đào, thủy đậu, quai

bị, thương hàn và uốn ván…vv Nguyên tắc vẫn không có gì thay đổi: gây miễn dịch bằng một vi khuẩn hoặc virus giảm độc lực, hoặc với một protein đặc hiệu có tính kháng nguyên để gây ra một đáp ứng miễn dịch, rồi tạo một trí nhớ miễn dịch đặc hiệu, tạo ra hiệu quả đề kháng cho cơ thể về sau khi tác nhân gây bệnh xâm nhập với đầy đủ độc tính

Có nhiều cách để phân loại vaccine, tuy nhiên dựa vào đặc điểm vaccine được phân thành các loại chính sau và cách phân loại này được hiện được nhiều người chấp nhận [55]

+, Vaccine truyền thống như: vaccine bất hoạt và vaccine giảm động lực với ưu điểm là dễ sản xuất và bảo quản, giá thành rẻ, độ an toàn cao Tuy nhiên, nhược điểm lớn của loại vaccine này là gây đáp ứng miễn dịch ngắn hạn, cần tiêm nhắc lại nhiều lần, khả năng sinh đáp ứng miễn dịch chậm, lượng vaccine tiêm mỗi lần nhiều và hiệu quả không cao đối với vaccine bất hoạt và vaccine giảm động lực thì không an toàn do có khả năng biến đổi lại thành chủng cường độc

+, Vaccine thế hệ mới gồm có: (1) Vaccine tái tổ hợp có chứa các

kháng nguyên được biểu hiện ở các hệ biểu hiện khác nhau như: vi khuẩn,

nấm men, tế bào động vật hay virus để tổng hợp Vaccine DNA sản xuất dựa

trên nguyên tắc là gen mã hóa kháng nguyên gây bệnh của virus được gắn vào một vector biểu hiện cùng với một promoter mạnh có khả năng biểu hiện tốt trong tế bào vật chủ Vaccine DNA rất an toàn, phương thức gây miễn dịch đơn giản do chỉ chứa DNA thuần khiết nên bền với nhiệt độ (2) Vaccine virus nhược độc nhân tạo sản xuất bằng kĩ thuật di truyền ngược được áp dụng cho virus có hệ gen gồm một sợi RNA gồm nhiều phân đoạn nhỏ Có 3 loại vaccine nhược độc nhân tạo đã được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vaccine trên thế giới hiện nay đó là NIBRG - 14 (NIBSC), VN/04xPR8 - rg (SJCRH) và

VNH5N1 - PR8/CDC - rg (CDC) (3) Vaccine dưới đơn vị là loại vaccine chỉ

sử dụng một phần của hạt virus để kích thích đáp ứng miễn dịch Do các kháng nguyên đã được tinh chế khi sử dụng làm vaccine nên có độ an toàn cao, không gây các phản ứng phụ Quy trình sản xuất lượng lớn vaccine dưới đơn vị khá đơn giản, không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp và đắt tiền

Bên cạnh đó, hiện nay các nhà khoa học đã tạo ra được vaccine viêm gan B và vaccine phòng chống HPV (human papilloma virus) là 2 loại vaccine đầu tiên được sản xuất bằng công nghệ VLP [19] và một số thử nghiệm ban đầu vaccine VLP cúm A/H5N1 trên mô hình chuột thực nghiệm cho kết quả rất khả thi [41] [13] Đây là một hướng đi mới đầy triển vọng trong cộng nghệ sản xuất vaccine và sử dụng vaccine để điều trị một số bệnh còn nan y như ung thư, AIDS…

1.3.2 Vaccine VLP

1.3.2.1 Khái quát về VLP

Công nghệ VLP đã được khai triển bởi nhiều trung tâm nghiên cứu và đại học quốc tế để tạo vaccine thế hệ mới cho nhiều tác nhân virus như virus cúm A/H1N1, virus cúm A/H5N1, Adenovirus, HIV, Hepatitis C, Respiratory Syncytial (RSV), Varicella Zoster (VZV), Ebola, Chikungunya [9], [13] Công ty Novavax Inc là một trong những công ty đầu ngành khai triển VLP cho các vaccine cúm ở Hoa Kỳ và một số nơi trên thế giới Các thử nghiệm của Novavax Inc trên động vật thực nghiệm và lâm sàng ở người đã cho kết quả tốt, vaccine VLP an toàn và có khả năng cao cho việc thương mại hóa trên thị trường trong tương lai

Hình 1.3 Sơ đồ minh họa cấu trúc của hạt virus tự nhiên (native virus)

và hạt giả virus (virus – like particle)

VLP được gọi là hạt giả virus vì hình thái cấu trúc của nó tương tự như một virus tự nhiên Phía ngoài là lớp vỏ chứa thành phần chủ yếu là lớp kép photpholipid của tế bào vật chủ và các loại protein đặc trưng của từng chủng virus Tuy nhiên, bên trong của VLPs không chứa vật liệu di truyền – đây là nguyên nhân khiến VLPs không gây hại cho tế bào vật chủ sau khi xâm nhiễm (hình 1.3)

Do các VLPs có cấu trúc tương tự virus tự nhiên và là tập hợp của các protein kháng nguyên quan trọng của virus, VLP sẽ được hệ thống miễn dịch của vật chủ nhận biết và tạo đáp ứng miễn dịch phòng vệ cao tương tự như khi bị nhiễm virus tự nhiên Phương pháp này hứu hẹn là một trong những bước đột phá mới trong cuộc chiến chống lại virus nguy hiểm như HIV, cúm A/H5N1 và virus truyền nhiễm khác [6]

Hình 1.4: Sơ đồ tái tổ hợp giữa bộ khung DNA của baculovirus và vector

trung gian (baculovirus transfer vector) mang gen kháng nguyên ngoại lai

để tạo VLP

Đầu tiên các gen mã hóa cho các kháng nguyên quan trọng của virus sẽ được thiết kế vào vector trung gian (baculovirus transfer vector) Tiếp theo

đó, vector này được đồng chuyển nạp (co-transfect) vào tế bào chủ (tế bào

côn trùng nuôi cấy in vitro) với DNA khung của baculovirus đã được xử lý

Trong tế bào chủ, bộ khung DNA này sẽ tái bản và đóng gói tạo nên các virus tái tổ hợp biểu hiện protein cần nghiên cứu (Gene of Interest - GOI) (hình 1.4) Các protein kháng nguyên quan trọng của virus (kháng nguyên bề mặt hoặc kháng nguyên lõi) khi được biểu hiện ra sẽ tự động lắp ghép lại với nhau tạo ra các hạt VLP

Để sản xuất VLP có thể sử dụng nhiều hệ thống biểu hiện như: (1) các dòng tế bào động vật có vú, (2) tế bào côn trùng; (3) các chủng nấm men như

Saccharomyces cerevisiae và Pichia pastoris, (4) Escherichia coli và các

chủng vi khuẩn khác Vaccine VLP theo đường miệng (vaccine HBV, vaccine virus Norwalk) đã được tạo ra từ các loài thực vật khác nhau bao gồm thuốc

lá, rau diếp và khoai tây [19], [43] Các hệ thống biểu hiện này đều có những

ưu và nhược điểm riêng Việc dễ dàng trong biểu hiện, khả năng mở rộng quy

mô và chi phí sản xuất thấp đã khiến Escherichia coli và nấm men là một lựa

chọn phổ biến, tuy nhiên xét về các yếu tố khác như glycosyl hóa, gấp nếp (folding) chính xác các protein tái tổ hợp biểu hiện ra và quá trình lắp ráp thành các hạt giả virus cũng như tối ưu hóa codon… hai hệ thống này vẫn bộc

lộ những hạn chế, vì vậy đòi hỏi cần có hệ thống sản xuất thay thế tối ưu hơn

VLP sản xuất trên hệ thống biểu hiện baculovirus mang nhiều ưu điểm như khả năng sửa chữa sau dịch mã, quá trình gấp nếp protein…tuy nhiên hệ thống này cũng tạo ra các thách thức trong việc tinh sạch các VLP ra khỏi baculovirus, vì cả hai đều có kích thước tương tự nhau 80-120 nm [34] Hệ thống nuôi cấy tế bào động vật có vú đang được ưa chuộng bởi khả năng sửa chữa sau dịch mã và lắp ráp các VLP chính xác, nhưng chúng lại là hệ thống

khó kiểm soát và tốn kém cho sản xuất Hệ thống Retrovirus có xu hướng mang các protein màng tế bào không mong muốn trong vỏ của chúng trong quá trình lắp ráp virus Hướng nghiên cứu sản xuất tương lai có thể là việc lắp ráp VLP từ các protein của virus trong ống nghiệm bằng phương pháp hóa học [31]

3.2.3 Đặc điểm của vaccine VLP

Quan sát thực nghiệm cho thấy nhiều protein cấu trúc của virus có khả năng tự lắp ghép lại với nhau hình thành các hạt giả virus (VLP) có cấu trúc giống với các virus lây nhiễm tự nhiên, hoặc trong một số trường hợp tạo thành các hạt dưới virus (subviral particles) Quan sát này đã mở ra một hướng nghiên cứu đầy triển vọng trong phát triển các vaccine thế hệ mới đó là tạo các vaccine VLP Vaccine VLP kết hợp các ưu điểm của vaccine virus toàn phần và các vaccine dưới đơn vị tái tổ hợp VLP có cấu trúc tương tự như virus tự nhiên nhưng do thiếu vật liệu di truyền (acid nucleic) của virus nên chúng hoàn toàn không có khả năng lây nhiễm[6] [11] [22] Khi sử dụng vaccine VLPs sẽ có các ưu điểm so với các loại vaccine khác là:

• Độ an toàn rất cao vì kháng nguyên VLP không còn DNA/RNA của

nhân Do tính an toàn, việc tạo VLP cho hầu hết các tác nhân bệnh lý được thực hiện trong điều kiện thường của phòng thí nghiệm, không đòi hỏi những

kỹ thuật hoặc phòng thí nghiệm độ an toàn quá cao như đối với các trường hợp tạo vaccine cổ điển

• Khả năng tạo kháng thể mạnh và chuyên biệt Các kết quả nghiên cứu

và thử nghiệm đã cho thấy VLP thường tạo đáp ứng miễn dịch mạnh hơn các tiểu đơn vị hoặc các protein kháng nguyên tái tổ hợp, và có thể kích thích cả miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào

• Sản xuất nhanh để đáp ứng khi dịch bệnh bộc phát Phương pháp cloning và dùng tế bào như Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) của côn trùng

(hãng Novavax Inc.) hoặc tế bào thực vật của cây thuốc lá và Alfalfa (hãng Medicaga Inc.) để tạo VLP làm kháng nguyên có thể được thực hiện từ vài tuần đến hai tháng thay vì sáu tháng như vaccine cổ điển sản xuất trên trứng

gà có phôi Ưu điểm này rất cần để tạo vaccine đáp ứng sự bộc phát và thay đổi gen (mutation) nhanh của các virus [15] [31] [19]

• Sự miễn dịch tồn tại trước: Các kháng thể tồn tại từ trước kháng lại

VLP có thể ảnh hưởng bất lợi đến tính sinh miễn dịch của VLP Trong trường hợp này, sử dụng các VLP có nguồn gốc từ các tác nhân không gây bệnh cho người có thể sẽ thuận lợi hơn

3.2.4 Cơ chế tạo đáp ứng miễn dịch của VLP

Để tạo đáp ứng miễn dịch hiệu quả, các kháng nguyên đích phải bộc lộ trên bề mặt VLP với mật độ cao Nhờ sự tiến bộ của ngành khoa học sinh học khác, đặc biệt là sinh học cấu trúc, rất nhiều protein của virus đã được phân tích cấu trúc cung cấp lượng thông tín rất lớn về các protein của virus, từ đó

có thể cải biến VLP tạo ra các VLP hoạt động như những giàn trình diện kháng nguyên Phương pháp phổ biến nhất để tạo các VLP mang cùng một lúc nhiều quyết định kháng nguyên (epitopes) đó là dùng kỹ thuật gen để chèn các các gen kháng nguyên khác nhau vào VLP Rất nhiều loại VLP đã được cải biến để đạt mục đích trên và nhiều vaccine VLP đã được thử nghiệm thành công trên mô hình động vật để chống lại các virus như virus sốt xuất huyết (malaria) và virus cúm [27] Ưu điểm của kỹ thuật lai ghép kháng nguyên là kháng nguyên ngoại lai chèn trên VLP sẽ được biểu hiện với cấu trúc tương tự với cấu trúc tự nhiên của chúng và với mật độ cao trên bề mặt của VLP Mặc dù vậy cũng có những khó khăn trong việc tạo các VLP lai (chimeric VLPs) Các peptid được chèn vào VLP chỉ mang lại hiệu quả khi chúng được bộc lộ trên bề mặt VLP và không cản trở quá trình gấp nếp (folding) và lắp ghép của các protein Một hạn chế khác của kỹ thuật tạo VLP

lai đó là chỉ chèn được các peptid có kích thước từ 20 đến 30 amino acid hoặc

ít hơn, mặc dù cũng có một số trường hợp ngoại lệ chèn được các peptid có kích thước lớn hơn [22] [33]

VLP còn có thể được sử dụng như các giá đỡ để gắn các hợp chất có bản chất không phải là protein nhờ phản ứng cộng hóa trị Khả năng các hợp chất phi protein có thể gắn vào VLP là nhờ các nhóm amin hoặc sulfuhydryl trên bề mặt của VLP Phương pháp phổ biến nhất mà các nhà nghiên cứu sử dụng đó là gắn các hợp chất này vào lysine trên phân tử protein vỏ bộc lộ trên

bề mặt VLP Tương tự, các lysine bộc lộ trên bề mặt VLP có thể được biotin hóa và sau đó gắn vào các kháng nguyên đích đã biotin hóa nhờ “cầu nối” streptavidin [6] [23] Ngoài ra người ta còn có thể cải biến tạo thêm các vị trị gắn kết trên bề mặt VLP Ví dụ, bằng phương pháp này người ta đã tạo ra các VLP MS2 và VLP virus cowpea mosaic chỉ chứa một amino acid cystein bộc

lộ trên bề mặt [46] [32] Các VLP mang cystein này có thể gắn kết dễ dàng với các kháng nguyên đã biến đổi có các nhóm maleimit hoạt hóa sulfhydryl Nói chung, kỹ thuật này được áp dụng linh hoạt tùy vào nguồn gốc và đặc điểm của các VLP khác nhau Điều quan trong nhất là chúng ta phải xác định được các quyết định kháng nguyên quan trọng của các virus gây bệnh và biểu hiện được chúng ở cấu trúc giống với cấu trúc tự nhiên của chúng Ưu điểm nổi bật của việc gắn các hợp chất phi protein vào VLP bằng phản ứng cộng hóa trị là chúng ta có thể gắn nhiều loại kháng nguyên với các kích thước khác nhau Ví dụ điển hình là người ta đã gắn thành công interleukin-17, một protein có khối lượng khoảng 35 kDa, lên bề mặt VLP [37] Phản ứng cộng hợp ngoài việc cho phép gắn các hợp chất phi protein còn cho phép gắn các hapten lên bề mặt VLP [36] Một dẫn chứng gần đây nhất là thuốc cai nghiện thuốc lá phát triển bởi Cytos Biotechnology, loại thuốc này được tạo ra bằng cách gắn nicotine, một dạng hapten lên bề mặt VLP Các nghiên cứu thử

nghiệm lâm sàng pha 1 cho thấy VLP cộng hợp nicotine tạo ra kháng thể lớp IgG đặc hiệu nicotine hiệu giá cao trong vật chủ được tiêm chủng [24]

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

Chủng virus cúm A/H5N1 (A/chicken/hatay/2004(H5N1)) bất hoạt được sử dụng làm khuôn để khuếch đại gen mã hóa protein M1 do phòng Vi sinh vật phân tử cung cấp

Vector pCR2.1 (Invitrogen, Mỹ) được dùng để tách dòng gen m1 trong

2.2 Phương pháp

2.2.1 Tách chiết RNA tổng số

RNA tổng số của virus cúm A/H5N1 được tách chiết theo phương pháp

sử dụng Trizol gồm các bước sau :

 Lấy 500 µl dịch virus vào ống eppendorf

 Bổ sung 500 µl dung dịch Trizol (Invitrogen) trộn đều

 Bổ sung tiếp 500 µl dung dịch chlorophorm : Isoamylalcohol (24:1), đảo đều

 Ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 40C Chuyển pha trên vào 1 ống eppendorf mới

 Bổ sung Isopropanol (tỷ lệ 1:1) Đảo đều, để ở nhiệt độ phòng trong vòng 10-15 phút

 Ly tâm 12000 v/p trong vòng 30 phút ở 40C để thu tủa

 Rửa tủa bằng 500 µl Ethanol 70% , ly tâm 12000 v/p trong 15 phút

ở 40C

 Làm khô tủa, hòa lại trong H2O treated DEPC

 Điện di kiểm tra trên gel Agarose

 Xác định nồng độ RNA bằng máy quang phổ kế theo nguyên tắc của dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm các bazơ purin và pyrimidine Mức độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm của mẫu cho phép xác định nồng độ DNA trong mẫu Nồng độ DNA hay RNA được tính theo công thức sau :

 Nồng độ DNA sợi đôi : CDNA = OD260 x 50 x d

CDNA là nồng độ DNA sợi đôi

d là độ pha loãng mẫu

 Nồng độ RNA hay DNA sợi đơn : CDNA/RNA = OD260 x 40 x d

CDNA/RNA là nồng độ DNA sợi đơn hay RNA Tuy nhiên cách tính trên chỉ chính xác khi acid nucleic sạch Để đánh giá mức độ sạch của mẫu acid nucleic người ta tính chỉ số OD260/OD280 = T Nếu 1,8 < T < 2,0 thì được coi là tinh sạch

2.2.2 Phương pháp tổng hợp cDNA

cDNA được tổng hợp từ mẫu RNA tổng số đã tách chiết từ virus cúm A/H5N1 (A/chicken/hatay/2004(H5N1) bằng bộ kit SuperScriptTM

(Invitrogen) sử dụng mồi Oligo dT với trình tự CTGTGAATGCTGCGACTACGA TTTTTTTTTTTT TTTT TTT-3’ Thành phần phản ứng và điều kiện tổng hợp cDNA như sau: 5,0 μl RNA tinh sạch, 4,5μl of nước đã loại RNase, 3,0 μl dNTPs (2,5 mM mỗi loại), 2,0 μl of mồi oligo dT (200 pM/μl), 1,0 μl SuperscriptTM II RNase H-reverse transcriptase (200U/μl), 0,5 μl RNase inhibitor (10U/μl) và 4,0 μl of 5x first strand buffer Phản ứng tổng hợp cDNA được thực hiện ở 37°C trong 60 phút và sau đó 94°C trong vòng 5 phút cDNA này sau đó được sử dụng làm khuôn để

5’-khuếch đại gen mã hóa protein M1

2.2.3 Thiết kế hộp gen m1 của virus cúm A/H5N1

Để biểu hiện protein M1 trong tế bào côn trùng (Sf9), gen mã hóa

protein M1 cần phải gắn thêm các yếu tố thiết yếu như trình tự Kozak,trình tự đóng vai trò quan trọng trong việc khởi đầu quá trình dịch mã ở sinh vật nhân chuẩn [21], mã khởi đầu và mã kết thúc của gen Cấu trúc này được gọi là hộp

gen (gene cassete) Hộp gen m1 được thiết kế bằng phương pháp PCR, sử dụng khuôn là cDNA tổng hợp ở trên, với cặp mồi đặc hiệu cho gen m1 có gắn trình tự nhận biết của enzyme BamHI, trình tự Kozak và mã khởi đầu vào đầu 5’ của mồi xuôi (M1pBac-F) và vị trí nhận biết của HindIII tại đầu 5’ của

mồi ngược (M1pBac-R), với trình tự như sau:

M1pBac-F: 5’-TC GGA TCC GGT CAT GGATGGGTCTTCTAACCG 3’

BamHI trình tự Kozak

M1pBac-R: 5’ - AC GAA GCT TTCACTTGAATCGCTGCATC- 3’

HindIII

Phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 25 µl bao gồm: 1 µl

DNA khuôn (cDNA), 2,5 µl đệm cho Taq DNA polymerase, 1 µl mồi xuôi, 1

µl ngược, 2,5 µl dNTP, 0,5 µl Taq DNA polymerase và 16,0 µl H2O khử ion

vô trùng Chu trình nhiệt của PCR: 94C trong 3 phút, 30 chu kỳ (95C trong

1 phút, 55C trong 40 giây, 72C trong 1 phút); 72C trong 8 phút

2.2.4 Phương pháp gắn đoạn DNA ngoại lai vào vector

Sản phẩm PCR (hộp gen m1) được tinh sạch qua kit tinh sạch PCR

(Fermentas, Đức) và gắn vào vector tách dòng pCR2.1 tạo plasmid tái tổ hợp pCRM1 Phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR®2.1 được tiến hành như sau: 3l H2O khử ion vô trùng + 1l dung dịch đệm của T4 DNA ligase + 3l sản phẩm PCR + 2l vector pCR®2.1 đã mở vòng +1l T4 DNA ligase Phản ứng được ủ ở 140C trong 16 giờ đảm bảo nhiệt độ cho T4 DNA ligase hoạt động

Tương tự vậy phương pháp ligation được sử dụng để thiết kế vector

trung gian baculovirus mang hộp gen m1 Đoạn DNA chứa hộp gen m1 được tách ra khỏi vector và pCRM1 bằng BamHI và HindIII, và thu nhận lại bằng

kit thôi gel (Invitrogen) Sản phẩm tinh sạch sau đó được gắn vào vector

pBluBac4.5/V5-His-TOPO tại 2 vị trí enzyme tương ứng là BamHI và HindIII

nhờ T4 DNA ligase tạo nên vector tái tổ hợp pBluBacM1 Theo thiết kế trên,

hộp gen m1 được gắn vào vùng xen giữa gen lacZ và ORF 1629 Đây là hai vị

trí sẽ xảy ra sự trao đổi chéo trình tự tương đồng giữa TOPO và DNA của baculovirus để tạo ra bộ khung của baculovirus tái tổ hợp

pBluBac4.5/V5-His-2.2.5 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli

Biến nạp là quá trình chuyển DNA plasmid trực tiếp vào tế bào thể nhận Cơ chế biến nạp bao gồm việc thay đổi cấu trúc thành tế bào vi khuẩn

để DNA plasmid dễ dàng đi vào tế bào thể nhận Những tế bào có khả năng tiếp nhận DNA plasmid ngoại lai gọi là tế bào khả biến DNA plasmid được

biến nạp vào tế bào E.coli chủng DH5α Nhờ bộ máy tổng hợp của vi khuẩn,

plasmid tái tổ hợp được nhân lên với số lượng lớn các bản sao Quá trình biến nạp gồm 2 giai đoạn : tạo tế bào khả biến và biến nạp