Phân tích đa hình di truyền và mức độ biểu hiện của gen OsHKT2 4 ở lúa (Oryza sativa)

Để cải thiện năng suất trong điều kiện stress mặn ở thực vật nói chung và ở lúa nói riêng, việc hiểu được các cơ chế phân tử của các đáp ứng stress mặn là hết sức quan trọng.. Trong số c

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Tiến Đạt

PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN

VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GENOsHKT2;4

Ở LÚA (Oryza sativa)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

Header Page 1 of 126

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-** -

Nguyễn Tiến Đạt

PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN

VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GENOsHKT2;4

Ở LÚA (Oryza sativa)

Chuyên ngành : Di truyền học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn: TS Đỗ Thị Phúc

Hà Nội, 2016

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Đỗ

đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài Cảm ơn cô,

người đã luôn truyền cảm hứng và niềm tin cho tôi trong từng thí

nghiệm, từng công việc

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô công tác tại

thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận văn Các thầy cô đã chỉ bảo cho tôi

sự cẩn thận, kiên trì và nghiêm túc trong nghiên cứu khoa học

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới CN Trần Xuân An, CN

trong các thí nghiệm Các em đã luôn quan tâm và truyền đạt cho tôi

những kinh nghiệm quý báu trong thực nghiệm

Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Protein và Enzyme; Học viện Nông

hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, những người đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và tạo điều kiện tốt

nhất để tôi học tập Cảm ơn mọi người đã luôn động viên, khuyến

khích tôi trong quá trình học tập và thí nghiệm

Hà Nội, tháng 11 năm 2016

Nguyễn Tiến Đạt

Header Page 3 of 126

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về cây Lúa (Oryza sativa) 3

1.2 Giới thiệu về họ protein vận chuyển ion xuyên màng HKT ở thực vật và ở lúa 4

1.2.1 Họ protein HKT ở thực vật 5

1.2.2 Họ protein HKT ở cây lúa 8

1.2.3 Gen OsHKT2;4 9

1.2.4 Tình hình nghiên cứu gen OsHKT2;4 10

1.3 Một số phương pháp nghiên cứu đa hình nucleotide 11

1.3.1 Phương pháp RFLP-PCR 11

1.3.2 Phương pháp giải trình tự 14

1.4 Phương pháp phân tích mức độ biểu hiện của gen 16

1.4.1 Lai Northern blot và lai huỳnh quang tại chỗ 16

1.4.2 RT-PCR và Real-time PCR 17

1.4.3 Các phương pháp sử dụng chip 19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu, hóa chất và thiết bị 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu đa hình gen OsHKT2;4 22

2.2.2 Các phương pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện gen 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Phân tích đa hình gen Oshkt2;4 ở lúa 30

3.1.1 Tách chiết DNA tổng số 30

3.1.2 Khuếch đại gen OsHKT2;4 bằng PCR 31

3.1.3 Giải trình tự gen OsHKT2;4 32

3.1.4 Phân tích đa hình gen OsHKT2;4 33

3.2 Phân tích biểu hiện gen 43

3.2.1 Kết quả trồng lúa thủy canh và xử lý mặn 43

3.2.2 Kết quả tách chiết RNA và tổng hợp cDNA 43

3.2.3 Phản ứng Real-time PCR và phân tích mức độ biểu hiện gen OsHKT2;4 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

KẾT LUẬN 50

KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Phụ lục 1

Phụ lục 2 Phụ lục 3 Phụ lục 4

Header Page 5 of 126

Bảng 1.1 Các protein họ HKT đã được biết 6

Bảng 1.2 Họ gen HKT ở lúa (Oryza sativa) 9

Bảng 2.1 Các giống lúa trong nghiên cứu 20

Bảng 2.2 Các cặp mồi đặc hiệu được sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng 3.1 Hai nhóm giống lúa phân chia theo các đa hình nucleotide 33

Bảng 3.2 Vị trí các đa hình nucleotide ở nhóm 2 35

Bảng 3.3 Các đa hình amino acid tương ứng với đa hình nucleotide 36

Bảng 3.7 Giá trị Fold change mẫu tách chiết từ lá giống Nipponbare và Pokkali tại các thời điểm 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây lúa (Oryza sativa) và các bộ phận của cây lúa 3

Hình 1.2 Một số cơ chế vận chuyển Na+ trong hệ thống đáp ứng stress mặn ở thực vật 5

Hình 1.3 Gen OsHKT2;4 trên cơ sở dữ liệu Phytozome 10

Hình 1.4 Phương pháp RFLP-PCR sử dụng trong nghiên cứu di truyền phân tử 13

Hình 1.5 Kỹ thuật giải trình tự bằng phương pháp Sanger cải biến 14

Hình 1.6 Các bước cơ bản trong phương pháp Northern blot 17

Hình 1.7 Đồ thị tín hiệu huỳnh quang thu nhận từ máy Real-time PCR 18

Hình 1.8 Sử dụng chip Microarray trong phân tích biểu hiện 19

Hình 2.1 Các bước thí nghiệm nghiên cứu đa hình gen OsHKT2;4 23

Hình2.2 Các bước thực hiện thí nghiệm phân tích biểu hiện gen OsHKT2;4 26

Hình 2.3 Trồng lúa thủy canh và xử lý mặn 27

Hình 3.1 Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ mẫu lá của 14 giống lúa 31

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen OsHKT2;4 31

Hình 3.3 Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm Bioedit 32

Hình 3.4 Một phần kết quả so sánh các trình tự bằng công cụ MultAlin 34

Hình 3.5 Mô hình dự đoán cấu trúc bậc ba protein OsHKT2;4 37

Hình 3.6 Phân bố góc quay của các amino acid trong mô hình cấu trúc 3D qua phân tích Ramachandran Plot 38

Hình 3.7 Cấu trúc phân tử của các amino acid đa hình vị trí 53 và 253 39

Hình 3.8 Cấu trúc phân tử của các amino acid đa hình vị trí 342 40

Hình 3.9 Mô hình dự đoán cấu trúc xuyên màng 41

Hình 3.10 Filter pore của protein OsHKT2;4 ở hai nhóm giống lúa 42

Hình 3.11 Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số 44

Hình 3.12 Biểu đồ Association curve thể hiện nhiệt độ gắn mồi 45

Hình 3.13 Biểu đồ Amplification curve các mẫu gen OsHKT2;4 46

Header Page 7 of 126

xử lý mặn so với mẫu đối chứng ở giống Nipponbare (A) và giống Pokkali (B) 48

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

HKT High-affinity Potassium Transporter

cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid

PCR Polymerase Chain Reaction RFLP-PCR Restriction Fragment Length Polymorphism -

Polymerase Chain Reaction

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

dNTP Deoxy Nucleoside Triphosphate (Deoxynucleotide) ddNTP Dideoxynucleotide

Header Page 9 of 126

MỞ ĐẦU

Tình hình biến đổi khí hậu trên thế giới đang diễn ra ngày càng phức tạp Việt Nam là một trong những nước chịu các tác động tiêu cực nặng nề của biến đổi khí hậu Với đường bờ biển dài hơn 3.260 km, cùng với hệ thống sông ngòi chằng chịt đổ ra biển qua rất nhiều cửa sông, tình hình xâm nhập mặn, một trong những hệ quả của biến đổi khí hậu đang ảnh hưởng mạnh đến tình hình sản xuất nông nghiệp của nước ta Ở đồng bằng sông Cửu Long tình hình xâm nhập mặn lấn sâu vào đất liền qua các con sông đến 70 km, và dự báo đến tiếp tục tăng Hạn hán và đất nhiễm mặn đã và đang ảnh hưởng đến trên 30 tỉnh thành của nước ta

Đất nhiễm mặn gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng, gây mất cân bằng ion do tích lũy Na+ và Cl-, tăng cường peroxide lipid, tăng sản phẩm của các dạng phản ứng oxy như các gốc superoxide và hydroxyl

Để cải thiện năng suất trong điều kiện stress mặn ở thực vật nói chung và ở lúa nói riêng, việc hiểu được các cơ chế phân tử của các đáp ứng stress mặn là hết sức quan trọng Khả năng chịu mặn là tính trạng được kiểm soát bởi nhiều gen Việc tìm hiểu mối liên hệ giữa gen quan tâm và khả năng đáp ứng với stress mặn có vai trò rất quan trọng trong lai tạo giống chịu mặn

Có rất nhiều kênh vận chuyển trên màng tế bào thực vật giữ vai trò chính trong các cơ chế chống chịu mặn Trong số các kênh vận chuyển Na+ và K+ liên quan đến tính trạng chống chịu mặn, họ protein HKT (High-affinity potassium transporter) có vai trò quan trọng trong đáp ứng với stress mặn OsHKT2;4 thuộc nhóm 2 họ protein HKT, OsHKT2;4 được biết đến với vai trò đồng vận chuyển Na+

và K+.Tuy nhiên, các nghiên cứu phân tử về genmã hóa cho protein OsHKT2;4 trên các giống lúa Việt Nam vẫn còn rất hạn chế Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Phân tích đa hình di truyền và mức độ biểu hiện của genOsHKT2;4 ở lúa

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Tiến Đạt

QH.2014.T.CH - 60420121

(Oryza sativa)” với mục tiêu:Phân tích đa hình genOsHKT2;4 và nghiên cứu mức

độ biểu hiện của genOsHKT2;4 ởmột số giống lúa có khả năng chịu mặn khác nhau

Header Page 11 of 126

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIớI THIệU Về CÂY LÚA (Oryza sativa)

Lúa (Oryza sativa) là một trong năm loại cây lương thực chính của thế giới, cùng với ngô (Zea mays L.), lúa mì (Triticum sp.), sắn (Manihot esculenta Crantz)

và khoai tây (Solanum tuberosum L.)[39] Lúa thuộc bộ Poales, họ Poaceae, chi

Oryza; người ta cho rằng tổ tiên của chi lúa Oryza là một loài cây hoang dại trên siêu lục địa Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm và phát tán rộng khắp các châu lục trong quá trình trôi dạt lục địa, hiện nay có khoảng 21 loài cây hoang dại

thuộc chi này và 2 loài lúa đã được thuần hóa là lúa châu Á (Oryza sativa) và lúa châu Phi (Oryza glaberrima) [70,73]

Hình 1.1 Cây lúa (Oryza sativa) và các bộ phận của cây lúa [73]

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Tiến Đạt

QH.2014.T.CH - 60420121

Lúa (Oryza sativa) có nguồn gốc tại khu vực xung quanh vùng Đông Nam Á; sau đó được nhân rộng và phân hóa thành hai nhóm sinh thái là Indica và Japonica Japonica được trồng ở nơi khô ráo, mát mẻ của vùng cận nhiệt đới và ôn đới trong khi Indica được tìm thấy ở vùng nhiệt đới Châu Á Hai nhóm sinh thái

này được phân biệt bởi các đặc điểm về hình thái (Hình 1.1.), sinh lý và đặc điểm

sinh thái; Indica có lá bản rộng và sáng hơn, cây cao và đẻ nhánh tốt, hạt dài mảnh, còn Japonica có lá hẹp và xanh đậm hơn, chiều cao cây thấp hơn và đẻ nhánh trung

bình, hạt tròn ngắn

Lúa (Oryza sativa) có rất nhiều giống thích nghi với nhiều điều kiện môi

trườngvà được gieo trồng làm cây lương thực trên khắp thế giới [70].Với tầm quan trọng trong cung cấp lương thực toàn cầu, việc nghiên cứu tăng năng suất của cây lúa đang ngày càng được chú trọng; nghiên cứu đáp ứng mặn ở cây lúa là một trong những hướng nghiên cứu đầy tiềm năng

1.2 GIớI THIệU Về Họ PROTEIN VậN CHUYểN ION XUYÊN MÀNG HKT ở THựC VậT VÀ ở LÚA

Đất nhiễm mặn là một trong những vấn đề thách thức nền nông nghiệp các quốc gia trên thế giới.Cây trồng bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi đất nhiễm mặn ở nồng độ muối cao [9] Stress mặn ở thực vật có thể phân ra các giai đoạn gồm mất cân bằng thẩm thấu xảy ra ở giai đoạn sớm, gây độc do tích tụ ion Na+ và Cl-

Có rất nhiều kênh vận chuyển trên màng tế bào thực vật giữ vai trò chính trong các cơ chế chống chịu với các stress do các nhân tố sinh học và phi sinh học

gây ra (Hình 1.2.) Trong số các kênh vận chuyển Na+ và K+ liên quan đến tính trạng chống chịu mặn [40;49], họ protein HKT có vai trò quan trọng trong sự chống chịu mặn ở thực vật [17;18;51]

Header Page 13 of 126

1.2.1 Họ protein HKT ở thực vật

Schachtman và Schroeder là hai người đầu tiên đã phát hiện ra các protein HKT (High-affinity Potassium Transporters) chỉ có ở thực vật nhưng có trình tự và chức năng tương tự với lớp protein vận chuyển cation TrkH / TrkB ở vi khuẩn và nấm [56]

HKTs thuộc lớp các protein màng quan trọng (IMP), tham gia vào quá trình vận chuyển cation qua màng tế bào, đóng vai trò quan trọng trong việc tham gia vào khả năng chống chịu mặn ở thực vật [63] HKT là nhân tố chính trong sự chống chịu mặn ở thực vật bằng cách loại bỏ Na+ khỏi xylem, giảm sự thẩm thấu của các ion theo gradien nồng độ [15;26;30]

Hình 1.2 Một số cơ chế vận chuyển Na+ trong hệ thống đáp

ứng stress mặn ở thực vật [75]

Luận văn thạc sĩ khoa học

Nguyễn Tiến Đạt

QH.2014.T.CH - 60420121

Các nghiên cứu về chức năng đã chỉ ra rằng protein vận chuyển HKT có chức năng vận chuyển các cation hóa trị 1, với sự chọn lọc cation khác nhau giữa các thành viên cụ thể trong họ gen HKT [51;57] Một số protein HKT có tính chọn lọc cao với Na+, trong khi một vài protein HKT có khả năng vận chuyển cả Na+ và

K+; thậm chí, một số protein HKT có thể thay đổi tính chọn lọc của nó tùy thuộc vào các ion trong môi trường [57]

Bảng 1.1.Các protein họ HKT đã được nghiên cứu [57]

AtHKT1;1 Arabidopsis thaliana Q84TI7.1 BdHKT1 Brachypodium distachyon XP_003560515.1 BdHKT4 Brachypodium distachyon XP_003581628.1 BdHKT6 Brachypodium distachyon XP_003570995.1 BdHKT8 Brachypodium distachyon XP_003564102.1 BdHKT9 Brachypodium distachyon XP_003563514.1 CaHKT1 Cochlearia anglica AFH37929.1 DfHKT Diplachne fusca AEM55592.1 EcHKT1;1 Eucalyptus camaldulensis AF176035_1 EcHKT1;2 Eucalyptus camaldulensis AF176036_1 EsHKT1 Eutrema salsugineum AFJ23835.1 GmHKT1 Glycine max XP_003540998.1 HbHKT Hordeum brevisubulatum AER42622.1 HvHKT1;5 Hordeum vulgare ABK58096.1 HvHKT4 Hordeum vulgare AEM44690.1 HvHKT2;1 Hordeum vulgare AEM55590.1 McHKT1;1 Mesembryanthemum crystallinum AF367366_1 McHKT1;2 Mesembryanthemum crystallinum AAO73474.1 MtHKT1;5 Medicago truncatula AES77170.1 OgHKT1 Oryza glumipatula ABD15858.1 Header Page 15 of 126

OrHKT1 Oryza rufipogon AAY33540.1 OsHKT1;1 Oryza sativa Q7XPF8.2 OsHKT1;3 Oryza sativa Q6H501.1 OsHKT1;5 Oryza sativa A2WNZ9.2 OsHKT2;1 Oryza sativa A2YGP9.2 OsHKT2;2 Oryza sativa Q93XI5.1 OsHKT2;3 Oryza sativa Q8L481.1 OsHKT2;4 Oryza sativa Q8L4K5.1 PaHKT1 Phragmites australis BAE44384.1 PtHKT1 Populus trichocarpa EEF03794.1 PutHKT2;1 Puccinellia tenuiflora ACT21087.1 SbiHKT1;5 Sorghum bicolor EES02856.1 SbiHKT1;3 Sorghum bicolor EES04614.1 SbiHKT2;3 Sorghum bicolor EER90327.1 SbHKT1 Salicornia bigelovii ADG45565.1 SmHKT1 Selaginella moellendorffii EFJ18587.1 SsHKT1 Suaeda salsa AAS20529.2 TaHKT1;5-D Triticum aestivum ABG33949.1 TaHKT2;1 Triticum aestivum AAA52749 TaHKT1;5-B1 Triticum aestivum ABG33947.1 TaHKT1;5-B2 Triticum aestivum ABG33948.1 TmHKT1;5-A Triticum monococcum ABG33946.1 ThHKT1 Thellungiella halophila BAJ34563.1 VvHKT1 Vitis vinifera XP_002270986.1 VvHKT1;3 Vitis vinifera XP_002267717.1 ZmHKT1 Zea mays AEK27028.1 ScTRK1 Saccharomyces cerevisiae AAA34728 ScTRK2 Saccharomyces cerevisiae AAA35172 VpTrkH Vibrio parahaemolyticus Q87TN7.1

Luận văn thạc sĩ khoa học

1.2.2 Họ protein HKT ở cây lúa

Ở lúa (Oryza sativa), họprotein HKT cũng được chia ra hai nhóm và được

mã hóa bởi 7 – 9 gen tùy theo các giống Trong đó, họ protein HKT nhóm I được

mã hóa bởi các genOsHKT1;1, OsHKT1;2, OsHKT1;3, OsHKT1;4, OsHKT1;5 và nhóm II được mã hóa bởi các genOsHKT2;1, OsHKT2;2, OsHKT 2;3, OsHKT2;4

[57]

OsHKT1;5 được xác định nằm trên locus định lượng SKC1 mã hóa cho một

protein tham gia vào vận chuyển Na+, có chức năng quan trọng trong mô xylem, nhằm giúp thu hồi Na+ từ mạch gỗ, do đó làm giảm tích lũy Na+ trong thân bẹ của cây OsHKT1;1 có thể được biểu hiện ở chồi và rễ OsHKT1;3 chủ yếu biểu hiện ở thân lá, ít biểu hiện ở rễ [8;24;45;57] OsHKT2;1 có mặt ở vỏ rễ, và có khả năng thu thập Na+ trong điều kiện thiếu K+, cung cấp ion nội mô [25;35;43;57] Dưới điều kiện mặn sự biểu hiện của gen này sẽ được điều hòa giảm hoạt động [35;61] Protein OsHKT2;1 vận chuyển Na+ vào trong rễ, nhưng hoạt động của nó bị giảm xuống ở những cây xử lý mặn 30mM NaCl, do đó làm giảm tích lũy Na+ gây độc cho cây [31] Ngoài ra, OsHKT2;1 cũng được biểu hiện trong lá [23;35;44] OsHKT2;2 có thể hoạt động đồng vận chuyển Na+ và K+ [64] Cây lúa xử lý mặn ở

150 mM NaCl làm tăng cường biểu hiện của gen này ở lá, đặc biệt là ở các tế bào

diệp lục Các gen OsHKT2;3 và OsHKT2;4 biểu hiện mạnh trong mô thân bẹ, ít

biểu hiện ở rễ [25;29;33]

Header Page 17 of 126

Bảng 1.2 Họ gen HKT ở lúa (Oryza sativa) [8;57]

1.2.3 GenOsHKT2;4

GenOsHKT2;4 nằm trên nhiễm sắc thế số 6, dài 1749 bp, trình tự mã hóa CDS dài 1530 bp mã hóa cho chuỗi 509 amino acid [1;2;74].Gen OsHKT2;4 ít biểu

hiện ở rễ và bông con, chủ yếu đƣợc biểu hiện ở các mô lá, bẹ lá, các chồi phân

sinh Gen OsHKT2;4 thuộc nhóm II họ gen HKT, quy định các protein đồng vận

chuyển Na+ và K+ hoặc vận chuyển chọn lọc Na+ khi ion này ở nồng độ cao [31;32]