Nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng bệnh than do bacillus anthracis ở quy mô phòng thí nghiệm (Tóm tắt trích đoạn)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Ngọc Bảo NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH THAN DO Bacillus anthracis Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM Chuyên ngành: VI S

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Ngọc Bảo

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN

PHÒNG BỆNH THAN DO Bacillus anthracis

Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM

Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC

Mã số: 62420107

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS Đoàn Trọng Tuyên

2 TS Lê Thu Hà

1.1 Một số đặc điểm dịch tễ học và lâm sàng bệnh than (Anthrax) 14

1.1.1Đặc điểm lưu hành bệnh than trên thế giới 14

1.1.2 Đặc điểm lưu hành bệnh than tại Việt Nam 18

1.1.3 Đặc điểm lâm sàng bệnh than Error! Bookmark not defined.

1.1.4 Dự phòng và điều trị bệnh than Error! Bookmark not defined.

1.2 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn than B anthracis Error! Bookmark not

defined.

1.2.1 Phân loại Error! Bookmark not defined.

1.2.2 Hình thể Error! Bookmark not defined.

1.2.3 Đặc điểm sinh trưởng của vi khuẩn than Error! Bookmark not

1.2.6 Độc tố của vi khuẩn than Error! Bookmark not defined.

1.2.7 Cấu trúc hệ thống gene của B anthracis Error! Bookmark not defined.

1.2.8 Đặc điểm của các chủng B anthracis dự tuyển sản xuất vắc xin Error!

Bookmark not defined.

1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất vắc xin phòng bệnh than Error! Bookmark not

defined.

1.4 Một số mô hình động vật dùng thử nghiệm vắc xin than Error! Bookmark not defined.

CHƯƠNG 2 Error! Bookmark not defined.

ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not

defined.

2.1 Đối tượng nghiên cứu: Error! Bookmark not defined.

2.2 Vật liệu nghiên cứu Error! Bookmark not defined.

2.2.1 Sinh phẩm, hoá chất nghiên cứu Error! Bookmark not defined.

2.2.3 Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu Error! Bookmark not defined.

2.3 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined.

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu tuyển chọn chủng sản xuất vắc xin và các chủng vi

khuẩn than gây bệnh làm chủng thử thách: Error! Bookmark not defined.

2.3.2 Quy trình kỹ thuật sản xuất vắc xin Error! Bookmark not defined.

2.3.3 Phương pháp đánh giá tính an toàn và tính sinh miễn dịch của vắc xin phòng

bệnh than Error! Bookmark not defined.

2.3.4 Quy trình đông khô vắc xin phòng bệnh than Error! Bookmark not

defined.

2.3.5 Xử lý số liệu: Error! Bookmark not defined.

CHƯƠNG 3 Error! Bookmark not defined.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined.

3.1 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN CHỦNG SẢN XUẤT VẮC XIN VÀ CHỦNG THỬ

THÁCH Error! Bookmark not defined.

3.1.1 Kết quả phân lập định danh vi khuẩn than từ các loại mẫu khác nhau… Error!

Bookmark not defined.

3.1.2 Kết quả phát hiện B anthracis và các yếu tố độc lực bằng kỹ thuật PCR….

Error! Bookmark not defined.

3.1.3 Kết quả gây bệnh thực nghiệm của các chủng B anthracis trên chuột nhắt trắng

Error! Bookmark not defined.

3.1.4 Kết quả đánh giá chủng dự tuyển vắc xin BaVCM1167 Error! Bookmark not defined.

3.2 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN THAN Error! Bookmark not

defined.

3.2.1 Một số kết quả nghiên cứu sản xuất vắc xin hấp phụ phòng bệnh than (VHP)

Error! Bookmark not defined.

3.2.2 Sản xuất vắc xin phòng bệnh than sống giảm độc lực tại Công ty Vắc xin và Sinh phẩm Pasteur Đà Lạt: Error! Bookmark not defined.

3.3 ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN, VÀ SINH MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN VHP VÀ TTB TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM Error! Bookmark not defined.

3.3.1 Kiểm tra tiêu chuẩn an toàn không đặc hiệu của vắc xin thành phẩm Error!

Bookmark not defined.

3.3.2 Tính an toàn và tính sinh miễn dịch của vắc xin: Error! Bookmark not

defined.

3.3.3 Đánh giá hiệu lực bảo vệ của hai vắc xin trên chuột lang Error! Bookmark

not defined.

KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined.

KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined.

Tài liệu tham khảo ……… ……144 Phụ lục

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

bệnh than

B anthracis/ Ba Bacillus anthracis

Organisation

Tổ chức nông lương thực thế giới

MAPK,

MAPKK

Mitogen-activated protein kinases, Mitogen-activated protein kinases kinases

Animal Health

Tổ chức thú y thế giới

Electrophogesis

khuẩn

WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1: Một số vắc xin phòng bệnh than hiện có trên thế giớiError! Bookmark not defined.

Bảng 2 1 Tiêu chuẩn vắc xin bào tử than (TTB)Error! Bookmark not defined

Bảng 2 2 Tiêu chuẩn vắc xin hấp phụ phòng bệnh than VHPError! Bookmark not defined.

Bảng 3 1: Kết quả định danh các chủng nghi ngờ từ mẫu bệnh phẩm và

chủng được cung cấp bằng bộ kit API 50CHB/EError! Bookmark not defined

Bảng 3.2 Kết quả định danh các chủng nghi ngờ từ mẫu môi trường

bằng bộ kit API 50CHB/E Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.3 Kết quả PCR phát hiện B anthracis và các yếu tố độc lực từ

các chủng được cung cấp và chủng phân lập Error! Bookmark not defined.

Bảng 3 4: Thử nghiệm độc tính các chủng than trên chuột nhắt trắngError! Bookmark not defined Bảng 3.5 Đặc tính sinh lý sinh hóa của chủng BaVCM1167Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.7 Kết quả kiểm tra chất gây sốt trên thỏ của vắc xin phòng bệnh

than VHP và TTB Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.8 Thăm dò liều chết LD100 của vắc xin VHP trên chuột nhắt

trắng Error! Bookmark not defined.

nhắt trắng Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.10 Kết quả dò liều chết LD100 của vắc xin TTB trên chuột nhắt

trắng Error! Bookmark not defined.

trắng Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.12 Nồng độ kháng thể trong huyết thanh thỏ trước khi tiêm

hai loại vắc xin Error! Bookmark not defined.

Bảng 3 13 Nồng độ anti-PA83 trong huyết thanh của các lô thỏ tiếp

nhận hai loại vắc xin ở tuần thứ 6 Error! Bookmark not defined.

Bảng 3 14 Nồng độ anti-PA83 trong huyết thanh của các lô thỏ tiếp nhận hai loại vắc xin ở tuần thứ 8 Error! Bookmark not defined Bảng 3.15 Nồng độ anti-PA83 trong huyết thanh của các lô thỏ tiếp nhận hai loại vắc xin ở tuần thứ 10 Error! Bookmark not defined Bảng 3.16 Kết quả kiểm định so sánh từng cặp về GMT giữa các lần lấy máu ở lô thỏ tiêm vắc xin VHP Error! Bookmark not defined Bảng 3.17 Kết quả kiểm định so sánh từng cặp về GMT giữa các thời điểm ở lô thỏ tiêm vắc xin TTB Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1: Bản đồ dịch tễ bệnh than trên thế giới năm 2013 17

Hình 1 2: Bệnh than thể da của bệnh nhân thu dung điều trị tại huyện

Mèo Vạc Hà Giang Error! Bookmark not defined.

Hình 1 3: Vi khuẩn than dưới kính hiển vi Error! Bookmark not defined.

Hình 1 4: Lát cắt dọc của bào tử Bacillus anthracisError! Bookmark not defined.

Hình 1 5 Đặc điểm sinh trưởng của B anthracis trên các loại môi

trường khác nhau Error! Bookmark not defined.

Hình 1 6: Cấu trúc đơn phân của kháng nguyên bảo vệ (PA)Error! Bookmark not defined.

Hình 1 7: Cơ chế tác động của độc tố than Error! Bookmark not defined.

Hình 2 1: Quy trình sản xuất vắc xin phòng bệnh than sống giảm độc

lực Error! Bookmark not defined

Hình 2 2 Quy trình sản xuất vắc xin hấp phụ phòng bệnh than VHPError! Bookmark not defined Hình 2 3: Lịch tiêm và thời gian lấy máu đánh giá đáp ứng miễn dịch

của thỏ tiêm vắc xin Error! Bookmark not defined.

Hình 3.1: Kết quả PCR phát hiện gene Ba813 của các chủng B anthracis

Hình 3.2: Kết quả PCR phát hiện gene pagA của các chủng B anthracisError! Bookmark not defined Hình 3.3: Kết quả PCR phát hiện gene capA, capB, capC của các chủng

B anthracis Error! Bookmark not defined.

Hình 3.4: Thử nghiệm gây bệnh thực nghiệm trên chuột nhắt trắng với

chủng B anthracis đầy đủ độc lực, liều 0,5ml đường tiêm ổ bụngError! Bookmark not defined.

Hình 3.5 Điện di sản phẩm PCR của gene pagA trên gel 0,8% agarose

với cặp mồi BA1 và BA2 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.6: So sánh trình tự nucleotide vùng pagA của 3 chủng B

anthracis phân lập tại Việt Nam và chủng dự tuyển sản xuất vắc xin

BaVCM1167 (Ba1167) bằng phần mềm Mega5Error! Bookmark not defined.

Hình 3.7: Điện di phát hiện sản phẩm protein PA trên thạch

polyacrylamide 12,6 % của chủng BaVCM1167 nuôi cấy trên môi trường

1 và 2 sau 42 giờ Error! Bookmark not defined.

Hình 3.8: Điện di trên gel polyacrylamide 12,6 % phát hiện sản phẩm

protein PA của chủng BaVCM1167 ở các thời điểm 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ,

60 giờ, 72 giờ nuôi cấy trong môi trường 1 dạng lỏngError! Bookmark not defined.

Hình 3.9: Điện di trên gel polyacrylamide 12,6 % phát hiện sản phẩm

protein PA của chủng BaVCM1167 ở các thời điểm 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ,

60 giờ, 72 giờ nuôi cấy ở môi trường 2 dạng rắn.Error! Bookmark not defined.

Hình 3.10: Điện di trên gel polyacrylamide 12,6 % phát hiện protein PA

của chủng BaVCM1167 sinh tổng hợp ở các thời điểm 24h, 36h, 48h,

60h, 72h nuôi cấy trong môi trường 2 dạng lỏngError! Bookmark not defined.

Hình 3.11: Động thái của quá trình lên men của chủng BaVCM1167 ở

Hình 3.12: Biểu đồ phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng

protein tổng số và protein PA Error! Bookmark not defined.

Hình 3 13: Điện di protein tổng số của chủng BaVCM 1167Error! Bookmark not defined.

Hình 3.14: Bán tinh sạch protein PA bằng phương pháp tủa ethanol ở

các nồng độ khác nhau Error! Bookmark not defined.

Hình 3 15: Sắc ký đồ DEAE của các phân đoạn được đẩy ra khỏi cộtError! Bookmark not defined Hình 3.16: Kết quả phản ứng ELISA phát hiện sự có mặt của protein PA

trong các đỉnh P1- P4 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.17: Hình ảnh điện di các phân đoạn tinh sạch protein bằng sắc ký

biogel P100 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.18: Phản ứng của protein PA gắn Thioredoxin với kháng thể

kháng Thioredoxin trên màng lai PVDF Error! Bookmark not defined.

Hình 3.19: Phản ứng của protein PA gắn Thioredoxin với kháng thể

kháng PA trên màng lai PVDF Error! Bookmark not defined.

Hình 3.20:Đáp ứng miễn dịch của cá thể thỏ tiếp nhận vắc xin hấp phụError! Bookmark not defined Hình 3.21: Đáp ứng miễn dịch của cá thể thỏ tiếp nhận vắc xin toàn tế

bào Error! Bookmark not defined.

Hình 3.22: Sự thay đổi nồng độ kháng thể trung bình (GMT) theo thời

gian Error! Bookmark not defined.

Hình 3 23: Đánh giá hiệu lực bảo vệ của vắc xin TTB trên chuột langError! Bookmark not defined Hình 3 24:Đánh giá hiệu lực bảo vệ của vắc xin VHP trên chuột langError! Bookmark not defined.

MỞ ĐẦU

Bệnh than (anthrax) là bệnh truyền nhiễm cấp tính, nguyên nhân do

nhiễm vi khuẩn than Bacillus anthracis Vi khuẩn than thường gây bệnh cho

các loại động vật móng guốc, ăn cỏ như: trâu, bò, ngựa, dê, cừu…người mắc bệnh là do ngẫu nhiên tiếp xúc trực tiếp với động vật mắc bệnh hoặc các sản phẩm từ động vật như: thịt, sữa, da, lông Vi khuẩn than được xếp vào nhóm tác nhân nguy hiểm nhóm 3 bởi vì bệnh cảnh lâm sàng và đường lây đa dạng, gây tử vong cao, tồn tại bền vững ngoài môi trường Vi khuẩn than hay được

sử dụng làm vũ khí sinh học vi: giá thành sản xuất rẻ và dễ sản xuất và tàng

trữ B anthracis thường được một số nước sử dụng như loại vũ khí bí mật

trong phòng chống và đánh trả, luôn có nguy cơ sử dụng khi chiến tranh [5]

Phòng chống bệnh than luôn là vấn đề mang tính cấp thiết, biện pháp

sử dụng kháng sinh chỉ mang tính ngắn hạn, tại chỗ Biện pháp tiêm phòng vắc xin chủ động bảo vệ cho các nhóm nguy cơ cao mang tính lâu dài và trên diện rộng: người dân trong vùng dịch, nhân viên y tế trực tiếp điều trị bệnh nhân mắc bệnh than, nhân viên xét nghiệm tại các phòng thí nghiệm Bên cạnh đó, sử dụng vắc xin phòng bệnh than cho quân nhân thực hiện nhiệm vụ trong điều kiện tác chiến nghi ngờ địch sử dụng vũ khí có vi khuẩn than cũng

là vấn đề nhiều quốc gia trên thế giới đặt ra

Hiện nay, việc sử dụng vắc xin phòng bệnh than cho người có hai xu hướng khác nhau Đối với các nước: Anh, Hoa Kỳ, vắc xin phòng bệnh than

đã đưa vào sử dụng là loại vắc xin phòng bệnh than hấp phụ, sử dụng một phần cấu trúc tế bào với tiêu chí gây miễn dịch đặc hiệu, an toàn, ít phản ứng phụ Trường phái của các nước: Nga, Trung Quốc, Ấn Độ,, sản xuất vắc xin bào tử than - toàn tế bào với mục đích gây đáp ứng miễn dịch nhanh và sản xuất đơn giản, đầu tư ít Do vậy cần có những nghiên cứu cụ thể về hai

Tại Việt Nam, hàng năm dịch than vẫn xảy ra trên gia súc và lây sang người nhưng vẫn chưa có vắc xin phòng cho người Đến nay tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu sự phù hợp giữa các chủng gây bệnh và chủng dùng sản xuất vắc xin Việc nhập vắc xin phòng bệnh than cho người có nhiều khó khăn và không đáp ứng được yêu cầu chủ động phòng bệnh Chính vì vậy, để đáp ứng yêu cầu của cộng đồng, nhất là yêu cầu của Quân đội chúng tôi tiến

hành đề tài “Nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng bệnh than do Bacillus anthracis ở quy mô phòng thí nghiệm” nhằm mục đích:

1 Tuyển chọn được chủng vi khuẩn than để sản xuất vắc xin và một số chủng than gây bệnh đầy đủ độc lực tại Việt Nam để đánh giá hiệu lực của vắc xin

2 Sản xuất được vắc xin phòng bệnh than ở quy mô phòng thí nghiệm

3 Đánh giá được tính an toàn, tính sinh miễn dịch và hiệu lực của hai loại vắc xin than trên động vật

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Một số đặc điểm dịch tễ học và lâm sàng bệnh than (Anthrax)

1.1.1 Đặc điểm lưu hành bệnh than trên thế giới

Hầu hết các nước trên thế giới đều đã từng báo cáo có ca bệnh than Theo Glassman ước tính trên thế giới có khoảng 20.000- 100.000 ca mắc (1958) Trong thập kỷ 1980 có gần 2000 ca bệnh trên người hàng năm Những ca bệnh đầu tiên được phát hiện liên quan đến các vùng sản xuất nông nghiệp ở một số nước châu Á

và châu Phi do tiếp xúc với súc vật nhiễm bệnh Ca bệnh đầu tiên được báo cáo liên quan đến công nghiệp xuất hiện ở châu Âu và Bắc Mỹ, là những nơi có nền công nghiệp thuộc da, làm len phát triển [98]

Những năm 1979- 1985, một đại dịch than xảy ra ở Zimbabwe làm khoảng 10.000 người mắc bệnh Năm 1979 tại Sverdlovsk - Liên Bang Nga xảy ra vụ nổ phòng thí nghiệm trong quân đội làm 42 người mắc bệnh than theo đường hô hấp [6] Ở Australia vẫn tiếp tục xuất hiện rải rác các vụ dịch than, hay gặp ở khu vực Nam Wales và Victoria Tại Anh, năm 1961 báo cáo có 145 ca bệnh, và 10 ca bệnh

từ năm 1980- 1990 [114] Dịch than trên động vật lan rộng khắp Ấn Độ, trong những năm 1991-1996 có 1613 vụ dịch than trên động vật được ghi nhận, tỉ lệ chết 62,5 % trong đó 20 % là trâu, 80 % còn lại là cừu và dê Trong năm 1996 tại Philippine có 4 vụ dịch than xảy ra trên động vật, ở Thái Lan có 6 vụ dịch xảy ra trên động vật và có 148 người mắc bệnh Tại Nepal từ năm 1992 đến 1997 có 19

vụ dịch than ở gia súc, cừu, ngựa làm tổng cộng 222 súc vật bị chết [54]

Bản đồ dịch tễ bệnh than trên thế giới nhìn chung không có nhiều biến động

về vùng lưu hành dịch, vùng tồn lưu bào tử và vùng không có bào tử than Châu

Âu, Châu Mĩ và Australia nhờ có những biện pháp và chính sách hợp lý đã khống

dịch than, những ổ dịch mang tính địa phương Tùy thuộc thời điểm khác nhau, các vùng đã từng lưu hành dịch có những đợt bùng phát trở thành dịch lớn hay vùng lưu hành dịch mức độ cao (Hình 1.1) Hiện tại, nhìn trên bản đồ dịch tễ bệnh than trên thế giới năm 2013 thì dịch than được cho là vẫn lưu hành mức độ cao ở một số nước Châu Phi và Châu Á như: Gambia, Guinea, Serria, Liberia, Bờ Biển Ngà, Ghana, Tchad, Ethiopia, Zambia và Zimbabwe, Thổ Nhĩ Kỳ, Tajikistan, Pakistan

và Myanma

Bệnh than trên động vật đã được khống chế ở các nước Châu Âu (Hy Lạp,

Ý, Tây Ban Nha, Thổ Nhĩ Kỳ) Khu vực Mỹ-Latin đã được xác định có bệnh than gây chết gia súc như Hoa Kỳ, Mexico, Guatemala, Peru, Bolivia và Venezuela Khu vực Nam Phi số lượng vụ dịch than đã giảm nhiều do chương trình kiểm soát tốt ở các nước như Bostswana, Zimbabwe và Zambia [92] Các nước Trung Đông còn có sự lưu hành cao của bệnh Ở phía Nam Ấn Độ, bệnh than vẫn lưu hành trên động vật, nhưng ở miền Bắc Ấn Độ không phát hiện thấy (vì khu vực này đất nhiễm axít), nhưng Nepal giáp phía Bắc Ấn Độ lại là vùng lưu hành dịch cao Một

số quốc gia Đông Nam Á (Myanma, Việt Nam, Campuchia, Thái Lan) và Tây Trung Quốc là vùng lưu hành dịch ở nhiều tỉnh, còn các nước Philippine và Indonesia chỉ giới hạn ở một vùng Dịch than lưu hành tản phát tại các quốc gia không có chương trình kiểm soát tốt, thường dẫn đến dịch hay bùng phát trên động vật [115]

Bệnh than thường thấy ở các loài gia súc ăn cỏ, tuy nhiên một số báo cáo có

cả ở chó hoang Bệnh than có khả năng gây dịch với số lượng lớn động vật Liều gây chết 50 % (LD50) của bệnh than đối với chuột lang là nhỏ hơn 10 vi khuẩn, đối với khỉ 3 x 103

vi khuẩn, đối với chuột cống 106, đối với lợn 109 và đối với chó 5 x

101o Liều gây nhiễm tối thiểu (MID) theo đường không khí đối với cừu là 35.000 bào tử, nhưng với chủng phân lập được trong công viên quốc gia Kruger là 100 bào