ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- TRẦN QUỐC KHÁNH TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN B TRÊN MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU NGƯỜI LUẬN
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-
TRẦN QUỐC KHÁNH
TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN B
TRÊN MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU NGƯỜI
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2016
Footer Page 1 of 126
Trang 2ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-
TRẦN QUỐC KHÁNH
TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN B
TRÊN MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU NGƯỜI
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ TRUNG
TS NGUYỄN ĐÌNH THẮNG
Hà Nội – 2016
Trang 3iii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Trung, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Đình Thắng (Bộ môn sinh lý thực vật và hóa sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) cùng các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh học, đặc biệt là các thầy giáo, cô giáo trong bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh học đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, giảng dạy và dìu dắt tôi trong thời gian thực hiện luận văn cũng như trong suốt thời gian học tập tại trường
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị, các bạn làm việc tại Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập
và thực hiện luận văn tại phòng
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã luôn khích lệ động viên tôi trong suốt thời gian qua
Hà Nội, ngày 9 tháng 12 năm 2016
Học viên
Trần Quốc Khánh
Footer Page 3 of 126
Trang 4MỤC LỤC
1.3.2 Vai trò và ứng dụng của kháng thể đơn dòng 11 1.3.3 Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng 14 1.3.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất kháng thể đơn dòng tại Việt Nam 17
2.2.1 Gây miễn dịch và đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch 20 2.2.1.2 Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch 23
Trang 5v
2.2.10 Đánh giá kháng thể do tế bào lai sản xuất 31 2.2.11 Cô đặc kháng thể bằng ammonium sulfate 32
3.1 Lựa chọn nguyên liệu và gây miễn dịch cho chuột 35 3.1.1 Lựa chọn nguyên liệu gây miễn dịch cho chuột 35
3.2 Nghiên cứu tạo tế bào lai giữa myeloma và tế bào lympho B chuột 37 3.2.1 Nuôi cấy tế bào đại thực bào để tạo lớp tế bào nền 37 3.2.2 Nghiên cứu tạo tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng gây ngưng kết đặc hiệu
3.2.2.1 Tách hỗn hợp tế bào giàu tế bào lympho B từ hạch bẹn và lách của chuột
3.2.2.2 Dung hợp giữa tế bào myeloma sp2/0 và hỗn hợp tế bào giàu tế bào lympho B tách từ chuột gây miễn dịch bởi hồng cầu mẫu B 39 3.2.2.3 Nghiên cứu sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên B 41 3.2.2.4 Khả năng sinh trưởng của tế bào B4D10C9 42 3.2.2.5 Khả năng sản xuất mAb kháng kháng nguyên B của dòng tế bào lai
3.2.2.6 Xác định độ đặc hiệu mAb do B4D10C9 sản xuất 44 3.2.2.7 Cường độ và ái tính mAb do B4D10C9 sản xuất với hồng cầu mẫu B 44 3.2.2.8 Xác định phân lớp mAb do dòng tế bào B4D10C9 sinh ra 45 3.2.2.9 Cô đặc dung dịch kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên B 47 3.2.2.10 Tạo sinh phẩm kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên B 49
Footer Page 5 of 126
Trang 6DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.2 Hướng dẫn đọc kết quả của phương pháp huyết thanh mẫu 09
Bảng 1.3 Hướng dẫn đọc kết quả của phương pháp hồng cầu mẫu 10
Bảng 3.1 Biến động hiệu giá kháng thể trung bình khi gây miễn dịch
theo các con đường khác nhau 35
Bảng 3.2 Số giếng hình thành tế bào lai từ thí nghiệm dung hợp hỗn hợp
tế bào lympho giàu tế bào lympho B tách từ lách và hạch bẹn chuột gây miễn dịch bằng hồng cầu mẫu B với tế bào myeloma
Bảng 3.3 Số giếng chứa tế bào lai tiết kháng thể gây ngưng kết hồng cầu
Trang 7vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.2 Cấu tạo các chuỗi đường quy định kháng nguyên nhóm
máu hệ ABO
7
Hình 1.4 Kháng thể đơn dòng liên kết với một epitope đặc hiệu 11
Hình 1.5 Phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên - kháng thể 13
Hình 2.1 Chuẩn bị vật liệu gây miễn dịch cho chuột 22
Hình 2.2 Gây miễn dịch cho chuột bằng cách tiêm vào hai gan bàn
Hình 2.5 Vị trí các ô đếm trong buồng đếm tế bào 29
Hình 2.6 Cách đọc kết quả trên đĩa elisa của bộ kit Pierce® Rapid
ELISA mouse mAb
31
Hình 3.1 Hình ảnh tế bào đại thực bào khi nuôi cấy tĩnh 38
Hình 3.2 Ảnh chụp tế bào lai quan sát dưới kính hiển vi soi ngược
(độ phóng đại 1000 lần: vật kính 10x, thị kính 20x, máy ảnh 5x)
40
Hình 3.3 Minh họa 5 giếng chứa dịch nuôi cấy gây ngưng kết hồng
cầu mẫu B mà không gây ngưng kết hồng cầu mẫu A và O
41
Hình 3.4 Sàng lọc tế bào lai đơn sinh mAb gây ngưng kết hồng cầu
mẫu B
42
Hình 3.5 Hiệu giá kháng thể của các dòng tế bào lai đơn tiết mAb
gây ngưng kết hồng cầu B
42
Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn mật độ tế bào lai B4D10C9 sinh trưởng
trong môi trường DMEM +10% FBS và DMEM+1% FBS
43
Footer Page 7 of 126
Trang 8theo thời gian
Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn hiệu giá kháng thể theo thời gian của dịch
nuôi cấy tế bào B4D10C9 trong môi trường DMEM+1%FBS và DMEM+10% FBS
44
Hình 3.8 Phản ứng ngưng kết đặc hiệu hồng cầu B của mAb do tế
bào lai B4D10C9 sinh ra
45
Hình 3.9 Phản ứng ngưng kết hồng cầu trên phiến kính xác định ái
tính mAb do dòng tế B4D10C9 sinh ra với hồng cầu mẫu B
Hình 3.13 Phản ứng ngưng kết hồng cầu của kháng thể kháng B thu
được sau khi tủa bằng ammonium sulphate
48
Hình 3.14 Kháng thể kháng B (anti-B) được hoàn nguyên trong dung
dịch hoàn nguyên màu vàng A dung dịch chứa kháng thể B (anti-B); B dung dịch dùng hoàn nguyên kháng thể B
50
Hình 3.15 A Phản ứng ngưng kết của sinh phẩm B với hồng cầu mẫu
A, B và O; B Lọ sinh phẩm kháng thể đơn dòng kháng B
50
Trang 9ix
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's
Medium
Môi trường Dulbecco biến đổi
DMSO Dimethyl sulfoxide
E coli Escherichia coli
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid ELISA enzyme-linked immunosorbent
assays Fab Fragment antigen-binding Mảnh liên kết kháng
nguyên
FCA Freund’s complete adjuvant Tá chất hoàn toàn FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và
Dược phẩm Hoa Kỳ FIA Freund’s incomplete adjuvant Tá chất không hoàn toàn HAT hypoxanthyl aminoteptrin
thymidine HGPRT hypoxanthine-guanine
phosphoribosyltransferase
HT hypoxanthyl thymidine
PBS Phosphate buffered saline Đệm muối phosphate PEG polyethylene glycol
RPMI Roswell Park Memorial Institute
medium
Môi trường RPMI WHO World Health Organisation Tổ chức y tế thế giới
Footer Page 9 of 126
Trang 10MỞ ĐẦU
Máu là thành phần vô cùng quý giá trong điều trị bệnh mà cho đến nay vẫn chưa có một sinh phẩm nào có thể thay thế được, đặc biệt máu được sử dụng trong điều trị nội khoa, cấp cứu ngoại khoa, sản khoa và triển khai nhiều kỹ thuật y học cao cấp như ghép tạng, mổ tim, lọc máu ngoài thận Tuy nhiên, việc sử dụng máu trong điều trị bệnh gặp phải nhiều rủi ro, do có sự ngưng kết giữa kháng nguyên trên màng hồng cầu người cho với kháng thể trong huyết thanh của người nhận Để quá trình truyền máu thành công phải có sự tương thích giữa máu người cho và người nhận Do đó, trước khi truyền máu cần phải tiến hành xác định nhóm máu Năm 2014, Hiệp hội truyền máu quốc tế đã thống kê có 35 hệ nhóm máu với hơn
300 kháng nguyên nhóm máu khác nhau Hầu hết các kháng nguyên trên màng hồng cầu có tính sinh miễn dịch yếu được dùng để nghiên cứu di truyền và quan hệ huyết thống, chỉ có hai nhóm kháng nguyên đặc biệt quan trọng gây ra phản ứng ngưng kết khi truyền máu dẫn đến tai biến đó là kháng nguyên A, B của hệ nhóm máu ABO và kháng nguyên D của hệ nhóm máu Rh Các nhóm máu nêu trên được xác định bằng phương pháp ngưng kết sử dụng hồng cầu mẫu hoặc huyết thanh mẫu Huyết thanh mẫu chính là các kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên nhóm máu, có 3 loại huyết thanh mẫu anti-A, anti-B, anti-AB được sử dụng trong xác định nhóm máu hệ ABO và huyết thanh mẫu anti-D để xác định nhóm máu hệ
Rh Nhiều phương pháp được phát triển để sản xuất kháng thể đơn dòng như công nghệ lai tế bào, công nghệ bất tử tế bào B, công nghệ phage display, công nghệ kháng thể tái tổ hợp, sử dụng chuột chuyển gene Phương pháp lai tế bào đã được ứng dụng thành công để tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể kháng lại kháng nguyên nhóm máu hệ ABO Hiện nay, nhiều thuốc thử nhóm máu có bản chất là kháng thể đơn dòng được sản xuất thành công như Blood Grouping (Prestige Diagnostics UK), Monoclonal blood grouping reagent (Maxwin international), Anti-A Monoclonal reagent (Atlas Medical), Transclone® (Biorad)
Ngày nay, nhu cầu sử dụng máu trong điều trị bệnh ngày càng lớn do vậy việc sử dụng huyết thanh mẫu càng gia tăng Tuy nhiên, Việt Nam vẫn chưa sản xuất được kháng thể đơn dòng xác định nhóm máu mà chủ yếu sử dụng hồng cầu
Trang 112
mẫu thu thập từ các tình nguyện viên hoặc kháng thể đơn dòng nhập ngoại Việc sử dụng hồng cầu mẫu làm thuốc thử xác định nhóm máu tốn ít chi phí nhưng lại mất rất nhiều máu thu được từ người tình nguyện Còn sử dụng huyết thanh mẫu nhập ngoại lại có giá thành cao làm tăng gánh nặng kinh tế đối với bệnh nhân Xuất phát
từ cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên B trên màng tế bào hồng cầu người” với mục tiêu tạo ra dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng
kháng nguyên B sử dụng như thuốc thử xác định nhóm máu B ở người
Footer Page 11 of 126
Trang 12CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Máu và hệ thống nhóm máu ở người 1.1.1 Khái niệm máu và các thành phần của máu
Máu là một tổ chức di động được tạo thành từ thành phần là các tế bào (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, một lượng nhỏ tế bào gốc sinh máu) và huyết tương (chứa protein, muối khoáng, nước) với vai trò cung cấp các chất nuôi dưỡng và cấu tạo các tổ chức cũng như loại bỏ các chất thải trong quá trình chuyển hóa của cơ thể như khí CO2 và acid lactic Đồng thời máu cũng là phương tiện vận chuyển của các
tế bào (cả tế bào có chức năng bảo vệ cơ thể lẫn tế bào bệnh lý) và các chất khác nhau (các amino acid, lipid, hormone) giữa các tổ chức và cơ quan trong cơ thể Các rối loạn về thành phần cấu tạo của máu hay ảnh hưởng đến sự tuần hoàn bình thường của nó có thể dẫn đến rối loạn chức năng của nhiều cơ quan khác nhau [3, 4] Máu chiếm 1/13 trọng lượng cơ thể (60 - 70 ml/kg); thể tích máu ở nam khoảng
5 - 6 lít, nữ 4,5 – 5 lít; tỷ trọng 1,055 – 1,063, pH 7,33 – 7,43
Hồng cầu
Hồng cầu trưởng thành là bào quan hình đĩa lõm, không chứa nhân và các bào quan (ty lạp thể, polyribosom) do vậy không có khả năng tổng hợp protein, hồng cầu chứa chủ yếu huyết sắc tố làm nhiệm vụ gắn O2 ở phổi vận chuyển tới các
tổ chức sau đó vận chuyển CO2 đào thải qua phổi Hồng cầu trưởng thành sống 120 ngày, được phân giải chủ yếu ở lách và tổ chức liên võng khác Sự cân bằng giữa môi trường và hồng cầu được duy trì bởi hoạt động của bơm natri nằm trên màng hồng cầu
1.1.2 Vai trò của máu trong y học
Máu mang oxy và các chất dinh dưỡng (protein, gluco, lipit, muối khoáng, các nội tiết tố ) đến các tế bào, đồng thời cũng mang đi các sản phẩm dư thừa của các tế bào này Ngoài ra, máu còn vận chuyển các tế bào miễn dịch để chống lại các tác nhân lây nhiễm và mang tiểu cầu để tạo thành các vết đông máu khi mạch máu
bị tổn thương để ngăn chặn sự mất máu Máu được vận chuyển đi khắp cơ thể qua
Trang 131.1.3 Phân loại các hệ thống nhóm máu ở người
Việc sử dụng máu để điều trị đã được áp dụng từ thế kỷ 17 và trong suốt thế
kỷ 18, tuy nhiên nhiều tai biến rất nguy hiểm đã xảy ra nhưng mãi đến năm 1900 con người mới bắt đầu hiểu được nguyên nhân của tai biến là do sự ngưng kết giữa kháng nguyên trên bề mặt hồng cầu người cho với kháng thể trong huyết thanh của người nhận Năm 1901, Karl Landsteiner là người đầu tiên phát hiện ra hệ thống nhóm máu ABO, phân loại các nhóm máu dựa vào kháng nguyên bề mặt trên màng
tế bào hồng cầu, với phát hiện này, ông đã được nhận giải Nobel về sinh lý và y học năm 1930 Nghiên cứu của ông chỉ ra rằng kiểu nhóm máu của những người khác nhau có thể không giống nhau và phụ thuộc vào kháng nguyên tồn tại trên màng hồng cầu Do đó, nhóm máu được phân loại dựa vào sự có mặt hoặc không có mặt của kháng nguyên A hoặc kháng nguyên B trên màng hồng cầu và việc xác định nhóm máu trước khi truyền máu là cần thiết [5]
Năm 2014, theo thống kê của Hiệp hội truyền máu Quốc tế có khoảng 35 hệ thống phân loại nhóm máu (hệ ABO, hệ Rh, hệ MNS, hệ Kell, hệ Kidd, hệ Lewis,
hệ Duffy, hệ Indian,…) với hơn 300 kháng nguyên nhóm máu khác nhau [6] Trên màng hồng cầu người có khoảng 30 loại kháng nguyên thường gặp và hàng trăm loại kháng nguyên hiếm gặp Hầu hết, kháng nguyên nhóm máu trên bề mặt hồng cầu có tính kháng nguyên yếu, thường được sử dụng trong nghiên cứu di truyền chỉ
có 2 kháng nguyên A, B của hệ thống nhóm máu ABO và kháng nguyên D của hệ thống nhóm máu Rh có tính kháng nguyên mạnh đóng vai trò quan trọng trong
Footer Page 13 of 126
Trang 14truyền máu và trong sản khoa
Kháng nguyên nhóm máu có thể là đường (glycan hoặc carbohydrate) hoặc protein, chúng liên kết với các thành phần khác nhau trên màng hồng cầu DNA của người quy định kiểu kháng nguyên hình thành trên màng tế bào hồng cầu của họ: kháng nguyên đường; kháng nguyên protein (protein xuyên màng một lần, nhiều lần
và protein liên kết glycosylphosphatidylinositol) Kháng nguyên nhóm máu ABO
có bản chất là đường Chúng được sản xuất bởi một loạt các phản ứng với sự tham gia của các enzyme xúc tác chuyển hóa các đơn vị đường DNA quy định kiểu enzyme của mỗi cá thể thông qua đó quy định kiểu kháng nguyên đường hình thành tương ứng trên màng tế bào hồng cầu Ngược lại, kháng nguyên của nhóm máu Rh lại có bản chất là protein, DNA của cá thể mang thông tin di truyền quy định protein
- kháng nguyên Gen RhD mã hóa kháng nguyên D, được biểu hiện ở những người mang gen, một vài người có gen không sản xuất kháng nguyên D và do đó protein RhD vắng mặt trên tế bào hồng cầu của họ Bên cạnh kháng nguyên đường, tế bào hồng cầu có ba loại protein mang kháng nguyên nhóm máu: protein xuyên màng một lần, protein xuyên màng nhiều lần và protein liên kết glycosylphosphatidylinositol (GPI) [9]
Hình 1.1 Kháng nguyên nhóm máu ở người
1.1.4 Hệ thống nhóm máu ABO và kháng nguyên nhóm máu ABO
Theo Landsteiner, trên màng hồng cầu có những kháng nguyên được gọi là
Trang 156
ngưng kết nguyên Có 2 loại ngưng kết nguyên là A và B Ngưng kết nguyên là polysaccharide có mặt trên màng hồng cầu từ giai đoạn sớm của bào thai Ðồng thời trong huyết tương có những kháng thể đặc hiệu của nhóm máu được gọi là ngưng kết tố Có 2 loại kháng thể đặc hiệu là kháng A (anti-A) và kháng B (anti-B) Các kháng thể này có khả năng làm ngưng kết hồng cầu khi hồng cầu nhóm máu A gặp anti-A, hoặc hồng cầu nhóm máu B gặp anti-B Tùy theo, sự có mặt hoặc vắng mặt của một trong hai hoặc cả hai kháng nguyên A và B trên màng hồng cầu, Landsteiner phân hệ thống nhóm máu ABO thành 4 nhóm máu A, B, AB và O (Bảng 1.1)
Bảng 1.1 Các nhóm máu hệ ABO ở người
Nhóm máu
Hồng cầu có kháng nguyên A hoặc B
Huyết thanh có kháng thể anti-A hoặc anti-B
Về bản chất, kháng nguyên nhóm máu ABO là các carbohydrate có mặt trên màng hồng cầu và nhiều mô, được đặc trưng bởi một gốc đường đặc hiệu (Hình 1.2) Các chuỗi đường này được gắn trên bề mặt hồng cầu bởi một phần có cấu trúc giống nhau được gọi là thân carbonhydrate (kháng nguyên H) Chuỗi đường cơ bản này không gây ngưng kết hồng cầu nên hồng cầu mang chuỗi đường cơ bản được kí hiệu là nhóm máu O Khi chuỗi đường cơ bản gắn thêm một gốc đường galactose hoặc galactosamine thì chúng gây ngưng kết hồng cầu B, nên đặc trưng cho nhóm máu B Chuỗi đường đặc trưng nhóm máu B được gắn thêm một nhóm N-acetyl thì chúng gây ngưng kết hồng cầu A nên đặc trưng cho nhóm máu A [10]
Footer Page 15 of 126
