Phân lập các chất từ dịch chiết vi khuẩn lam có khả năng ức chế tăng trưởng một số dòng tế bào ung thư

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ***** Bùi Thị Thùy Dung PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƯỞNG MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

*****

Bùi Thị Thùy Dung

PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM

CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƯỞNG MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

*****

Bùi Thị Thùy Dung

PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM

CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƯỞNG MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn: TS Phạm Thị Lương Hằng

PGS TS Hoàng Thị Mỹ Nhung

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS Phạm Thị Lương

Hằng và PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung, người đã trực tiếp hướng dẫn , tạo mo ̣i

điều kiê ̣n thuâ ̣n lợi , giúp đỡ tôi trong suốt quá trình ho ̣c tâ ̣p và hoàn thành luâ ̣n văn Các cô không chỉ là những người truyền đạt cho tôi những kiến thức mà còn

hỗ trợ tôi rất nhiều về vật chất Tôi thấy mình thật may mắn khi được là học trò của các cô

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới ThS Bùi Thị Vân Khánh, ThS

Nguyễn Đắc Tú , những người chi ̣, người anh tâ ̣n tình hướng dẫn tôi những kĩ

thuâ ̣t đầu tiên khi bước chân vào phòng thí nghiê ̣m Anh, chị không chỉ truyền đạt cho tôi những kinh nghiê ̣m trong công viê ̣c mà cả những kinh nghiê ̣m quý báu trong cuô ̣c sống, đó sẽ là những hành trang mà tôi sẽ luôn mang theo sau này

Xin gửi lời cảm ơn đến CN Nguyễn Thị Thu Hà, CN Hà Hữu Cường,

CN Nguyễn Thị Loan, CN Vũ Anh Công đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá

trình làm thí nghiệm

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô và cán bô ̣ trong Khoa Sinh

học, đă ̣c biê ̣t là các thầy cô trong Bô ̣ môn Sinh ho ̣c tế bào và Bộ môn Sinh lí

Thực vật và Hóa sinh đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành lu ận

văn này

Và, tôi xin chân thành cảm ơn các anh chi ̣ , các bạn và các em trong Phòng

thí nghiệm Nuôi cấy Tế bào người và động vật cũng như Phòng thí nghiệm Nuôi cấy Mô thực vật và Vi tảo đã luôn đồng hành , quan tâm và giúp đỡ tôi

trong thời gian tham gia nghiên cứu ta ̣i đây Sự quan tâm , chia sẻ của các bạn và các em là động lực lớn lao với tôi trong những lúc mệt mỏi và khó khăn nhất Tôi sẽ không bao giờ quên thời gian làm việc đầ y ắp tiếng cười cùng các ba ̣n trong hai gia đình lớn ở trường Đại học khoa học tự nhiên Hà Nội

Xin gửi lời cảm ơn đến Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia

(NAFOSTED) đã tài trợ kinh phí cho nghiên cứu này trong đề tài mang mã số

106.16-2012.24

Cuối cùng, tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc và lớn lao nhất đến gia đình tôi , những người đã hy sinh cả vâ ̣t chất và tinh thần , luôn yêu thương , ủng hộ, đô ̣ng viên và tôn tro ̣ng mo ̣i quyết đi ̣nh của tôi Mỗi khi nghĩ về gia đình tôi như được tiếp thêm sức ma ̣nh để vững tin hoàn thành tốt luận văn này

Hà Nội, tháng 12 năm 2016

Học viên

Bùi Thị Thuỳ Dung

BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Tƣ̀ viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt

ED50 Median effective dose Liều có hiệu quả ở 50% số

động vật thí nghiệm

HCT116 Human colon carcinoma cell Dòng tế bào ung thƣ đại

trực tràng HepG2 Hepatocellular carcinoma G2 Dòng tế bào ung thƣ gan

IC50

Half maximal inhibitory concetration

Nồng độ ức chế 50% số tế bào

LC/MS Liquid chromatography–mass

spectrometry Sắc kí lỏng - khối phổ

LD50 Median lethal dose 50% Liều gây chết trung bình MCF7 Breast adenocarcinoma cell Dòng tế bào ung thƣ vú

MIC

Minimal inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

TLC Thin-layer chromatography Sắc kí bản mỏng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Vi khuẩn lam 2

1.1.1.Đặc điểm hình thái và sinh lí của vi khuẩn lam 2

1.1.2.Phân loại vi khuẩn lam 3

1.2 Tiềm năng phát triển dược phẩm điều trị ung thư từ vi khuẩn lam 4

1.3 Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ vi khuẩn lam 9

1.4 Phân tách các hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam 13

Chương 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Vật liệu 15

2.1.1 Các chủng vi khuẩn lam 15

2.1.2 Dòng tế bào 16

2.2 Các nội dung chính trong nghiên cứu 17

2.3 Các phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Đánh giá khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào 17

2.3.2 Chuẩn bị dịch chiết từ sinh khối vi khuẩn lam Nostoc sp APD4 19

2.3.3 Phương pháp sắc kí cột silica gel 20

2.3.5 Phương pháp LC/MS 21

Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thư 22

3.1.1.Kết quả hoạt hóa tế bào 22

3.1.2.Xác định chỉ số IC50 của các dịch chiết từ vi khuẩn lam 22

3.2 Phân lập các chất có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào từ vi khuẩn lam Nostoc sp APD4 29

3.2.1.Sự phân tách bằng cột sắc ký silica gel 29

3.2.2 Sự phân tách bằng cột sắc kí sillica gel lần 2 32

3.2.3 Sự phân tách bằng cột sắc kí silica gel lần 3 35

3.3 Xác định khối lượng phân tử của hoạt chất bằng phương pháp LC/MS 37

KẾT LUẬN 43 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của Cryptophycin 1 [36] 5

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của Borophycin [17] 7

Hình 2.1 Các chủng vi khuẩn lam dùng trong nghiên cứu 16

Hình 3.1 Các dòng tế bào ung thư dùng trong phép thử hoạt tính 22

Hình 3.2 Tế bào MCF7 ở mẫu đối chứng sau 48h thử nghiệm 23

Hình 3.3 Tế bào MCF7 dưới tác dụng của dịch chiết APD4- EtOAc 24

Hình 3.4 Tế bào HCT116 dưới tác dụng của dịch chiết APD4- EtOAc 24

Hình 3.5 Tế bào HepG2 dưới tác dụng của dịch chiết APD4- EtOAc 24

Hình 3.6 Đường cong đáp ứng liều của các dịch chiết có hoạt tính trên hai dòng tế bào MCF7 và HCT116 27

Hình 3.7 Đường cong đáp ứng liều của dòng tế bào MCF7 đối với Taxol 28

Hình 3.8 Các phân đoạn rửa giải từ dịch chiết APD4-Met 30

Hình 3.9 Hình dạng tế bào MCF7 khi được ủ với phân đoạn DE5 32

Hình 3.10 Sắc kí cột silica gel cho phân đoạn có hoạt tính (DM-E) 33

Hình 3.11 Tế bào MCF7 khi ủ với phân đoạn DP1 và DP5 ở nồng độ 50µg/ml 34 Hình 3.12 Sắc ký đồ TLC của phân đoạn DP1 và DP5 35

Hình 3.13 Tế bào MCF7 dưới tác dụng của phân đoạn DF4 36

Hình 3.14 Sắc kí đồ của phân đoạn DF2 ở bước sóng 256nm 37

Hình 3.15 Sắc kí đồ của phân đoạn DF4 ở bước sóng 256nm 38

Hình 3.16 Phổ khối lượng của hợp chất P3 xuất hiện ở phút 23,6 39

Hình 3.17 Kết quả tra cứu hợp chất có trọng lượng phân tử từ 795-796 dalton tháng 10/2016 40

Hình 3.18 Công thức cấu tạo của Apratoxin E [26] 41

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số chất có khả năng kháng ung thư được phân lập từ vi khuẩn lam [39] 8

Bảng 2.1 Các chủng vi khuẩn lam dùng trong thí nghiệm đánh giá hoạt tính 15

Bảng 3.1 Giá trị tăng sinh A% của các dịch chiết có hoạt tính ức chế sự tăng sinh

tế bào dòng MCF7 25 Bảng 3.2 Giá trị tăng sinh A% của các dịch chiết có hoạt tính ức chế sự tăng sinh

tế bào dòng HCT116 26 Bảng 3.3 Giá trị IC50 của một số dịch chiết có hoạt tính 27 Bảng 3.4 Giá trị IC50 của Taxol trên ba dòng tế bào MCF7, HCT116 và HepG2 28 Bảng 3.5 Khối lượng các phân đoạn từ dịch chiết của chủng APD4 31 Bảng 3 6 Khối lượng khô của các phân đoạn thu được từ cột silica gel lần 2 34 Bảng 3.7 Khối lượng các phân đoạn thu được từ cột sắc ký silica gel lần 3 36 Bảng 3.8 Tỷ lệ tương đối về hàm lượng của các chất trong phân đoạn DF4 38

MỞ ĐẦU

Sự xuất hiện của bệnh ung thư đã và đang là mối đe dọa tính mạng con người hàng đầu trên thế giới với tỷ lệ mắc phải ngày càng tăng Theo số liê ̣u báo cáo của Viện nghiên cứu quốc tế về ung thư , trong năm 2012, trên toàn thế giới có hơn 8,2 triệu người chết vì các loại bệnh ung thư khác nhau Các chuyên gia cảnh báo nếu con người không sớm tìm được biện pháp hữu hiệu để ngăn chặn tốc độ phát triển như hiện nay của căn bệnh này thì tới năm 2035, ung thư sẽ cướp đi sự sống của ít nh ất 24 triệu người [14] Hóa trị và xạ trị từ lâu là phương pháp được sử dụng phổ biến trong điều trị ung thư, tuy nhiên hai phương pháp này có nhiều tác dụng phụ, ảnh hưởng xấu tới sức khỏe người bệnh, hoặc người bệnh có thể tử vong trước khi tiêu diệt được tận gốc các tế bào ung thư Bởi vâ ̣y, viê ̣c tìm ra mô ̣t loa ̣i thuốc đă ̣c hiê ̣u điều tri ̣ ung thư và an toàn v ới người bệnh là

mô ̣t vấn đề r ất cấp bách hiê ̣n nay Trong công cuộc tìm kiếm đó, các hợp chất từ thiên nhiên được quan tâm nhiều hơn cả bởi chúng đã có mặt trong các bài thuốc dân gian từ lâu và có độ an toàn cao

Vi khuẩn lam là nguồn giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học với tiềm năng dược phẩm có ý nghĩa quan trọng Chúng cho thấy khả năng chống lại các khối u, kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm Một số hợp chất được phân lập và tinh sạch từ vi khuẩn lam đã cho kết quả bước đầu thành công trong các thử nghiệm điều trị ung thư lâm sàng Các hợp chất này được xem là hợp chất tiên phong cho sự phát triển, tổng hợp các hợp chất dẫn với hoạt tính sinh học tốt hơn

Từ các kiến thức như trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân lập các chất từ dịch chiết vi khuẩn lam có khả năng ức chế tăng trưởng một số dòng tế bào ung thư” với mục đích:

1 Đánh giá được khả năng ức chế tăng trưởng của dịch chiết từ 9 chủng vi khuẩn lam lên 3 dòng tế bào ung thư phổ biến ở Việt Nam

2 Tìm ra được hợp chất có khả năng kháng ung thư từ dịch chiết vi khuẩn lam

Chương 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khuẩn lam

1.1.1 Đặc điểm hình thái và sinh lí của vi khuẩn lam

Vi khuẩn lam là vi khuẩn quang hợp cổ xưa, xuất hiện trên trái đất từ 3,5 tỉ năm về trước Bằng việc tạo ra khí oxy như một sản phẩm phụ của quá trình quang hợp, vi khuẩn lam được cho là đã chuyển đổi khí quyển ở thời kì sơ khai từ tính khử sang tính ô-xi hóa, từ đó làm thay đổi thành phần sự sống trên Trái Đất Chính vì vậy, chúng được xem là nhóm sinh vật tiên phong trong quá trình sản xuất ra khí oxy giúp hình thành sự sống trên Trái Đất ngày nay

Vi khuẩn lam trước đây còn được biết đến với tên gọi là tảo lam bởi chúng có cơ chế quang hợp giống tảo (nhóm sinh vật nhân chuẩn) với sắc tố quang hợp nằm trên màng thylakoid Tuy nhiên, cấu tạo tế bào của chúng giống với sinh vật nhân sơ (Prokaryote) hơn là sinh vật nhân chuẩn (Eukaryote) vì chúng không có màng nhân, vật liệu di truyền không liên kết với protein histone, thiếu màng bao quanh các bào quan như bộ máy Golgi, lục lạp, ty thể, lưới nội chất Vi khuẩn lam có ribosome 70S và có cấu trúc thành tế bào gồm các lớp peptidoglycan Màu xanh của vi khuẩn lam là do sự kết hợp của chlorophyll a (xanh lục) và các sắc tố phụ phycocyanin (xanh lam), allophycocyanin (xanh lam), phycoerythin (màu đỏ) Các sắc tố này kết hợp với nhau theo tỷ lệ và thành phần nhất định để thích ứng với môi trường sống [9]

Vi khuẩn lam có hai hệ thống quang hệ I và II nằm trên màng thylakoid (trừ

chi Gleobacter) Trong quang hệ II có phycobiliprotein có chức năng giống các

sắc tố “ăng-ten” bắt giữ năng lượng sáng cho chlorophyll a Năng lượng ánh sáng sau đó sẽ được chuyển từ quang hệ II sang quang hệ I - nơi chúng được chuyển thành năng lượng hóa học trong đó có phân tử cao năng lượng như ATP và NADPH+H Phân tử cao năng này sẽ được sử dụng để cố định CO2 thành carbohydrate thông qua chu trình Calvin Vi khuẩn lam thực hiện quang hợp trong điều kiện hiếu khí với H2O là chất cho điện tử và O2 là sản phẩm phụ được tạo ra

Tuy nhiên, một số chủng vi khuẩn lam có thể sống trong điều kiện kị khí bằng cách sử dụng quang hệ I và chất cho điện tử H2S, H2 hoặc các hợp chất hữu cơ [9]

Vi khuẩn lam có thể được tìm thấy gần như trong mọi môi trường sống trên đất liền như đất, đá ẩm, đá trong các hoang mạc thậm chí kể cá các loại đá tại châu Nam Cực và trong môi trường nước như trong các đại dương, môi trường nước ngọt [8]

Vi khuẩn lam đã và đang được nghiên cứu trong một số lĩnh vực, đem lại giá trị kinh tế vô cùng to lớn như:

 Làm phân bón sinh học cho lúa và các cây trồng khác bởi nhiều chủng vi khuẩn lam có các tế bào dị hình, có khả năng cố định nitơ khí quyển giúp tăng năng suất cây trồng

 Vi khuẩn lam là một nguồn protein đơn bào có ý nghĩa quan trọng

Các chủng không độc như Spirulina sp đã được nuôi trên quy mô lớn để làm thực

phẩm bổ sung cho người và làm thức ăn giàu protein cho gia súc

 Các chất chuyển hóa thứ cấp từ vi khuẩn lam là nguồn dược liệu quan trọng cho việc phát triển thuốc và điều trị bệnh

1.1.2 Phân loại vi khuẩn lam

Phân loại sinh học là một phương pháp theo đó các nhà sinh học lập nhóm

và phân loại các loài sinh vật theo những nguyên tắc nhất định Mỗi nhóm sinh vật có tên gọi riêng và được phân định dựa trên những đặc điểm xác định về hình thái, trình tự DNA,…Căn cứ vào mối quan hệ giữa các nhóm, người ta sắp xếp chúng theo thứ tự bằng hoặc phân cấp cao hơn trên cây phân loại

Dựa trên hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey, vi khuẩn lam được chia thành 5 bộ [41]:

 Bộ Chroococcales: Dạng đơn bào, tế bào dạng đơn lẻ hoặc tập trung lại thành đám Các tế bào phân chia theo 1; 2 hoặc 3 mặt phẳng đối xứng

hoặc nảy chồi Ví dụ các chi: Microcystis, Prochlorococcus, Prochloron, Synechoccus

 Bộ Pleurocapsales: Dạng đơn bào, tế bào dạng đơn lẻ hoặc tập trung

lại thành đám Ví dụ các chi: Chroococcidiopsos, Myxosarcina, Pleurocapsa

 Bộ Oscillatoriales: Dạng sợi đơn, không có tế bào dị hình Ví dụ các

chi: Oscillatoria, Spirulina, Lyngbya, Trichodesmium, Planktothrix

 Bộ Nostocales: Dạng sợi, không phân nhánh, có tế bào dị hình, có khả năng cố định nitơ Ví dụ các chi: Nostoc, Calothrix, Nodularia

 Bộ Stigonematales: Dạng sợi, phân nhánh, có tế bào dị hình để cố định nitơ Ví dụ các chi: Fischerella, Hapalosiphon, Westiellopsis

Sự phân loại vi khuẩn lam truyền thống thường dựa trên hình thái của chúng Tuy nhiên, chỉ dựa vào tiêu chí hình thái có thể không chính xác vì một số chủng vi khuẩn lam có sự thay đổi về hình thái khi đáp ứng với các điều kiện môi trường khác nhau Sử dụng các trình tự DNA 16S để làm thước đo phân loại đang

là hướng đi nhiều tiềm năng vì DNA không bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường Sự kết hợp giữa phương pháp truyền thống và phương pháp hiện đại giúp quá trình phân loại vi khuẩn lam chuẩn xác hơn

1.2 Tiềm năng phát triển dược phẩm điều trị ung thư từ vi khuẩn lam

Trong số 974 hợp chất mới được giới thiệu làm thuốc trên thế giới những năm 1981-2006, 63% có nguồn gốc từ các sản phẩm thiên nhiên Trong đó, 6% là các sản phẩm thiên nhiên, 33% là các dẫn xuất tổng hợp dựa trên các kiến thức thu được từ các sản phẩm tự nhiên và 24% là sản phẩm bắt chước sản phẩm tự nhiên Bên cạnh đó, đối với các dược phẩm điều trị ung thư, 78% là sản phẩm tự nhiên hoặc có nguồn gốc từ các sản phẩm tự nhiên [29] Đại đa số các sản phẩm tự nhiên bắt nguồn từ nấm, vi khuẩn và thực vật Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu phát triển nguồn dược phẩm từ hợp chất thiên nhiên theo hai hướng, đó là: phân tích sâu hơn các hợp chất có mặt trong nguồn tài nguyên cũ đã được biết đến

và hướng tới nguồn tài nguyên mới dồi dào, phong phú hơn Trong đó, vi khuẩn lam đang là đối tượng tiềm năng được chú ý theo hướng nghiên cứu thứ hai

So sánh với các loại thuốc từ vi khuẩn nói chung, vi khuẩn lam nổi trội hơn hẳn nhờ có mặt những hợp chất tiềm năng kháng ung thư Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra 6% đến 10% dịch chiết từ vi khuẩn lam đang được nuôi cấy có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư ở người, 0,8% trong tổng số 2000 dịch chiết vi khuẩn lam có độc tính đối với các khối u rắn [27] Theo báo cáo của Patterson, ông và cộng

sự đã tiến hành sàng lọc trên quy mô lớn sử dụng 1000 chủng vi khuẩn lam từ các môi trường sống khác nhau Quá trình sàng lọc đã cho thấy khoảng 7% dịch chiết có khả năng ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư KB [31]

Các nghiên cứu của Gerwick và cộng sự tập trung vào việc sàng lọc các hợp chất kháng ung thư của các chủng vi khuẩn lam sống trong môi trường nước biển Kết quả nghiên cứu cho thấy có tới 40% các chất từ vi khuẩn lam thu được có hoạt khả năng chống lại ung thư, ngăn ngừa khối u Chúng cũng là nguồn giàu các hợp chất peptide và polyketide, các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh có thể là nguồn hợp chất tạo dược phẩm kháng ung thư mới [16]

Một số lượng lớn các hợp chất được phân lập từ vi khuẩn lam có hoạt tính

ức chế sự trùng hợp tubulin đang là đối tượng được nghiên cứu để phát triển thuốc kháng ung thư

Được phân lập từ vi khuẩn lam Nostoc sp ATCC 53789, Cryptophycin là

một trong những ứng cử viên được phát hiện sớm và có tiềm năng cao cho loại dược phẩm mới chống ung thư Ở nhóm Cryptophycin có hơn 25 thành viên có hoạt động mạnh gây bất ổn tubulin, trong đó Crytophycin 1 có hoạt tính mạnh nhất [36]

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của Cryptophycin 1 [36]