tóm tắt Nghiên cứu tối ưu qui trình tách AND hệ gen từ xương lâu năm ứng dụng trong nhận dạng cá thể người

Tài liệu là bản tóm tắt

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUI TRÌNH TÁCH ADN HỆ GEN

TỪ XƯƠNG LÂU NĂM ỨNG DỤNG TRONG NHẬN DẠNG

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân

Hà Nội - 2017

Header Page 2 of 126

Footer Page 2 of 126

Trang 3

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan kết quả thể hiện trong bản luận văn này là công trình nghiên cứu thực tế Toàn bộ số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực, khách quan, chưa được công bố công khai bởi một ai khác

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân –Chủ nhiệm Bộ môn Di truyền học đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Viện Kỹ thuật Hóa học, Sinh học

và Tài liệu nghiệp vụ - Tổng cục IV – Bộ công an đã ủng hộ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình hoàn thành luận vặn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học và lãnh đạo Khoa đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn bộ cán bộ phòng Kỹ thuật Sinh học nghiệp vụ - Viện Kỹ thuật Hóa học, Sinh học và Tài liệu nghiệp vụ - Tổng cục IV –

Bộ công an, gia đình, người thân và bạn bè đã luôn bên tôi, quan tâm động viên và tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 06 tháng 01 năm 2017

Học viên

Trần Thị Hạnh

Trang 5

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……… 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ……… 3

1.1 Các phương pháp nhận dạng cá thể người 3

1.1.1 Phương pháp hình thái học……… 3

1.1.2 Phương pháp phân tích các chỉ thị phân tử……… 4

1.1.3 Một số chỉ thị ADN ứng dụng trong nhận dạng cá thể……… 6

1.1.3.1 Các locus STR……… 6

1.1.3.2 Mini-STRs……… 8

1.1.3.3 Vùng siêu biến HV1 và HV2 của ADN ti thể……… 10

1.1.3.4 Đa hình đơn nucleotide (SNPs)……… 11

1.2 Các nguồn ADN sử dụng trong phân tích mẫu hài cốt 12

1.2.1 Xương……… 12

1.2.1.1 Cấu trúc xương……… 12

1.2.1.2 Sự tồn tại của ADN trong xương ……… 14

1.2.2 Răng 14

1.2.2.1 Cấu trúc răng 14

1.2.2.2 Vị trí của ADN trong răng 15

1.2.3 Sự tồn tại và khả năng thu được ADN trong các bộ phận khác nhau của mẫu hài cốt……… 17

1.3 Các phương pháp tách chiết ADN từ xương lâu năm trên thế giới… 19

1.4 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam……… 23

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 25

2.1 Nguyên liệu……… 25

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu……… 25

Trang 6

2.1.2 Hóa chất……… 25

2.1.3 Thiết bị dụng cụ……… 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 27

2.2.1 Phương pháp lựa chọn mẫu ……… 27

2.2.2 Phương pháp thu mẫu, bảo quản mẫu và bố trí khu vực thí nghiệm sau khi thu mẫu 28

2.2.3 Xử lý mẫu – Loại canxi……… 29

2.2.4 Tách chiết ADN từ xương bằng phương pháp hữu cơ (Phenol/ Chloroform/ Isoamyl alcohol: PCI) 30

2.2.5 Tách chiết ADN từ xương bằng KIT QIAmp DNA Investigator (QiAgen) 31

2.2.6 Tách chiết ADN từ xương bằng KIT DNA IQTM System (Promega) 32

2.2.7 Định lượng ADN 33

2.2.8 PCR nhân bội sản phẩm 33

2.2.9 Điện di và đọc kết quả trên máy điện di mao quản……… 34

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN….……… 36

3.1 Kết quả nghiên cứu tối ưu bước xử lý mẫu ban đầu và loại canxi……… 36

3.2 Kết quả thử nghiệm, lựa chọn phương pháp tách chiết tối ưu tại điều kiện phòng thí nghiệm ……… 38

3.2.1 Kết quả phân tích, xác định kiểu gen……… 38

3.3.2 Kết quả đánh giá, lựa chọn phương pháp tách chiết……… 39

3.3 Kết quả tối ưu quy trình tách chiết, phân tích ADN nhân từ xương lâu năm……… 40

3.4 Kết quả phân tích ADN nhân các mẫu xương theo quy trình đã xây dựng……… 46

3.5 Thảo luận chung ……… 50

Trang 7

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 53

Kết luận……… 53

Kiến nghị……… 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 54

PHỤ LỤC………

Trang 8

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

(Cục điều tra Liên Bang Mỹ) -HA :Hydroxyl Apatite (Tinh thể hydroxyapatít)

-NST :Chromosome (Nhiễm sắc thể)

-mtADN :Mitochondrial DNA (ADN ti thể)

-qADN :DNA Quantification (Định lượng ADN) -OD :Optical Density (Mật độ quang học) -PCR :Polymerase Chain Reaction

-PD :Power of discrimination (Khả năng phân biệt) -PCI :Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol

-RFLP :Restriction fragment length polymorphism

(Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn)

-STR :Short Tandem Repeat (Đoạn lặp đa hình ngắn) -SNP :Single nucleotide polymorphism

(Đa hình đơn nucleotide)

Trang 9

-Taq :Thermus aquaticus

-Tm :Temperature melting (Nhiệt độ nóng chảy) -UV :Ultra Violet (Tia cực tím)

-VNTR :Variable Number of Tandem Repeat

(Đoạn lặp có độ dài trung bình)

Trang 10

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ minh hoạ các khả năng di truyền một số alen thuộc

locus STR từ bố, mẹ cho con theo định luật Mendel 7

Hình 1.2 Hình minh họa vị trí thiết kế mồi Mini-STR và các bộ mồi

Hình 1.6 Lớp tế bào odontoblast xếp thành lớp trên bề mặt khoang tủy

răng và ống tủy, nơi có quá trình biệt hóa hình thành lớp

Hình 1.6 Sơ đồ các khu vực mẫu xương và mức độ thành công của các

Hình 3.1 Kết quả so sánh một số mẫu khi tách theo kit IQS của nhà sản

Hình 3.1 Sơ đồ mô tả qui trình tổng quát tách chiết, phân tích ADN từ

Trang 11

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các phương pháp tách chiết ADN từ xương lâu năm đã được công bố

Bảng 3.3 Kết quả đo OD các mẫu khuôn sau tách chiết bằng 3 phương pháp 38

Bảng 3.4 Kết quả phân tích ADN các locus STR trên các mẫu hài cốt được tách

Bảng 3.5 So sánh kết quả khi tách chiết bằng Kit IQS và IQS có cải tiến 41

Trang 12

Khóa học 2014-2016

Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành Di truyền học

MỞ ĐẦU

Trước hậu quả của bất kỳ thảm họa hàng loạt nào, một trong những điều quan trọng cần đề cập đến đầu tiên là việc nhận diện nạn nhân Những thiên tai tàn phá như sóng thần, động đất, rơi máy bay, chiến tranh gây ra cái chết cho hàng nghìn nạn nhân Trong những trường hợp đó, các nhân viên pháp y buộc phải làm công việc định danh cho hàng trăm, hàng ngàn thi thể

Phương pháp thông thường để định danh bao gồm nhận dạng các đặc điểm ngoại hình, so sánh dấu vân tay, hồ sơ nhân chủng học (ước tính tuổi, giới tính, chủng tộc, tầm vóc, nha khoa, chấn thương và bệnh án) Các phương pháp xác định trên, mặc dù hữu ích và dễ thực hiện nhưng không phải lúc nào cũng thành công, đặc biệt là khi các đặc điểm ngoại hình, dấu vân tay đã bị mất, như trường hợp thi thể bị phân hủy mạnh, biến dạng do tác động của nhiệt, ngoại lực… hoặc thời gian chết đã quá dài, thi thể bị phân mảnh chỉ còn lại các mảnh hài cốt, hoặc khi hồ sơ nha khoa và y tế đối chứng không có Phân tích ADN sẽ được thực hiện khi các phương pháp nhận dạng khác không thành công hoặc cho kết quả không rõ ràng Mặc dù phân tích ADN có thể thực hiện từ tất cả các nguồn mô của người, tuy nhiên ở những trường hợp này, xương và răng của hài cốt người nhiều khi là nguồn cung cấp ADN duy nhất, dựa vào cấu trúc đặc biệt của xương mà ADN sẽ được bảo tồn tương đối tốt trong thời gian dài

Giống như các tế bào khác trong cơ thể người, nguồn ADN tách chiết từ xương thường được phân tích chủ yếu theo hệ gen ti thể và hệ gen nhân Đối với hệ gen ti thể, phương pháp được thực hiện là so sánh trình tự ADN thu được sau khi giải trình tự các mẫu Sự sai khác về trình tự của các mẫu so với nhau và so với trình tự chuẩn cho phép kết luận loại trừ hay không loại trừ mối quan hệ họ hàng theo dòng mẹ của các mẫu đó Phương pháp phân tích hệ gen ti thể đã thực hiện thành công ở nhiều nước trên thế giới [33] Với hệ gen nhân, phương pháp giám định ADN pháp y hiện nay sử dụng chủ yếu là thiết lập hồ sơ ADN cá thể dựa trên kiểu gen của 12 đến 24 trình tự STR (Short Tandem Repeat – Đoạn lặp lại ngắn kế tiếp) có chiều dài khoảng từ 100 – 350 bp [1],[3] Khác với hệ gen ty thể, một hồ sơ ADN gen nhân đầy đủ cho phép định danh chính xác đến từng cá thể, tuy nhiên, đối

Trang 13

Khóa học 2014-2016

với các mẫu xương, đặc biệt là những mẫu xương lâu năm, ADN của hệ gen nhân thường bị phân hủy mạnh hơn và có số lượng bản sao ít hơn so với hệ gen ti thể Do

đó, việc thực hiện phân tích ADN của hệ gen nhân thường khó khăn hơn

Cho đến nay, chưa có một phương pháp chung nào cho phép tách chiết được nguồn ADN tổng số có chất lượng đảm bảo sử dụng tốt cho việc phân tích ADN hệ gen nhân từ các mẫu xương lâu năm Tùy thuộc vào từng loại xương (xương đùi, răng, xương hàm, ) điều kiện môi trường, thời gian chôn cất và đặc điểm sinh học của xương mà các PTN sử dụng các phương pháp xử lý, các phương pháp tách chiết khác nhau và phải cải tiến để phù với điều kiện thực tế nhằm thu được ADN hiệu quả nhất [42]

Thực tế tại Việt Nam, trong các vụ án hình sự, mẫu hiện trường thu được trong nhiều trường hợp chỉ là mẫu răng, xương tồn tại ở các điều kiện môi trường khác nhau Ngoài ra, do hậu quả chiến tranh để lại, nhu cầu giám định hài cốt rất lớn, số lượng mẫu cần giám định hàng năm lên tới hàng trăm nghìn mẫu Các mẫu hài cốt này thường được chôn dưới đất, do khí hậu nóng ẩm cộng với thời gian khoảng trên 40 năm Phần lớn các mẫu xương đều đã bị phân hủy mạnh, chất lượng xương kém, nguồn ADN tách chiết được thường có hàm lượng ADN tổng số thấp, lẫn nhiều chất ức chế, gây khó khăn cho việc phân tích ADN, đặc biệt là đối với hệ gen nhân Do vậy, để đạt được kết quả phân tích tốt, cần thiết phải có sự thử nghiệm, cải tiến và tối ưu phương pháp tách chiết ADN đối với các mẫu xương lâu năm

Trước tình hình thực tế nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tối

ưu qui trình tách ADN hệ gen từ xương lâu năm ứng dụng trong nhận dạng cá thể người” với mục tiêu xây dựng được qui trình tối ưu để tách chiết và phân tích

ADN nhân từ mẫu xương lâu năm phù hợp với điều kiện tồn tại mẫu và năng lực phân tích của phòng thí nghiệm ở Việt Nam

Trang 14

Khóa học 2014-2016

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Các phương pháp nhận dạng cá thể người

Nhận dạng cá thể người là một trong những mục tiêu chính của lĩnh vực khoa học pháp y phục vụ cho thực thi pháp luật, giám định y khoa và các mục tiêu nhân đạo của xã hội Hàng năm, các cơ quan điều tra, các cơ sở giám định pháp y ghi lại hàng nghìn trường hợp, đó là hậu quả của thiên tai, thảm họa hàng loạt, chiến tranh…khiến cho số lượng thi thể, hài cốt cần nhận diện có thể lên tới hàng chục nghìn vụ mỗi năm

Về nguyên lý, công tác nhận dạng chính là việc so sánh các thuộc tính, các đặc điểm của mẫu sinh phẩm thu được với những tiêu chuẩn, những chỉ tiêu đã biết

để xác định cá thể Xác định độ tuổi, giới tính, chủng tộc hoặc so sánh giữa những thuộc tính, những đặc điểm của mẫu nghi ngờ với mẫu đối chứng để xem mức độ phù hợp hay không phù hợp hoặc chúng có cùng một nguồn gốc hay không Thông qua việc phân tích các đặc tính chúng ta sẽ phân nhóm được các mẫu giám định hoặc loại trừ được mẫu nghi ngờ trong nhóm đối tượng cần giám định đôi khi chỉ bằng các phương pháp đơn giản hoặc một vài đặc điểm nhận dạng Như vậy, chúng

ta sẽ giới hạn và khu trú dần số mẫu (đối tượng) cần giám định

Các phương pháp sử dụng trong nhận dạng cá thể người bao gồm phương pháp hình thái học và phương pháp phân tích các chỉ thị phân tử Trong nhận dạng

cá thể, thông thường nhận dạng bằng hình thái cũng được thực hiện trước trong trường hợp mẫu đủ nguyên vẹn [7],[47], sau đó việc sử dụng chỉ thị phân tử có được tiến hành hay không tùy thuộc vào kết quả giám định hình thái và chất lượng mẫu thu được Trong thực tế, rất nhiều trường hợp phải sử dụng đến phương pháp phân tích sâu hơn như phân tích nhóm máu, phân tích ADN [44]

Trang 15

Khóa học 2014-2016

Các nhà nhân chủng học đã phát triển một hệ thống phân tích nhân chủng học pháp y dựa trên phân tích đặc điểm hình thái Hồ sơ sinh học bao gồm các ước tính về độ tuổi, giới tính, chủng tộc, tầm vóc, nha khoa, chấn thương và bệnh án [44] Những đặc điểm này có thể được so sánh với báo cáo mất tích tại khu vực xung quanh để hỗ trợ điều tra Phương pháp xác định này mặc dù hữu ích và có giá trị pháp lý nhưng không phải lúc nào cũng thành công, đặc biệt là khi các đặc điểm nhận dạng và thông tin trước khi chết không rõ ràng, hồ sơ nha khoa và y tế không

có

1.1.2 Phương pháp phân tích các chỉ thị phân tử

Chỉ thị di truyền dựa trên protein là hệ thống đầu tiên được sử dụng để nhận dạng trong giám định sinh học hơn 25 năm trước đây [10] Phương pháp tiên phong này ngay sau đó đã bộc lộ một số hạn chế như: tính kém ổn định của mẫu trước các yếu tố môi trường, lượng mẫu cần xét nghiệm phải đủ lớn, khả năng phân biệt cá thể thấp nên khó có thể truy nguyên cá thể Hơn nữa, đối với những mẫu vật sinh học đã bị phân hủy nặng nề do tác động của nhiệt độ cao, ngoại lực lớn hoặc thời gian lâu, mẫu đã phân hủy hoàn toàn thì phương pháp sử dụng các chỉ thị protein là không thể thực hiện được

Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, cộng đồng pháp y sau đó

đã quan tâm tới chỉ thị di truyền khác tiềm năng hơn, đó là các chỉ thị ADN đa hình Cho đến nay nó đã được phát triển thành một công cụ không thể thiếu trong lĩnh vực nhận dạng cá thể người trong lĩnh vực hình sự [10]

Tế bào có chứa 2 loại ADN: ADN ti thể (mtDNA) và ADN nhân (nDNA) Mỗi loại có vị trí, số lượng bản sao, cấu trúc vật lý khác nhau trong tế bào Ti thể là những bào quan nằm trong tế bào chất, được di truyền theo dòng mẹ, do đó các trình tự mtADN giống nhau ở các cá nhân cùng mẫu hệ, (ví dụ: anh, chị em ruột,

mẹ, bà ngoại, bác - dì - cậu họ ngoại…) Tế bào người có thể chứa tới hàng trăm đến hàng ngàn ti thể cho nên số lượng bản sao trình tự mtADN lớn hơn so với nADN ADN trong nhân ở các tế bào sinh dưỡng (soma) có hai bản sao, một di truyền từ mẹ và một di truyền từ bố Những trình tự này là đặc trưng duy nhất cho mỗi cá thể ngoại trừ trường hợp song sinh cùng trứng Do đó các đặc điểm trình tự

Trang 16

Khóa học 2014-2016

nADN được xác định là đặc điểm nhận dạng giúp truy nguyên đến từng cá thể [9]

Phân tích ADN được áp dụng lần đầu tiên trong pháp y vào cuối những năm

1980 sử dụng kĩ thuật phân tích đa hình chiều dài đoạn cắt bằng enzyme giới hạn (RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism) Kỹ thuật này được sử dụng

để xác định kiểu gen các locus VNTR (Variable Number of Tandem Repeat), hay còn gọi là các trình tự lặp lại liên tiếp với số lượng thay đổi [21] Chỉ thị này cung cấp khả năng phân biệt cao cho nhận dạng cá thể Tuy nhiên để phân tích thành công chỉ thị này, cần một lượng tương đối lớn ADN khuôn, khoảng 10 - 25ng, ADN cần phải nguyên vẹn và trình tự cần phân tích có chiều dài lên tới 10,000 bp Kỹ thuật phân tích này không thể áp dụng đối với những mẫu bằng chứng ít (mẫu dấu vết) hoặc mẫu đã bị thoái hóa

Kỹ thuật RFLP sau đó đã được thay thế bằng kỹ thuật phân tích dựa trên phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) trong khoảng 20 năm trước đây PCR là một phương pháp được sử dụng để khuếch đại các vùng cụ thể của khuôn ADN tổng số tách chiết từ mô sinh học Nó được dùng để tái tạo và đồng thời nhân bội tạo ra hàng triệu bản sao của một trình tự ADN cụ thể trong bộ gene PCR cho phép thu lại được hồ sơ ADN hoàn chỉnh từ khuôn mẫu ban đầu thấp (> 100 pg) trong thời gian ngắn Các chỉ thị di truyền đầu tiên dựa trên nền tảng PCR được sử dụng trong nhận dạng cá thể là hệ đa hình đơn nucleotide (SNP) trên gen nhân, gồm có: trình tự

đa hình tại vị trí HLA-DQA1, LDLR, GYPA, HBGG, D7S8 và Gc Những xét nghiệm dựa trên hệ SNP này nhạy với mẫu kém nhưng lại không cung cấp được khả năng phân biệt như hệ VNTR/RFLP trước đó Hơn nữa, do tính chất mỗi locus chỉ

có hai alen nên khả năng nhận dạng cá thể trong các mẫu lẫn là rất khó giải quyết [8]

Đầu những năm 1990, kỹ thuật nhân bội đa hình chiều dài đoạn (AmpFLP) được áp dụng trong nhận dạng cá thể Phương pháp này sử dụng kỹ thuật PCR để nhân bội các locus VNTR như D1S80, ApoB, D17S30 (YNZ22) và COL2A1, sau

đó sản phẩm nhân bội được phân tách gel Polyacrylamide và đọc kết quả bằng kỹ thuật nhuộm bạc, mặc dù phương pháp này rút ngắn được thời gian hơn so với RFLP, nó vẫn đòi hỏi lượng mẫu đầu vào nguyên vẹn và lớn (> 5 ng)

Trang 17

Khóa học 2014-2016

Đến cuối những năm 1990, các locus trình tự lặp lại ngắn (STR) hoặc các locus tiểu vệ tinh (microsatellite: một phân lớp nhỏ của các VNTR) đã thay thế các chỉ thị di truyền thế hệ I trong các ứng dụng nhận dạng cá thể dựa trên kỹ thuật PCR STR cải thiện đáng kể những thiếu sót của VNTR do kích thước vùng nhân bội nhỏ (100-500 bp), mức độ đa hình cao và có thể tự động hóa qui trình phân tích [9] Hiện nay, phân tích STR đã trở thành tiêu chuẩn “vàng” của nhận dạng cá thể trong khoa học hình sự

1.1.3 Một số chỉ thị ADN ứng dụng trong nhận dạng cá thể

Các chỉ thị di truyền hiện đang được sử dụng phổ biến ở các phòng thí nghiệm khoa học hình sự hiện nay trong giám định truy nguyên cá thể bao gồm các locus STR, các SNP và ADN ti thể (mtADN)

1.1.3.1 Các locus STR

Khái niệm các đoạn lặp và STR

Đoạn lặp: Hệ gen (genome) của người chứa rất nhiều các trình tự lặp lại khác nhau Các trình tự ADN lặp lại này đa dạng về loại hình và kích thước Những đoạn lặp lại dài có thể chứa đến hàng trăm, thậm chí hàng ngàn nucleotide ở vùng lặp lại (còn gọi là nhân lặp) Những vùng này thông thường nằm gần vùng tâm động của NST

Locus STR: STR (trình tự ngắn lặp lại liên tiếp) là các trình tự chứa các đoạn ADN ngắn, thường từ 2 đến 7 nucleotide, lặp lại liên tiếp tại một vị trí xác định trong hệ gen nhân Số lần lặp lại của mỗi locus này được gọi là alen, mỗi cá nhân có kiểu gen 2 alen của mỗi locus STR, một alen nhận từ mẹ và một alen nhận từ bố

Cơ sở khoa học của phân tích STR trong nhận dạng cá thể người

Năm 1956, Joe Hin Tjio và Albert Levan đã xác định chính xác ở người, trong nhân tế bào (thể lưỡng bội) có 46 cặp NST được xếp thành 23 cặp tương đồng: 22 cặp NST thường và một cặp NST giới tính Riêng tế bào trứng và tinh trùng chỉ có 23 NST (tế bào đơn bội) Sự kết hợp giữa trứng và tinh trùng đã duy trì được số lượng NST trong tế bào thường là 46 Bộ NST được bảo tồn và di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Thế hệ con cái bao giờ cũng thừa hưởng các đặc tính di truyền thông qua gen của cả bố và mẹ với xác suất ngang nhau Điều đó có nghĩa là

Trang 18

Khóa học 2014-2016

23 NST từ bố được truyền cho con thông qua tinh trùng, 23 NST từ mẹ truyền cho con thông qua trứng Các locus STR nằm trên NST cũng theo đó mà được di truyền qua các thế hệ (hình 1.1)

Hình 1.1 Sơ đồ minh hoạ các khả năng di truyền một số alen thuộc locus STR từ

bố, mẹ cho con theo định luật Mendel (8 - 12: một số alen thuộc một locus STR nào đó )

[10]

Vai trò các STR trong nhận dạng cá thể người

Các locus STR trở thành các chỉ thị ADN phổ biến trong nhận dạng cá thể bởi đặc tính dễ dàng nhân bội đồng thời nhờ kỹ thuật PCR, không phải thực hiện nhân bội riêng rẽ như đối với các locus VNTR Đặc điểm này là do các alen của locus STR nằm trong một khoảng kích thước tương đương, khoảng vài trăm bp, các đơn vị lặp lại có kích thước nhỏ Hơn nữa, số đơn vị lặp của các chỉ thị STR rất khác nhau giữa các cá thể, điều này làm cho chúng trở thành công cụ hữu hiệu trong nhận dạng cá thể

Với mục đích sử dụng cho nhận dạng cá thể, điểm quan trọng đối với các

chỉ thị ADN là có tính đa hình càng cao càng tốt hoặc một số chỉ thị có tính đa hình thấp hơn có thể kết hợp với các chỉ thị khác để đạt được đủ độ tin cậy phân biệt giữa các cá thể

Bộ STR đầu tiên được nghiên cứu phát triển phục vụ cho ngành pháp lý là bộ STR 4 trình tự STR : TH01, FES/FPS, vWA và F13A Đây là bộ chỉ thị thế hệ thứ nhất Xác suất hai cá thể trùng nhau khi sử dụng bộ KIT bốn gen này khoảng 1/10.000 Bộ KIT thế hệ thứ hai gồm 6 locus là TH01, vWA, FGA, D8S1179,

Trang 19

Khóa học 2014-2016

D18S51 và D21S11 với xác suất hai cá thể trùng nhau 1/50.000.000 Những locus nêu trên đều sử dụng các phương pháp đọc tín hiệu huỳnh quang để phát hiện nên đòi hỏi kinh phí trang bị tương đối lớn và đồng bộ [9]

Từ năm 1996 phòng thí nghiệm của FBI đã hỗ trợ cho việc nghiên cứu và xây dựng cơ sở dữ liệu từ 13 đoạn FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, D18S51, CSF1PO, D8S1179 và D21S11 13 locus đánh dấu này được chia thành 4 nhóm chính:

- Nhóm thứ nhất: trình tự lặp lại chứa các trình tự giống nhau: TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D16S539

- Nhóm thứ hai: Một vài trình tự có những alen không đồng nhất: TH01, D18S51, D7S820

- Nhóm thứ ba: Cấu trúc kép với các alen khác nhau:vWA, FGA, D3S1358, D8S1179

- Nhóm thứ tư: Cấu trúc dạng lặp dạng phức: D21S11

Cho đến nay, số lượng các locus trong bộ KIT nhận dạng cá thể thương mại

có thể lên tới 30 locus, phổ biến sử dụng là các bộ KIT 16 locus [10]

1.1.3.2 Mini-STR

Trong thực tế áp dụng, việc nhận dạng cá thể không phải lúc nào cũng được thực hiện đối với nguồn mẫu chuẩn (như: các mẫu được thu trực tiếp từ cơ thể, các mẫu sinh học còn giữ nguyên vẹn về cấu trúc và đủ hàm lượng ADN cho phân tích một hồ sơ STR đầy đủ) Rất nhiều trường hợp việc nhận dạng cá thể phải thực hiện với các mẫu sinh học đã biến tính một phần hoặc ở tình trạng phân hủy mạnh (mẫu dấu vết hình sự, mẫu hài cốt lâu năm….) Do đó, các nhà nghiên cứu đã đưa ra giải pháp: thiết kế các bộ mồi PCR nhằm nhân bội được các locus STR với kích thước sản phẩm PCR (amplicon) tạo ra rất ngắn, khoảng trên dưới 100 bp (hình 1.2) để phù hợp với việc phân tích các mẫu ADN biến tính [36]

Việc phân tích một số locus mini-STR này sẽ góp phần bổ sung thông tin về

hồ sơ ADN (kiểu gen) cá thể trong những trường hợp phân tích STR thông thường không thu được một hồ sơ kiều gen đầy đủ Tỉ lệ thành công của các hệ Mini-STR

so với các hệ STR “truyền thống” trên các mẫu bị phân hủy mạnh đã được chứng

Trang 20

Khóa học 2014-2016

minh: Mini-STR đã cung cấp một hồ sơ ADN với thông tin di truyền gấp 3 lần và đầy đủ hơn hệ STR tiêu chuẩn Các nghiên cứu trên mẫu bị phân hủy mạnh cho thấy rằng các locus mini-STR có kích thước dưới 120 bp đều cho kết quả tốt, các trình tự trên 150 bp thường khó thu được kết quả hơn [51]

Hình 1.2: Hình minh họa vị trí thiết kế mồi Mini-STR và các bộ mồi multiplex Mini-STR (A): Cặp mồi mini-STR được thiết kế lại nhằm tiếp cận gần sát đến vùng nhân lặp hơn các cặp mồi STR thông thường, do đó thu nhỏ kích thước đoạn được nhân bản, tạo điều kiện nhân bội những mẫu ADN bị thoái hóa (B): So sánh kích thước đoạn được nhân bản của hai bộ KIT: AmpFlSTR® MiniFiler™ và Identifiler® kit (Applied Biosystems) [6]

Việc nhân bội ADN sử dụng các locus mini STR phù hợp với các mẫu đã

biến tính, tuy nhiên cũng có một số hạn chế nhất định Thứ nhất, khó có thể kết hợp

nhiều locus mini-STR trong cùng một phản ứng multiplex và phân tách đọc kết quả

tự động bằng điện di mao quản Do là khi mồi được thiết kế để tiếp cận gần hơn vùng nhân lặp, kích thước của các trình tự nhân bội đều bị giảm xuống cùng chung một phạm vi hẹp hơn (khoảng 100 – 150 bp) [10], vì vậy đọc kết quả trên thiết bị

điện di mao quản sẽ chỉ giới hạn được một số locus trong mỗi kênh màu Thứ hai,

theo nghiên cứu của Parsons và cộng sự, trên một mẫu đã bị phân hủy cao cho thấy,

Vùng nhân lặp của STR

Mồi mini STR

Mồi mini STR Mồi PCR

thông thường

Mồi PCR

thông thường Header Page 20 of 126

Định dạng
Số trang	41
Dung lượng	1,01 MB