Nghiên cứu sản xuất đường Erythritol từ nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam

Lời cảm ơn tiếp theo tôi xin gửi tới các Cán bộ của Trung tâm Hóa sinh công nghiệp và môi trường - Viện Công nghiệp thực phẩm đã chia sẻ, hướng dẫn và tạo những điều kiện tốt nhất để

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Ánh Thao

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ĐƯỜNG ERYTHRITOL

TỪ NẤM MEN MONILIELLA PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

Footer Page 1 of 126

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Ánh Thao

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ĐƯỜNG ERYTHRITOL

TỪ NẤM MEN MONILIELLA PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Khóa 2014 - 2016

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng cảm ơn và kính trọng sâu sắc tới PGS.TS Lê Đức Mạnh và TS Lê Hồng Điệp đã tận tình hướng dẫn, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn này

Lời cảm ơn tiếp theo tôi xin gửi tới các Cán bộ của Trung tâm Hóa sinh công nghiệp và môi trường - Viện Công nghiệp thực phẩm đã chia sẻ, hướng dẫn và tạo những điều kiện tốt nhất để tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn của mình

Tôi c ng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy giáo, cô giáo của Khoa Sinh học c ng như các thầy, các cô thuộc Bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức nền tảng bổ ích

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố m , ông bà và những người thân trong

gia đình đã luôn dành tình cảm và động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập

Và cuối cùng tôi xin cảm ơn các bạn bè đã luôn ủng hộ và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

Hà Nội, tháng 12 năm 2016

Học viên

Nguyễn Thị Ánh Thao

Footer Page 3 of 126

Khóa 2014 - 2016 i

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đường erythritol 3

1.1.1 Cấu tạo và tính chất của đường erythritol 3

1.1.2 Lợi ích cho sức khỏe của đường erythritol 3

1.1.3 Ứng dụng của đường erythritol 4

1.2 Công nghệ sản xuất ertythritol từ tinh bột 4

1.3 Tình hình sản xuất erythritol trên thế giới và ở Việt Nam 6

1.4 Nấm Moniliella 7

1.4.1 Đặc điểm cơ bản của nấm men Moniliella 7

1.4.2 Ưu điểm và ứng dụng của nấm men đen Moniliella trong sản xuất erythritol 9

1.4.3 Con đường sinh tổng hợp đường erythritol của nấm men 10

1.5 Một số phương pháp thu nhận erythritol trong dịch lên men 14

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng, nguyên vật liệu nghiên cứu 17

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.2 Các môi trường nghiên cứu 17

2.1.3 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 18

2.1.4 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Phương pháp lên men sinh tổng hợp erythritol 19

2.2.2 Phương pháp sắc ký HPLC 19

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm men Moniliella 20

2.2.4 Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình

sinh tổng hợp đường erythritol 22

2.2.5 Các phương pháp làm sạch dịch lên men thu hồi đường erythritol 23

2.2.6 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình kết tinh 24

2.2.7 Phương pháp kiểm tra một số chỉ tiêu chất lượng đường erythritol 26

Footer Page 4 of 126

Khóa 2014 - 2016 ii

Chương 3 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 27

3.1 Sàng lọc các chủng nấm men đen Moniliella có khả năng sinh tổng hợp đường erythritol 27

3.2 Đặc điểm cơ bản của chủng nấm men M megachiliensis TBY 3406.6 30

3.2.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng TBY 3406.6 30

3.2.2 Đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng M megachiliensis TBY 3406.6 31

3.3 Nghiên cứu các điều kiện lên men sinh tổng hợp erythritol của chủng

M megachiliensis TBY 3406.6 từ dịch đường thủy phân là sản phẩm của

quá trình dịch hóa đường hóa tinh bột sắn 33

3.3.1 Nghiên cứu lựa chọn hàm lượng đường glucose 33

3.3.2 Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ cao nấm men 35

3.3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ ure 36

3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 37

3.3.5 Ảnh hưởng của pH 37

3.3.6 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lắc 38

3.3.7 Ảnh hưởng của thời gian 39

3.4 Nghiên cứu quá trình làm sạch và thu hồi eyrthritol 41

3.4.1 Nghiên cứu loại bỏ tạp chất trong dịch lên men - Xử lý than hoạt tính (khử mùi, khử màu) 41

3.4.1.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ than hoạt tính 41

3.4.1.2 Ảnh hưởng của thời gian xử lý chất hấp phụ 42

3.4.2 Xử lý dịch đường trên cột trao đổi ion (tẩy khoáng) 42

3.4.3 Nghiên cứu điều kiện kết tinh đường erythritol 43

3.4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khô hòa tan tới quá trình kết tinh 43

3.4.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ mầm tinh thể tới quá trình kết tinh 44

3.4.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình kết tinh 46

3.4.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến quá trình kết tinh 46

Footer Page 5 of 126

Khóa 2014 - 2016 iii

3.4.4 Nghiên cứu điều kiện sấy và thu hồi sản phẩm 48

3.4.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến chất lượng đường 48

3.4.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian sấy kết hợp với các mức

nhiệt độ đến độ ẩm của đường thu được 48

3.5 Sơ đồ quy trình công nghệ 50

3.6 Sản xuất thử nghiệm quy mô phòng thí nghiệm 51

3.7 Phân tích đánh giá sản phẩm 54

3.7.1 Đánh giá cảm quan đường erythritol thu nhận được 54

3.7.2 Phân tích đánh giá thành phần sản phẩm đường erythritol 54

3.7.3 Đánh giá chỉ tiêu vi sinh vật 54

3.7.4 Đánh giá chỉ tiêu kim loại nặng 55

3.8 Một số ứng dụng đường erythritol vào những sản phẩm thương mại 55

3.8.1 Qui trình sản xuất viên nén đường erythritol 56

3.8.2 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm nước uống có thành phần erythritol 57

KẾT LUẬN 60

KIẾN NGHỊ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHỤ LỤC 65

Footer Page 6 of 126

Khóa 2014 - 2016 iv

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt

AMG

oBx CFU CNTP CTPT

DE DNA DNS DSMZ

FAO FCB

GI GSFA HFCS HFCS HPLC

JECFA KLPT KNU NADPH PCR rARN TCVN v/v VFA w/v w/w WHO

YM

AOAC

Viết đầy đủ

Amyloglucosidase (Glucoamylase) Độ Brix - Nồng độ chất khô hòa tan Colony Forming Unit

Công nghiệp thực phẩm Công thức phân tử Dextrose equivalentDeoxyribonucleic acid acid dinitrosalicylic

Ký hiệu chủng giống thuộc Bộ sưu tập Vi sinh vật và Tế bào của Đức, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Food and Agriculture Organization

Frozen Carbonated Beverage Glycemic index

General High fructose corn syrup High fructose corn syrup High-performance liquid chromatography of high-pressure liquid chromatography

Joint Expert Committee on Food Additives Khối lượng phân tử

Kilo Novo Unit alpha-amylase Nicotinamide adenine diculeotide phosphate Polymerase Chain Reaction

ARN riboxom Tiêu chuẩn Việt Nam Volume/volume Volatile fatty acids Weigh/volume Weigh/weigh World Health Organisation Yeast Malt

Association of Official Analytical Chemist

HSCH Hiệu suất chuyển hóa

Footer Page 7 of 126

Khóa 2014 - 2016 v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 So sánh đặc điểm hình thái của chi Moniliella với một số chi thường gặp

có thể bị nhầm lẫn với Monilliela [4] 8

Bảng 2.1 Bảng thành phần dịch đường thủy phân sau khi cô đặc 120 phút 17

Bảng 2.2 Danh sách các nguồn cơ chất 20

Bảng 3.1 Hàm lượng erythritol tích l y của các chủng nấm men đen sau 8 ngày nuôi cấy trong môi trường chứa 20% 27

Bảng 3.2 Hàm lượng erythritol tích l y trong dịch lên men của các chủng thuộc loài M megachiliensis 28

Bảng 3.3 Khảo sát sơ bộ sự sinh tổng hợp erythritol của 2 chủng TBY 3406.6 và TBY 3438.2 30

Bảng 3.4 Bảng đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng TBY 3406.6 31

Bảng 3.5 Một số đặc điểm cơ bản của M megachiliensis TBY 3406.6 31

Bảng 3.6 Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon của chủng M megachiliensis

TBY 3406.6 32

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch đường đến quá trình chuyển hóa erythritol

của chủng M megachiliensis TBY 3406.6 34

Bảng 3.8 Đánh giá dịch sau khi lên men của chủng sau 13 ngày nuôi cấy 41

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ than hoạt tính 42

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của thời gian xử lý than hoạt tính 42

Bảng 3.11 Thành phần dịch đường sau khi làm sạch 43

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ chất khô hòa tan quá trình kết tinh 44

Bảng 3.13 Kết quả ảnh hưởng của thời gian đến quá trình kết tinh 47

Bảng 3.14 Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sấy (sấy trong 3 giờ) 48

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của thời gian sấy đến độ ẩm của đường 49

Bảng 3.16 Chỉ tiêu cảm quan đường erythritol 54

Bảng 3.17 Kết quả các chỉ tiêu đánh giá sản phẩm đường erythritol 54

Bảng 3.18 Các chỉ tiêu vi sinh vật của erythritol 55

Bảng 3.19 Hàm lượng kim loại nặng 55

Footer Page 8 of 126

Khóa 2014 - 2016 vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức hóa học của erythritol [10] 3

Hình 1.2 Hình ảnh khuẩn lạc nấm men Moniliella suavedens var suavedens

nuôi cấy trên đĩa thạch [7] 7

Hình 1.3 Hình ảnh sinh sản nảy chồi của nấm men đen [2] 8

Hình 1.4 Quá trình sinh tổng hợp erythritol của nấm men và vi khuẩn [26] 11

Hình 1.5 Tác động của 2 enzym chuyển hóa Transketolase và Transaldoase trong con đường pentose – phosphate [26] 12

Hình 1.6 Con đường pentose phosphate chuyển hóa đường glucose thành đường erythritol [26] 13

Hình 3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ dịch đường tới khả năng tích l y erythritol của chủng

M megachiliensis TBY 3406.6 34

Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ cao nấm men đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng TBY 3406.6 35

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ cao nấm men đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng TBY 3406.6 36

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng tích l y erythritol của chủng TBY 3406.6 37

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào pH 38

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tốc độ khuấy lắc đến khả năng sinh tổng hợp erythritol 39

Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào thời gian lên men 40

Hình 3.8 Hình ảnh đường erythritol kết tinh ở các nồng độ khác nhau trong cùng khoảng thời gian 16 giờ 44

Hình 3.9 Quá trình kết tinh khi lượng mầm tinh thể bổ sung thay đổi 45

Hình 3.10 Đồ thị mối liên hệ giữa lượng mầm tinh thể và hiệu suất kết tinh 45

Hình 3.11 Đồ thị sự ảnh hưởng của nhiệt độ kết tinh đến hiệu suất kết tinh đường 46

Hình 3.12 Quá trình kết tinh đường theo thời gian 47

Hình 3.13 Sơ đồ quy trình sản xuất erythritol quy mô phòng thí nghiệm 50

Footer Page 9 of 126

Khóa 2014 - 2016 vii

Hình 3.14 Quá trình lên men thu dịch len men sử dụng chủng 3406.6 51

Hình 3.15 Dịch lên men trước và sau ly tâm 52

Hình 3.16 Dịch lên men được lọc qua than hoạt tính và chất trợ lọc 52

Hình 3.17 Quá trình kết tinh đường erythritol 53

Hình 3.18 Đường được rửa sau kết tinh 53

Hình 3.19 Sản phẩm đường erythritol 53

Hình 3.20 Quy trình sản xuất viên nén đường erythritol 56

Hình 3.21 Các ví viên nén đường erythritol 57

Hình 3.22 Quy trình sản xuất nước uống quả dâu tằm erythritol 58

Hình 3.23 Sản phẩm thử nghiệm nước dâu tằm có chứa thành phần erythritol 59

Footer Page 10 of 126

Khóa 2014 - 2016 1

MỞ ĐẦU

Thừa cân, béo phì, tiểu đường và những hệ lụy của nó đang là một vấn nạn

về sức khỏe con người của thế kỉ 21, nguyên nhân sâu xa của nó là việc sử dụng các thực phẩm giàu dinh dưỡng, nhiều đường, mất cân bằng trong thực đơn hàng ngày Bên cạnh các biện pháp điều trị thì việc sử dụng các thực phẩm chức năng hỗ trợ

c ng rất hiệu quả trong việc phòng và hỗ trợ những căn bệnh trên Đường thấp năng lượng là một bộ phận quan trọng trong nhóm thực phẩm chức năng, được tập trung nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây do có nhiều đặc tính có lợi cho sức khỏe như: chống béo phì, tiểu đường, sâu răng, kích thích tiêu hóa như là sorbitol, xylitol, maltitol, erythritol trong đó erythritol được biết đến là một rượu đường (hoặc polyol) 4 phân tử cacbon là loại đường thấp năng lượng với độ ngọt khoảng 70-80% so với sucrose trong khi năng lượng của nó chỉ là 0,24 cal/g tức là chỉ bằng 10% so với các đường chức năng polyol khác chính vì vậy erythritol được xem như một thực phẩm chức năng vàng cho bệnh nhân tiểu đường, béo phì và ăn kiêng

Với những nhu cầu thực tế hiện tại erythritol đang được nghiên cứu và sản xuất trên nhiều nước trên thế giới với quy mô công nghiệp Một trong những phương pháp tối ưu để sản xuất loại đường chức năng thấp năng lượng này là sử

dụng vi sinh vật, cụ thể là sử dụng các chủng nấm men Moniliella Moniliella là

nhóm đối tượng được đặc biệt quan tâm vì hiệu suất chuyển hóa đường để tạo erythritol tương đối cao, đây là nhóm vi sinh vật có nhiều đặc điểm có lợi khi sử dụng trong quy mô công nghiệp như là khả năng chịu nhiệt, khả năng chịu nồng độ muối cao và những đặc tính khác Ở Việt Nam vẫn chưa có một quy trình công nghệ nào cụ thể để sản xuất ra đường erythritol, các nghiên cứu về đặc tính c ng như các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu hồi, sản xuất ở Việt Nam của loại đường này vẫn còn rất ít

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài : “Nghiên cứu sản

xuất đường erythritol từ nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam” nhằm

Footer Page 11 of 126

Khóa 2014 - 2016 2

thu nhận đường erythritol và đưa ra quy trình sản xuất quy mô phòng thí nghiệm

từ đó tạo tiền đề cho sản xuất công nghiệp phục vụ cho việc ứng dụng vào việc sản xuất các loại thực phẩm chức năng ít năng lượng nhằm hỗ trợ và điều trị cho người ăn kiêng, béo phì và tiểu đường và trong sinh hoạt sử dụng đường của mỗi người hằng ngày

Footer Page 12 of 126

1.1.1 Cấu tạo và tính chất của đường erythritol

Erythritol có màu trắng, không hút ẩm, có dạng bột mịn hay tinh thể với vị ngọt nh và có hình dạng giống sucrose Erythritol là một đường đa chức với 4C Kích thước phân tử nhỏ và có nhiều tính chất độc đáo [10]

CTPT: C4H10O4 được thể hiện ở hình 1.1

Hình 1.1 Công thức hóa học của erythritol [10]

Erythritol có tính ổn định cao, không có đầu khử nên bền với nhiệt và axit

Nó không bị phân hủy trong cả hai môi trường axit và kiềm Không hòa tan trong một số dung môi phân cực khác và thường được sử dụng kết hợp với maltitol [26]

1.1.2 Lợi ích cho sức khỏe của đường erythritol

Không calo

Erythritol được coi là một loại chất ngọt không cung cấp calo, vì lượng calo trong 1 gam rất thấp [13, 30]

Footer Page 13 of 126

Khóa 2014 - 2016 4

Lợi ích về răng miệng

Lợi ích về răng miệng của erythritol đã được kiểm nghiệm bằng cách: Trong

ống nghiệm, tiến hành ủ erythritol với một loạt các loài Streptococcus (liên cầu khuẩn) Trong thử nghiệm vi sinh vật này cho thấy rằng Streptococcus đã không thể

sản xuất mảng bám cao phân tử khi ủ trên erythritol, trái ngược với kết quả khi

Streptococcus được ủ trên sucrose [21]

Không làm gia tăng lượng đường huyết

Trong một nghiên cứu của nhóm tác giả F Bornet và cộng sự đã kiểm tra đường huyết ở các thời điểm từ khi bắt đầu sử dụng đến 3 giờ sau khi uống một liều duy nhất 1g erythritol/kg trọng lượng cơ thể, kết quả cho thấy erythritol không ảnh hưởng tới đường huyết và mức insulin [11] Kết luận này c ng được nhóm nghiên cứu Yoshida và cộng sự đưa ra [37] Sự an toàn của erythritol đã được các tổ chức WHO/FAO Uỷ ban chuyên gia về phụ gia thực phẩm (JECFA) xác nhận vào 21-24 tháng 6 năm 1999 Erythritol c ng đã được Cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm Hoa

Kỳ công nhận là đồ gia vị trong thực phẩm kể từ năm 2001 [18]

1.1.3 Ứng dụng của đường erythritol

Erythritol được sử dụng an toàn như là một chất tạo ngọt không năng lượng

ở nhiều nước do không có khả năng trao đổi chất trong cơ thể Các số liệu khuyến cáo chỉ ra rằng erythritol không gây ra phản ứng bất lợi nào khi sử dụng với các thực phẩm khác Dựa trên các số liệu nghiên cứu công bố, erythritol được chứng nhận là an toàn khi sử dụng trong thực phẩm Erythritol là thành phần trong khẩu phần ăn của con người từ hàng nghìn năm nay khi có mặt trong lê, nho… và các thực phẩm lên men: rượu, nước tương

1.2 Công nghệ sản xuất ertythritol từ tinh bột

Đường erythritol đã được đưa vào sản xuất quy mô lớn bằng phương pháp hóa học và bằng quá trình lên men vi sinh vật Erythritol có thể được tổng hợp từ tinh bột biến tính bằng phản ứng hóa học ở nhiệt độ cao với sự có mặt của hóa chất

Footer Page 14 of 126