Đánh giá đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết với hải miên tại vùng biển Đà Nẵng Việt Nam thông qua nghiên cứu Metagennomics bằng kỹ thuật 16s rRNA Miseq Sequencing

Bảng 1: Phần mềm, các công cụ dựa trên Web và các cơ sở dữ liệu sử dụng để phân tích metagenome Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA metagenome Bảng 3.2: Kết quả

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN MẠNH HÙNG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG SINH HỌC VI SINH VẬT LIÊN KẾT VỚI HẢI MIÊN TẠI VÙNG BIỂN ĐÀ NẴNG VIỆT NAM THÔNG QUA NGHIÊN CỨU METAGENOMICS

BẰNG KỸ THUẬT 16S rRNA MISEQ SEQUENCING

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan kết quả thể hiện trong bản luận văn này là công trình nghiên cứu thực

tế Toàn bộ số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực, khách quan, chƣa đƣợc công bố công khai bởi một ai khác

Tôi cũng xin được tỏ lòng cảm ơn chân thành tới các cán bộ thuộc phòng Công nghệ sinh học, viện Hoá sinh biển; Viện nghiên cứu khoa học Miền Trung, Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam đã có những hỗ trợ, đóng góp, tư vấn rất nhiệt tình giúp tôi hoàn thiện đề tài

Tôi thật sự rất biết ơn người thân, bạn bè và đồng nghiệp đã giành tình cảm, đặt niềm tin, hỗ trợ, động viên; đồng thời cũng là nguồn động lực to lớn góp phần giúp tôi hoàn thiện đề tài này Với sự hỗ trợ về kiến thức; các nguồn dữ liệu bổ sung; các công trình nghiên cứu khoa học có liên quan ở trong nước và trên thế giới-Tập thể các Thầy cô thuộc khoa sinh học; Bộ môn Vi sinh vật học và đặc biệt TS Phạm Đức Ngọc đã giúp tôi làm nên sự thành công của đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 27 tháng 12 năm 2016

Nguyễn Mạnh Hùng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 8

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 9

1.1 Sơ lược về hải miên 9

1.2 Vai trò và tầm quan trọng của vi sinh vật liên kết với hải miên 12

1.3 Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết với hải miên 18

1.4 Sơ lược về gen 16S rRNA 23

1.5 Sơ lược về MiSeq Sequencing 24

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined

2.1 VẬT LIỆU Error! Bookmark not defined 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.2.1 Tách DNA Error! Bookmark not defined 2.2.2 Thiết kế thư viện 16S rRNA cho MiSeq Error! Bookmark not defined 2.2.3 Phân tích thư viện 16S rRNA Error! Bookmark not defined CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 KẾT QUẢ Error! Bookmark not defined 3.1.1 Tách DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miênError! Bookmark not defined

3.1.2 Khuếch đại vùng siêu biến V4 của gen 16S rRNA và gắn barcodes Error! Bookmark not defined

3.1.3 Đa dạng các cộng đồng vi sinh vật liên kết hải miên biển Đà Nẵng Error! Bookmark not defined

3.2 THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined

TÀI LIỆU THAM KHẢO 28

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH

Hình 1.1: Hình thái Porifera, (Ruppert et al., 2004)

Hình 1.2: Cấu trúc cơ thể hải miên và các tế bào chức năng

Hình 1.3: Sinh sản hữu tính ở hải miên

Hình 1.4 Đa dạng vi khuẩn liên kết với hải miên (Tabares 2011)

Hình 1.5: Mô mesohyl của (A) Ancorina alata, hải miên có vi khuẩn liên kết phong

phú

Hình 1.6: Gene 16S rRNA có 9 vùng biến đổi nằm xen giữa các vùng bảo thủ

Hình 3.1: Điện di đồ DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên biển Đà Nẵng trên agarose gel 0,8% Lane 1: DN 9 ; lane 2: DN10; lane

Hình 3.2: Ảnh điện di PCR khuếch đại vùng V4 gen 16S rRNA của vi sinh vật liên kết hải miên biển Đà Nẵng M: Marker DNA 1 kb (GeneRuler™); 1, 2, 3: Sản phẩm PCR vùng V4 của mẫu DN9, DN10 và DN12, tương ứng

Hình 3.3: Sản phẩm PCR sau khi gắn barcodes M: Marker DNA 1 kb (GeneRuler™);

1, 2, 3: Mẫu DN9, DN10 và DN12, tương ứng

Hình 3.4: Đồ thị biểu hiện tỉ lệ vi khuẩn và cổ khuẩn liên kết với ba mẫu hải miên

Hình: 3.5: Đồ thị biểu hiện thành phần các ngành vi khuẩn liên kết với ba mẫu hải miên DN9; DN10; DN12

Hình: 3.6: Đồ thị biểu hiện thành phần các lớp vi khuẩn liên kết với ba mẫu hải miên DN9; DN10; DN12

Hình: 3.7: Đồ thị biểu hiện thành phần các bộ vi khuẩn liên kết với ba mẫu hải miên DN9; DN10; DN12

Hình: 3.8: Đồ thị biểu hiện thành phần các họ vi khuẩn liên kết với ba mẫu hải miên DN9; DN10; DN12

Hình: 3.9: Đồ thị biểu hiện thành phần các chi vi khuẩn liên kết với ba mẫu hải miên DN9; DN10; DN12

Bảng 1: Phần mềm, các công cụ dựa trên Web và các cơ sở dữ liệu sử dụng để phân tích metagenome

Bảng 3.1: Kết quả kiểm tra hàm lƣợng và độ tinh sạch của DNA metagenome

Bảng 3.2: Kết quả nhận dạng các mẫu hải miên

Bảng 3.3 Tóm tắt kết quả phân loại vi sinh vật liên kết với hải miên

Bảng 3.4: Kết quả phân loại vi sinh vật liên kết với hải miên ở mức giới

Bảng 3.5: Kết quả phân loại các ngành vi sinh vật liên kết với hải miên

Bảng 3.6 Kết quả phân loại các lớp vi sinh vật liên kết với hải miên

Bảng 3.7 Kết quả phân loại các bộ vi sinh vật liên kết với hải miên

Bảng 3.8 Kết quả phân loại các bộ vi sinh vật liên kết với hải miên

Bảng 3.9: Kết quả phân loại các chi vi sinh vật liên kết với hải miên

MỞ ĐẦU

Hải miên là vật chủ của nhiều vi sinh vật và vai trò của những vi sinh vật này thay đổi theo nguồn dinh dưỡng và sự cộng sinh với hải miên Dựa trên những nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật bằng các phương pháp như điện di gel gradient biến tính (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis_DGGE), giải trình tự gen 16S rRNA và lai huỳnh quang in-situ (Fluorescense In Situ Hybridization_FISH), người ta nhận thấy ngoài các thành viên của Archaea còn có tới hơn 25 ngành vi khuẩn liên kết với hải miên Trong số đó

có Proteobacteria, Nitrospira, Cyanobacteria, Bacteriodetes, Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, Poribacteria và Verrucomicrobia Chưa rõ

về virus trong hải miên, mặc dù các hạt giống như virus được phát hiện trong nhân tế bào của Aplysina (Verongia) cavernicola Những nghiên cứu về vi sinh vật liên kết với hải miên cho thấy vi sinh vật có thể chiếm đến 40% - 50% thể tích hải miên và cộng đồng này đặc trưng cho từng hải miên [40] Mối liên hệ giữa vi sinh vật với hải miên gần đây đang được quan tâm nghiên cứu do: (i) phát hiện nhiều hải miên có liên kết với cộng đồng vi khuẩn dày đặc và đa dạng, (ii) chúng là một nguồn giàu các chất chuyển hóa hoạt tính sinh học có ý nghĩa trong lĩnh vực dược phẩm và công nghệ sinh học [50]

Việc phân lập, nuôi cấy vi sinh vật sinh trưởng trong điều kiện đặc biệt thường khó khăn, đặc biệt vi sinh vật liên kết với các dạng sống khác như hải miên bởi mối tương tác giữa chúng khá phức tạp Cũng không thể khai thác hải miên để tách chiết các hoạt chất vì nguồn nguyên liệu này có hạn, khó phục hồi và gây hủy hoại môi trường

Đề tài này được thực hiện với mục đích nghiên cứu sự đa dạng của vi sinh vật liên kết với hải miên biển trên cơ sở phân tích dữ liệu metagenome của vi sinh vật Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp nguồn cơ sở dữ liệu có giá trị cho các nghiên cứu tiếp theo về mối liên hệ giữa vi sinh vật-hải miên biển

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Sơ lược về hải miên

Hải miên (bọt biển) là động vật ăn lọc, đa bào, cổ xưa thuộc ngành động vật thân lỗ

(Porifera) Ngành Porifera là một nhóm đa ngành bao gồm ba lớp chính, được đặc

trưng bởi cơ cấu gai của chúng: (1) Hexactinellida (glass sponges -bọt biển thủy tinh) chứa gai silic trong cấu trúc hexactine; (2) Calcarea (calcareous sponges -bọt biển vôi) chứa gai vôi (calcareous spicules); (3) Demospongiae (demosponges) có khoảng 85% các loài được công nhận hiện nay, thường có một bộ khung khoáng chất bao gồm gai silic (siliceous spicules) Tuy nhiên, một số loài trong Demospongiae không chứa bộ khung [21] Hải miên có cấu trúc cơ thể đơn giản nhất trong tất cả các loài động vật đa bào: thiếu cơ quan và mô thực; không có cơ, hệ thần kinh, hệ tiêu hóa, hệ tuần hoàn, cơ quan bên trong, và khả năng vận động Các tế bào của hải miên sắp xếp có thứ tự gồm nhiều lớp tế bào chuyên biệt (Hình 1.2) phù hợp với lối sống ăn lọc Hầu hết hải miên

có bộ khung cứng được hình thành từ canxi cacbonat và các gai silic dioxide Các sợi Collagen và spongin có tác dụng hỗ trợ thêm sự cứng chắc và đàn hồi cho bộ khung [21] Ngoài các loại tế bào xốp khác nhau, mật độ cao của các vi sinh vật cũng được tìm thấy trong các mesohyl của một số loài hải miên Độ sâu phổ biến tìm thấy hải miên từ 5-10m

Động vật thân lỗ, trong đó có hải miên thường ăn bằng cách hút nước qua các lỗ chân lông Một dòng chảy được duy trì liên tục qua cơ thể để lấy thức ăn, ôxy cũng như loại

bỏ chất thải Khi nước đã được lọc qua các khoang choanocyte, nó bị thải ra khỏi cơ thể qua các osculum, về cơ bản là vô trùng [43, 44] Hầu hết hải miên có thể bơm một lượng nước tương đương với khối lượng cơ thể của nó mỗi 5 giây [47], điều này có thể bằng vài ngàn lít mỗi ngày [55] Mối liên hệ giữa vi sinh vật với hải miên gần đây đang được quan tâm nghiên cứu do: (i) phát hiện nhiều hải miên có liên kết với cộng đồng vi

khuẩn dày đặc và đa dạng, (ii) chúng là một nguồn giàu các chất chuyển hóa hoạt tính sinh học có ý nghĩa trong lĩnh vực dược phẩm và công nghệ sinh học [50]

*) Cấu trúc chung của một cơ thể hải miên:

Porifera có 3 dạng hình thái cơ thể từ đơn giản (asconoid và syconoid) đến phức tạp (leuconoid) được hình thành bằng cách thay đổi mức độ gấp của màng cơ thể bên trong và sự thay đổi phức tạp của hệ thống kênh [9]

Pinacoderm: Bề mặt bên ngoài, được hình thành bởi các tế bào biểu mô được gọi là

pinacocytes Ở lớp ngoài này nước sẽ được rút ra qua các lỗ (Ostia)

Mesohyl:Một matrix ngoại

bào giữa pinacoderm và choanoderm có vai trò như một hệ khung dàn, chiếm phần lớn cơ thể hải miên

Các hạt thức ăn được chuyển từ choanocytes tới archaeocytes di động (hoặc amoebocytes) để thực bào Amoebocyte là nhóm các tế bào toàn năng (totipotent), thực hiện việc phân phối dinh dưỡng từ Choanocytes tới các tế bào khác; giúp các tế bào trứng (Oocyte) phát triển, chuyển tinh trùng từ choanocytes tới các tế bào trứng; có khả năng biệt hóa thành các loại tế bào có chức năng khác nhau Ví dụ như collencytes, sản xuất ra các sợi collagen, sclerocytes hình thành spicule và spongocytes sản xuất spongin

Hình 1.2: Cấu trúc cơ thể hải miên và các tế bào chức năng

Hình 1.1: Hình thái Porifera, (Ruppert et al., 2004)

Choanoderm: Một lớp tế bào bên trong hình thành bởi các tế bào hình roi

(choanocytes) cho phép nước đi qua hệ thống aquiferous Hệ thống này được hình thành bởi một loạt các kênh, dẫn đến một kênh chính (atrium) Nước ra khỏi cơ thể hải miên thông qua một lỗ thoát cuối cùng (osculum) Vi sinh vật và thức ăn được lọc

ra khỏi nước tuần hoàn (circulating water) bởi choanocytes

Với tổ chức đơn giản nhưng hải miên là động vật đa bào thực Ngoài cấu trúc cố định của cơ thể, hải miên còn thể hiện khả năng biến đổi hình thái tuyệt vời Cơ thể chúng xuất hiện nhiều màu sắc do sự hiện diện của các tế bào sắc tố xốp và/hoặc từ vi khuẩn lam cộng sinh và vi tảo Hải miên đa dạng về hình thái, từ dạng các lớp đóng cặn chỉ

vài mm chiều cao tới các dạng khổng lồ, ví dụ: Xestospongia muta có đường kính và

chiều cao hơn một mét [35]

*) Sinh sản ở hải miên

Hải miên có 2 hình thức sinh sản bao gồm vô tính và hữu tính

Sinh sản vô tính: Xuất hiện các chồi mọc ra từ cơ thể trưởng thành Các chồi trải qua quá trình phát triển, tăng lên về kích thước cuối cùng tách khỏi cơ thể ban đầu và phát triển thành cơ thể mới Ở hình thức sinh sản hữu tính, hải miên không có sự chia tách

cụ thể về giới tính Cả hai loại tế bào trứng và tinh trùng đều có nguồn gốc từ một cơ thể hải miên Các tế bào tinh trùng được phóng thích vào môi trường nước, sau đó sẽ thụ tinh với tế bào trứng ở cơ thể hải miên

khác Ấu trùng hình thành sẽ phát triển và

tách khỏi cơ thể mẹ nhờ sự tác động của

nước Đây là giai đoạn duy nhất cho sự vận

động của hải miên Ấu trùng sau đó sẽ bám

vào bề mặt cứng và phát triển thành cơ thể

trưởng thành Trong suốt giai đoạn đó hải

miên không có sự di chuyển Hình 1.3: Sinh sản hữu tính ở hải miên

1.2 Vai trò và tầm quan trọng của vi sinh vật liên kết với hải miên

Môi trường biển được chứng minh là nguồn đa dạng sinh học và hóa học giàu có Được biết có tới 109 taxa vi khuẩn trên trái đất, trong đó 106 taxa là từ đại dương Sự phân bố của vi sinh vật biển là 105 tế bào/ml và dự báo các đại dương chứa 3.6x1029 tế bào vi sinh vật, với phần lớn sinh khối là từ vi khuẩn, archaea, protist và nấm đơn bào Trong

nước biển vi khuẩn chiếm ưu thế thuộc về một số loài: Pseudomonas sp., Vibrio sp., Achromobacter sp., Flavobacterium sp., và Micrococcus sp

Cộng đồng vi sinh vật biển vô cùng đa dạng, phong phú và phức tạp Vì biển là môi trường cực đoan, nơi có sự đa dạng về các điều kiện sinh thái dẫn đến có rất nhiều cộng đồng vi sinh vật đặc trưng cho từng điều kiện sống khác nhau, như vi sinh vật ưa nhiệt,

ưa acid, ưa kiềm, … Vi sinh vật biển là các nhà sản xuất sinh khối đầu tiên trong đại dương, thu nhận ánh sáng và cố định cacbon, và là những tác nhân chuyển hoá dinh dưỡng đầu tiên Vi sinh vật biển cũng được biết tham gia vào chu trình toàn cầu của các nguyên tố sinh học như nitơ, cacbon, oxy, photpho, sắt, lưu huỳnh và các yếu tố vi lượng Do tính linh hoạt của các khả năng sinh hóa và sinh khối to lớn của chúng trong

hệ sinh thái biển, chúng được tin rằng là các thành phần chính chịu trách nhiệm cho việc duy trì các chu trình này, giúp ổn định các hệ sinh thái

Hải miên là động vật có đời sống ở biển, là vật chủ của nhiều vi sinh vật khác nhau Vì vậy cộng đồng vi sinh vật có liên kết với hải miên cũng như cộng đồng vi sinh vật tồn tại ở những vật chủ khác đều là những thành phần tạo nên sự đa dạng, phong phú, phức tạp về hệ sinh thái vi sinh vật biển nói chung Đến nay, nhiều công trình khoa học trong nước và trên thế giới đã có những công bố về số lượng thành phần các vi sinh vật liên kết với hải miên lên tới hơn 25 ngành vi khuẩn khác nhau

Người ta cũng phát hiện ra nhiều điều thú vị khi nghiên cứu về mối quan hệ giữa vi khuẩn với hải miên Nhiều dẫn chứng đã được đưa ra đều khẳng định vai trò to lớn và

vô cùng quan trọng mà những dạng sống có kích thước vô cùng nhỏ bé này mang lại

nhiều lợi ích cho chính vật chủ của nó cũng như cho con người Qua đó giúp chúng ta hiểu rõ hơn về quá trình tiến hoá, quá trình trao đổi chất, các chu trình chuyển hoá vật chất, đa dạng sinh học và cân bằng sinh thái[4]; [16]; [38] Ở từng đối tượng cụ thể, hệ

vi sinh vật có những vị trí và vai trò khác nhau

1.2.1 Đối với hải miên:

Chức năng cộng sinh của vi khuẩn liên kết với hải miên gồm thu dinh dưỡng, ổn định khung hải miên, xử lý chất thải trao đổi chất, sản sinh các chất trao đổi thứ cấp, quang hợp, oxy hoá metan, nitorat hoá, cố định nitơ, khử sulphat và khử halogen (dehalogenation)

Một số nghiên cứu đã tìm thấy sự xuất hiện của chu trình lưu huỳnh ở hai loài hải miên

nước lạnh Geodia barrette và Aplysina aerophoba Chu trình này được thực hiện trong

điều kiện vắng mặt oxy, lúc quá trình bơm đẩy không hoạt động ở hải miên Ở hải

miên Geodia barrette, người ta ước tính được tỉ lệ khử sulphur là rất cao lên tới

1200nmol/cm3 hải miên/ngày [22] Các gen mã hoá cho enzyme APS (aprA)-một enzyme quan trọng trong việc khử sulphate và oxy hoá sulphur được tìm thấy ở hải

miên nước sâu Polymastia corticata thuộc biển Caribe [36] Cả hai loại vi khuẩn oxy

hoá sulphur và khử sulphate đều được phát hiện ở nhiều loài hải miên [50] Vi khuẩn

khử sulphate thuộc các chi Desulfoarculus, Desulfomonile Chi Syntrophus được tìm thấy ở hải miên nước lạnh Geodia barretti [22]

Quá trình oxy hoá metan cũng được tìm thấy ở nhiều loài hải miên được khảo sát

Chẳng hạn, loài hải miên ăn thịt sống ở vùng nước sâu Cladorhiza methanophila được

phát hiện có liên quan đến hai nhóm vi khuẩn, trong số đó có ít nhất một loại là vi khuẩn methane (methanotrophic) [52, 53] Dehalogenation (khử halogen) cũng được chứng minh có xuất hiện ở hải miên có cộng sinh với vi sinh vật Một số hải miên được biết là nguồn tự nhiên cung cấp các hợp chất brome như bromophenols và

bromoindoles Ở hải miên Aplysina aerophoba khử halogen có thể được thực hiện qua

trung gian là vi khuẩn [2]

Với lối sống dị dưỡng, quá trình chuyển hoá cacbon ở hải miên có thể diễn ra bằng cách tiêu thụ trực tiếp vi khuẩn từ nước biển hoặc sử dụng nguồn cacbon hữu cơ được hấp thu từ vi khuẩn cộng sinh với hải miên [62] Trong môi trường nghèo dinh dưỡng, hải miên vẫn có thể phát triển do cộng sinh với vi khuẩn quang hợp, đặc biệt là vi

khuẩn lam Synechococcus spongiarum [14] Ở khu vực có sự xuất hiện của những rạn

san hô, nơi mà dinh dưỡng hoà tan và các vật chất hữu cơ khan hiếm, hải miên sẽ phải đối mặt với môi trường sống thiếu nitơ Trong trường hợp này, nhóm vi khuẩn tự dưỡng (cyanobacteria) và dị dưỡng cộng sinh với hải miên [60] sẽ là nguồn bổ sung nitơ cho hải miên thông qua quá trình cố định nitơ từ khí quyển [37] Bằng chứng đầu tiên để kiểm định điều này là việc phát hiện ra hoạt tính của enzyme nitrogenase có trong hải miên được khảo sát ở Biển đỏ [60] Bằng chứng tiếp theo được phát hiện trong những năm gần đây thông qua việc sử dụng kỹ thuật đo tỉ lệ đồng vị nitơ [59] và việc giải trình tự gen mã hoá cho enzyme nitrogenase ở vi khuẩn [37] đã cho thấy có sự xuất hiện quá trình nitrat hoá ở hải miên Người ta cũng tìm thấy chi vi khuẩn

Nitrosospira và Nitrosococcus oxy hoá ammonia thành nitrite ở hải miên [38] Cổ khuẩn oxy hoá ammonia lần đầu tiên được phát hiện ở hải miên Axinella mexicana thuộc vùng biển California Vi khuẩn oxy hoá nitrite thành nitrate là Nitrospina và Nitrospira cũng được tìm thấy trong nhiều loài hải miên

Vi sinh vật liên kết với hải miên biển có vai trò chủ yếu trong việc bảo vệ vật chủ chống lại các loài ăn thịt do chúng sản sinh ra các chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học Bên cạnh đó, nhóm vi khuẩn quang hợp cố định cacbon cung cấp đến gần 50% nhu cầu cacbon cho hải miên Ngoài ra, có quan hệ cộng sinh với vi khuẩn quang hợp giúp hải miên nhận được một số sản phẩm từ quá trình quang hợp như glycerol Ngược lại, vi khuẩn sẽ được cung cấp giá thể và cơ chất từ hải miên mà nó có quan hệ

cộng sinh [6] Một số vi sinh vật được cho là sinh các chất trao đổi thứ cấp có khả năng bảo vệ vật chủ Các chức năng khác như loại bỏ các sản phẩm phụ của quá trình trao đổi chất có hại Đổi lại hải miên làm cho vi sinh vật có thể nhận được ánh sáng mặt trời, chỗ ẩn náu khỏi các loài săn mồi, cơ chất để bám và cung cấp dinh dưỡng [58]

1.2.2 Các chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật liên kết hải miên

Vi sinh vật liên kết với hải miên và một số vật chủ biển khác có cả nội bào và ngoại bào Hiện nay, cộng đồng vi sinh vật ở hải miên và hệ gen của chúng chưa được hiểu

rõ Người ta tin rằng rất nhiều sản phẩm của hải miên thực tế là do vi khuẩn liên kết

với nó sinh ra Ví dụ diketopiperazines của Tedania ignis được qui cho là sản phẩm trao đổi chất của Micrococcus sp liên kết với hải miên Kháng sinh polybrominated biphenyl ether tách từ hải miên Dysidea herbacea (Demospongiae) thực tế do cyanobacterium Oscillatoria spongeliae nội cộng sinh tạo ra Vi khuẩn Salinispora phân lập từ hải miên P clavata được nhận dạng là nguồn kháng sinh rifamycin

Người ta đã chứng minh được rằng vi sinh vật liên kết với hải miên sản sinh các chất

có hoạt tính sinh học thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng khối u, ức chế miễn dịch…và cũng có hoạt tính chữa bệnh tim, hô hấp và tiêu hóa (Grasa et al., 2013)

- Các chất có hoạt tính kháng khuẩn

Polyketide synthases (PKS) và Non ribosomal peptide synthases (NRPS) tham gia sản xuất rất nhiều các sản phẩm tự nhiên NRPS liên quan đến tạo ra một số thuốc chống khối u, ức chế miễn dịch, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, và hàng trăm các sản phẩm tự nhiên, gồm các hợp chất giảm cholesterol lovastatin là từ PKS (Brakhage, 2013) Yung và cs (2010) đã sử dụng Metagenomics chức năng để sàng lọc các protein

kháng khuẩn mới từ vi sinh vật liên kết với hải miên Cymbastela concentrica và đã chọn được 2 dòng là CcAb1 và CcAb2 có hoạt tính kháng Staphyloccus aureus và Alteromonas sp., cả hai dòng đều thuộc lớp Gammaprotebacteria Các tác giả cũng

nhận diện được các enzyme thủy phân mới từ cộng đồng vi sinh vật liên kết với hải

miên và phần lớn chúng thuộc lớp Alphaproteobacteria và Gammaproteobacteria

Phần lớn các chất kháng khuẩn được nhận dạng bởi chọn lọc metagenomic là những phân tử nhỏ, chẳng hạn như palmitoylputrescine, violacein, turbomycin A và B, indirubin và indigo Những nghiên cứu trước đây cũng tìm thấy các enzyme lipolytic

mới bằng sàng lọc thư viện gen metagenomic của vi sinh vật liên kết hải miên Aplysina aerophoba và Hyrtios erecta (Karpushova et al., 2005; Okamura at al 2010) Lipases

tác động lên lipids giải phóng acid béo có độ dài khác nhau, chúng được biết có phổ đối kháng vi sinh vật rộng Phương thức hoạt động của chúng được cho là liên quan đến các đặc tính tẩy (detergent) của các acid này, cho phép chúng tạo các lỗ nhỏ hoặc ở nồng độ cao làm cho tế bào bị tiêu bởi màng tế bào bị phân hủy (Desbois et al 2010)

Sử dụng phương pháp chọn lọc chức năng từ thư viện metagenomic hải miên biển Nhật

Bản Discodermia calyx đã phân lập được cyclodipeptides có hoạt tính kháng khuẩn

cathepsins B và L được phân lập từ hải miên biển Theonella mirabilis Các chất ức chế

enzyme được chú ý như một công cụ hữu hiệu, không những để nghiên cứu cấu trúc enzyme và cơ chế tác động mà còn có tiềm năng sử dụng trong dược học và nông nghiệp Các chất ức chế protease là công cụ mạnh để bất hoạt các proteases đích trong quá trình gây các bệnh ở người như khí thũng (emphysema), viêm khớp (arthritis), nghẽn mạch (throbosis), huyết áp cao, loạn dưỡng cơ, ung thư và AIDS (Wahyudi et al., 2010) Abdelmohsen và cs (2012) đã tách được Diazepinomicin từ chủng

Micromonospora sp RV115 liên kết với hải miên Aplysina aerophoba (Croatia) có

hoạt tính không những kháng khối u phổ rộng, mà còn có khả năng chống ôxy hóa và

ức chế protease Ba chủng vi khuẩn SAB S-2; SAB 17; SAB S-21 được phân lập từ hải

miên Jaspis sp có hoạt tính ức chế serine protease (subtilisin), metalloprotease (thermolysin) và dịch chiết thô của vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus (tụ cầu khuẩn) và Pseudomonas aeruginosa (Trực khuẩn mủ xanh) Chủng SAB S-2 tương đồng với Providencia dựa trên trình tự gen 16S rRNA; chủng SAB 17 – Pracoccus và SAB S-21- Bacillus sp Một sản phẩm tự nhiên khác có hoạt tính ức chế protease là các dẫn xuất của tetromycins 1-4 được tách từ xạ khuẩn Streptomyces axinellae Po1001T liên kết với hải miên Axinella polypoides ở biển Mediterranean Các sản phẩm tự nhiên

này có hoạt tính ức chế một vài cystein proteases [36]

- Các chất có hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư

Dịch chiết ethyl acetate của nấm Eurotium cristatum phân lập từ hải miên Mycale sp

đã được nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học Kết quả nhận được cho thấy dịch chiết thô có hoạt tính ức chế sinh trưởng của 3 dòng tế bào ung thư: ung thư vú, ung thư phổi và ung thư da-tế bào hắc tố (melanoma) (Almeida et al., 2010) Có thể tìm

thấy trong hải miên Discodermia dissoluta và Theonella swinhoei các hợp chất chống ung thư discodermolide, onnamide và theopederin Ngoài ra, vi khuẩn Salinispora phân lập từ hải miên Pseudoceratina clavata được nhận dạng là nguồn kháng sinh

rifamycin, được sản xuất bởi hệ PKS Kháng sinh polybrominated biphenyl tách từ hải

miên Dysidea herbacea thực tế do cyanobacterium Oscillatoria spongeliae nội cộng sinh tạo ra Lên men chủng nấm lớp Hyphomycetes được phân lập từ hải miên Jaspis affjohnstoni thu được tricyclic sesquiterpenes coriolin B, dihydrocoriolin C cũng như

chloriolines A-C mới Coriolin B có hoạt tính ức chế ung thư vú mạnh và dòng tế bào CNS, với IC50 0.7 µg (vú) và 0.5 µg (neuroblastoma) (Thomas et al., 2010) Một taxa thú vị khác liên kết với hải miên có tầm quan trọng dược học là Cyanobacteria như:

Lyngbya, Oscillatoria, Symploca, Calothrix, Leptolyngbya, Dichothrix, Geitlerinema, Schizothrix, Aphanothece, Blennothrix, và Synechocystis (Tabares, 2011)

1.3 Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết với hải miên

Bằng công nghệ sinh học phân tử không phụ thuộc nuôi cấy, kính hiển vi và kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật, người ta đã phát hiện có sự liên kết của các loài thuộc ba giới là Bacteria, Archaea và Eukarya với hải miên (Taylor et al., 2007) Các quần thể vi sinh vật khác sống trong hải miên còn có vi nấm và vi tảo Sự đa dạng này có thể giải thích một phần bởi sự thay đổi các điều kiện lý, hóa, sinh trong hải miên, có thể ảnh hưởng đến sinh thái vi sinh vật và tiến hóa Vi sinh vật liên kết với hải miên có cả nội bào và ngoại bào [7] [8] Cộng đồng vi sinh vật này đặc hiệu cho hải miên

Dựa trên những nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật bằng các phương pháp như điện di gel gradient biến tính (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis_DGGE), giải trình tự

gen 16S rRNA và lai huỳnh quang in-situ (Fluorescense In Situ Hybridization_FISH), người ta nhận thấy ngoài các thành viên của Archaea còn có tới hơn 25 ngành vi khuẩn liên kết với hải miên Trong số đó có Proteobacteria, Nitrospira, Cyanobacteria, Bacteriodetes, Actinobacteria, Chloroflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, Poribacteria và Verrucomicrobia Chưa rõ về virus trong hải miên, mặc dù các hạt giống như virus được phát hiện trong nhân tế bào của Aplysina (Verongia) cavernicola

Ở Việt Nam, chỉ có một số nghiên cứu về thành phần hải miên ở vịnh Hạ Long, Nha Trang cho thấy thành phần loài của chúng rất đa dạng [1], [2]

Có hai con đường để hải miên tạo nên vi khuẩn liên kết, một là hấp thu vi khuẩn đặc hiệu từ nước xung quanh khi nước đi qua hải miên trong quá trình ăn lọc và hai là truyền thẳng vi khuẩn thông qua giao tử (gametes) của hải miên bằng cách đưa cả vi

khuẩn vào noãn bào (oocytes) hoặc ấu trùng (larvae) (Wang et al., 2006; Li et al.,

2007)