Master's thesis of Mr. Le Minh Thanh_3.10

Protein thô của thức ăn một phần được lên men bởi VSV trong dạ cỏ hay ở ruột già, một phần được tiêu hoá bằng men ở ruột, phần còn lại không được tiêu hoá sẽ được thải ra ngoài qua phân.

-š²œ -Lấ MINH THANH

phân lập và đánh giá hoạt tính cellulase

của các chủng vi khuẩn trong dịch dạ cỏ bò nuôi

-š²œ -Lấ MINH THANH

phân lập và đánh giá hoạt tính cellulase

của các chủng vi khuẩn trong dịch dạ cỏ bò nuôi

tại công ty cổ phần th truemilk

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN TRONG DỊCH DẠ CỎ Bề SỮA TẠI

CễNG TY CỔ PHẦN TH TRUEMILKChuyờn ngành: Sinh học thực nghiệm

Mó số: 60.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả, số liệu trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Nghệ An, ngày tháng 10 năm 2015

Tác giả

Lê Minh Thanh

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được hoàn thành tại Bộ môn Sinh học thực nghiệm, Khoa Sinh học, Trường Đại học Vinh

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc đến thầy giáo hướng dẫn khoa

học TS Hoàng Vĩnh Phú đã tận tâm giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình

nghiên cứu và thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể Khoa Sinh học, Phòng đào tạo sau đại học

đã tạo điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các lãnh đạo, nhân viên Công ty Cổ phần sữa TH True Milk, huyện Nghĩa Đàn, tỉnh Nghệ An đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn các thành viên trong gia đình, bạn bè đã giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Nghệ An, ngày …… tháng 10 năm 2015

Tác giả

Lê Minh Thanh

MỤC LỤC

L I CAM OAN Ờ Đ i

L I C M N Ờ Ả Ơ ii

M C L C Ụ Ụ iii

B NG GHI CHÚ NH NG C M T DANH M C VI T T T Ả Ữ Ụ Ừ Ụ Ế Ắ iv

DANH M C CÁC B NG Ụ Ả vi

DANH M C CÁC HÌNH Ụ viii

M Ở ĐẦ 1 U 1 LÝ DO CH N Ọ ĐỀ TÀI 1

2 M C CH NGHIÊN C U Ụ ĐÍ Ứ 2

Ch ươ ng 1 3

T NG QUAN V N Ổ Ấ ĐỀ NGHIÊN C U Ứ 3

1.1 THÀNH PH N TH C N VÀ QUÁ TRÌNH CHUY N HÓA TH C N Ầ Ứ Ă Ể Ứ Ă C A BÒ S A Ủ Ữ 3

L I CAM OAN Ờ Đ i

L I C M N Ờ Ả Ơ ii

M C L C Ụ Ụ iii

B NG GHI CHÚ NH NG C M T DANH M C VI T T T Ả Ữ Ụ Ừ Ụ Ế Ắ iv

DANH M C CÁC B NG Ụ Ả vi

DANH M C CÁC HÌNH Ụ viii

M Ở ĐẦ 1 U 1 LÝ DO CH N Ọ ĐỀ TÀI 1

2 M C CH NGHIÊN C U Ụ ĐÍ Ứ 2

Ch ươ ng 1 3

T NG QUAN V N Ổ Ấ ĐỀ NGHIÊN C U Ứ 3

1.1 THÀNH PH N TH C N VÀ QUÁ TRÌNH CHUY N HÓA TH C N Ầ Ứ Ă Ể Ứ Ă C A BÒ S A Ủ Ữ 3

BẢNG GHI CHÚ NHỮNG CỤM TỪDANH MỤC VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

L I CAM OAN Ờ Đ i

L I C M N Ờ Ả Ơ ii

M C L C Ụ Ụ iii

B NG GHI CHÚ NH NG C M T DANH M C VI T T T Ả Ữ Ụ Ừ Ụ Ế Ắ iv

DANH M C CÁC B NG Ụ Ả vi

DANH M C CÁC HÌNH Ụ viii

M Ở ĐẦ 1 U 1 LÝ DO CH N Ọ ĐỀ TÀI 1

2 M C CH NGHIÊN C U Ụ ĐÍ Ứ 2

Ch ươ ng 1 3

T NG QUAN V N Ổ Ấ ĐỀ NGHIÊN C U Ứ 3

1.1 THÀNH PH N TH C N VÀ QUÁ TRÌNH CHUY N HÓA TH C N Ầ Ứ Ă Ể Ứ Ă C A BÒ S A Ủ Ữ 3

DANH MỤC CÁC HÌNH

L I CAM OAN Ờ Đ i

L I C M N Ờ Ả Ơ ii

M C L C Ụ Ụ iii

B NG GHI CHÚ NH NG C M T DANH M C VI T T T Ả Ữ Ụ Ừ Ụ Ế Ắ iv

DANH M C CÁC B NG Ụ Ả vi

DANH M C CÁC HÌNH Ụ viii

M Ở ĐẦ 1 U 1 LÝ DO CH N Ọ ĐỀ TÀI 1

2 M C CH NGHIÊN C U Ụ ĐÍ Ứ 2

Ch ươ ng 1 3

T NG QUAN V N Ổ Ấ ĐỀ NGHIÊN C U Ứ 3

1.1 THÀNH PH N TH C N VÀ QUÁ TRÌNH CHUY N HÓA TH C N Ầ Ứ Ă Ể Ứ Ă C A BÒ S A Ủ Ữ 3

, SƠ ĐỒ, BIỀU ĐỒ

2 Bảng 1.2 Vi khuẩn sản xuất hệ thống cellulosome 29

3 Bảng 3.1 Giá trị pH của dung dịch đệm citrat 47

4 Bảng 3.2 Khả năng thủy phân của các chủng vi khuẩn phân lập được 57

5 Bảng 3.3 Hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn qua 4, 5, 6, 7

7 Bảng 3.5 Tỷ lệ hạt nảy mầm, trọng lượng tươi của đậu xanh sau 7 ngày trồng trên phân ủ từ rơm rạ 62

8 Bảng 3.6 Hình thái học tế bào, phản ứng Gram, thông tin về bào tử, tính di động và hoạt tính catalase của bốn chủng vi khuẩn 63

9 Bảng 3.7 Các sản phẩm lên men của bốn chủng vi khuẩn 64

10 Bảng 3.8 Khả năng sử dụng các nguồn cacbohydrat của 4 chủng vi khuẩn 64

11 Bảng 3.9 Kết quả nhận diện bốn chủng vi khuẩn 65

12 Hình 1.1 Quá trì nh ti êu hoá gluxi t ở bò 9

13 Hình 1.2 Quá trình phân gi ải và lên me n gluxit ở dạ cỏ 10

14 Hình 1.3 Sơ đồ chuyể n hoá các hợp chất c hứa nitơ ở gia s úc nhai l ại 13

15 Hì nh 1.4 Sơ đồ chuyể n hoá l ipi t ở gia s úc nhai lại 16

17 Hình 1.6 Cấu trúc của cellulose trong vách tế bào thực vật 19

19 Hình 1.8 Cấu trúc β - glucosidase với các bản xoắn K (màu đỏ), các

bản xoắn β (màu vàng) và các nối β (màu xanh) 23

20 Hình 1.9 Các nguyên tử Calcium có trong cellulase (β - Glucosidase) tại vị trí Glu 295 và Glu 325 trên cả hai

25 Hình 1.14 Sự hấp thu carbohydrate và phosphoryl hóa bởi C.thermocellum 34

26 Hình 1.15 Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển

27 Hình 1.16 Trang trại bò sữa TH True milk ở huyện Nghĩa Đàn, tỉnh Nghệ An 37

28 Hình 1.17 Bò sữa tại trang trại TH True Milk 38

29 Hình 1.18 Công ngh s n xu t c tệ ả ấ ỏ ươi cho bò s a ữ 39

30 Hình 1.19 Nguyên li u ch bi n th c n cho bò s a ệ ế ế ứ ă ữ 40

31 Hình 1.20 Quá trình ch bi n th c n cho bò s a t i trang tr i THế ế ứ ă ữ ạ ạ

32 Hình 3.1 Các khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường CMC từ dịch dạ cỏ bò 56

33 Hình 3.2 Vòng thủy phân CMC bởi các dòng vi khuẩn sau 48h ủ 56

34 Hình 3.3 Khả năng thủy phân của các chủng vi khuẩn 58

35 Hình 3.4 Đường chuẩn glucose tại bước sóng 540nm 59

36 Hình 3.5 Hoạt tính CMCase của các chủng vi khuẩn 60

37 Hình 3.6 Trọng lượng tươi của đậu xanh sau 7 ngày trồng trên phân ủ từ rơm rạ 63

MỞ ĐẦU

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Khoảng một nửa hợp chất carbon trong sinh khối (biomass) trên mặt đất là cellulose, chiếm tới 35 - 50% khối lượng khô sinh khối thực vật Tất cả sản phẩm sinh khối sẽ được khoáng hóa nhờ hệ thống enzyme được cung cấp bởi vi sinh vật

Hệ thống enzyme phân giải cellulose thường chậm và không hoàn toàn Tuy nhiên, trong khoảng thời gian ngắn (48 giờ) hệ vi sinh vật trong dạ cỏ bò có thể phân giải cellulose

Cellulose thường được phân hủy bởi enzyme gọi là cellulase Sự thủy phân cellulose triệt để bằng enzyme cần có sự phối hợp đồng thời của ba loại enzyme cellobiohydrolase (exoglucanase), endoglucanase hay carboxymethycellulase, và ß-glucosidases [2425]

Mặc dù được nghiên cứu sau các enzyme khác như protease, amylase (những năm 1980)…nhưng enzyme cellulase đã đóng vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực đời sống Enzyme cellulase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như xử lý phế phẩm nông nghiệp, trong các ngành công nghiệp như trong sản xuất bia, chất tẩy, dệt, giấy, thực phẩm và cả trong y dược…[282932], [464750]

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng enzyme cellulase là một hệ enzyme phức tạp - được sinh ra bởi nhiều vi sinh vật, phổ biến là nấm và vi khuẩn [22], [43447] Mặc

dù những loài nấm sợi thì tỏ ra phân hủy rất tốt các cellulose tự nhiên [53547],

[666770] thế nhưng vi khuẩn lại có tốc độ sinh trưởng cao hơn so với nấm nên có tiềm năng lớn để được dùng trong việc sản xuất cellulase Tuy nhiên, việc nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn nhìn chung vẫn còn khiêm tốn so với nghiên cứu trên nấm [32336] Dù vậy, đặc điểm phân giải

cellulose của vài giống vi khuẩn như Cellulomonas, Cellovibrio, Pseudomonas, Sporosphytophaga spp [585962]; Bacillus và Micrococcus [43447] đã được nghiên cứu

Trong chăn nuôi bò sữa, nguồn thức ăn thô chiếm tới hơn 90%, vì thế hiệu quả chuyển hóa thức ăn của bò sữa phụ thuộc lớn vào khả năng phân giải lượng thức ăn thô hàng ngày của đàn bò [5] Công ty cổ phần TH Truemilk ở huyện Nghĩa Đàn,

tỉnh Nghệ An được xem là mô hình chăn nuôi bò sữa lớn nhất Việt Nam Nguồn cung cấp thức ăn chủ yếu cho bò sữa ở đây là cỏ, rơm rạ và bã mía Ngoài sự quan tâm đến hiệu quả chuyển hóa thức ăn cho bò sữa, việc nghiên cứu tăng hiệu suất của thức ăn thô lên men, xử lí bã thải của quá trình thu nhận, chế biến thức ăn cũng nhận được sự quan tâm của các nhà khoa học

Vì thế, đề tài “Phân lập và đánh giá hoạt tính cellulase của các chủng vi khuẩn trong dạ cỏ bò nuôi tại công ty cổ phần TH Truemilk” được thực hiện để

làm cơ sở đánh giá ban đầu hiệu quả chuyển hóa thực ăn của đàn bò sữa Đặc biệt, kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần vào việc lựa chọn được chủng vi khuẩn

có khả năng phân giải tốt cellulose, phù hợp điều kiện địa phương để thử nghiệm trong chế biến thức ăn cho bò sữa và xử lí môi trường

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 THÀNH PHẦN THỨC ĂN VÀ QUÁ TRÌNH CHUYỂN HÓA THỨC ĂN CỦA BÒ SỮA

1.1.1 Thành phần thức ăn cho bò sữa

Thức ăn của bò sữa, chủ yếu là thức ăn xanh thô Trong thức ăn xanh thô, trước hết phải kể đến cỏ tươi Trường hợp thiếu cỏ tươi, có thể thay thế bằng lá su hào, cải bắp, cỏ khô loại tốt, cỏ ủ chua và củ quả Đối với bò sữa, thức ăn nhiều nước có ý nghĩa sinh lý quan trọng vì muốn tạo được một lít sữa phải có 450 - 500 lít máu vận chuyển các chất dinh dưỡng vào tuyến vú Củ quả và bã bia là nguồn thức ăn rất tốt cho bò sữa

Cho ăn bổ sung thức ăn tinh trong nhiều trường hợp là để tăng năng lượng, không phải để tăng lượng protein trong khẩu phần nên phải có thức ăn xanh thô và cho bò ăn tự do Còn thức ăn tinh cho ăn trộn lẫn với thức ăn xanh thô mơi hợp với sinh lý dạ cỏ và hiệu quả sử dụng thức ăn của bò sữa mới cao

Thành phần của thức ăn của bò sữa bao gồm nước và vật chất khô (VCK), một

số có hàm lượng vật chất khô cao, một số khác có hàm lượng vật chất khô thấp Các loại thức ăn thô xanh có hàm lượng vật chất khô thấp hơn các loại thức ăn ủ ướp và thức ăn ủ ướp lại có hàm lượng vật chất khô thấp hơn các loại thức ăn đã phơi khô Theo Pozy (1998), hàm lượng vật chất khô của thức thô xanh biến động từ 11 % đến

20 %, của thức ăn ủ ướp từ 20 % đến 40 % (biến động rất lớn và phụ thuộc vào nguyên liệu đem ủ), của các loại thức ăn phơi khô và thức ăn tinh từ 85 % đến 92 %

[54]

1.1.2 Quá trình chuyển hóa thức ăn ở bò sữa

1.1.2.1 Quá trình tiêu hoá thức ăn

Khi ăn thức ăn thô bò thường ăn vào dưới dạng các mẩu thức ăn với kích thước

lớn nên vi sinh vật dạ cỏ khó có thể tấn công và lên men hoàn toàn Chất chứa dạ cỏ liên tục được nhào trộn nhờ sự co bóp theo nhịp của vách dạ cỏ Phần thức ăn chưa được nhai kĩ có kích thước lớn nằm trong dạ cỏ và dạ tổ ong thỉnh thoảng được

ợ lên theo từng miếng vào thực quản và trở lại xoang miệng Trong miệng phần chất lỏng được nuốt ngay còn thức ăn thô được thấm nước bọt và nhai kỹ lại

trước khi được nuốt trở lại dạ cỏ để lên men tiếp.

Hiện tượng nhai lại bắt đầu xuất hiện khi bê được cho ăn thức ăn thô Quá trình nhai lại chịu ảnh hưởng của một số yếu tố như trạng thái sinh lý của con vật,

cơ cấu khẩu phần, nhiệt độ môi trường v.v Tác nhân chính làm cho con vật nhai lại có thể là do sự kích thích của thức ăn vào niêm mạc tiền đình dạ cỏ Một

số loại thức ăn, nhất là những thức ăn chứa ít hoặc không có thức ăn thô có thể không kích thích được phản xạ nhai lại Thời gian con vật dành để nhai lại phụ thuộc chủ yếu vào hàm lượng và tính chất của xơ trong khẩu phần

Thức ăn thô trong khẩu phần càng ít thì thời gian nhai lại càng ngắn Trong điều kiện yên tĩnh gia súc sẽ bắt đầu nhai lại (sau khi ăn) nhanh hơn Cường độ nhai lại mạnh nhất vào buổi sáng và buổi chiều Mỗi ngày bò chăn thả thường giành khoảng 8 giờ để nhai lại, tức bằng với thời gian gặm cỏ Mỗi miếng ợ lên nhai lại đượ c nhai 40-50 lần, do vậy thức thô được nghiền nhiều hơn trong quá trình nhai lại so với trong quá trình ăn

1.1.2.2 Quá trình tiêu hoá các thành phần của thức ăn

a) Tiêu hoá gluxit (carbohydrate hay hydratcarbon)

Toàn bộ quá trình tiêu hoá gluxit ở bò có thể tóm tắt qua hình 1.1 Gluxit trong thức ăn có thể chia thành 2 nhóm: (1) gluxit phi cấu trúc (NSC) gồm tinh bột, đường (có trong chất chứa của tế bào thực vật) và pectin (keo thực vật)

và (2) gluxit vách tế bào (CW) gồm xenluloza và hemixenluloza (gọi chung là xơ) Cả hai loại gluxit đều được VSV dạ cỏ lên men Khoảng 60 - 90 % gluxit của khẩu phần được lên men trong dạ cỏ Phần không được lên men trong dạ cỏ được chuyển xuống ruột Trong ruột non xơ (CW) không được tiêu hoá, còn tinh bột và đường sẽ được men tiêu hoá của đường ruột thuỷ phân thành glucoza hấp thu vào máu Khi xuống ruột già tất cả các thành phần gluxit còn lại sẽ được VSV lên men lần thứ hai tương tự như quá trình lên men diễn ra trong dạ cỏ

Hình 1.1 Quá trình tiêu hoá gluxit ở bò

Trong dạ cỏ quá trình phân giải các gluxit phức tạp đầ u tiên sinh ra các đường đơn hexoza và pentoza (hình 1.1) Những phân tử đường này là các sản phẩm trung gian nhanh chóng được lên men tiếp bởi các VSV dạ cỏ Quá trình lên men này sinh ra năng lượng dưới dạng ATP và các axit béo bay hơi (AXBBH), đó là các axit axetic, propionic và butyric theo một tỷ lệ tương đối khoảng 70 20 8 cùng với một lượng nhỏ izobutyric, izovaleric và valeric Những axit này được hấp thu qua vách các dạ dày trước vào máu và trở thành nguồn năng lượng cho vật chủ (bò) Quá trình lên men ở dạ cỏ còn sinh ra khí cácbônic và hydro, hai khí này kết hợp với nhau tạo ra một phụ phẩm lên men

là khí mêtan được định kỳ thải ra ngoài qua ợ hơi (hình 1.2)

Hình 1.2 Quá trình phân giải và lên men gluxit ở dạ cỏ

b) Quá trình chuyển hoá các hợp chất chứa nitơ

Toàn bộ quá trình chuyển hoá các hợp chất chứa N ở gia súc nhai lại có thể tóm tắt trong hình 1.2 Các hợp chất chứa nitơ (N) trong thức ăn của gia súc nhai lại bao gồm protein thực và nitơ phi protein (NPN), được tính chung dưới dạng protein thô (N

x 6,25) Protein thô của thức ăn một phần được lên men bởi VSV trong dạ cỏ hay ở ruột già, một phần được tiêu hoá bằng men ở ruột, phần còn lại không được tiêu hoá

sẽ được thải ra ngoài qua phân

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hoá các hợp chất chứa nitơ ở gia súc nhai lại

Trong dạ cỏ, protein thô có thể phân chia thành 3 thành phần gồm: protein hòa tan, protein có thể phân giải và protein không thể phân giải Protein hòa tan và protein có thể phân giải trong dạ cỏ có khác nhau về động thái phân giải nhưng được xếp vào một nhóm là protein phân giải được ở dạ cỏ Sau khi ăn vào NPN nhanh chóng được phân giải thành amôniac còn một phần (nhiều hay ít tuỳ thuôc bản chất thức ăn và khẩu phần) protein có thể phân giải được VSV thuỷ phân thành peptide và axit amin Một số axit amin tiếp tục được lên men sinh ra axit hữu cơ, amôniac và khí cacbonic Cả vi khuẩn, protozoa và nấm dạ cỏ đều tham gia vào quá trình phân giải các hợp chất chứa nitơ Tuy vậy, vi khuẩn dạ cỏ là thành phần quan trọng nhất trong quá trình này Khoảng 30 - 50% loài vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ là có khả năng phân giải protein và đóng góp hơn 50% hoạt động phân giải protein trong dạ cỏ.Tốc độ phân giải protein bởi VSV trong dạ cỏ thay đổi rất lớn và chịu ảnh hưởng bởi cấu trúc ba chiều của phân tử protein, các mối liên kết nội phân tử và giữa các phân tử (kể cả với xơ), các rào cản trơ như lignin trong vách tế bào và các nhân tố kháng dinh dưỡng Những yếu tố này phụ thuộc vào nguồn protein cũng như cách chế biến thức ăn Cấu trúc protein ảnh hưởng đến khả năng tiếp cận của VSV, đó chính là yếu tố quan trọng nhất quyết định tốc độ và tỷ lệ phân giải protein trong dạ

cỏ Tuy nhiên, nhiều yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến khả năng phân giải hữu hiệu của protein, trong đó có lượng thu nhận thức ăn, tỷ lệ thô/tinh của khẩu phần; nguồn, chất lượng và khối lượng gluxit và protein trong khẩu phần; pH dịch dạ cỏ; tác động phối hợp của các loại thức ăn; tần số cung cấp thức ăn; nguồn bổ sung các vi chất dinh dưỡng cũng như các yếu tố môi trường

Quá trình phân giải protein thô trong dạ cỏ sinh ra một hỗn hợp gồm peptide, axit amin, ammoniac và các axit hữu cơ, trong đó có cả một số axit mạch nhánh sinh

ra từ lên men các axit amin mạch nhánh Amôniac sinh ra cùng với các peptide mạch ngắn và axit amin tự do được VSV dạ cỏ sử dụng để tổng hợp nên protein của chúng (protozoa không sử dụng được amôniac) Một số protein VSV bị phân giải ngay trong

dạ cỏ và nguồn nitơ của chúng cũng được tái sử dụng bởi VSV dạ cỏ

Mặc dù ammoniac có thể được vi khuẩn sử dụng để tổng hợp protein tế bào của chúng, vi khuẩn không hạn chế việc phân giải protein để tự cung cấp đủ ammoniac cho mình Vi khuẩn phân giải càng nhiều protein khi chúng có nhiều thời gian thực hiện việc này Bởi vì sinh trưởng của vi khuẩn bị hạn chế bởi năng lượng có

thể sử dụng được từ lên men hydratcarbon trong điều kiện yếm khí, amôniac vượt quá nhu cầu của vi sinh vật sẽ không được sử dụng Lượng ammoniac vượt quá nhu cầu sẽ được gia súc hấp thu vào máu về gan để tổng hợp thành urê rồi thải ra ngoài qua nước tiểu Ngược lại, thiếu amôniac làm giảm sự tăng sinh của vi sinh vật và vì thế mà giảm tốc độ phân giải thức ăn trong dạ cỏ và lượng thức ăn vào.

Sinh khối protein vi sinh vật dạ cỏ sẽ theo dòng chất chứa dạ cỏ xuống dạ khế

và ruột non Trong ruột protein vi sinh vật cùng với phần protein của thức ăn không qua phân giải ở dạ cỏ (protein thoát qua) sẽ được tiêu hoá và hấp thu tương tự như đối với động vật dạ dày đơn Trong sinh khối protein VSV có khoảng 80 % là protein thật có chứa đầy đủ các axit amin không thay thế với tỷ lệ cân bằng, phần còn lại chủ yếu là N có trong axit nucleic Protein thật của VSV được tiêu hoá khoảng 80 -

85 % ở ruột Một số axit amin có trong peptidoglycan của màng tế bào VSV không được vật chủ tiêu hoá

Nhờ có protein VSV dạ cỏ mà bò cũng như gia súc nhai lại nói chung ít phụ thuộc vào chất lượng protein thô của thức ăn hơn là động vật dạ dày đơn bởi vì chúng

có khả năng biến đổi các hợp chất chứa N đơn giản, như urê, thành protein có giá trị sinh học cao Bởi vậy để thoả mãn nhu cầu duy trì bình thường và nhu cầu sản xuất ở mức vừa phải thì không nhất thiết phải cho bò ăn những nguồn protein có chất lượng cao, bởi vì hầu hết những protein này sẽ bị phân giải thành amôniac; thay vào đó amôniac có thể sinh ra từ những nguồn NPN và rẻ tiền hơn Khả năng này của VSV

dạ cỏ có ý nghĩa kinh tế rất lớn vì thức ăn chứa protein đắt hơn nhiều so với các nguồn NPN Tuy nhiên, đối với gia súc cao sản thì phần protein thoát qua có vai trò rất quan trọng trong việc đáp ứng đầy đủ nhu cầu protein cho vật chủ vì lượng protein VSV là có giới hạn Mặt khác, VSV dạ cỏ cũng có tác động xấu lên những protein của thức ăn có chất lượng cao do quá trình phân giải Bởi vậy, gần đây người ta đã tìm các phương pháp để bảo vệ các nguồn protein chất lượng cao tránh sự phân giải của VSV ở dạ cỏ nhằm đưa thẳng xuống ruột cho vật chủ (gia súc cao sản) tiêu hoá bằng men

c) Chuyển hoá lipid

Lipid trong thức ăn của gia súc nhai lại thường có hàm lượng thấp Trong các loại cỏ và các loại hạt ngũ cốc hàm lượng lipid chỉ có khoảng 4 - 6 % Tuy nhiên, trong nhiều loại hạt chứa dầu cao làm thức ăn bổ sung cho gia súc nhai lại có chứa

hàm lượng lipid có thể cao tới 36 % (như hạt lanh) Các dạng lipid của thức ăn thường có là triaxylglycerol, galactolipid (thành phần chính lipid trong các loại thức

ăn xơ) và phospholipid Triaxylglycerol trong thức ăn của gia súc nhai lại thường chứa một tỷ lệ khá cao các axit béo không no C18 là axit linoleic và linolenic

Hình 1.4 Sơ đồ chuyển hoá lipit ở gia súc nhai lại

Quá trình chuyển hoá lipid ở gia súc nhai lại có thể tóm lược qua hình 1.4 Trong dạ cỏ có hai quá trình trao đổi lipit có liên quan với nhau: phân giải lipid của thức ăn và tổng hợp mới lipid của VSV Triaxylglycerol và galactolipid của thức ăn được thuỷ phân bởi lipaza VSV Glyexerol và galactoza được lên men ngay thành AXBBH Khác với các axit béo bay hơi (mạch ngắn), các axit béo mạch dài không được hấp thu trực tiếp qua vách dạ cỏ mà được chuyển xuống phía dưới của đường tiêu hoá Vi sinh vật dạ cỏ cũng có khả năng tổng hợp lipid, kể cả một số axit có chứa các axit béo lạ (có mạch nhánh và mạch lẻ) và các axit này sẽ có mặt trong sữa và mỡ

cơ thể của vật chủ Như vậy, lipid của VSV dạ cỏ là kết quả của việc biến đổi lipid của thức ăn và lipid được tổng hợp mới

Trong dạ cỏ còn xảy ra quá trình no hoá và đồng phân hoá các axit béo không

no Các axit béo không no mạch dài bị làm bão hoà (hydrogen hoá thành axit stearic)

và sử dụng bởi một số vi khuẩn Một số mạch nối đôi của các axit béo không no có thể không bị hydrogen hoá nhưng được chuyển từ dạng cis sang dạng trans bền vững hơn Các axit béo có mạch nối đôi dạng trans này có điểm nóng chảy cao hơn và hấp

thu (ở ruột non) chuyển vào mô mỡ ở dạng như vậy nên làm cho mỡ của gia súc nhai lại có điểm nóng chảy cao.

Khả năng tiêu hoá lipid của VSV dạ cỏ rất hạn chế Cho nên khẩu phần nhiều lipid sẽ cản trở tiêu hoá xơ và giảm thu nhận thức ăn do lipid bám vào VSV dạ cỏ và các tiểu phần thức ăn làm cản trở quá trình lên men Tuy nhiên, đối với phụ phẩm xơ hàm lượng lipid trong đó rất thấp nên dinh dưỡng của gia súc nhai lại ít chịu ảnh hưởng của tiêu hoá lipid trong dạ cỏ

d) Tổng hợp vitamin

Vi sinh vật dạ cỏ có khả năng tổng hợp được tất cả các vitamin nhóm B và vitamin K Nếu cho gia súc nhai lại ăn khẩu phần chứa nhiều vitamin nhóm B thì lượng vitamin tổng hợp bởi VSV dạ cỏ tương đối ít, nhưng sẽ tăng lên nếu lượng vitamin đó có ít trong thức ăn Do vậy, trong điều kiện bình thường gia súc nhai lại trưởng thành ít phụ thuộc vào các nguồn vitamin này trong thức ăn Tuy nhiên cũng cần nhấn mạnh rằng để VSV dạ cỏ tổng hợp được đầy đủ vitamin B12 thì cần có đủ coban ở trong thức ăn Hơn nữa, đối với bò cao sản nếu xét theo yêu cầu tối ưu hoá sức khoẻ, năng suất và chất lượng sản phẩm thì sự tổng hợp vitamin nhóm B của vi khuẩn dạ cỏ không thể đáp ứng đủ cho những nhu cầu này

1.2 CƠ CHẤT CỦA HỆ ENZYME CELLULASE

1.2.1 Cellulose

1.2.1.1 Khái niệm và cấu trúc

Cellulose là thành phần chính của tế bào thực vật Trong gỗ chứa khoảng 5 % cellulose, sợi bông vải 97- 98 %, sợi lanh, sợi gai chứa 81 - 90 %, sợi đay 75%, than cây họ cói, họ lúa 30- 40%

Cellulose là polimer được cấu thành từ các đơn phân glucose được liên kết bởi β

- 1,4 glycoside, là vật liệu chủ yếu của vách tế bào thực vật vàad là nguồn carbohydrate phong phú nhất trong tự nhiên Mức độ polimer hóa thường từ 100 đến 20.000 Các chuỗi cellulose gần nhau được liên kết với nhau tạo thành các tấm cellulose qua liên kết hydrogen và liên kết Vander Waal tạo thành cấu trúc tinh thể, phân tử dạng sợi, bền vững

Khoảng 30 phân tử cellulose riêng lẻ được sắp xếp thành đơn vị lớn hơn gọi là sợi cơ bản, sau đó được bó thành sợi lớn hơn gọi là vi sợi và được cấu trúc thành những sợi cellulose Sợi cellulose bền vững bởi các liên kết nội phân tử cũng như liên

kết hydrogen nội phân tử Sự sắp xếp các chuỗi riêng lẻ bên trong những sợi cơ bản đã được tìm hiểu từ sự phân tích tán xạ tia X.

Cấu trúc cellulose tinh thể bao gồm những cấu trúc cố định trong những vị trí riêng biệt có quan hệ chặt chẽ với những vị trí khác (hình 1.5) Chúng có khả năng ngăn ngừa sự xâm nhập không chỉ enzyme mà thậm chí những phân tử nhỏ như nước Bên cạnh cellulose cấu trúc tinh thể, những sai sót trong cấu trúc tinh thể đã dẫn đến hình thành một nhóm sợi cellulose có cấu trúc vô định hình Sợi cellulose còn có những cấu trúc bất quy tắc khác như: Nnhững chỗ xoắn trong vi sợi, những lỗ trống trên bề mặt, những lỗ, hốc nhỏ và một số mạch nhỏ Tổng diện tích tiếp xúc của sợi cellulose lớn hơn bề mặt tinh thể trong cấu trúc cùng kích thước Sự không đồng nhất trong cấu trúc làm cho sợi bị hydrate bởi nước khi nhúng vào môi trường lỏng và cho phép sự xâm nhập bởi các phân tử lớn bao gồm các enzyme thủy phân cellulose

Hình 1.5 Cấu trúc của cellulose

Cellulose không có vai trò dinh dưỡng trong cơ thể con người Vị dịch tiêu hóa của con người có enzyme để cắt các liên kết β- 1,4 glycoside Nhưng trong khẩu phần thức ăn của con người luôn luôn có thành phần cellulose, cellulose ăn vào hằng ngày

từ rau, hoa quả, giúp cho cơ thể dễ tiêu hóa thức ăn, do nó làm cho lưu động ruột tốt,

dễ dàng Ngoài ra cellulose còn giúp ruột già đào thải những chất bã, chống lại sự táo bón

Hàng năm có khoảng 230 tỷ tấn chất hữu cơ được tổng hợp bằng quá trình quang hợp ở thực vật trong đó có tối đa 70 tỷ tấn (30 %) cellulose Đây là polymer tự nhiên β - D - lucose được nối với nhau qua liên kết β - D - 1,4 - glucan, mức dộ polymer hóa của phân tử cellulose: 200- 15000, trung bình là 3000 Tùy theo các loài thực vật mà các phân tử cellulose có trọng lượng phân tử khác nhau rất nhiều từ 50.000- 2.500000.

Cellulose là hợp chất tự nhiên khá bền, không tan trong nước chỉ bị trương phồng do hút nước, bị phân hủy khi đun nóng với kiềm hay axit hoặc do các enzyme Phân tử cellulose rất bền vững, với thời gian bán rã là 5 - 8 triệu năm cho sự phân cắt lien kết β - 1,4 glycoside tại 25oC Trong khi quá trình phân hủy sinh học thường nhanh hơn và cung cấp dòng carbon cho khí quyển

1.2.1.2 Thành phần của sinh khối thực vật

Sinh khối thực vật chiếm giữ khoảng một nửa nguồn carbon trong sinh quyển Người ta ước tính rằng lượng carbon được thực vật đồng hóa hàng năm khoảng 200 tỷ tấn Khoảng 70 % sinh khối thực vật được cấu thành từ các đơn vị đường chứa 5 hoặc,

6 carbon Phân tử cellulose kết hợp thành những sợi có cấu trúc tinh thể hình thành nên bộ khung cho vách tế bào thực vật Sợi cellulose được liên kết chéo với các polysaccharide khác gọi là hemicelluloses để làm tăng độ bền cho vách tế bào (hình 1.6)

Hình 1.6 Cấu trúc của cellulose trong vách tế bào thực vật

Hemicellulose bao gồm xylan (đơn phân - D - glucose với liên kết - 1,4 - ), glucomannan (đơn phân - D - mannose và - D - glucose với liên kết - 1,4 -), xylodlucan (đơn phân - D - glucose với liên kết - 1,4 -, và - D - xylose và - D - glucose với liên kết - 1,6-), 1,3 và 1,4- glucan ( đơn phân - D -glucose với liên kết - 1,3 - và -1,4 -), và số lượng nhỏ polysaccharide khác bao gồm - D - glucose, - D - xylose, - D - mannose và đơn vị đường khác với các lien kết khác nhau Bộ khung cellulose và hemicelluloses còn được liên kết với pectin ( đơn phân - D - galacturonic acid với liên kết chủ yếu -1,4-), với chức năng là chất gắn trong vách tế bào [9].Thành phần và cấu trúc của vách tế bào có sự khác biệt lớn giữa các loài thực vật, hàm lượng cellulose thông thường chiếm từ 35 đến 50 % trọng lượng khô thực vật Trong một số trường hợp, sợi cellulose được gắn vào mạng lưới các sợi sinh học khác, chủ yếu là hemicelluloses chiếm khoảng 20 đến 35 % và lignin chiếm khoảng đến 30% trọng lượng khô thực vật.

Lignin hiện diện cùng với cellulose trong nhiều loài thực vật giúp làm cứng vách

tế bào thực vật Các loài thực vật khác nhau thì có thành phần lignin khác nhau Tuy nhiên, sự hiện diện của lignin ngăn cản sự chuyển đổi các polysaccharide thành các đơn phân dưới tác động của enzyme

Sự sử dụng sinh khối cellulose phức tạp hơn so với cellulose thuần khiết không chỉ bởi thành phần phức tạp của chúng mà còn bởi vì cấu trúc đa dạng của tế bào thực vật Tế bào thực vật rất khác nhau về kích thước và tổ chức Một số loại tế bào thực vật có vách mỏng, ít bị lignin hóa thì dễ dàng bị thủy phân bởi các enzyme thủy giải polysaccharide

Sinh khối thực vật khó khăn trong việc thủy giải bởi vì: chúng liên kết với hemicelluloses, được bao bọc bởi lignin và có cấu trúc tinh thể có khả năng hình thành sáu liên kết hydrogen: Bbốn liên kết nội phân tử và hai liên kết phân tử Do đó, trước khi thủy giải với enzyme, việc tiền xử lý là cần thiết để gia tăng diện tích bề mặt của cellulose bằng cách loại bỏ lớp lignin, hòa tan hemicelluloses, phá vỡ cấu trúc tinh thể

và gia tăng cấu trúc lỗ trong tinh thể

1.2.2 Cacboxylmethyl cellulose (CMC)

1.2.2.1 Định nghĩa

Carboxymethyl cellulose (CMC) là một polime, là dẫn xuất của cellulose với các nhóm carboxymethyl (-CH2COOH) liên kết với một số nhóm hydroxyl của các glucopyranose monomer tạo thành khung sườn cellulose, nó thường được sử dụng dưới dạng muối natri carboxymethyl cellulose Dạng natri carboxymethyl cellulose có công thức phân tử là [C6H7O2(OH)x(OCH2COONa)y]n

1.2.2.2 Tính chất

Là chế phẩm ở dạng bột trắng, hơi vàng, hầu như không mùi, hạt hút ẩm (hình 1.7) Carboxymethyl cellulose tạo dung dịch dạng keo với nước, không hòa tan trong ethanol

Hình 1.7 Cacboxylmethyl cellulose (CMC)

Các tính chất hóa học của Carboxymethyl cellulose phụ thuộc vào mức độ thế của các cấu trúc cellulose ( tức là bao nhiêu nhóm hydro đã tham gia vào phản ứng thế), cũng như độ dài chuỗi các cấu trúc sườn cellulose và mức độ của các phân nhóm của nhóm thế carboxymethyl Carboxymethyl cellulose có thể kết hợp dễ dàng với thành phần hóa học thực phẩm như làm chậm sự kết tinh của đường, protein, tinh bột

và hầu hết các polymer trung tính

1.3 CELLULASE

1.3.1 Định nghĩa

Cellulase là các enzym xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành các sản phẩm hòa tan.

Trong thời gian đầu khi enzym học chưa phát triển, người ta thường gọi tên và phân loại enzym một cách tùy tiện Sau đó người ta gọi tên và phân loại enzym bằng cách lấy tên cơ chất đặc hiệu của enzym cộng thêm đuôi “ase”, vì vậy các enzym phân giải cellulose có tên là cellulase

1.3.2 Tính chất của enzym cellulase

Tính đặc hiệu: Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như CMC

hoặc hydroxylethyl cellulose (HEC) Cellulase cắt liên kết β - 1- 4 - glucoside trong cellulose, lichenin và các β - D - glucan của ngũ cốc Người ta cho rằng đầu tiên exoglucanase tác động trên các đầu chuỗi mới tạo thành để sản xuất chủ yếu cellobiose, β- glucosidase thủy phân các gốc β -D- glucose cuối cùng từ các đầu của phân tử cellulose Trong tự nhiên cellulose thường kết hợp với các thành phần khác như hemicellulose, lignin và pectin Các cellulase SERVA chứa một số hoạt tính khác tham gia bẻ gãy các thành phần này và phân hủy vách tế bào

Đặc tính lý hóa học: Hầu hết các cellulase nghiên cứu có pH tối ưn, tính hòa tan

và thành phần acid amin giống nhau Độ bền nhiệt và tnhs đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau Cellulase hoạt động ở pH từ 3 - 7, nhưng pH tối thích trong khoảng 4 - 5 Nhiệt độ tối ưu từ 40 -50oC Hoạt tính cellulase bị phá hủy hoàn toàn ở 80oC trong 10 đến 15 phút

Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose

và bị ức chế hoàn toàn bởi Hg Ngoài ra, cellulase còn bị ức chế bởi các ion kim loại khác như Mn, Ag, Zn nhưng ở mức độ nhẹ Trọng lượng của enzyme cellulase thay đổi từ 30- 110 Kda [12]

1.3.3 Cấu trúc của enzym cellulase

Cellulase là nhóm enzym thủy phân cellulose kết tinh bằng cách bẻ gãy các liên kết β-1- 4 glucan Trong đó β-glucosidase là enzym chính trong quá trình phân giải cellulose β - glucosidase gồm 2 chuỗi A và B đều có 434 gốc nhưng chúng đều có những điểm khác nhau để phân biệt (như số nối β, γ) [2223]

Bảng 1.1 Đặc tính của enzym β - glucosidase

Hình 1.87 Cấu trúc β - glucosidase với các bản xoắn K (màu đỏ), các bản xoắn β

(màu vàng) và các nối β (màu xanh)Các bản xoắn β không song song tạo bề mặt chung với nhau (chúng cong và hình thành những mặt lõm và lồi với nhau) và tạo nên một thể tích được bao bọc bên ngoài bởi các chuỗi kỵ nước và một phần nhỏ ưa nước Phần ưa nước được hình thành bởi một số góc của bản xoắn Cấu hình tạo ra bởi các bản xoắn này làm xuất hiện một đường ống chạy dọc theo chiều dài của bản lõm và ống này được cho là vị trí hoạt động của enzyme

Có một nguyên tử Ca2+ ở cả hai chuỗi A và B của cellulase và ở mỗi chuỗi nó kết hợp với Glu 295 và Glu 325 Một phân tử nước được gắn vào phân tử Ca2+

Hình 1.98 Các nguyên tử Calcium có trong cellulase (β - Glucosidase) tại vị trí Glu

295 và Glu 325 trên cả hai chuỗi A và B

Β Β- Glucosidase là một enzyme chứa hai vùng xúc tác nối với một vùng gắn cellulose qua một vùng liên kết được glycoside hóa cao Phần trung tâm là một ống lớn Ống này cấu tạo bởi các vòng kéo dài từ phần trung tâm kẹp β Ống này có vị trí liên kết glycoside đặc hiệu (A-G) đặt cùng với các vị trí gắn đặc hiệu khác.

1.3.4 Thành phần của cellulase

Dựa trên kết quả phân tích sinh hóa của hệ thống cellulase từ vi khuẩn kị khí, hiếu khí và từ nấm, các nhà khoa học đã phân loại cellulose thành 3 nhóm cơ bản gồm:

- Endoglucanase hoặc 1,4 - β - D - glucan - 4 - glucanohydrolase (EG) , (EC 3.2.1.4), phân cắt tại vị trí vô định hình bên trong phân tử cellulose tạo ra các chuỗi oligosaccharide

-

- Exoglucanase, bao gồm 1,4-β- D-glucan glucanohydrolase (cellodextrinase)

(EC 3.2.1.74) và 1,4 - β - D - glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (CBH) (EC 3.2.1.91) Exoglucanase phân cắt từ đầu khử hoặc không khử của chuỗi cellulose tạo ra sản phẩm chính glucose hay cellobiose Exoglucanase hoạt động chủ yếu trên vùng cellulose tinh thể

- β- glucosidase hoặc β- glucoside glucohydrolase (BGL) (EC3.2.1.21) Thủy phân cellodextrin hòa tan và cellobiose thành glucose

Cellulase là một cấu trúc nhiều đơn vị bao gồm vị trí liên kết và thủy phân carbohydrate (CBD) CBD là tiểu phần có trong cấu trúc của cellulases và được phân chia thành 54 họ khác nhau Chức năng chủ yếu của CBD gắn kết vùng xúc tác vào cellulose tinh thể Sự gắn kết đưa vùng xúc tác lại gần vùng cellulose tinh thể cho sự thủy giải hiệu quả Sự gắn kết cellulase thông qua CBD bền vững, cũng cho thấy khả năng xúc tác cắt đứt các tương tác không cộng hóa trị giữa các chuỗi cellulose của vùng cellulose tinh thể

Một vài CBD khác ưu tiên gắn kết với vùng cellulose vô định hình Mô hình thủy phân cellulose được đề nghị lần đầu bởi Reese và các cộng sự, các CBD có vai trò làm “tróc” những đoạn cellulose từ bề mặt, gia tăng sự thủy giải cellulose

Hệ thống cellulase hoạt động phối hợp để nâng cao hiệu quả thủy phân cellulose

Vi sinh vật đã thích ứng theo nhiều cách khác nhau để gia tăng hiệu quả thủy phân cellulose cũng như hemicellulose và lignin trong tự nhiên Cellulase từ những nguồn

khác nhau có những đặc điểm khác nhau về pH tối ưu, độ hòa tan và thành phần amino acid Khả năng chịu nhiệt cũng như cơ chất tối ưu cũng thay đổi theo nguồn thu nhận, pH tối ưu thường khoảng 4 - 5 và nhiệt độ là 40 - 50°C.

1.3.5 Cơ chế thủy giải cellulose

Cơ chế thủy giải cellulose được chấp nhận hiện nay do hoạt động phối hợp của endoglucanase, exoglucanase (cellobiohydrolase) và β - glucosidase Endoglucanase thủy giải liên kết β - 1,4 - glucosid bên trong phân tử, exoglucanase tiếp tục phân cắt chuỗi cellulose tại hai đầu cuối tạo ra cellobiose hoặc glucose và β - glucosidase thủy giải cellobiose thành glucose (hình 1.10)

Hình 1.109 Cơ chế hoạt động của hệ cellulase của Trichoderma reesei

Trong quá trình thủy giải cellulose, cơ chất có sự thay đổi: Sự thay đổi số lượng đầu khử tạo ra bởi endoglucanase và các chuỗi này được exoglucanase sử dụng, sự thay đổi trong khả năng xâm nhập vào phân tử cellulose của enzym từ sự thủy phân cơ chất Hoạt động phối hợp của endoglucanase (EG) và exoglucanase làm thay đổi bề mặt cellulose qua thời gian làm cho thay đổi tỷ lệ thủy phân

Endoglucanase hoạt động trên vùng cellulose vô định hình và hoạt tính của chúng có thể được thử nghiệm bằng cơ chất cellulose hòa tan như carboxy methylcellulose

Tuy nhiên, một vài cellulases cho thấy cả hai hoạt tính endo- và exo- Chúng có

sự phối hợp rất cao giữa hai hoạt tính endo- và exo- cần thiết cho sự thủy phân cellulose hiệu quả

1.3.6 Ứng dụng enzyme cellulase

Công nghiệp dệt nhuộm: Cellulase là một trong ba nhóm enzym được ứng dụng

nhiều nhất trong công nghiệp dệt Chúng giúp cho vải bông mềm và sáng màu hơn thay thế cho đá bột được dùng truyền thống, giúp vết cắt hoàn hảo hơn, giúp điều chỉnh độ đậm nhạt cho vải sợi

Công nghiệp tẩy rửa: Cellulase, đặc biệt là EGIII và CBHI, thông thường được

dùng làm sạch vải sợi Những cellulase thu nhận từ những chủng nấm mốc:

Trichoderma T reesei, Trichoderma T viride, Trichoderma T.hH arzianum,

H.iInsolens… hoạt động trong môi trường kiềm nhẹ thường được ứng dụng trong công nghiệp tẩy rửa Chúng thường được dùng kết hợp với bột giặt và chất tẩy

Công nghiệp thực phẩm và thức ăn gia súc: Trong công nghiệp thực phẩm

cellulase được dùng trong dịch chiết làm trong nước ép trái cây, dùng trong dịch chiết dầu oliu Glucanase được thêm vào để cải thiện dịch mạch nha trong sản xuất bia rượu Cellulase cũng được dùng trong dịch chiết carotenoid cho sản xuất chất màu thực phẩm Sự điều chế phối hợp hoạt động cellulase, hemicellulase và pectinase cải thiện chất lượng dinh dưỡng thức ăn cỏ cho vật nuôi

Công nghiệp sản xuất giấy: Cellulase và hemicellulase đã được sử dụng chuyển

đổi bột gỗ thô thành bột gỗ mịn, loại màu bột gỗ tái sử dụng và cải thiện hệ thống thoát nước trong các nhà máy bột gỗ Chúng cũng được dùng sản xuất bột giấy mềm làm nguyên liệu cho sản xuất khăn giấy và giấy vệ sinh

Sản xuất nhiên liệu sinh học: Có lẽ ứng dụng quan trọng nhất của cellulase hiện

nay được dùng để sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối thực vật Cellulase có thể chuyển đổi sinh khối thực vật thành đường glucose và các đường khác mà chúng có khả năng được vi sinh vật sử dụng như là nguồn cơ chất sản xuất ethanol và protein đơn bào Hiện nay, sản xuất ethanol từ sinh khối thực vật trải qua quá trính gồm nhiều bước: Tiền xử lí loại bỏ lignin, thủy giải cellulose thành các loại đường có khả năng lên men bằng cellulase ở nhiệt độ 50oC và cuối cùng dùng vi sinh vật để sản xuất ethanol Tuy nhiên, quá trình này lại chưa hiệu quả về mặt kinh tế

1.3.7 Hệ thống cellulase không phức hợp

Nấm sợi sản xuất lượng lớn cellulase ngoại bào Các loại enzym này không hình

thành phức hợp phân tử có trọng lượng lớn nên thường được gọi là “Hệ thống

cellulase không phức hợp” Hệ thống cellulase của TrichodermaT reesei được tập

trung nghiên cứu trong hơn 50 năm qua và có nhiều ứng dụng trong công nghiệp

TrichodermaT reesei tạo ra hai loại exoglucanase (CBHI và CBHII), năm loại

endoglucanase (EGI, EGII, EGIII, EGIV, và EGV) và hai loại ß - glucosidase (BGLI và BGLII) [13]

Hai loại exoglucanase chuyên biệt cho hoạt tính phân cắt từ đầu đường khử CBHI và đầu không khử CBHII chiếm tương ứng 60 và 20 % hệ thống cellulase

TrichodermaT reesei Mô hình tinh thể đã giải thích cấu trúc của hai loại

exoglucanase này CBHI có bốn vòng trên bề mặt tạo ra một ống với chiều dài 50

Å, CBHII có hai vòng trên bề mặt tạo ra một ống với chiều dài 20 Å Cấu trúc ống cần thiết cho quá trình phân cắt cellulose từ đầu khử và không khử Tuy nhiên, hoạt tính cả hai loại cellobiohydrolase giảm khi mức độ polymer hóa của cellulose giảm Cellobiose, sản phẩm chính của hoạt tính thủy giải CBHI và CHBII, sẽ kìm hãm hoạt tính cellobiohydrolase và endoglucanase Cấu trúc EGI bao gồm nhiều vòng ngắn tạo ra một đường rãnh Các rãnh cho phép cellulose đi vào và thủy giải EGIII có cấu trúc tương tự EGI, đây là endoglucanase thiếu vùng CBD Tuy nhiên,

các endoglucanase của Trichoderma T reesei chiếm vai trò không lớn trong quá

trình thủy giải cellulose, chúng chiếm không tới 20 % tổng số cellulase

TrichodermaT reesei tạo ra ít nhất hai loại ß - glucosidase tham gia thủy giải

cellobiose và các oligosaccharide thành glucose

Cả hai loại BGLI và BGLII thu nhận được trong dịch nuôi cấy và cũng được gắn lên vách tế bào ß - glucosidase trên vách tế bào làm giảm khả năng mất glucose

vào môi trường khi thủy phân cellobiose TrichodermaT reesei sản xuất ß - glucosidase thấp hơn những loại nấm khác như Aspergillus sSp Hơn nữa, ß - glucosidase của TrichodermaT reesei bị kìm hãm mạnh bởi glucose so với

Aspergillus Trong công nghiệp hiện nay, cellulase của Trichoderma.T reesei được

bổ sung với ß - glucosidase của Aspergillus làm tăng khả năng đường hóa của

chúng [15], [29318]

Loài nấm trắng Phanerochaete chrysosporium được dùng cho nghiên cứu

phân hủy lignocellulose Chúng tạo ra nhiều phức hợp enzym phân hủy cellulose,

hemicellulose, và lignin là thành phần chủ yếu của vách tế bào thực vật Sự phân hủy cellulose và hemicellulose thường được xảy ra trước, trong khi sự biến dưỡng lignin xảy ra sau khi có sự giới hạn nguồn carbon, nitrogen, hoặc sulfur.

1.3.8 Cellulosome - Hệ thống cellulase phức hợp

Những vi khuẩn kị khí thiếu khả năng xâm nhập vào bên trong vật liệu cellulose và do đó chúng phải tìm ra một cơ chế hữu hiệu cho sự phân hủy cellulose khi có sự hiện diện cạnh tranh của nhiều vi sinh vật khác và bị giới hạn bởi ATP

cho sự tổng hợp cellulase Điều này đã dẫn đến sự phát triển của “Hệ thống

cellulase phức hợp”, gọi là cellulosome, thường được tìm thấy ở các loài Clostridia

và Ruminococcus Các cellulosome kết hợp với nhau tạo thành các polycellulosome

và được gắn lên vách tế bào có đường kính 60 - 200 nm

Mỗi polycellulosome chứa đựng vài trăm cellulosome Cellulosome là phức hợp ngoại bào lớn và tương đối bền vững, trọng lượng phân tử từ 2 - 16 MDa đối với cellulosome và có thể đạt đến trọng lượng 100 MDa đối với polycellulosome Cellulosome được phát hiện lần đầu bởi Bayer và Lamed khi quan sát thấy những

khối u trên bề mặt tế bào Clostridium thermocellum và phức hợp này chứa protein

không có hoạt tính xúc tác có chức năng gắn liên kết các tiểu đơn vị enzym

Cellulosome không chỉ phân hủy cellulose tinh thể, mà còn phân hủy hemicellulose, chitin, thậm chí cả pectin Cellulosome có khả năng phối hợp hoạt tính các enzym trong không gian gần với vách tế bào vi khuẩn và có khả năng phối hợp hoạt tính giữa các cellulose hiện diện bên trong cellulosome Cellulosome thường chứa 6 đến 13% carbohydrate, có vai trò bảo vệ khỏi hoạt tính của protease

và cũng có thể có vai trò quan trọng trong sự nhận diện các cohensin

Các sản phẩm thủy giải cellulose cũng được tế bào hấp thu tốt hơn do có sự tiếp xúc với vách tế bào Cellulosome gắn kết rất linh hoạt với cellulose tinh thể

Cellulosome được tìm thấy ở nhiều loài vi khuẩn: ClostridiumC cellulovoran,

ClostridiumC cellulolyticum, ClostridiumC josui, ClostridiumC acetobutylicum, Acetovibrio cellulolyticus, Bacteroides cellulosolvens, Ruminococcus albus, RuminococcusR flavefaciens, Vibrio sp và nhóm nấm kị khí Neocallimastix, Piromyces và Orpinomyces Thành phần quan trọng của cellulosome là protein

scaffoldin không có hoạt tính xúc tác, có chức năng tập hợp các tiểu đơn vị cellulase Các tiểu đơn vị xúc tác chứa những vùng dockerin khác nhau có trách

nhiệm gắn vào scaffoldin Mối quan hệ này được thể hiện vùng cohesin trên scaffoldin, gắn kết với vùng, dockerin trên enzyme và CBD trên scaffoldin liên kết phức hợp với cellulose

Có ít nhất tám gen scaffoldin từ vi khuẩn thủy giải cellulose đã được giải trình

tự (bảng 1.2) Chúng bao gồm cipA của ClostridiumC thermocellum, cbpA của

ClostridiumC cellulovoran, cipC của ClostridiumC cellulolyticum, cipA của ClostridiumC josui, cipA của ClostridiumC acetobutylicum , scaB của RuminococcusR flavefacien, cipBc của BacteroidesB cellulosolven và cipV của AcetovibrioA cellulolyticus Phức hợp cellulosome của ClostridiumC thermocellum tương tự như những loài vi khuẩn ưa nhiệt trung bình ClostridiumC cellulovoran và ClostridiumC cellulolyticum.

Bảng 1.2 Vi khuẩn sản xuất hệ thống cellulosome

Tên các chủng vi khuẩn Nhiệt độ tối ưu Nguồn phân lập

Acetivibrio cellulolyticus M SewageNước thải

Bacteroides cellulosolvens M SewageNước thải

Butyrivibrio fibrisolvens M RumenDịch dạ cỏ bò

Clostridium cellulovorans M Wood fermenterGỗ mùn

Clostridium cellobioparum M RumenDịch dạ cỏ bò

Clostridium cellulolyticum M CompostPhân hỗn hợp

Clostridium papyrosolvens M Paper millGiấy nghiền

Clostridium thermocellum T Sewage soilĐất

Ruminococcus flavefaciens M RumenDạ cỏ bò

Ruminococcus succinogenes M Dạ cỏ bòRumen

ClostridiumC acetobutylicum không thủy phân cellulose, phân tích trình tự

genome cho thấy có sự hiện diện của nhóm gen mã hóa cho cellulosome Nhóm gen này bao gồm gen mã hóa protein scaffolding CipA, endocellulase Cel48A, vài endoglucanase nhóm 5 và 9, mannanase Man5G và protein kị nước, OrfXp Tổ chức

gen này tương đồng với của ClostridiumC cellulolyticum

1.4 SƠ LƯỢC VỀ VI SINH VẬT PHÂN HỦY CELLOSE

1.4.1 Nấm mốc

Nhiều vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose nhưng chỉ có một vài vi sinh vật có khả năng phân hủy hiệu quả cellulose tinh thể [18] Các sinh vật phân hủy cellulose hiếu khí như vi khuẩn và nấm, sử dụng cellulose thông qua sản xuất số lượng lớn cellulase ngoại bào trong dịch nuôi cấy, mặc dù thỉnh thoảng cũng có sự hiện diện trên bề mặt tế bào Hầu hết các loài nấm đều có khả năng sử dụng cellulose như là nguồn cơ chất cho sự phát triển (hình 1.11)

Hình 1.1110 Hình dạng của nấm mốc

Nhiều loài nấm nguyên thủy, như lớp nấm Chytridomycete kị khí, có khả năng

thủy giải cellulose trong vùng ruột của động vật nhai lại Khả năng thủy giải cellulose cũng được tìm thấy ở nhiều loài nấm kị khí khác Với xấp xỉ 700 loài nấm

giải cellulose Trái lại, ngành nấm Ascomycete, Basidiomycete và Deuteromycete,

mỗi ngành có hơn 15000 loài, thủy giải mạnh cellulose Nhiều giống nấm thu hút

nhiều sự nghiên cứu cho hoạt tính thủy giải cellulose và gỗ như: Chaetomium và Helotium (Ascomycetes), Coriolus, Phanerochaete, Poria, Schizophyllum và

Serpula (Basidiomycete) và Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium và Trichoderma (Deuteromycete).

Nấm mốc thuộc giống Trichoderma và Aspergillus là hai loài sản xuất được số

lượng lớn cellulase và đã có nhiều sản phẩm thương mại dùng trong công nghiệp

Trichoderma sản xuất ra lượng lớn endo - ß - glucanase và exo - ß - glucanase nhưng với mức độ thấp ß - glucosidase, trong khi đó giống Aspergillus sản xuất số

lượng lớn endo - ß - glucanase và ß - glucosidase nhưng với số lượng thấp exo-ß glucanase

Phức hợp cellulase của Trichoderma reesei có thể chuyển đổi hoàn toàn

cellulose tự nhiên cũng như các dẫn xuất của cellulose thành glucose Sự phát triển của các loại nấm cũng như sự sản xuất của các loại enzyme cellulase phụ thuộc nhiều vào thành phần môi trường, nước, pH, nhiệt độ, ánh sang và không khí môi trường xung quanh

Chủng Aspergillus fumigatus cho thấy khả năng sử dụng cellulose tinh thể như

là nguồn carbon duy nhất Chúng tạo ra nhiều loại cellulase ngoại bào, trong đó có 6 vạch có hoạt tính endoglucanase khi điện di trên gel polyacrylamide Hoạt tính CMCase tối ưu tại 65°C và pH = 2, cho thấy đây là loài vi sinh vật sản xuất endoglucanase ưa nhiệt và acid

1.4.2 Vi khuẩn sản xuất cellulase

Trong số các loài vi khuẩn, khả năng thủy giải cellulose được tìm thấy ở hai

bộ: Actinomycetales hiếu khí và Clostridiales kị khí Dựa vào các đặc điểm sinh lí,

vi khuẩn thủy giải cellulose có thể thấy bao gồm những nhóm sinh lí sau:

+ Vi khuẩn gram dương hiếu khí (Cellulomonas và Thermobifida)

+ Vi khuẩn nhầy hiếu (Cytophaga và Sporocytophaga)

+ + Vi khuẩn kỵ khí, gram dương

(Clostridium, Ruminococcus và Caldicellulosiruptor)

Thông thường, chỉ một vài loài trong những giống trên có hoạt tính thủy giải cellulose Các vi khuẩn này khác nhau trong việc sử dụng oxy, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ muối và cellulose trong môi trường tự nhiên Việc phân loại các vi khuẩn

kị khí sử dụng cellulose là hết sức phức tạp bởi vì gần đây nhiều chủng vi khuẩn không có khả năng thủy giải cellulose nhưng lại có hệ thống gene cellulosome

không được biểu hiện do sự sai hỏng của trình tự promoter như loài Clostridium acetobutylicum.

Các nhóm vi khuẩn kị khí và hiếu khí có sự khác nhau trong cơ chế thủy giải cellulose Hầu hết các vi khuẩn kị khí phân hủy cellulose thông qua hệ thống

cellulase phức hợp được tổ chức tốt như polycellulosome của Clostridium thermocellum Mặc dù, các vi khuẩn kị khí tùy nghi, phân bố rộng …, giống Cellulomonas là giống vi khuẩn kị khí tùy tiện duy nhất có hoạt tính phân hủy

cellulase Các vi khuẩn thủy giải cellulose hiếu khí trong đất thường được tìm thấy:

Bacillus, Micromonospora và Thermobifida

Gần đây, chủng Bacillus subtilis DR được phân lập từ suối nước nóng tạo ra

một vài loại cellulase bền nhiệt Nhiệt độ môi trường cao cho phép sản xuất ra loại endocellulase CelDR bền nhiệt với nhiệt độ tối ưu lên đến 50°C và hoạt tính này vẫn còn đến 70 % tại 75°C sau khi ủ 30 phút Chủng vi khuẩn này cho thấy có nhiều tiềm năng dùng trong công nghiệp lọc dầu bởi vì khả năng chịu được nhiệt

độ cao

Hình 1.1211 Hình dạng vi khuẩn Bacillus

Chủng vi khuẩn ưa nhiệt thủy giải cellulose Brevibacillus sp JXL có khả năng

sử dụng nhiều loại cơ chất như cellulose tinh thể, CMC, xylan, cellobiose, glucose

và xylose Enzym của Brevibacillus sp JXL có khả năng bền nhiệt rất cao, vẫn giữ

được 50% sau khi xử lý tại 100°C trong một giờ

Những loài vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose (Fibrobacter, Ruminococcus và Clostridium) thường giới hạn trong phạm vi sử dụng carbohydrate, phát triển trên cellulose và những sản phẩm thủy phân của chúng nhưng không phát triển trên

đường đơn, đường đôi, đường đa được cấu thành bởi các đơn phân khác glucose

Clostridium C thermocellum phát triển chậm trên môi trường glucose và cả

ClostridiumC thermocellum và RuminococcusR albus dùng cellobiose ưu tiên hơn so với glucose Một vài loài vi khuẩn kị khí thủy giải cellulose có thể sử dụng

xylan

Hình 1.1312 Hình dạng vi khuẩn Clostridium

Một vài báo cáo gần đây cho thấy các vi khuẩn kị khí phân giải cellulose

(Anaerocellum thermophilum, ClostridiumC saccharolyticus và Halocella cellulolytica) có phạm vi rộng trong việc sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau với

các hợp chất tinh bột, đường đơn, đường đa [19], [2021], [2324] Các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của những loài thủy giải cellulose bao gồm: nitrogen, phospho, lưu huỳnh, các khoáng đa lượng, vi lượng và một số loại vitamin Một vài vi khuẩn thủy giải cellulose cần các yếu tố cho sự phát triển mạnh như pepton hay dịch chiết nấm men [272830]

1.5 TỔNG QUAN VỀ CÔNG TY CỔ PHẦN TH TRUE MILK

1.5.1 Lịch sử hình thành và phát triển

Trang trại của tập đoàn TH tại Nghĩa Đàn (Nghệ An) là một dự án chăn nuôi bò sữa lớn nhất Đông Nam Á (hình 1.16) Dự án này (với thương hiệu TH True Milk) triển khai tháng 10/2009 trên tổng diện tích 37.000 ha tại huyện Nghĩa Đàn, Nghệ An với tổng vốn đầu tư trên 1,2 tỷ USD

Hình 1.1613 Trang trại bò sữa TH True milk ở huyện Nghĩa Đàn, tỉnh Nghệ An

Với sự đầu tư nghiêm túc và dài hạn kết hợp với công nghệ hiện đại nhất thế giới, với tinh thần gần gũi với thiên nhiên, Tập đoàn TH luôn nỗ lực hết mình để nuôi dưỡng thể chất và tâm hồn Việt bằng cách cung cấp những sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên - sạch, an toàn, tươi ngon và bổ dưỡng

Công ty cổ phần Sữa TH đã giới thiệu ra thị trường sản phẩm sữa sạch TH true Milk tại xã Nghĩa Sơn, huyện Nghĩa Đàn, tỉnh Nghệ An Đây là thành quả của dự án Chăn nuôi bò sữa và chế biến sữa sạch quy mô lớn của Đông Nam Á Bằng sự ra đời của các sản phẩm TH true Milk, Công ty cổ phần Sữa TH đang từng bước khẳng định mục tiêu trở thành nhà sản xuất hàng đầu trong ngành hàng thực phẩm

Từ xuất phát điểm đó, Tập đoàn TH đang từng bước phát triển để trở thành nhà sản xuất hàng đầu Việt Nam cung cấp các sản phẩm thực phẩm sạch có nguồn gốc từ thiên nhiên, trong đó có sữa tươi, thịt, rau củ quả sạch, thủy hải sản… đạt chất lượng quốc tế Với tiêu chí giữ vẹn nguyên tinh túy thiên nhiên trong từng sản phẩm, Tập đoàn TH đã trang bị công nghệ hiện đại cũng như nguồn nhân lực hàng đầu thế giới Tập đoàn TH cũng ứng dụng hệ thống quản lý cao cấp và quy trình sản xuất khép kín đồng bộ từ khâu nuôi trồng đến phân phối sản phẩm tận tay người tiêu dùung Tất cả đều nhằm mục đích phục vụ người tiêu dùng những sản phẩm sạch, an toàn, tươi ngon

và bổ dưỡng nhất

Danh mục sản phẩm của Tập đoàn TH hiện nay bao gồm các sản phẩm sữa tươi tiệt trùng TH true Milk Tập đoàn TH cũng đang phát triển hệ thống cửa hàng bán lẻ

TH truemart Hiện nay, bò tại trang trại TH được nhập khẩu từ các nước nổi tiếng về chăn nuôi bò sữa như: New Zealand, Uruguay, Canada… để đảm bảo nguồn con giống tốt, từ đó cho chất lượng sữa tốt nhất.

Tuy mới thành lập được bảy năm, nhưng thương hiệu sữa sạch TH True Milk được người Việt nhắc đến với đầy niềm tự hào Đây là thương hiệu sữa có trang trại

bò hiện đại nhất Đông Nam Á, có doanh thu hơn 1 tỷ USD, đang là thương hiệu “sữa sach” không có đối thủ trên thị trường Việt Nam

1.5.2 Công nghệ chăn nuôi bò sữaThực trạng chăn nuôi bò sữa ở công ty THtruemi k l k

Trang trại TH True Milk hiện có 45.000 con bò sữa với hơn 22.000 con cho sữa, cho năng suất sữa bình quân 40 lít/ con/ ngày được nuôi trong trang trại tập trung và khép kín (hình 1.17)

Hình 1.174 Bò sữa tại trang trại TH True Milk

Đàn bò tại đây được chăm sóc với công nghệ hiện đại: Nuôi dưỡng bằng nguồn dưỡng chất tự nhiên, cỏ được qua ủ chua theo công thức của các chuyên gia dinh dưỡng để khống chế sự phát triển của các virus lạ từ môi trường Nước sạch dùng cho

bò uống được lọc bằng công nghệ Amiad tối tân Sữa được vắt qua một hệ thống dây chuyền hiện đại Bò được theo dõi tình trạng sức khỏe bằng hệ thống máy tính 100 %

Bò được nghe nhạc và tắm mát mỗi ngày

Mỗi chân một con bò đều được gắn chíp (thay vì gắn chíp vào cổ như thông thường), giúp việc thu thập dữ liệu đạt độ chính xác cao, từ đó giúp sớm phát hiện