PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG β – AGONIST(CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL) TRONG THỊT HEO

• Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở khoa học của các công trình nghiên cứu về Salbutamol Sal và Clenbuterol Clen được công bố trong và ngoài nước, chúng tôi đã thực hiện đề tài

PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG β – AGONIST

(CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL) TRONG THỊT HEO

• Trong chăn nuôi, các dược liệu này đã có lúc được đưa vào trong thức ăn gia súc nhằm làm

giảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với thú vật nuôi Theo nhiều nghiên cứu, các loại dược liệu này gây hại cho gia súc và cả cho người nếu ăn phải thịt thú vật nuôi bằng loại thức

ăn có trộn các loại dược liệu trên, vì các hóa chất thuộc nhóm β-agonist thường là những chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức năng gan.

1 Lí do chọn đề tài:

• Tại Châu Âu và Châu Mỹ, những loại hóa chất trên bị cấm sử dụng Ở Việt Nam, các loại dược liệu thuộc nhóm β-agonist trong đó có clenbuterol và salbutamol được xếp

vào danh mục 18 hóa chất bị cấm của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn

Tuy nhiên, các chất này vẫn còn bị một bộ phận người dân lén sử dụng trong chăn nuôi và việc kiểm tra sự hiện diện của chúng trong thức ăn gia súc Việc định lượng chính xác dư lượng của các β-agonist trong thức ăn chăn nuôi là vấn đề cần được

quan tâm trong công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm

• Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở khoa học của các công trình nghiên cứu về

Salbutamol (Sal) và Clenbuterol (Clen) được công bố trong và ngoài nước, chúng

tôi đã thực hiện đề tài “ Đánh giá hàm lượng các chất β-agonists (clenbuterol và

salbutamol) trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ” Nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng

1 Lí do chọn đề tài:

2 Mục đích nghiên cứu:

• Đề tài này được thực hiện với mong muốn:

• • Xây dựng được phương pháp phân tích dư lượng clen và sal trong thức ăn chăn nuôi, thịt gia súc, gia cầm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ đạt độ nhạy và

độ chọn lọc cao, đáp ứng được nhu cầu phân tích của các đơn vị kiểm nghiệm

trong nước

• • Theo dõi mức độ tồn lưu của Clen và Sal trong thực phẩm gà, heo khi nuôi gà, heo với thức ăn có chứa Clen và Sal

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

a Mẫu thịt heo: nuôi thử nghiệm với thức ăn có chứa nồng độ nhất định Clen và

Sal để kiểm tra khả năng tồn lưu của hai chất nầy

b Mẫu thịt dùng cho điều tra: được lấy từ các chợ đầu mối trên địa bàn Tp Hồ

Chí Minh, là nơi phân bố nguồn thịt chủ yếu đi khắp các quận trên thành phố

c Thiết bị phân tích:

Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực LC/MS/MS TSQ Quantum Access của Thermo Scientific (Công ty dịch vụ KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh)

Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ 1 tứ cực LC/MS 2010A của Shimadzu (Công ty dịch vụ KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh)

4 Phương pháp nghiên cứu:

• Xây dựng phương pháp chuẩn bị mẫu để tách chiết và làm giàu chất phân tích (Clenbuterol và Salbutamol) trước khi đưa vào máy sắc ký lỏng ghép khối phổ

• Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực để xác định khả năng

tồn dư Clen và Sal trong thịt heo.

B NỘI DUNG:

1 Tổng quan về Clenbutarol và Salbutamol

2 Các phương pháp phân tích dư lượng salbutamol và clenbutarol trong thịt heo:

3 Xác định dư lượng β2-Agonist trong thịt heo bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ.

1 Tổng quan về Clenbutarol và Salbutamol:

1.1 Khái quát về họ β- agonist:

-Trong lĩnh vực dược phẩm, β_agonist là nhóm chất được sử dụng nhiều trong điều trị bệnh hen suyễn, hai chất điển hình là Clenbuterol và Salbutamol

- Trong chăn nuôi, các dược liệu này đã có lúc được đưa vào trong thức ăn gia súc

nhằm giảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với thú vật nuôi Theo nhiều

nghiên cứu, các loại dược liệu này gây hại cho gia súc và cả cho người nếu ăn phải thịt thú vật nuôi bằng loại thức ăn có trộn các loại dược liệu trên, vì các hoá chất thuộc

nhóm β_agonist thường là những chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức năng gan.

• Tại Châu Âu và Châu Mỹ, những loại hoá chất trên bị cấm sử dụng Ở Việt Nam,

các loại dược liệu thuộc nhóm β_agonist trong đó có Clenbuterol và Salbutamol được xếp vào danh mục 18 hoá chất bị cấm của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn.

1.2 Giới thiệu về Clenbuterol và Salbutamol:

1.2.1 Clenbuterol:

-Công thức phân tử : C12H8Cl2ON2

- Khối lượng phân tử: 276.0796 ( đvC)

-Tên gọi: 2-(tert-butylamino)-1-(4-amino-3,5-diclophenyl) ethanol

- Tên thương mại: vetipulmin

- Hình dạng: tinh thể không màu, mịn.

- Nhiệt độ nóng chảy ( ℃ ): 174-175.5

- Nhiệt độ sôi ( ℃ ): 404.9

- pKa: 9.29

- Độ tan: tan nhiều trong nước, aceton, methanol; ít tan trong clorofom; không tan trong benzen

** Trong y học, Clenbuterol có tác dụng làm giãn phế quản, giãn cơ trơn ở cuống phổi, Clenbuterol còn là dược

phẩm được chỉ định để điều trị các chứng bệnh có liên quan đến phổi như hen, suyễn, tuy nhiên có thể hại đến hệ thần kinh và tuần hoàn của con người.

** Trong thú y,Clenbuterol được sử dụng để điều trị các căn bệnh dị ứng đường hô hấp ở ngựa (tên thương mại là

ventipulmin), điều trị bệnh đường hô hấp ở trâu bò,…Thuốc có thể thải qua đường tiểu và qua phân nhưng với thời gian rất dài.

** Trong y học, Clenbuterol có tác dụng làm giãn phế quản, giãn cơ trơn ở cuống phổi, Clenbuterol còn là dược phẩm được chỉ định để điều trị các chứng

bệnh có liên quan đến phổi như hen, suyễn, tuy nhiên có thể hại đến hệ thần kinh và tuần hoàn của con người.

** Trong thú y, Clenbuterol được sử dụng để điều trị các căn bệnh dị ứng

đường hô hấp ở ngựa (tên thương mại là ventipulmin), điều trị bệnh đường hô hấp ở trâu bò,…Thuốc có thể thải qua đường tiểu và qua phân nhưng với thời gian rất dài.

1.2.2 Salbutamol:

• Công thức phân tử : C13H21O3N

• Khối lượng phân tử: 239,152 (đvC)

• Tên gọi: 2-(tert-butylamino)-1-(3-hydroxyethyl-2-hydroxyphenyl) ethanol.

• Tên thương mại: Ventolin

• Hình dạng: tinh thể màu trắng, mịn.

• Nhiệt độ nóng chảy ( ): 157-158 ℃

• Nhiệt độ sôi ( ): 433.5 ℃

• pKa: 9.27

• Độ tan: tan nhiều trong nước, aceton và ethanol; ít tan trong eter

• ** Salbutanol được ứng dụng trong y học được dùng để điều trị bệnh hen suyễn rất hiệu nghiệm Thuốc điều trị hen suyễn có chứa Salbutanol có nhiều trên thị trường trong nước cũng như trên thế giới

• ** Tác dụng của Clenbuterol và Salbutamol lên động vật nuôi và người: Clenbuterol và Salbutamol tích luỹ trong thực phẩm thịt sẽ làm ảnh hưởng đến sức khoẻ người tiêu dùng thông qua dây chuyền thực phẩm, gây ra các triệu chứng rối loạn nhịp tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp, co thắt phế quản, phù nề, run cơ, liệt cơ, choáng váng,…

1.3 Những dấu hiệu nhận biết thịt gia súc gia cầm có chứa

Clenbutarol và Salbutamol:

• Với loại lợn siêu nạc tốt nhất ở nước ta hiện nay, người ta phải mất 5 tháng mới

đạt được trọng lượng 95-100 kg/con nhưng cho thêm 1 thìa cà phê salbutamol vào thức ăn (cho 10 con lợn loại 78-80kg/con), thời gian xuất chuồng rút ngắn chỉ còn 3 tháng.

• Người sử dụng chất tạo nạc này chỉ cho lợn ăn không quá nửa tháng trước khi

xuất chuồng nếu nuôi quá nửa tháng lợn sẽ tự khuỵu chân,vì hóa chất này làm

xương giòn Khắp người con lợn sẽ bắt đầu xuất hiện những vết lở rỉ nước.

• Theo ông Nguyễn Xuân Dương, Phó cục trưởng Cục Chăn nuôi (Bộ NN&PTNT): “

Nếu nhìn bằng mắt thường thì rất khó phân biệt thịt lợn được nuôi bằng thức ăn tạo nạc

và thịt nạc bình thường Để biết thịt lợn nào bị nhiễm chất tạo nạc thì phải lấy mẫu thịt

để kiểm tra, phân tích mới có thể đưa ra kết luận chắc chắn Tuy nhiên, người dân nên tránh những loại thịt lợn phần nạc có màu đỏ giống thịt bò”.

** Cách nhận biết thịt nào có chất tạo nạc hay thịt bình thường:

Đây là 4 đặc điểm nhận biết thịt siêu nạc có hóa chất theo các chuyên gia Cục Chăn nuôi:

2 Các phương pháp phân tích dư lượng salbutamol và clenbutarol trong thịt heo:

2.1 Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ GC/MS:

2.2 Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ đầu dò 3 tứ cực:

2.1 Xác đinh dư lượng β2- Agonists trong thịt heo bằng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ phổ GC/MS:

2.1.1 Giới thiệu chung:

Kết hợp kỹ thuật sắc ký khí và đầu dò khối phổ cho kỹ

thuật sắc ký khí khối phổ

Cấu tạo gọn nhẹ và giảm thời gian phân tích đi rất nhiều

Khả năng phân tích trong rất nhiều ứng dụng

GC/MS là công cụ hữu hiệu để xác định các hợp chất

chưa biết, cho độ phân giải cao và nhiều dữ liệu về điện tử

và hóa học của hợp chất

Ứng dụng nhiều trong pháp y, xét nghiệm, dược phẩm,

hóa dầu, môi trường, phân tích sinh học…

2.1.2 Nguyên tắc hệ thống GC/MS:

GC/MS là kỹ thuật phân tích có độ chọn lọc cao để xác định các chất nhờ vào quá

trình đo khối lượng, sắc ký khí GC gồm:

 Một pha động là pha khí, trong sắc ký lỏng pha động là pha lỏng.

Lưu ý : trong GC/MS là quá trình chuẩn bị mẫu và lựa chọn dung môi vì mẫu bị bẩn

hoặc phân hủy sẽ làm sai lệch độ nhạy của khối phổ rất nhiều

Các kỹ thuật chuẩn bị mẫu thường dùng:

 Chiết pha rắn (SPE)

 Chiết lỏng – lỏng (LLE)

 Vi chiết pha rắn (SPME).

Hệ thống sắc ký khí ghép nối khối phổ liên tục GCMS-TQ8040 Triple Quadrupole

GC/MS/MS của hãng Shimadzu

2.1.3 Quy trình định tính và định lượng β- agonists (salbutamol và clenbuterol):

Hầu hết các phương pháp phân tích sắc ký dùng phát hiện và định lượng salbutamol

và clenbuterol đều trãi qua ba giai đoạn như sau :

1 Chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu (mẫu nguyên liệu)

2 Làm sạch mẫu, loại tạp chất ra khỏi dịch chiết và làm giàu chất phân tích

3 Sử dụng các phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ để định lượng chất phân

tích

2.1.4 Thiết bị , hóa chất và dung dịch thử

2.1.4.1 Thiết bị :

Hệ thống máy LC- MS/MS Thermo Finnigan gồm:

 Hệ thống máy sắc ký lỏng: Bơm và hệ thống tiêm mẫu tự động

 Đầu dò khối phổ ba tứ cực TSQ Quantum Access với hai loại nguồn ion hóa ESI và APCI

 Cột sắc ký lỏng pha đảo Purospher Star C18, 150 mm x 4,6 mm, kích cỡ hạt 5 µm, cột bảo vệ pha đão C18 (hãng Merck)

 Phần mềm Xcalibur, điều khiển thiết bị và xử lý dữ liệu sắc ký

2.1.5 Chất chuẩn và nội chuẩn:

• Clenbuterol hydrochloride, Dr Ehrenstorfer, 95% (C12H18Cl2ON2,HCl)

• Clenbuterol–d9 (100 mg/L), Dr Ehrenstorfer (C12H 9D9 Cl2ON2)

• Salbutamol sulfate, Dr Ehrenstorfer, 99 % (C13H22O3N, ½ H2SO4)

• Salbutamol–d3 (100 mg/L), Dr Ehrenstorfer (C13H19D3O3N)

2.2 Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ đầu dò 3 tứ cực

• Đầu dò tứ cực có độ nhạy cao được sử dụng

trong phân tích định lượng một chất đã biết,

tạo được nhiều phân mảnh trong chế độ

MS/MS, thích hợp cho phân tích vi lượng các

chất đã biết trước cấu trúc.

• Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ đầu dò 3 tứ

cực (Agilent 6410 Triple quad LC/MS/MS) bao

gồm hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao LC1200

(thiết bị bơm mẫu tự động - HiP-ALS kèm bộ

phận điều chỉnh nhiệt độ - FC/ALS, bơm áp suất

cao - Binary SL, bộ phận loại khí - degasser, cột

phân tích) và đầu dò khối phổ.

2.2.1 Nguyên tắc hoạt động

Mẫu cần phân tích sẽ đi

qua một ống dẫn đến

đầu dò MS

diễn ra quá trình ion hóa trong buồng API với kiểu ESI, APCI hoặc APPI

Ion sinh ra tập trung và gia tốc bằng hệ quang học ion đưa vào bộ phân tích khối Tứ cực thứ nhất sẽ chọn ion mẹ có m/z xác định, các phân

mảnh của ion này được tạo ra tại buồng va chạm (collision cell) nhờ tương tác với khí trơ và được phân tích nhờ tứ cực thứ ba,

tạo ra tín hiệu đặc trưng tại bộ phận phát hiện ion

2.2.2 Cấu tạo đầu dò khối phổ ba tứ cực

Đầu dò khối phổ ba tứ cực bao gồm 4 bộ phận chính sau:

1 Nguồn ion hóa tại áp suất khí quyển: đầu dò khối phổ ba tứ cực 6410A có 4 nguồn ion gồm ESI, APCI, APPI và MMI

2 Hệ quang học ion (ion optics) là một bát cực (octopole) gồm tám thanh hình trục xếp song song có tác dụng như bộ lọc khối để đưa ion vào tứ cực thứ nhất Q1, ngoài ra còn còn có 2 thấu kính nằm trước và sau buồng va đập để hỗ trợ đưa ion vào buồng va đập và tứ cực thứ 3.

3 Bộ phân tích khối (mass analyzer) gồm một buồng va chạm (collision cell, được xem là tứ cực thứ hai Q2) đặt ở giữa 2 tứ cực (Q1 và Q3).

4 Đầu dò phát hiện ion (Dual Dynode Detector) gồm có 2 dynode đặt vuông góc với dòng các ion và phân tử trung tính đi ra khỏi bộ phân tích khối.

2.2.3 Ứng dụng hệ thống Agilent 6410 Triple quad LC/MS/MS

• Phân tích được các chỉ tiêu ở hàm lượng siêu

vết (ppb/ppt);

• Phân tích dư lượng các loại kháng sinh thuộc

nhóm A (theo quy định của châu Âu

• Các loại vitamin trong thực phẩm

• Dư lượng thuốc trừ sâu nhóm Carbamate, diệt

cỏ, thủy hải sản, thức ăn gia súc,…

• Hóc môn tăng trưởng (họ β-Agonist,

Clenbuterol, Salbutamol…) trong thịt gia súc,

thủy hải sản,…

Hệ thống HPLC bao gồm các bộ phận cơ bản như sau:

1.1 Bình chứa pha động :

Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ của

4 đường là 100%

Nhưng ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc thường sử dụng 2 hoặc 3

đường hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, đơn giản hơn ổn định quá trình rửa giải

Lưu ý: Tất cả dung môi đều phải là dung môi tinh khiết Tất cả các hóa chất dùng

để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là hóa chất tích khiết dùng cho phân tích.Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân tích

1.2 Bộ khử khí Degases

• Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động, tránh xảy

ra một số hiện tượng có thể có như sau:

• Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời gian lưu của peak thay đổi.

• Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể lọai trừ hết được thì bơm cao áp có thể không hút được dung môi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất và

hoạt động của cả hệ thống HPLC.

• Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích.

1.3 Bơm cao áp

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký Bơm phải tạt được áp suất cao khỏang 250-600bar và tạo dòng liên tục Lưu lượng

bơm từ 0.1 đến 10ml/phút

1.4 Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đồi

Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động (autosamper)

Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký.

1.6 Đầu dò

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc

ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất phân tích

mà lựa chọn lọai đầu dò phù hợp

Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…

1.7 Bộ phận ghi nhận tín hiệu

Bộ phận này ghi tín hệiu do đầu dò phát hiện

Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak như tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính tóan, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tich

1.8 In dữ liệu

Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển

2.2.4 Một số hệ thống HPLC

Ngày nay, phương pháp HPLC được ứng dụng rất rộng rãi trong lĩnh vực phân tích định tính cũng như định lượng các thành phần trong dược phẩm, thực phẩm, môi trường, hóa chất,…

Các hệ thống HPLC hiện đại phân tích như Shimadzu (model 10A, 20A), Agilent (LC 1200), Dionex (UltiMate 3000), Thermo, Mehtrom…với hầu hết các đầu dò như quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS), huỳnh quang (RF), khúc xạ (RI), đo độ dẫn (sắc ký ion-IC), khối phổ (MS),… Các hệ thống HPLC này đều có gắn các bộ chích mẫu tự động nhằm nâng cao tính chính xác và có thể phân tích đồng thời

nhiều mẫu