NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd. Et Wils, Magnoliaceae)

Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học nói chung và các thầy cô trong Bộ môn Tế bào – Mô – Phôi – Lý sinh nói riêng đã trang bị cho tôi những kiến thức quý

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC

HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd

Et Wils, Magnoliaceae)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA CÁC

HOẠT CHẤT PHÂN LẬP TỪ CÂY VÔNG NEM (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) VÀ CÂY HẬU PHÁC (Magnolia officinalis Rehd

Et Wils, Magnoliaceae)

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm

Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS HOÀNG THỊ MỸ NHUNG

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:

PGS.TS Trần Công Yên, người thầy đã tạo nên trong tôi niềm ham

thích với lĩnh vực nghiên cứu ung thư và thu nhận tôi vào nhóm Ung thư thực nghiệm Thầy đã luôn thấu hiểu và động viên những khi tôi gặp khó khăn trong những ngày đầu vào nhóm Tôi luôn cảm thấy mình may mắn khi

đã được học và làm việc dưới sự hướng dẫn của thầy dù thời gian đó không dài

PGS.TS Nguyễn Thị Quỳ, người đồng sáng lập nhóm Ung thư thực

nghiệm Cô đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo lý thuyết và các kỹ năng thực nghiệm từ khi tôi còn là sinh viên đại học, tạo nền tảng giúp tôi phát triển luận văn của mình sau này Tôi cũng như các anh chị, các bạn học viên, sinh viên trong nhóm luôn muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô, cảm ơn cô đã luôn quan tâm và chia sẻ, ủng hộ các thế hệ sinh viên chúng tôi tiếp bước con đường đóng góp cho khoa học

TS Hoàng Thị Mỹ Nhung, người có ảnh hưởng lớn đến việc thôi thúc

tôi gia nhập nhóm Ung thư thực nghiệm mặc dù thời điểm đó tôi chưa có cơ hội được làm việc cùng cô Cô không chỉ là người gợi mở, giúp đỡ tôi thực hiện thí nghiệm mà còn tạo nên trong tôi lòng tin tưởng, mong muốn được chia sẻ những khó khăn, khúc mắc gặp phải trong công việc và chủ động nêu lên ý kiến của mình Tôi đã học được ở cô không chỉ kiến thức, kỹ thuật mà còn cả tính lạc quan, bình tĩnh xử lý và tháo gỡ những khó khăn gặp phải Cô

đã, đang và sẽ luôn là một tấm gương cho tôi học tập và cố gắng

ThS Bùi Thị Vân Khánh, chị là người tôi có cơ hội được làm việc cùng

ngay từ những ngày đầu gia nhập nhóm nghiên cứu Với vai trò là thành viên

cơ hữu dày kinh nghiệm, chị đã luôn tận tâm chỉ bảo, chia sẻ những kinh nghiệm thực nghiệm quý báu và những khúc mắc trong cuộc sống với những

thế hệ học viên, sinh viên đi sau như tôi Đặc biệt trong khoảng thời gian chuẩn bị bảo vệ, chị đã luôn sẵn sàng giúp đỡ và động viên tôi rất nhiều

Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học nói chung và các thầy cô trong Bộ môn Tế bào – Mô – Phôi – Lý sinh nói

riêng đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu, cách tư duy, làm việc, tạo nền tảng vững chắc giúp tôi thực hiện luận văn cũng như công việc của mình sau này

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới những người bạn lớp K51B Công nghệ Sinh học, các anh chị, các bạn và các em sinh viên đã và đang là thành viên trong nhóm Ung thư thực nghiệm, Bộ môn Tế bào – Mô – Phôi –

Lý sinh, Khoa Sinh học đã luôn ở bên cạnh, chia sẻ với tôi những khi tôi gặp

khó khăn trong công việc và cuộc sống Tôi rất may mắn có được những người bạn, những người anh chị em thực sự như vậy

Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm, ĐH Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ và TS Phương Thiện Thương, Viện Dược liệu Trung ương đã cung cấp mẫu để chúng tôi thực hiện nghiên cứu này

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình đã luôn ủng

hộ và tin tưởng tôi, góp ý và tôn trọng những lựa chọn của tôi trong suốt thời gian tôi học tập xa nhà, giúp tôi có một chỗ dựa vững chắc hoàn thành những lựa chọn của mình

Luận văn được thực hiện dưới sự tài trợ kinh phí từ đề tài Trọng điểm Đại học Quốc gia Hà Nội, mã số QGTĐ 10.28

Hà Nội, tháng 12 năm 2012

Học viên

Nguyễn Thị Ngọc Ánh

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH MINH HỌA ix

BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT xiii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 3

1.1 T ng u n ung hư 3

1.1.1 Một số đặc điểm củ ung hư 3

1.1.2 Các gi i đoạn phá riển củ ung hư 5

1.2 Các m h nh sàng ọc huốc chống ung hư 8

1.2.1 Nu i cấy cơ u n 8

1.2.2 Nu i cấy tế bào 8

1.2.3 Nu i cấy khối cầu đ bào ung hư (mu ice u r umor spheroid)……… 10

1.2.4 M h nh in i o 12

1.3 Mộ số ng ế bào ung hư 14

1.3.1 D ng ế bào ung hư biểu m ruột kết ở người - HCT116 14

1.3.2 D ng ế bào ung hư biểu m c tử cung ở người - Hela 14

1.3.3 D ng ế bào ung hư biểu m ú ở người - MCF7 15

1.3.4 D ng ế bào ung hư ú ở người - KPL4 16

1.4 Chế ph m Hono io M gno o Derrone à huốc T o 16

1.4.1 Hono io (H) à M gno o (M) 16

1.4.2 Derrone (D) 19

1.4.3 Taxol (Paclitaxel) 20

1.5 Enzyme Aurora kinaza 22

CHƯƠNG 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Đối ượng nghiên cứu 25

2.2 Máy móc ụng cụ 25

2.3 Hó chất sử dụng 26

2.4 Phương pháp hoạ hó à nhân nu i các ng ế bào in vitro 27

2.5 Phương pháp hử độc ính MTS 28

2.6 Phương pháp hử độc ính rên m h nh spheroi 30

2.7 Phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang 31

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Kế u h o sá độc ính củ Hono io M gno o à Derrone rên m h nh 2D……… 33

3.1.1 Với ng HCT116 33

3.1.2 Với ng He 38

3.1.3 Với ng MCF7 41

3.1.4 Với ng KPL4 44

3.2 Kế u nghiên cứu ác động củ Hono io rên m h nh 3D hối cầu đ bào MCF7………… 51

3.2.1 Kết qu hí nghiệm heo õi sự ăng rưởng khối spheroid MCF7……… 51

3.2.2 Kết qu hí nghiệm kiểm r ác động củ Hono io ên uá r nh ạo khối spheroid MCF7 54

3.2.3 Kết qu hí nghiệm kiểm r ác động củ Hono io ên sự ăng rưởng của khối spheroid MCF7 56

3.3 Kết qu nghiên cứu nh hưởng củ Hono io ên hệ vi sợi actin 59

3.4 Kết qu nghiên cứu nh hưởng củ Derrone ên sự phosphory hó Histon H3 tại vị rí Serine 10 62

KẾT LUẬN 66

KIẾN NGHỊ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Dụng cụ và vật tư tiêu hao 25

Bảng 2: Thiết bị sử dụng 26

Bảng 3: Hóa chất sử dụng 26

Bảng 4: Dải nồng độ cuối cùng của thuốc thử trong giếng 28

Bảng 5: Chỉ số tăng sinh A(%) của dòng HCT116 sau 48h ủ với với Honokiol, Magnolol và Taxol 35

Bảng 6: Giá trị IC 50 của Honokiol, Magnolol và Taxol với dòng HCT116 38

Bảng 7: Chỉ số tăng sinh A(%) Hela với Honokiol và Taxol 39

Bảng 8: Giá trị IC 50 của Honokiol và Taxol với dòng Hela 41

Bảng 9: Chỉ số tăng sinh A(%) của MCF7 với Honokiol và Taxol 43

Bảng 10: Giá trị IC 50 của Honokiol (H) và Taxol với dòng TBUT MCF7 44

Bảng 11: Chỉ số tăng sinh A(%) của dòng KPL4 với Honokiol, Magnolol, Derrone và Taxol 47

Bảng 12: Giá trị IC 50 của Honokiol, Magnolol, Derrone và Taxol với dòng KPL4 50 Bảng 13: Tổng hợp giá trị IC 50 và chỉ số tương quan R 2 của Honokiol, Magnolol, Derrone và Taxol 50

Bảng 14:Thể tích của khối spheroid MCF7 qua 25 ngày sau khi hạ giọt treo 52

Bảng 15: Thể tích trung bình khối spheroid MCF7 trong 15 ngày theo dõi ủ với Honokiol 58

DANH MỤC HÌNH MINH HỌA

Hình 1: Sáu đặc trưng cơ bản của ung thư 3

Hình 2: Thận chuột được sử dụng để sàng lọc thuốc 8

Hình 3: Các TBUT HeLa bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy 9

Hình 4: Mô hình cấu trúc cơ bản của khối u invivo và khối cầu đa bào ung thư 10

Hình 5: Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết HCT116 ở người 14

Hình 6: TBUT vú MCF7 được nuôi cấy dạng đơn lớp in vitro 15

Hình 7: Cây Hậu phác bắc Magnolia officinalis Rehd Et wils (trái) và cấu trúc phân tử của hai đồng phân Honokiol và Magnolol (phải) 16

Hình 8: Cơ chế tác động của Honokiol (H) và Magnolol (M) lên con đường truyền tin dẫn đến apoptosis của tế bào 18

Hình 9: Cây vông nem Erythrina orientalis L., Fabaceae và công thức cấu tạo Derrone 19

Hình 10: Cấu trúc phân tử Taxol 20

Hình 11: Cơ chế tác động của Taxol lên tế bào gây apoptosis 22

Hình 12: Hình ảnh mô phỏng liên kết của Taxol với vi sợi tubulin 22

Hình 13: Các chất ức chế Aurora kinaza 24

Hình 14: Các dòng TBUT được bảo quản trong bình đựng Nito lỏng 27

Hình 15: Tế bào HCT116 mẫu ĐCSH (trái) và ĐCDM (phải) (100x) 33

Hình 16: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL (trái) và 10µg/mL (phải) (100x) 33

Hình 17: Tế bào HCT116 sau 48h ủ Magnolol ở nồng độ 5µg/mL (trái) và 50µg/mL (phải) (100x) 34

Hình 18: Tế bào HCT116 sau 48h ủ với Taxol nồng độ 0,003µg/mL (trái); 0,3µg/mL (giữa) và 30µg/mL (phải) (100x) 34 Hình 19: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của HCT116 với Honokiol (H)

Hình 34: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Magnolol NĐ 5 (trái), 20 (giữa) và 50µg/mL (phải) (100x) 45 Hình 35: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Derrone NĐ 5 (trái) và 20µg/mL (phải) (100x) 46 Hình 36: Tế bào KPL4 sau 48h ủ với Taxol NĐ 0,003 (trái); 0,3 (giữa) và 30µg/mL (phải) (100x) 46 Hình 37: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Honokiol (H) 48 Hình 38: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Magnolol (M) 48 Hình 39: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Derrone (D) 49 Hình 40: Đồ thị biểu diễn đường cong đáp ứng liều của KPL4 với Taxol 49 Hình 41: Đồ thị biểu diễn sự tăng trưởng thể tích của khối spheroid MCF7 sau 25 ngày kể từ khi hạ giọt treo 52 Hình 42: Khối spheroid MCF7 trong 25 ngày quan sát kể từ khi hạ giọt treo 53 Hình 43: Khối spheroid MCF7 ở mẫu ĐCSH sau 5 (a) và 7 (b) ngày, ủ với Honokiol NĐ 5µg/mL sau 5 (c) và 7 (d) ngày và không tạo khối khi ủ Honokiol NĐ 10µg/mL (e) 55 Hình 44: Khối spheroid MCF7 mẫu ĐCSH sau 5, 9, 13 và 15 ngày hạ giọt treo 56 Hình 45: Khối spheroid MCF7 ủ với Honokiol nồng độ 10µg/mL sau 5, 9, 13 và 15 ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x) 56 Hình 46: Khối spheroid MCF7 ủ với Honokiol nồng độ 20µg/mL sau 5, 9, 13 và 15 ngày hạ giọt treo (tương ứng từ trái qua phải) (400x) 57 Hình 47: Các khối spheroid dưới tác động của Honokiol trở nên lỏng lẻo về mặt cấu trúc, các tế bào bên ngoài bong tróc ra khỏi khối từ ngày thứ 9 sau khi hạ giọt treo (400x) 57

Hình 48: Đồ thị tăng trưởng thể tích của khối spheroid MCF7 dưới ảnh hưởng của Honokiol (H) 58 Hình 49: Ảnh hưởng của Honokiol lên hình thái tế bào Hela Tế bào đối chứng (trái); Tế bào Hela ủ với Honokiol NĐ 10 µg/mL (phải); màu đỏ: actin; màu lam: nhân tế bào 60 Hình 50: Sự rối loạn phân bố của F-actin dưới tác động của Honokiol tại NĐ 10 µg/mL sau 48h ủ 60 Hình 51: Tế bào Hela sau 24h ủ với Honokiol tại NĐ 20µg/mL 61 Hình 52: Sự biểu hiện H3PS10 tại các kỳ khác nhau trong quá trình phân chia của

tế bào 64 Hình 53: So sánh biểu hiện của H3PS10 tại các mẫu tế bào xử lý với Derrone (b); Magnonol (c); Honokiol (d) và mẫu đối chứng (a) 65

BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT

HCT116 Human colorectal carcinoma cell line

HeLa Henrietta Lacks' 'Immortal' cell line

NST Nhiễm sắc thể

PBS Đệm phosphate saline – Phosphate buffered saline

MỞ ĐẦU

Ung hư à nguyên nhân gây chế hàng đầu ở các nước có n n kinh tế phá triển à hứ hai ở các nước đ ng phá riển Gánh nặng ung hư ở các nước đ ng phá riển ăng ên o hậu qu của sự ăng ân số già hó ân số cũng như sự du nhập lối sống có i m năng gây ung hư như hú huốc á í ận động à hực ph m

“Tây hó ” Theo T chức Y tế thế giới – WHO có ho ng 12.7 triệu c ung hư à 7,6 triệu ca tử ong o ung hư được ghi nhận rong năm 2008 rong đó 56% số ca

à 64% rường hợp tử ong à ở các nước đ ng phá riển Cũng heo dự báo của WHO, tới năm 2020, số người mắc ung hư rên oàn cầu có hể ăng ên đến 15 triệu ca mới mỗi năm Tỷ lệ chế o ung hư có hể chiếm 25% t ng số ca tử vong Theo số liệu c ng bố tại Hội th o Quốc gi ph ng chống ung hư năm 2010 Việt

N m có 126.300 c mắc mới Căn bệnh n n y này đ ng ăng nh nh so ới 10 năm rước [1]

Vốn à mộ đấ nước được hiên nhiên ưu đãi nằm rong ùng nhiệ đới gió

mù Việ N m có một th m thực vậ cùng phong phú à đ ạng với hơn 12.000 oài hực vật bậc c o hác nh u Từ nhi u thế kỷ nay, thực vậ h ng chỉ à nguồn cung cấp inh ưỡng cho con người mà c n à những phương huốc chữa bệnh hết sức uý giá b o gồm thuốc chống ung hư nói riêng à các bệnh hác nói chung Bởi vậy, nghiên cứu m r các hợp chất từ nguồn ược liệu hiên nhiên có h năng chữ ung hư à mộ hướng nghiên cứu được nhi u nhà hoa học à hầy thuốc đầu

ư ập rung nghiên cứu trong nhi u năm n y

Trong u hướng này chúng i iến hành nghiên cứu hoạ ính háng u của

ba chất Hono io M gno o được ách chiết từ cây Hậu phác Magnolia officinalis

Rehd Et wils, Magnoliaceae à Derrone được ách chiết từ cây V ng nem

Erythrina orientalis L Murr., Fabaceae do Viện Dược liệu Trung ương cung cấp

cho nhóm Nghiên cứu Ung hư hực nghiệm, Khoa Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Đại học Quốc gi Hà Nội nhằm mục đích:

Kh o sá nh hưởng của ba chất Honokiol, M gno o à Derrone ên

sự tăng rưởng của một số ng ế bào ung hư nu i cấy đơn ớp 2D Nghiên cứu nh hưởng củ Hono io ên m h nh 3D hối cầu đ bào các tế bào ung hư

Bước đầu nghiên cứu cơ chế ác động của Hono io ên hệ thống vi sợi à ác động của ba chấ ên hoạ động của enzyme Aurora kinaza ở

tế bào ung hư

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN

1.1.1 Một số đặc điểm của ung thư

Trong uá r nh đ gi i đoạn h nh hành hối u, tế bào ung hư (TBUT) thu nhận à biểu hiện nhi u đặc điểm rong đó có sáu kh năng sinh học n i bật tạo nên đặc ính phức tạp v mặt t chức của bệnh, bao gồm: duy r ín hiệu ăng sinh; rốn ránh các yếu tố ức chế khối u; chống lại sự chết của tế bào; cho phép nhân ên gần như bất tử; c m ứng h nh hành mạch máu à hoạ hó uá r nh âm ấn à i căn Nguyên nhân sâu của những đặc điểm đặc rưng này à sự bất n của hệ gen trong TBUT dẫn đến những biến đ i v mặt di truy n đồng thời cũng hỗ trợ các chức năng rên Ngoài r những nghiên cứu gần đây đ xuất hêm h i đặc rưng hác củ ung hư b o gồm sự ái ập r nh r o đ i năng ượng à sự trốn ránh hệ thống miễn dịch Tuy nhiên cần những nghiên cứu sâu hơn để h i đặc rưng mới này được c ng nhận rộng rãi [14]

Hình 1: Sáu đặc trưng cơ bản của ung thư

V mặ h nh hái TBUT có sự h y đ i há rõ né so ới tế bào b nh hường:

 V nhân: Nhân ăng ích hước đ ạng, nhi u hùy đặc biệ có những nhân h ng lồ phân chi mạnh gọi à nhân uái nhân chi Màng nhân

ày ên à đường vi n h ng đ u

 V tỷ lệ giữ nhân à nguyên sinh chấ : Nhân o ên rong hi nguyên sinh chất hẹp lại

 V nguyên sinh chấ : Có nhi u t n hương hoái hó như nhi u hang, hốc… Nguyên sinh chất chứ các chất chế tiết, thể ùi

 Kh ng c n h năng ức chế tiếp úc nên ễ bong ra khỏi u

V mặt chức năng TBUT biệ hó ém h ng hực hiện được những chức năng b nh hường à ễ hoại tử Đặc biệ chúng iế r các chất chỉ điểm được gọi

à m r er như µFP CA125 (ung hư buồng trứng) CA25 (ung hư đại ràng) HCG (ung hư nhau thai inh hoàn)…

Khi u n sá uần thể TBUT các nhà ho học đã đư r ba học thuyế hác nhau nhằm gi i hích nguồn gốc quần thể này:

 Thuyế đơn ng: Là u n niệm inh điển cho rằng khối u phá sinh ừ một tế bào mẹ nhân ên Ví ụ: Ở bệnh bạch cầu tủy rên phụ nữ đen thấy đồng nhất loại tế bào hương n NST số 10 Các ế bào này đ u tiết men Glucose-6-phosphate dehydroglubuline

 Thuyế đ ng: Dự rên ết qu u n sá h nh hái à chức năng cho thấy t chức ung hư có nhi u loại tế bào nên hi chu n đoán ế bào học

dễ nhầm lẫn à có nhi u marker sinh học

 Thuyết v ém n định gen của TBUT: Có hể b n đầu à mộ ng o gen ung hư h ng n định nên có các ế bào biến dị sinh r hàng oạ các

tế bào hỗn hợp Ví ụ: u lympho ác ính ế bào ớn, tế bào nhỏ hoặc các loại ung hư ph i thể hỗn hợp ung hư m iên ết thể hỗn hợp

1.1.2 Các giai đoạn phát triển của ung thư

Theo Doug s à Rober Weinberg uá r nh iến triển củ ung hư có hể chi àm 6 gi i đoạn chính:

 Gi i đoạn khởi phá : Các TBUT nhận được các ín hiệu húc đ y sự ăng sinh à phân bào Các ín hiệu này có hể xuất hiện do sự h y đ i củ các yếu

tố ngoại bào hoặc do sự h y đ i bên rong hệ thống truy n ín hiệu nội bào dẫn tới sự ăng sinh à phân bào Thậm chí rong một số rường hợp đặc biệt, các ín hiệu ích hích phân bào có hể được tạo ra từ chính các TBUT Khi đó

tế bào được ích hích phân chi h ng giới hạn Quá r nh này iễn ra nhanh

à hoàn ất trong mộ ài giây h ng hể đ o ngược được Trong cuộc đời một con người có nhi u tế bào rong cơ hể có hể tr i u uá r nh hởi phá nhưng h ng ph i tất c các ế bào đ u phá sinh bệnh Đ số các ế bào hởi phá hoặc h ng iến triển, hoặc chế đi hoặc bị cơ chế miễn dịch hiệu hó

 Gi i đoạn húc đ y: Các ế bào rở nên “ c m” mộ cách bấ hường với các ín hiệu ức chế phân bào Trong các ế bào b nh hường, sự phân bào hường được ích hoạt bởi các ín hiệu nhấ định; à ồn tại song song với chúng à các ín hiệu ức chế phân bào B nh hường h i cơ chế này cùng tồn tại à phối hợp với nhau ở mức cân bằng ậy sự phân bào iễn ra n định

à có chức Ở các TBUT h sự ngăn c n phân bào bị ê iệ hi đó ế bào sẽ

u n được chuyển từ ph G1 s ng S để tiến hành s o chép ADN à bước ào

mộ chu r nh ế bào mới bất kể các s i hỏng ADN có được khắc phục hay

h ng Các ế bào s u gi i đoạn ăng rưởng này sẽ tiếp tục phá riển hành các hối u ác ính

 Gi i đoạn chuyển biến: Như đã biết, protein p53 giữ i r u n rọng rong uá r nh b o vệ cơ hể chống lại sự ích ũy s i hỏng ADN có hể gây nguy hiểm cho cơ hể Khi p53 bị mất chức năng này h con đường apoptosis của tế bào h ng hoạ động V ậy tế bào hỏng có hể sống à iếp tục nhân

ên nh nh chóng Những tế bào này có u hướng tạo r các hế hệ tế bào con

có mức độ sai hỏng c n c o hơn chính nó Hậu qu à mỗi tế bào con h nh hành đ u có nguy cơ chuyển hành các TBUT Như ậy có hể nói h năng hoá hỏi cơ chế chế heo chương r nh à “cột mốc” u n rọng để một TBUT phá riển hành hối u ác ính

 Gi i đoạn n ràn: Các TBUT có h năng s o chép ận Ở người, mỗi

tế bào som hường chỉ có h năng s o chép rung b nh ho ng 60 – 70 lần Tuy nhiên các TBUT có hể ượ uá số lần phân bào này nhờ việc ADN phần đầu mú nhiễm sắc thể được éo ài nhờ hoạ động mạnh của enzyme ADN telomeraza Khi các TBUT đạ đến gi i đoạn này chúng được gọi à các ế bào bất tử Gi i đoạn này có hể ngắn ài háng hoặc cũng có hể éo ài ài năm Trong gi i đoạn này hối u bành rướng gi ăng có hể từ 100 đến 1 triệu tế bào nhưng ẫn c n uá nhỏ để các phương pháp ho học phá hiện được

 Gi i đoạn củng cố: Các ế bào phá riển hệ thống tự nu i ưỡng Các m rong cơ hể đ bào đ u cần một hệ thống mạch máu cung cấp chất dinh ưỡng Các ế bào hối u ti n ác ính hường ăng rưởng chậm o chúng được

nu i ưỡng bởi hệ tuần hoàn b nh hường Nhưng ở các TBUT, khi khối u phá triển đến một mức nhấ định h uất hiện sự h nh hành mạch máu mới Lúc này các hối u được nu i ưỡng à phá riển rất mạnh Đây à mộ bước

“củng cố” các TBUT ác ính h nh hành mạch máu mới nu i ưỡng các hối u, giúp hối u phá riển mạnh mẽ à gây nguy hiểm cho cơ hể

 Gi i đoạn âm ấn à i căn: Ở gi i đoạn này các TBUT có h năng

âm ấn ào các ùng m hác à h nh hành hối u mới Hơn 90% số bệnh nhân bị ung hư đ u chế ào gi i đoạn hi các TBUT đã i căn ới các phần hác nh u củ cơ hể Khi các hối u i căn các TBUT rời khỏi khối u nguyên phá à i chuyển dọc heo đường máu hoặc đường bạch huyết tới các ị rí hác nh u rong cơ hể rước hi chúng rú ngụ ở vị rí mới à h nh hành hối ung hư mới Di căn heo đường bạch huyế hường gặp nhi u rong ung hư biểu m có hể n ràn heo đường bạch huyết tại chỗ à đ i hi àm ắc, rồi

n đến mạch bạch huyế ùng Trong phương hức i căn heo đường kế cận, các TBUT đi heo mạch máu à hần kinh, theo lối í hi bị c n trở như ung

hư ạ ày n u ớp thanh mạc ào bụng đến buồng trứng… Di căn heo đường máu hường gặp nhi u ở ung hư m iên ế Khi đó ế bào ế húc ở mao mạch à ăng rưởng ở đó Như ậy kết qu i căn à sự h nh hành các khối u thứ cấp ở vị rí có hể cách rất xa vị rí hối u nguyên phá b n đầu Khi ung hư đã iến triển đến gi i đoạn này h sự kiểm soá à đi u trị cực kỳ hó hăn Đây à gi i đoạn cuối cùng à nguy hiểm nhấ rong uá r nh phá riển

củ ung hư Với khối u ành ính, gi i đoạn này h ng y ra Các ế bào trong khối u ành ính sinh s n chậm à bám ào các m iên ết tại chỗ, khối

u có r nh giới rõ ràng à h ng gây c m giác đ u cho người bệnh nếu ích hước khối u h ng uá o h y chèn ép ào ây hần inh Do đó hối u ành

h ng gây nguy hiểm cho người bệnh à ễ chữa trị [14, 32, 36]

Kể từ hi ung hư uất hiện, lịch sử oài người đã sử dụng à phá riển nhi u phương pháp hác nh u để chống lại căn bệnh này như gi i phẫu, vậ ý rị liệu hó trị liệu, miễn dịch trị liệu đi u trị hướng đích…

Trước đây huốc chống ung hư được đư ào nhóm phương pháp hó rị liệu, trị liệu hóc m n à miễn dịch trị liệu Trong đó hó rị liệu lại bao gồm nhi u nhóm hác nh u ùy theo cấu rúc hó học à cơ chế ác động như nhóm y hó nhóm háng sinh nhóm chống chuyển hó nhóm ức chế topoisomeraza I à II nhóm ức chế phân bào các hợp chấ p inum à các hợp chấ hác Tuy nhiên nhóm cuối cùng này ẫn đ ng ngày càng mở rộng nên các nhà ho học đã đ xuất cách hức phân oại mới dự rên đích ác động Cụ thể các nhà ho học cho rằng thuốc chống ung hư có hể ác động ở nhi u mức độ hác nh u: TBUT, nội m chất n n ngoại bào h y hệ thống miễn dịch TBUT có hể trở hành đích ác động ở mức độ ADN, ARN hay protein Hầu hế các ác nhân hó rị liệu ương ác ới ADN của TBUT rong hi các háng hể đơn ng à các phân ử nhỏ được thiết kế

để ác động ở mức độ protein, mức độ nội m à mức độ chất n n ngoại bào Dù ở mức độ nào các hợp chấ để được phá riển hành huốc sử dụng cho người đ u cần

tr i qua mộ uá r nh sàng ọc nghiêm ngặt rên nhi u đối ượng cũng như uy m hác nh u Trong lịch sử phá riển ĩnh ực sàng ọc thuốc, đã có một số m h nh được sử dụng như:

1.2.1 Nuôi cấy cơ quan

Đây à oại m h nh được sử dụng từ những năm 1950 Các cơ u n được

ách r hỏi cơ hể đem nu i cấy in vitro S u đó chúng được ương ác ới các hợp

chất cần thử Ưu điểm củ m h nh này à uy r được ính nguyên ẹn củ m cũng như mối quan hệ giữa tế bào ới tế bào nhờ vậy mà nó có ính ương đồng cao

với đi u kiện in vivo Tuy nhiên o những hó hăn trong hác biệt v mẫu mà

việc đánh giá hiệu qu của thuốc có nhi u sai số, do vậy việc sử dụng m h nh này

bị hạn chế à hó để áp ụng ào sàng ọc thuốc uy m ớn [4]

Hình 2: Thận chuột được sử dụng để sàng lọc thuốc

1.2.2 Nuôi cấy tế bào

Như đã biế các hử nghiệm độc ính b n đầu được tiến hành rên sinh thiết khối u nu i cấy nhân ạo rong m i rường có hành phần h ng ác định, do vậy uá r nh định ượng rấ hó hăn Năm 1950, nhờ sự phá riển củ c ng nghệ

nu i cấy tế bào hành ạng đơn ớp 2D rong đĩ Pe ri hủy tinh hoặc nhựa, kết hợp

với sự phá riển củ m i rường có hành phần ác định v mặ hó học nên uy

r nh sàng ọc thuốc được tiến hành đơn gi n hơn rên các tế bào nu i cấy 2D này

Sử dụng các loại thuốc nhuộm protein sẽ cho phép chúng ác định được mối quan hệ đáp ứng li u giữ các ng ế bào hác nh u ới các nồng độ thuốc thử hác nh u [39]

Các tế bào hi được phân ập đem nu i cấy in vitro hường phá riển hành

dạng hoặc r i n i, hoặc bám ính, hoặc hỗn hợp c 2 loại Các oại TBUT sống r i

n i như ế bào u ympho TBUT máu h y ế bào ung hư m iên ết Sarcoma-180 Các ế bào này phá riển giống những h n đ o nhỏ r i n i rong m i rường nu i cấy Nhi u tế bào sống ở dạng bám ính như nguyên bào sợi, TBUT c tử cung HeLa, TBUT ú KPL4… Một số tế bào sống ở dạng hỗn hợp c bám ính c r i

n i như TBUT biểu m ph i 3LL [11, 27, 39]

Hình 3: Các TBUT HeLa bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy

Sử dụng m h nh tế bào 2D có nhi u ưu điểm như hời gi n sàng ọc ngắn, cho phép h o ác ới nhi u ng ế bào nhi u hợp chấ hác nh u à i nồng độ rộng cùng mộ úc Tuy nhiên m h nh này có nhược điểm à ương ác giữa TBUT với hợp chất chỉ theo một chi u, thiếu sự ương ác giữa TBUT với hệ miễn dịch

cũng như của hệ miễn dịch với hợp chấ Như ậy m h nh này h ng m phỏng

được đi u kiện in vivo củ cơ hể [39]

1.2.3 Nuôi cấy khối cầu đa bào ung thư (multicellular tumor spheroid)

M h nh nu i cấy khối cầu đ bào ung hư gọi tắ à m h nh spheroi à một khối h nh cầu được tạo nên ừ TBUT Để tạo được m h nh này người ta tiến hành nu i cấy giọ reo các TBUT Dưới ác dụng của trọng lực cùng ới các iên kết giữ các ế bào các TBUT tập trung lại à iên ết với nhau tạo nên các hối cầu nhỏ S u đó các hối cầu nhỏ này được đư ào các đĩ nu i cấy chứ m i rường nu i cấy ương ứng đã phủ một lớp giá đỡ bên ưới [11, 39]

Hình 4: Mô hình cấu trúc cơ bản của khối u invivo và khối cầu đa bào ung thư

Cấu rúc của một khối spheroid bao gồm:

 Lớp ng ngoài: Gồm kho ng từ 2-3 lớp tế bào sống phân chi mạnh xếp hí nh u Độ ày mỏng của lớp này ùy huộc từng ng ế bào hác

nh u ùy đi u kiện m i rường à ùy nguồn tế bào b n đầu ùng để tạo spheroid

 Lớp trung gian: Gồm những tế bào ẫn sống nhưng đã ngừng phân chi Các ế bào củ ùng này có hể h nhập để hành những tế bào củ ng ngoài hoặc ng rong ùy thuộc đi u kiện nu i cấy (có mạch máu hoặc

h ng nồng độ g ucozơ pH…) V i r củ ùng này há u n rọng rong các hí nghiệm đi u trị ung hư bằng hó chất, xạ trị

 Lớp rong cùng: à õi hoại tử, bao gồm những tế bào đã chết, có nhân

kế đặc lại nên ánh sáng u ng học h ng hể uyên u được, ậy lớp này có màu đen hi u n sá ưới ính hiển i Độ ày mỏng của lớp này

ùy huộc ào ừng gi i đoạn hác nh u của uá r nh sinh rưởng khối spheroid [34]

So với m h nh nu i cấy tế bào đơn ớp h cấu rúc của spheroid gần giống

với hệ thống in vivo hơn Các nghiên cứu gần đây cho hấy các tế bào được nu i cấy

rong m h nh 3D biểu hiện các đặc ính hác so ới khi nu i cấy 2D Những sự hác biệ này được coi như à yếu tố giúp m h nh 3D ph n ánh ố hơn sự ương ác

giữ các TBUT với m i rường in vivo như:

 V đặc điểm h nh hái: Các TBUT nu i cấy 2D có h nh hái r i rộng

h ng ự nhiên c n các TBUT nu i cấy 3D có sự iên ết chặt chẽ ba

chi u, co cụm giống với khối u in vivo

 V tốc độ ăng rưởng: Các TBUT nu i cấy 3D phá riển chậm hơn so với hi nu i cấy 2D Tốc độ phá riển ở m h nh 3D ph n ánh các m

h nh oán học động học của khối u in vivo tốt hơn so ới m h nh 2D

 Các TBUT rong m h nh 3D cũng biểu hiện uá r nh đường phân nhi u hơn à có sự hác biệt trong biểu hiện ở các gene chịu rách nhiệm trong

uá r nh ăng sinh mạch máu như VEGF ( scu r en o he i grow h factor), chemokine, IL-8 à các gene chịu rách nhiệm rong uá r nh i

nhập à âm hực của tế bào b o gồm Rho GTP se à FAK (foc adhesion kinaza)

 Các TBUT được nu i cấy 3D thể hiện ính háng mạnh hơn hoặc nhạy

c m hơn ới một số liệu pháp hó rị so với hi nu i cấy 2D ùy huộc

ào oại tế bào à oại thuốc Sự hác biệ rong độ nhạy này ở m h nh 3D có hể đặc rưng cho phương hức các TBUT đó đáp ứng với các

phương hức hó rị liệu ở mức độ in vivo [24]

Như ậy các hối cầu nhỏ này sẽ à m h nh ố hơn để đánh giá độc ính bởi lẽ chúng có cấu rúc ba chi u à m phỏng được sự khuếch án huốc ào các

m Spheroi c n cho phép đánh giá uá r nh âm nhập của thuốc ào các hối u

h ng có mạch máu đồng thời cũng đánh giá được ác động của O2, CO2 à sự âm nhập củ các chấ inh ưỡng rong m i rường ào các m này Gần đây các nhà khoa học đã iến hành đồng nu i cấy 3D các TBUT với các ế bào b nh hường cũng

có mặ rong i m i rường của khối u Khi đó các ác động của thuốc ên các ế bào ành ung u nh hối u có hể được kiểm chứng Hầu hế các nghiên cứu được thực hiện rên spheroi cũng được thực hiện rên các ng ế bào [24, 28, 30, 39, 47]

1.2.4 Mô hình in vivo

Thực nghiệm cho thấy rằng các TBUT của khối u ác ính rên cá hể này có thể cấy truy n cho các cá hể hác cùng ng à các TBUT này cũng có kh năng phá riển à giết chết vật chủ mới Tất c các ế bào b nh hường củ động vậ có ương sống rưởng hành à các ế bào ở khối u của thực vậ giun r n động vật da

g i à các ạng sống thấp hác h ng có h năng này Chỉ có các ạng sống t chức cao như cá ưỡng cư b sá chim à động vậ có ú có h năng bị khối u ác ính Rõ ràng ung hư à mộ căn bệnh c đại, các nhà ho học đã m hấy bằng chứng ung hư m iên ế ương ở ương hủng long từ hơn b y mươi triệu năm rước Do đó iệc sử dụng các m h nh động vậ để thay thế con người trong việc nghiên cứu ung hư à sàng ọc thuốc à đi u hoàn oàn có cơ sở khoa học [39]

Có nhi u oài động vậ được sử dụng để ây ựng m h nh in vivo như hỏ,

mèo chuộ cá gà… Trong số đó chuộ được sử dụng rộng rãi hơn c do sự ương đồng v mặt di truy n với con người cũng như sự tiện lợi hi nu i à chăm sóc rong ph ng hí nghiệm Chuột dễ sinh s n à đặc biệ à có sự n định hi ùng để gây ạo khối u thực nghiệm

M h nh in vivo có ưu điểm n i bậ à đánh giá được chính ác ác động của

thuốc ên hối u cũng như ên cơ hể do sự ương ác của c ba yếu tố: hệ miễn dịch, khối u à huốc quyế định Tuy nhiên uá r nh sàng ọc rên m h nh này ốn nhi u thời gi n hơn so ới các m h nh hác à cần có sự heo õi chặt chẽ hường uyên củ người àm hí nghiệm [40]

Như ậy có hể thấy ù sử dụng bấ m h nh nào cũng sẽ có những ưu

nhược điểm riêng Nhưng ễ thấy rằng m h nh nu i cấy tế bào 2D in vitro có h

năng ự động hó c o có hể sử dụng nhi u máy móc h y hế cho người àm hí nghiệm đồng thời rú ngắn được thời gi n h o ác rên nhi u ng ế bào ới nhi u hợp chấ hác nh u Do vậy m h nh này rấ phù hợp để sử dụng cho sàng ọc thuốc uy m ớn, nhấ à ới sự phá riển mộ ượng lớn các huốc có độc ính như hiện nay Mặ hác s u uá r nh sàng ọc uy m ớn chúng sẽ thu nhận được các hợp chấ có độc ính như mong muốn Lúc này m h nh 3D đóng i r như

m h nh rung gi n cho phép iến hành các hử nghiệm m phỏng m i rường in

vivo rong cơ hể với chi phí rẻ hơn ễ àng iến hành ở đi u kiện ph ng hí

nghiệm u n sá được rõ ràng à nh nh hơn cơ chế hâm nhập à ác động của thuốc ào m h nh hối u mà ại ránh được các ấn đ v đạo đức rên các hử

nghiệm động vậ S u đó m h nh in vivo sẽ trở hành mộ m h nh sàng ọc thứ cấp

cho phép đánh giá chính ác ác động của thuốc ên hối u rong cơ hể Việc sử

dụng m h nh in vitro như m h nh sàng ọc sơ cấp sẽ cho phép chúng iết kiệm

thời gi n cũng như inh phí hi sàng ọc một số ượng lớn, lựa chọn ra những hợp

chấ iêu biểu có ác ụng để tiến hành hử in vivo

1.3 M n b n h

1.3.1 Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết ở người - HCT116

HCT116 à ng ung hư biểu m ruột kết củ người, sống ở trạng hái bám

ính hi nu i cấy in vitro HCT116 có ph n ứng ương ính ới keratin khi nhuộm

immunopero i se có mộ đột biến ở codon 13 ở proto-oncogene r s à có hể sử dụng như đối chứng ương rong ph n ứng PCR kiểm r đột biến ở co on này Dạng ưỡng bội củ HCT116 có 45 NST chiếm 62% à ạng đ bội chiếm 6.8% Kết qu phân ích nhuộm G-band cho thấy 50% số tế bào HCT116 hiếu NST Y

Hình 5: Dòng tế bào ung thư biểu mô ruột kết HCT116 ở người

1.3.2 Dòng tế bào ung thư biểu mô cổ tử cung ở người - Hela

He à ng ế bào ung hư biểu m c tử cung ở người (Cervix enoc rcinom ) được ách ừ khối u ung hư c tử cung của một phụ nữ đen b mươi mốt tu i He có các m r er đặc hiệu à sống bám ính rong đi u kiện nu i

cấy in vitro 98% tế bào He có chứa một nhiễm sắc thể âm giữa nhỏ à 100% à

aneuploidy Thời gi n nhân đ i củ He à 23h

Tính đến n y đã có bốn marker nhiễm sắc thể (NST) điển h nh của Hela được ghi nhận, bao gồm: M1 – à mộ ùng ái sắp xếp giữ cánh ài à âm động của NST số 1 à cánh ài của NST số 3; M2 – à một t hợp củ cánh ngắn NST số

3 à cánh NST số 5; M3 – à mộ NST ương ự (isochromosome) củ cánh ngắn NST số 5; M4 - gồm cánh ài NST số 11 à mộ cánh của NST số 19 Nhuộm băng

G cho thấy tế bào He có một b n sao của M1, một b n sao của M2, bốn đến năm

b n sao củ M3 à h i b n sao củ M4 He có ph n ứng ương ính ới keratin khi nhuộm immunopero i se à có chứ r nh ự di truy n củ irus u nhú 18 của người (human papilloma virus 18 – HPV-18); biểu hiện p53 thấp à pRB (retinoblastoma suppressor) ở mức b nh hường

1.3.3 Dòng tế bào ung thư biểu mô vú ở người - MCF7

Hình 6: TBUT vú MCF7 được nuôi cấy dạng đơn lớp in vitro

MCF7 à ng ế bào ung hư biểu m ú hu ừ dịch màng ph i (vị rí i căn) của một phụ nữ sáu mươi chín tu i có đặc ính bám ính ới thời gi n nhân

đ i à 29h rong đi u kiện in vitro MCF7 có một số đặc ính của biểu m động vật

có ú đã biệ hó b o gồm kh năng ử ý es r io h ng u các hụ thể estrogen trong tế bào chấ à h năng ạo khối cầu MCF7 bị ức chế sinh rưởng bởi TNF-α

V mặt kiểu nhân h ng hường số ượng NST điển h nh củ MCF7 à 82 có hể

o động từ 66 – 87 NST D ng ế bào này có ho ng 29 – 34 marker NST, trong

đó 24 – 28 m r er à uất hiện hường uyên ở kho ng 30% tế bào

1.3.4 Dòng tế bào ung thư vú ở người - KPL4

KPL4 à ng ế bào ung hư ú ở người được phân ập từ dịch màng ph i ác ính của một bệnh nhân ung hư ú đã i căn s ng ung hư ạng iêm D ng ế bào này biểu hiện Erb B-1, Erb B-2 à Erb B-3 KPL4 có h năng gây u ở chuột sạch miễn dịch KPL4 được đánh giá à hữu dụng trong việc phá riển các chiến ược chống lại bệnh ung hư ú có biểu hiện uá mức các hụ thể họ Erb B

1.4.1 Honokiol (H) và Magnolol (M)

Vỏ cây à rễ củ các oài thuộc họ Ngọc lan Magnoliaceae đã được sử dụng như mộ phương huốc c truy n ở Hàn Quốc, Trung Quốc à Nhật b n để đi u trị nhi u chứng bệnh hác nh u b o gồm chứng o âu đột quỵ o ăng huyế áp sốt hương hàn rầm uấ đ u đầu à các chứng iên u n đến thần inh hác Trong số các hợp chấ ách chiế được từ các oài cây này các nhà ho học đặc biệ chú ý đến hai chấ Hono io à M gno o Đây à h i đồng phân của một hợp chất chứa

gốc pheno được ách chiết từ vỏ cây Hậu phác Magnolia officinalis Rehd Et wils,

c n gọi à Hậu phác bắc

Hình 7: Cây Hậu phác bắc Magnolia officinalis Rehd Et wils (trái) và cấu trúc phân tử

của hai đồng phân Honokiol và Magnolol (phải)

Honokiol (3,5'-diallyl-4,2'-dihydroxybiphenyl) chiếm kho ng 1-5% trọng ượng vỏ cây à M gno o (5,5'-diallyl-2,2'-dihydroxybiphenyl) chiếm kho ng 2-

10% đ u có c ng hức cấu tạo à C18H18O2 với trọng ượng phân ử M = 266,33 Theo các nhà ho học, hoạ ính của hai chấ này có được à nhờ các nhóm chức

hy ro y à y ic

M gno o hường được sử dụng để đi u trị đ u cấp ính ho chứng lo lắng à các chứng iên u n đến dạ ày Các ết qu khoa học đã c ng bố cho thấy

M gno o có hoạ ính háng hu n háng iêm chống o y hó chống ung hư

b o vệ tế bào hần kinh vỏ khỏi đi u kiện thiếu oxy (hypoxia) Trong hi đó Honokiol - đồng phân của Magnolol - hác với Magnolol ở cách sắp xếp của một nhóm chức y rên ng pheno Đây à mộ điểm quan trọng quyế định hoạ ính sinh học củ Hono io Các nhà ho học cũng phá hiện thấy Hono io có ược ính rộng như háng iêm chống đ ng máu chống rối loạn nhịp tim, b o vệ thần kinh, chống o y hó Các nghiên cứu hác cũng cho hấy Hono io có hể sử dụng như ác nhân chống stress, chất ức chế ung hư ti m năng à các hư hỏng do oxy

hó gây r Magnolol gây apoptosis ở nhi u ng TBUT như ung hư ph i CH-27, HL-60 ung hư ạ ày COLO 205 ung hư g n HepG2 rong hi Hono io gây apoptosis ở các ng TBUT buồng trứng SKOV3 ung hư máu Mo 4B ế bào ung

hư ruột kết RKO, TBUT ph i CH27, tế bào nội m chuyển dạng SVR à có hoạt

ính chống ung hư à ung hư m iên ết mạch SVR in vivo rên m h nh chuột

nhắt [3, 17, 21, 45, 46]

Thực hiện các nghiên cứu chuyên sâu hơn v cơ chế c m ứng apoptosis của Magnolol các nhà ho học đã chỉ ra rằng ưới ác động củ M gno o F s được

hoạ hó à cytochrome c được chuyển từ ty thể ra tế bào chấ h ng u chênh ệch

nồng độ ion Ca2+ tự do trong bào ương à uá r nh đi u h âm của Bcl-2 (B-cell

lymphoma 2) Th ng u sự hoạ hó F s và sự gi i phóng cy ochrome c, caspase-8

à caspase-9 được hoạ hó , từ đó éo heo chuỗi ph n ứng u i ng củ các

c sp se à ẫn đến apoptosis Xử ý ế bào ới ZB4 ( ác nhân àm gián đoạn cơ chế đáp ứng F s) cũng àm gi m ác động của caspase-8 c m ứng bởi Magnolol, từ đó

àm gi m ác suất x y r pop osis Tuy nhiên đến n y các nhà ho học vẫn chư

tr lời được liệu Magnolol hoạ hó F s rực tiếp h y nó ích hoạt hoạ động của một phối tử Fas rồi s u đó phối tử này mới hoạ hó F s [22, 38, 46]

Hình 8: Cơ chế tác động của Honokiol (H) và Magnolol (M) lên con đường truyền tin dẫn

đến apoptosis của tế bào

Trong hi đó Hono io được chứng minh à có ác động đi u h âm c-FLIP (FLICE- i e inhibi ory pro ein c n gọi à cFLAR) ở TBUT, dẫn đến àm TBUT mẫn c m hơn với các con đường apoptosis c m ứng bởi c TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) à F s Chỉ sử dụng Honokiol sẽ ức chế ở mức độ vừa

ph i sự ăng rưởng củ các TBUT ph i ở người trong khi nếu kết hợp với TRAIL,

nó sẽ àm gi m mạnh mẽ kh năng sống của tế bào à c m ứng apoptosis tố hơn so với chỉ sử dụng TRAIL Quá r nh apoptosis c m ứng bởi F s hi Hono io được sử dụng kết hợp với một phối tử Fas hoặc mộ háng hể háng F s cũng có ết qu ương ự

Trong tất c các pro ein iên u n đến uá r nh pop osis đã được kiểm tra

h c-FLIP à pro ein uy nhấ được đi u h âm nh nh chóng bởi Honokiol ở tất c các ng ế bào Đi u này cho hấy đi u h âm c-FLIP à mộ bước chủ chốt của

uá r nh ác động của Honokiol dẫn đến apoptosis c m ứng bởi thụ thể chết [2, 12,

15, 46] Cấu rúc 2 ng phenol chứ 2 nhóm y giúp ăng ái ực của Honokiol với các ế bào nội m ; nó hoạ động như ác nhân chống o y hó ức chế sự o y hó của lipoprotein có tỷ trọng thấp à uá r nh pop osis c m ứng bởi glucose ở tế bào nội m củ người nhờ các hoạ ính mạnh trong việc àm sạch các gốc tự do [5-8,

20, 19, 22, 23, 25, 26, 33, 38, 42, 44]

1.4.2 Derrone (D)

Cây V ng nem c n được gọi bằng nhi u ên gọi hác à cây á V ng H i

đồng b Thích đồng b có ên ho học à Erythrina orientalis L Murr., thuộc họ

Đậu Fabaceae Loài này phân bố rộng từ Ð ng Á ới châu Phi Ở châu Á oài này

ph biến ở Ấn Độ, Trung Quốc Thái L n C mpuchi Lào Việt Nam, Malaixia, Indonesia à Philippin Đây à một trong những vị thuốc ân gi n ở Việ N m à nhi u nước hác rên hế giới, có ác ụng n hần hạ huyế áp háng hu n à chống oãng ương

Hình 9: Cây vông nem Erythrina orientalis L., Fabaceae và công thức cấu tạo Derrone

Derrone (5,4-dihydroxy-7,8-(2,2-di- methylpyrano)isoflavone) có c ng hức

hó học à C20H16O5, M = 336,1 à hợp chất được ách chiết từ cây V ng nem

Erythrina orientalis (L.) Murr., Trong c ng r nh nghiên cứu được c ng bố ào

háng 6 năm 2012 Hayet Edziri à cộng sự đã chứng minh Derrone có ác động

háng hu n với vi khu n Pseudomonas aeruginosa à Escherichia coli với nồng

độ trong kho ng từ 7,81 – 15,62 µg/mL Ngoài r Derrone cũng hể hiện ính háng nấm mạnh với các oài huộc họ Candida ở nồng độ 7,81 µg/mL à có ính độc với

ng ế bào ung hư g n HepG2 Tuy nhiên các cơ chế chuyên sâu ác động của Derrone ên ế bào ẫn c n chư được biế rõ [10, 18]

1.4.3 Taxol (Paclitaxel)

Taxol (C47H51NO14, M = 853,906 g/mol) lần đầu iên được đ cập đến với ên gọi Caltuvocus – cây Thủy ùng ừ thời L Mã c đại Một số bài huốc ân gi n cũng sử dụng các ịch chiế này như à chấ độc hoặc thuốc chữa bệnh Lịch sử hiện đại nghiên cứu v Taxol bắ đầu từ năm 1962 hi iến sĩ Arthur S Barclay thu thập

vỏ của Taxus brevifolia à một trong số các mẫu củ oài này hể hiện độc ính ới

tế bào Năm 1967 Monroe E W à M nsu h C W ni huộc Viện ung hư Ho

Kỳ ách chiết được chấ này ừ vỏ cây Taxus brevifolia à đặ ên à T o S u này

hi được phá riển hành hương ph m bởi Bristol-Myers Squibb (BMS), Taxol được đ i ên hành Paclitaxel

Hình 10: Cấu trúc phân tử Taxol

Năm 1971 cấu rúc phân ử của Taxol được phá hiện nhờ các phân ích inh thể bằng tia X bởi chính Monroe à W ni Năm 1979 iến sĩ Horwi z à cộng sự

c ng bố các phá hiện của họ v ương ác giữa Taxol với các i ống: nó có h

năng húc đ y uá r nh h nh hành i ống bằng cách bám à àm b n vi ống, từ đó

h y đ i lịch r nh đã định sẵn củ uá r nh phân bào gây r sự chết cho TBUT lẫn

tế bào b nh hường Các hử nghiệm âm sàng ới Taxol bắ đầu từ háng 4 năm

1984 à cho đến nay, Taxol đ ng được sử dụng để đi u trị ung hư ph i ung hư buồng trứng ung hư ú ung hư chuyển dạng Kaposi sarcoma [29, 35]

Các nghiên cứu chuyên sâu cho hấy Taxol có h năng iêu iệt TBUT

h ng u các con đường độc lập với p53; ác động này sẽ được ăng cường hiệu

qu với các ế bào bị đột biến p53 hơn à ới các ế bào có iểu gen p53 dại Ngoài

ra, Taxol có u hướng c m ứng chặn tế bào đi ừ G2 s ng M rong chu r nh ế bào

à gây r pop osis ở các ế bào bị chuyển dạng, nhưng chỉ gây r ừng ở G1 với các ế bào h ng bị chuyển dạng Tất c các đặc ính này giúp Taxol có hể ác động biệ hó ới các TBUT mà hại với các ế bào hường [35, 43]

V cơ chế ác động ên ế bào ẫn đến pop osis cũng như các ác nhân c m ứng apop osis hác cơ chế của Taxol cũng iên u n đến họ protein Bcl-2 Taxol có thể đi u chỉnh biểu hiện củ các hành iên rong họ pro ein này à gây r biến đ i sau dịch mã củ các phân ử Bcl-2 Taxol đi u h âm Bc -XL à đi u h ương

B à B Ngoài ra, Taxol cũng c m ứng sự phosphory hó Bc -2 từ đó c m ứng pop osis Các nghiên cứu gần đây cũng cho hấy sự phosphory hó Bc -2 chỉ xuất hiện ở các ế bào đã được dừng ở phase G2/M sau khi xử ý ới Taxol Đi u này gợi cho thấy sự phosphory hó Bcl-2 chỉ xuất hiện như à hệ qu của sự dừng phân bào

tế bào Các nhà ho học cũng chỉ ra rằng, hoạ hó JNK/SAPK cần cho gi i đoạn sớm củ uá r nh pop osis khởi phá bởi Taxol Ngoài r Taxol cũng c m ứng apoptosis xuất hiện sau khi ngừng phân bào ới cơ chế u i ng sự n định các i sợi ubu in mà hiện nay vẫn chư được biế rõ [35, 43]

Hình 11: Cơ chế tác động của Taxol lên tế bào gây apoptosis

Hình 12: Hình ảnh mô phỏng liên kết của Taxol với vi sợi tubulin

Aurora kinaza thuộc nhóm những pro ein đi u khiển uá r nh phân bào Chúng b o gồm b pro ein hành iên có ên gọi Auror A Auror B à Auror C Các pro ein này iên u n đến uá r nh h nh hành à phân chi rung thể uá r nh iên ế các inetochore với các i sợi (micro ubu e) à sự sắp xếp củ hoi sắc

V ậy, những pro ein này đóng mộ i r u n rọng rong uá r nh phân chi

của nhiễm sắc thể à sự n định v nhân ế bào [41] Sự quan âm đến các pro ein này ăng ên hi các nhà ho học nhận thấy sự ương u n giữa sự biểu hiện uá mức củ các pro ein này rong rất nhi u loại ung hư ới sự bấ hường của bộ nhiễm sắc thể [2] Gen uy định Aurora A nằm rên nhiễm sắc thể 20 củ người tại

vị rí 20 13 Sự biểu hiện uá mức củ pro ein này ần đầu iên được phá hiện ở ung hư ruộ nguyên phá Đây chính à bằng chứng đầu iên cho hấy mối iên u n giữ Auror à ung hư Auror hoạ động như gen gây ung hư hi chuyển nhiễm

ào các ng tế bào nguyên bào sợi Rat1 ở chuột cống hay NIH3T3 ở chuột nhắt Gen Aror A h ng những được ăng cường trong nhi u ng ế bào mà c n ở 52% ung hư rực ràng nguyên phá à 12% ung hư ph i nguyên phá [13]

Auror B cũng biểu hiện uá mức ở các ng ế bào ách ừ ung hư ruột [9] Hơn nữa, sự biểu hiện uá ngưỡng của Aurora B trong tế bào nu i cấy ích hích sự phân chi nhiễm sắc thể mộ cách bấ hường Những tế bào h nh hành sẽ à những

tế bào nhân uái ( neup oi y) à có hể húc đ y sự h nh hành ung hư ở chuột [31] Tại kỳ giữ à ỳ sau củ uá r nh phân bào Auror B tạo hành phức hợp với các pro ein hách (p ssenger pro eins) như Sur i in INCENP TD60 à Borealin Những pro ein này cũng biểu hiện vượt mức ở một số loại ung hư như ung hư rực ràng ung hư ruộ ung hư ú… à một số ng ế bào chuyển dạng Các nghiên cứu đã chứng tỏ rằng Sur i in à INCENP à cơ chất cho hoạ ính enzym củ Auror B đồng thời chúng cũng à ác nhân ích hích hoạ ính của pro ein này [37] Như ậy rong các ng ế bào ung hư hoạ ính của Aurora B phụ thuộc ào sự biểu hiện củ chính b n hân nó à các pro ein iên u n

Aurora C biểu hiện uá mức ở ung hư uyến ti n liệ à một số ng ế bào ung hư hác [41] Đi u đó chứng tỏ rằng nó có hể có i r rong ung hư ế bào soma Mặc ù ậy, sự hiểu biết v chức năng củ pro ein này ần c n rấ nghèo nàn

Những đi u rên chứng tỏ Aurora kinaza à một mục iêu rong đi u trị ung

hư à o ậy việc m iếm các chất ức chế hoạ ính của Aurora kinaza à rất cần thiết Mộ ài chất ức chế đã được nghiên cứu à c ng bố như ZM447469 (2003)

Hesperadin (2004), VX-680 (2004) and PHA-680632 (2006), Benzo[e]pyridoindole

(2008) (Hình 13) Trong số đó VX680 có ác ụng ức chế sự phá riển ung hư in

vivo à hiện n y đ ng được em é để thử nghiệm âm sàng Tuy nhiên những chất

ức chế này có một số ác ụng phụ à ính đặc hiệu chư c o VX680 à một chấ có nhi u triển vọng nhất hiện nay trong việc ức chế hoạ ính củ Auror nhưng đồng thời nó cũng ức chế FLT-3 LcK à kinaza đột biến BcrAbl T315I Mặ hác hoạt ính của chấ này c n phụ thuộc ào p53 Hơn nữ rong uá r nh phá riển u hường xuất hiện các đột biến ung u nh các ị rí (si es) đi u khiển hoạ ính kinaza Do vậy, việc nghiên cứu à m iếm các chất ức chế đặc hiệu hơn à rất cần thiết [16]

Hình 13: Các chất ức chế Aurora kinaza

( ): các ạng khung cấu rúc củ các chất ức chế; (b): các chất ức chế đã c ng bố

CHƯƠNG 2 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Các ng TBUT HCT116, He MCF7 à KPL4 o Nhóm nghiên cứu Ung hư hực nghiệm – Bộ m n Tế bào M Ph i à Lý sinh – Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gi Hà Nội cung cấp

- Mẫu Honokiol (H), Magnolol (M) à Derrone (D) do Viện Dược liệu Trung ương cung cấp, dạng dung dịch đồng nhấ ưu rữ ở nồng độ 20.000µg/mL rong ung m i DMSO

- Đối chứng ương T o ạng hương ph m 30mg/5mL ương đương 6.000µg/mL

Bảng 1: Dụng cụ và vật tư tiêu hao

Đĩ nu i cấy tế bào 35, 100mm Corning, Mỹ

Pipet nhựa 1mL, 2mL, 5mL, 10mL Corning, Mỹ

Anti-Histon H3PS10 Antibody Invitrogen, Mỹ

Non-Radioactive Cell Proliferation Assay

Promega, Mỹ