NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ

Trên cơ sở đó, chúng tôi đã ứng dụng phương pháp HPLC và phân tích hình ảnh bằng phần mềm ImageJ để thực hiện đề tài “Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trịnh Hồng Thái

TS Đỗ Minh Hà Header Page 2 of 126

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn và kính trọng sâu sắc đối

với thầy, PGS TS Trịnh Hồng Thái, người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt

quá trình học tập và thực hiện luận văn này Thầy đã mở ra cho em những vấn đề khoa học rất lý thú, hướng em vào nghiên cứu các lĩnh vực hết sức thiết thực và vô cùng bổ ích, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu Em đã học hỏi được rất nhiều ở Thầy phong cách làm việc, cũng như phương pháp nghiên cứu khoa học

Em cũng xin trân trọng cảm ơn đến TS Đỗ Minh Hà và thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy cô giáo trong bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh học đã tận tình giảng dạy dìu dắt tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tại Phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, các bạn học viên cao học và các em sinh viên làm việc tại phòng, những người đã làm cùng tôi, luôn ở bên tôi lúc thất bại hay những lúc thành công

Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của PTNTĐ Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học KHTN,

sự giúp đỡ của các cán bộ nhân viên thuộc khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh, bệnh viện K, Hà Nội trong việc cung cấp mẫu nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn

Luận văn được thực hiện trong phạm vi nội dung và kinh phí củađề tài cấp nhà nước (mã số KC.04.10/11-15) Tôi xin chân thành cảm ơn

Con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Bố, Mẹ người đã vất vả nuôi con khôn lớn và dạy con những bài học làm người đầu tiên, con cảm ơn ông bà, cô chú…những người thân của con, những người luôn dành tình cảm và những lời động viên con

Và cuối cùng tôi xin cảm ơn các bạn bè của tôi, những người luôn ủng hộ và giúp đỡ tôi

Hà Nội, tháng 8 năm 2015 Học viên

Nguyễn Hồng Nhung

Header Page 3 of 126

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribonucleic

APS Ammonium persulfate

ARN Acid Ribonucleic

ATP Adenosine Triphosphate

AcN Acetonitrile

Bp Base pair (cặp bazơ)

EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid

EtBr Ethidium Bromide

HCC Ung thư biểu mô tế bào gan (Hepatocellular carcinoma)

HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid

chromatography) MT/mt Mitochondria (ti thể)

mtADN ADN ti thể (mitochondrial DNA)

nADN ADN nhân (nuclear DNA)

PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction)

Smac/DIABLO Chất hoạt hóa caspase thứ hai từ ti thể/ chất ức chế trực tiếp của

protein gắn trong quá trình apoptosis trong điều kiện pI thấp (Second mitochondria-derived activator of caspase/direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI)

TEA Triethylamine

TEAA Triethylammonium acetate

tARN ARN vận chuyển (transfer RNA)

rARN ARN ribosome (RNA ribosome)

Header Page 4 of 126

Bảng 5 Công thức đổ gel polyacrylamide 10% bản 7cm

Bảng 6 Số liệu phân tích HPLC với các mẫu có tỉ số hàm lượng ADN chuẩn

Bảng 10 Biến đổi tỉ số mt/ACTB trong các loại mẫu ở bệnh nhân ung thư vú

và bệnh nhân u xơ vú bằng phương pháp ImageJ

Bảng 11 Biến đổi tỉ số mt/ACTB và đặc điểm bệnh học ở bệnh nhân ung thư

vú phân tích bằng phương pháp ImageJ Header Page 5 of 126

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Phân bố gen trên ADN ti thể

Hình 2 Sơ đồ quy trình thí nghiệm

Hình 6 Kết quả phân tích HPLC với ADN chuẩn 100_200bp và

200_400bp

Hình 7 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn mt và ACTB trên gel

agarose 1,7%

Hình 8 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi ở các chu kì khác nhau

trên gel polyacrylamide 10%, nhuộm bạc

Hình 9 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đa mồi mt_ACTB ở 28 chu kì của

các mẫu khác nhau

Hình 10 Hình ảnh khuẩn lạc sau khi plasmid được biến nạp vào tế bào

E.coli DH5α

Hình 11 Hình ảnh điện di sau khi tách plasmid

Hình 12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR plasmid mt và ACTB

Hình 13 Kết quả giải trình tự plasmid có chứa đoạn mt

Hình 14 Kết quả giải trình tự plasmid có chứa đoạn ACTB

Hình 15 Hình ảnh phân tích HPLC và Biểu đồ đường chuẩn tỉ số hàm

lượng ADN chuẩn 400bp/100bp Hình 16 Hình ảnh phân tích HPLC và biểu đồ đường chuẩn tỉ số mt/ACTB Hình 17 Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB ở các loại mẫu

Hình 18 Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo nhóm tuổi ở bệnh nhân ung

thư vú

Hình 19 Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo kích thước khối u ở bệnh Header Page 6 of 126

nhân ung thư vú Hình 20 Hình ảnh bản gel khi phân tích bằng phầm mềm ImageJ

Hình 21

Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB theo loại mẫu phân tích bằng phương pháp ImageJ

Header Page 7 of 126

1.2.2 Các giai đoạn của ung thư vú 12

1.3 NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ADN TI THỂ 16Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.2 THIẾT KẾ CÁC CẶP PRIMER CHO PHẢN ỨNG PCR ĐA MỒI 30Header Page 8 of 126

3.3 KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG SỐ BẢN SAO ADN TI THỂ 35

Header Page 9 of 126

MỞ ĐẦU

Ti thể là bào quan quan trọng trong tế bào nhân chuẩn có vai trò chính tạo ra năng lượng thông qua hô hấp hiếu khí, là nơi hình thành và đích đến của các gốc oxy tự do (ROS) tác nhân gây ung thư Mỗi tế bào có nhiều bản sao của ti thể, có thể tới hàng trăm bản sao, tuy nhiên số lượng ADN ti thể (mtADN) tương đối ổn định trong các tế bào trong điều kiện sinh lý Những thay đổi trong mtADN về cấu trúc, hay số lượng bản sao mtADN có thể đóng vai trò trực tiếp là tác nhân gây ung thư Nhiều nghiên cứu đã chứng minh sự thay đổi số lượng bản sao mtADN có liên quan đến hình thành và tiến triển của nhiều loại ung thư như ung thư hạch bạch huyết (Non-Hodgkin lymphoma), ung thư phổi, ung thư dạ dày, ung thư thận, ung thư tuyến tụy, ung thư đại trực tràng và ung thư vú,

Ung thư vú là bệnh ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên toàn thế giới, hiện nay

tỷ lệ mắc ung thư vú cũng tăng lên nhanh chóng, đặc biệt ở các nước Châu Á như Việt Nam Mặc dù đã có nhiều phương pháp chẩn đoán, tầm soát ung thư giúp phát hiện sớm như chụp nhũ ảnh và nhiều phương pháp điều trị hiện đại đã giúp giảm đáng kể tỉ lệ mắc bệnh và tử vong do ung thư vú, tuy nhiên, ung thư vú vẫn là loại ung thư gây tử vong hàng đầu ở nữ giới

Phương pháp HPLC là phương pháp định lượng cơ bản kinh điển trong phân

tích hóa sinh học Phương pháp này có độ nhạy cao, có khả năng ứng dụng rộng rãi,

cho phép phân tích với lượng mẫu nhỏ Với sự pháp triển của khoa học hiện đại, nhiều phần mềm đã được ra đời phục vụ mục đích bán định lượng dựa trên phân tích hình ảnh các băng điện di như phần mềm ImageJ – NIH US, đây là phương pháp đơn giản, ít tốn kém, tiện dụng, cho kết quả nhanh và có thể áp dụng rộng rãi Trên cơ sở đó, chúng tôi đã ứng dụng phương pháp HPLC và phân tích hình ảnh

bằng phần mềm ImageJ để thực hiện đề tài “Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao

ADN ti thể ở bệnh nhân ung thư vú”

Đề tài được thực hiện tại phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Kinh phí thực hiện từ đề tài cấp nhà

nước, mã số KC.04.10/11-15 “Nghiên cứu phát hiện các bệnh đột biến gen ti thể ở người Việt Nam bằng các kỹ thuật sinh học phân tử”

Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ TI THỂ

Ti thể là bào quan chuyển hóa năng lượng của tế bào nhân chuẩn, trong đó năng lượng từ thức ăn được bộ máy chuyển hóa của cơ thể và tế bào chuyển đổi thành ATP thông qua nhiều quá trình phức tạp mà mắt xích cuối là quá trình phosphoryl oxi hóa diễn ra ở trong ti thể Ti thể có lớp màng kép, màng ngoài phân tách các ti thể với bào tương Màng bên trong được gấp cuộn để tạo thành các nếp gấp hướng vào tâm, bên trong có chứa chất nền Phức hệ 5 enzyme của hệ thống phosphoryl oxi hóa được gắn vào trong màng trong ti thể Ti thể chứa bộ gen của riêng mình, được gọi là ADN ti thể (mtADN) và phân chia độc lập với ADN nhân Trong tế bào động vật có vú, mỗi tế bào thường chứa nhiều bản sao giống hệt nhau của mtADN [7]

Ti thể được cho là có nguồn gốc từ vi khuẩn hiếu khí bị cộng sinh vào tế bào nhân chuẩn (thuyết nội cộng sinh) Trong quá trình tiến hóa để trở thành nhà máy năng lượng của tế bào nhân chuẩn, các vi khuẩn cộng sinh đã chuyển nhiều gen thiết yếu của mình vào các nhiễm sắc thể nhân Tuy nhiên, ti thể vẫn mang các dấu ấn của các vi khuẩn tổ tiên Ví dụ, ti thể sử dụng N-formylmethionyl-tARN (fMet-tARN) để kích hoạt quá trình tổng hợp protein [28]

1.1.1 Cấu trúc và chức năng của ti thể

1.1.1.1 Cấu trúc của ti thể

ADN ti thể người là phân tử vòng sợi kép có kích thước 16.569 bp Các chuỗi của ADN mạch kép dựa trên thành phần nucleotide khác nhau được chia thành chuỗi nặng chứa nhiều Guannine và chuỗi nhẹ chứa nhiều Cytosine Hầu hết các thông tin được mã hóa trên chuỗi nặng, với gen mã hóa cho 2 rARN, 14 tARN và 12 chuỗi polypeptide Chuỗi nhẹ mã hóa cho 8 tARN và một chuỗi polypeptide (Hình 1) Tất

cả 13 protein sản phẩm là thành phần của phức hợp enzyme trong hệ thống phosphoryl oxy hóa: 7 chuỗi polypeptide, từ ND1 đến ND6 và ND4L là các tiểu đơn

vị của phức hợp I (NADH dehydrogenase- ubiquinone reductase); 1 chuỗi

chuỗi: CO I, CO II và CO III là tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp IV (cytochrome c oxidase); ATPase 6 và 8 là tiểu đơn vị của phức hợp V (ATP synthetase) [2]

Hình 1- Phân bố gen trên ADN ti thể

mtADN được sắp xếp rất tiết kiệm, các gen không có intron, các trình tự mã hóa tiếp giáp với nhau hoặc cách nhau bởi một vài nucleotide Các phân tử rRNA và tARN đều rất nhỏ Một số gen mã hóa cho protein còn nằm gối lên nhau (ở người, ATPase 6 và 8 gối nhau 46 nucleotide, ND4 và tiểu đơn vị ND4L gối nhau 7 nucleotide), trong một số trường hợp một phần của bộ ba kết thúc không mã hóa trong mtADN mà được tạo ra sau phiên mã bởi quá trình thêm đuôi poly A của mARN tương ứng Ngoài ra còn có thay đổi trong việc sử dụng các bộ ba so với ARN nhân Ví dụ, UGA mã hóa cho tryptophan chứ không phải bộ ba kết thúc, AUA, AUC và AUU được sử dụng như bộ 3 mở đầu, AGA và AGG không mã hóa cho arginine mà là bộ 3 kết thúc [20]

1.1.1.2 Chức năng chính của ti thể Năng lượng và quá trình trao đổi chất

Chức năng quan trọng nhất và đặc trưng nhất của ti thể là sản xuất adenosine triphosphate (ATP) thông qua quá trình phosphoryl oxy hóa, được thực hiện bởi một loạt các phức hợp protein, được gọi chung là chuỗi hô hấp, được mã hóa bởi cả nADN và mtADN Chuỗi hô hấp hoàn chỉnh chứa ít nhất 87 polypeptide, 13 trong số

đó là mã hóa bởi mtADN Do đó, phần lớn các tiểu phần của chuỗi hô hấp mã hóa trong nhân và được đưa vào ti thể sau khi được dịch mã trong nhân và đưa ra bào tương Phosphoryl oxy hóa là một quá trình sinh hóa độc đáo được tạo ra từ sự phối hợp chặt chẽ của các protein sản phẩm từ hai bộ gen riêng biệt (nhân và ti thể) Tuy nhiên, quá trình này không phải là cách duy nhất để tạo ra năng lượng cho tế bào Đường phân cũng có thể tạo ra ATP và cung cấp cơ chế thay thế khi quá trình phosphoryl oxy hóa trở nên kém hiệu quả do chuỗi hô hấp có khiếm khuyết Khi các electron được vận chuyển thông qua chuỗi hô hấp trong quá trình hô hấp của ti thể, một số electron có thể trốn khỏi hoặc rò rỉ từ các phức hợp vận chuyển electron và phản ứng với oxy phân tử hình thành các gốc superoxide (O*2-) Dòng chảy electron này xảy ra chủ yếu tại khu phức hợp I và III [27] Do vậy một đột biến mtADN nhất định có thể gây ra sự thay đổi các thành phần vận chuyển điện tử và tạo ra các gốc superoxide, sau đó chuyển đổi thành các dạng gốc oxy hóa tự do (ROS) Các đột biến mtADN và sự gia tăng quá trình oxy hóa đã được quan sát thấy trong các loại tế bào ung thư khác nhau ở nhiều nghiên cứu độc lập [9] Tuy nhiên, liên hệ trực tiếp giữa đột biến mtADN và sự gia tăng hình thành ROS trong các tế bào ung thư vẫn chưa được chứng minh bằng thực nghiệm

Ti thể đóng vai trò điều tiết các cơ chế trung gian quan trọng trong quá trình chuyển hóa carbohydrate, axid amin và axid béo Chu trình acid tricarboxylic trong chất nền của ti thể là một ví dụ điển hình của một con đường sinh hóa đòi hỏi nhiều

cơ chế trung gian quan trọng [13] Một phần chính của chu trình urê cũng xảy ra trong ti thể, nơi xảy ra quá trình xử lý các axid amin trung gian có chứa nitơ Axit béo được chia nhỏ thành các đơn vị hai carbon bởi một loạt các β-oxy hóa và tiếp tục xử

lý để acetyl CoA trong chất nền của ti thể Như vậy, chức năng chính của ti thể là tạo

ATP qua quá trình phosphoryl oxy hóa không phải là thiết yếu, ti thể lại không thể thiếu để các tế bào nhân chuẩn tham gia vào các quá trình trao đổi chất quan trọng khác, điều này giải thích tại sao trong một số tế bào có mất đoạn mtADN, lượng ti thể vẫn được duy trì mà không có các đoạn mtADN mã hóa các protein trong chuỗi hô hấp [12]

Apoptosis và sự tồn tại của tế bào

Ti thể đóng một vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis, một quá trình sinh học cơ bản của các tế bào chết theo chương trình có kiểm soát Một số nDNA

mã hóa protein tham gia quá trình apoptosis bao gồm cytochrome c, yếu tố cảm ứng apoptosis (AIF), endonuclease G, và Smac/DIABLO được dự trữ trong ti thể Khi những yếu tố protein này được giải phóng khỏi ti thể, chúng sẽ tạo ra một loạt phản ứng các sinh hóa để kích hoạt những tín hiệu của thác apoptois Đặc điểm nổi bật của sự khơi mào apoptosis là sự hoạt hóa caspase (một họ protease) bởi cytochrome

c và apaf-1 với sự có mặt của ATP hoặc dATP [17] Quá trình chuyển AIF từ ti thể tới nhân để gây apoptosis độc lập với caspase [26] Quá trình apoptosis đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển bệnh ung thư và đáp trả lại tín hiệu của các tác nhân chống ung thư Tuy nhiên, vai trò chính xác của đột biến mtDNA trong phản ứng chết theo chương trình của tế bào để đáp trả lại tín hiệu của các tác nhân chống ung thư vẫn chưa được xác định

1.1.2 Những biến đổi ti thể và bệnh ung thư

Khiếm khuyết chức năng ti thể từ lâu đã được cho là đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và tiến triển của ung thư Hơn 70 năm trước, Warburg tiên phong nghiên cứu sự biến đổi trong quá trình hô hấp của ti thể với bệnh ung thư và đề xuất

cơ chế để giải thích ảnh hưởng của ti thể trong quá trình gây ung thư Ông đưa ra giả thuyết rằng một sự kiện then chốt trong ung thư liên quan đến sự phát triển tổn thương của bộ máy hô hấp, dẫn đến tăng sản xuất ATP trong quá trình đường phân [34] Cuối cùng, các tế bào ác tính sẽ đáp ứng nhu cầu năng lượng bằng cách sản xuất một phần lớn ATP thông qua quá trình đường phân chứ không phải thông qua sự phosphoryl oxy hóa Do hiệu suất của quá trình đường phân thấp, điều này có thể giải

thích phần nào các tế bào ác tính có nhu cầu tiêu thụ glucose lớn để đáp ứng nhu cầu năng lượng Điều này trái ngược với các tế bào bình thường, ưu tiên sử dụng quá trình phosphoryl oxy hóa tạo ATP với hiệu quả cao Sự khác biệt về trao đổi năng lương giữa các tế bào bình thường và ung thư là một cơ sở sinh hóa để phát triển chiến lược điều trị để tiêu diệt tế bào ung thư có chọn lọc.Kể từ khi ấn phẩm đầu tiên của Warburg ra đời hơn nửa thế kỷ trước, đến nay nhiều khiếm khuyết của ti thể liên quan đến ung thư đã được xác định và mô tả Những khiếm khuyết này bao gồm các thay đổi trong biểu hiện và hoạt động của các tiểu đơn vị trong chuỗi hô hấp và các enzym đường phân và đột biến mtADN[10].

Hầu hết các protein ti thể được mã hóa bởi ADN nhân (nADN) và đưa vào ti thể Mặc dù các quá trình nhân bản của mtADN là không đồng bộ với quá trình nhân bản nADN, số lượng tổng thể của ti thể trong mỗi tế bào vẫn tương đối ổn định trong các loại tế bào cụ thể trong quá trình tăng sinh, cho thấy rằng quá trình tạo ti thể quyết định phần lớn bởi các tín hiệu ngoài ti thể Sự sinh tổng hợp của ti thể có thể tiếp tục ngay cả khi mất mtADN Như vậy, việc nhân bản ti thể không cần sự có mặt của mtADN và không chịu ảnh hưởng của các đột biến trong mtADN, dẫn đến việc duy trì các khiếm khuyết của ti thể [5]

1.1.2.1 Đột biến gen ti thể và bệnh ung thư

Hầu hết các tế bào của động vật có vú có chứa hàng chục, hàng trăm ti thể, mỗi ti thể lại có chứa 2-10 bản sao mtADN [25] Trong một cá thể, tất cả các bản sao mtADN thường giống hệt nhau (homoplasmy), nhưng đột biến có thể phát sinh, duy trì và được khuếch đại, do đó các bản sao đột biến khác nhau cùng tồn tại với kiểu mtADN ban đầu (heteroplasmy) Khi tế bào phân chia, bộ gen ti thể được phân bố ngẫu nhiên cho các tế bào con và do đó, mặc dù chỉ bắt đầu từ một trường hợp heteroplasmy nhất định, nhưng kết quả có thể tồn tại mức độ khác nhau của heteroplasmy và thậm chí có thể homoplasmy mtADN trong dòng tế bào khác nhau [14]

Bộ gen ti thể được đi truyền theo dòng mẹ; một vài ti thể từ tinh trùng có thể xâm nhập vào trứng trong quá trình thụ tinh sẽ bị loại bỏ bởi cơ chế phụ thuộc ubiquitin Trong quá trình tạo trứng, chỉ có số lượng nhỏ phân tử mtADN được

khuếch đại và truyền tới thế hệ sau con [18] Hiện tượng này giải thích tại sao một đột biến có thể trở thành dạng homoplasmy sau một hoặc một vài thế hệ

Tỷ lệ biến đổi của mtADN nhanh hơn rất nhiều so với bộ gen nhân Một trong những nguyên nhân là mtADN không được bảo vệ bởi protein (histone), thêm vào đó

ti thể là nhà máy năng lượng của tế bào, nơi xảy ra các quá trình photphoryl oxi hóa

và nhiều quá trình sinh hóa khác, các quá trình này tạo ra các gốc oxy hóa tự do ROS nên mtADN rất dễ bị tổn thương Mặt khác, ti thể lại không có các cơ chế sửa chữa ADN như nhân, theo một số công bố mtADN đột biến đột biến cao hơn nADN 10-

100 lần [22]

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh các đột biến và thay đổi trong mtADN đóng một vai trò quan trọng trong một số bệnh như bệnh thần kinh thị giác di truyền Leber, bệnh tiểu đường di truyền theo dòng mẹ, hội chứng Leigh [8] Bên cạnh các bệnh của

ti thể là đột biến dòng mầm, các đột biến soma mtADN cũng được tìm thấy ở nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là ung thư Với vai trò quan trọng của ti thể trong quá trình chuyển hóa ATP, trong tạo ra các gốc oxy hóa tự do và trong việc điều hòa quá trình apoptosis, đột biến ở mtADN có khả năng ảnh hưởng đến năng lượng tế bào, gây ra tổn thương ADN trung gian qua ROS và làm thay đổi phản ứng của tế bào cảm ứng apoptosis với các tác nhân chống ung thư Ngày càng có nhiều nghiên cứu chứng minh ảnh hưởng của đột biến mtADN đối với sự phát triển, di truyền và tiến triển của nhiều bệnh ung thư khác nhau Hơn nữa, tần suất đột biến mtADN cao trong ung thư và sự xuất hiện của chúng trong giai đoạn sớm của bệnh có thể là chỉ thị để phát hiện sớm bệnh ung thư [19]

Ung thư đại trực tràng: Trong một nghiên cứu đã tiến hành trên mô thường

và mô u của 10 bệnh nhân ung thư đại trực tràng đã phát hiện 7 trong số 10 bệnh

nhân có đột biến soma mtADN Các đột biến được tìm thấy trên các gen 12S rRNA, 16S rRNA, ND1, ND4L, ND5, Cytochrome b, COXI, COXIIvà COXIII [23] Phần lớn

các đột biến là đột biến điểm soma ở vùng D-Loop không mã hóa trong đó A  T và

G  C và các đột biến mất đoạn được phát hiện bằng cách kết hợp 2 phương pháp phân tích sợi đôi tương đồng heteroduplex và phương pháp biến tính sợi đơn (SSCP) [1] Một số nghiên cứu khác đã cho thấy mức độ biểu hiện tăng của mARN mã hóa

ND2 ở các mô u so với các mô lành ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng, mARN của ND1 và rARN mã hóa cho tiểu đơn vị 16S tăng trong mẫu u của bệnh nhân polip

tuyến gia đình so với mô lành ruột kết [6]

Ung thư buồng trứng: Liu và cs đã phân tích mtADN từ mô bình thường và

mô u được lấy từ 10 bệnh nhân ung thư buồng trứng Giải trình tự hoàn chỉnh mtADN của cặp mô và so sánh phân tích, đã xác định được các đột biến soma với tỉ

lệ cao (60%) Hầu hết các đột biến được xác định là T  C hoặc G  A Các đột biến

soma chủ yếu trên 4 khu vực của mtADN: D-loop, 12S rRNA, 16S rRNA và cytochrome b [16]

Ung thư vú: Nhiều nghiên cứu toàn diện về đột biến mtADN ở ung thư vú đã

được công bố gần đây Trong một nghiên cứu của Tan và cs, đã sử dụng kết hợp phương pháp điện di và giải trình tự ADN trực tiếp để đưa ra trình tự hoàn chỉnh bộ gen ti thể có đột biến ở 19 bệnh nhân, trên mẫu u và mẫu mô thường và đã xác định được ở mtADN của 14 bệnh nhân có đột biến soma (74%) Phần lớn các đột biến nằm trong vùng D-loop (81,5%) Tuy nhiên, đột biến cũng được phát hiện trên gen

16S rRNA, ND2 và ATPase [29] Trong một nghiên cứu khác sử dụng phương pháp

sinh thiết khối u nguyên phát của 18 bệnh nhân, đột biến soma được phát hiện trong phần lớn các bệnh nhân (61%) và hầu hết các đột biến xác định là ở vùng D-loop, còn

lại đột biến đã được tìm thấy trên các vùng gen ND1, ND4, ND5 và cytochrome b

[21] Các nghiên cứu trước đó cũng cho thấy tồn tại đột biến điểm và mất đoạn mtDNA ở bệnh nhân ung thư vú Đột biến mất đoạn phổ biến nhất 4977 bp được tìm thấy trong mô u ác tính và mô vú lành của các bệnh nhân có các bất thường vú [4]

Ngoài đột biến ở mtADN, biểu hiện cao của mARN cytochrome c oxidase II cũng

được phát hiện trong mô u ở một số bệnh nhân so với mô bình thường [24]

1.1.2.2 Biến đổi số lượng bản sao gen ti thể và bệnh ung thư

Như đã nêu ở trên, mỗi tế bào chứa hàng trăm, ngàn ti thể, trong mỗi ti thể lại chứa 2-10 bản sao mtADN, tuy nhiên số lượng bản sao mtADN tương đối ổn định trong diều kiện sinh lí Nhiều nghiên cứu ở bệnh nhân ung thư nguyên phát đã chỉ ra rằng thay đổi số lượng bản sao mtADN là một yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của ti thể và có liên

quan đến sự hình thành và phát triển ở nhiều loại ung thư Biến đổi số lượng bản sao mtADN liên quan đến bệnh ung thư đã được nghiên cứu rộng rãi bằng nhiều phương pháp tiếp cận

Năm 2004, Yin và cs đã nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN và ti thể ở bệnh nhân ung thư biểu mô gan (HCC) Ở bệnh nhân HCC số lượng bản sao mtADN giảm ở mô u so với mô lành tương ứng Biểu hiện thụ thể kích hoạt peroxisome proliferator γ coactivator-1 bị ức chế mạnh ở bệnh nhân, trong khi các biểu hiện của các protein liên kết với mtADN sợi đơn lại tăng, cho thấy hoạt động chức năng sinh học của ti thể bất thường ở bệnh nhân HCC Đáng chú ý là 22% bệnh nhân HCC mang một đột biến soma trong vùng D-loop của mtADN Vùng gan lành của bệnh nhân HCC có tiền sử uống rượu trong nhiều năm có số lượng bản sao mtADN giảm và mức độ mất đoạn 4977 bp cao hơn so với bệnh nhân không uống rượu Kết quả cho thấy số lượng bản sao mtADN giảm, suy giảm chức năng ti thể

và đột biến soma trong mtADN là những sự kiện quan trọng trong quá trình sinh ung thư HCC [38] Bên cạnh đó trong một nghiên cứu năm 2006 của Yamada và cs

ở 31 bệnh nhân HCC đã chứng minh rằng hàm lượng mtADN thấp có liên quan mật thiết với kích thước khối u và xơ gan Bệnh nhân HCC có hàm lượng mtADN thấp

hơn thường có tiên lượng xấu hơn và thời gian sống ngắn hơn [36] Đối với bệnh

nhân ung thư phổi NSCLC, tìm ra mối liên hệ giữa giảm số lượng bản sao mtADN được gắn liền với sự phát triển của khối u Tương tự, sự giảm hàm lượng mtADN phổ biến hơn ở các bệnh nhân ung thư dạ dày [33]

Một số nghiên cứu khác cho thấy số lượng bản sao mtADN trong mô ung thư cao hơn so với các mô lân cận Năm 2006, Wang và cs cho thấy ở ung thư buồng trứng, số lượng bản sao mtADN thấp ở giai đoạn đầu và cao hơn nhiều giai đoạn sau, cho thấy mối tương quan giữa việc tăng số lượng bản sao mtADN tới tiến triển của bệnh nhân ung thư buồng trứng [31]

Trong báo cáo năm 2008 của Lin và cs, việc giảm số lượng bản sao mtADN trong các mô ung thư có thể làm giảm tổn thương của quá trình oxy hóa mtADN, thúc đẩy quá trình phát triển và tạo điều kiện cho tế bào ung thư trở thành bất tử Mẫu ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (NSCLC) đã được thu thập từ 29 bệnh

nhân ở giai đoạn III sau khi hóa trị hỗ trợ trị liệu và phẫu thuật cắt bỏ Số lượng bản sao mtADN tương đối và các tổn thương oxy hóa mtADN của mỗi mô ung thư được xác định bằng phương pháp PCR định lượng Kết quả cho thấy số lượng bản sao mtADN ít và quá trình ôxy hoá mtADN mức độ thấp có tương quan với sự tiến triển của khối u Hơn nữa, số lượng bản sao mtADN và tổn thương của quá trình oxy hóa mtADN thấp hơn ở những bện nhân NSCLC sau khi hóa trị Phát hiện này cho thấy

sự suy giảm hàm lượng mtADN có thể dẫn đến giảm mật độ của ti thể trong tế bào ung thư, dẫn đến giảm sản xuất ROS nội sinh và giảm ROS gây tổn thương ADN để

tế bào ung thư trở thành bất tử [15]

1.2 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÚ

Ung thư vú là loại ung thư phổ biến thứ hai trên thế giới và là bệnh ung thư thường gặp nhất ở phụ nữ với ước tính 1,67 triệu trường hợp ung thư mới được chẩn đoán vào năm 2012 (25% của tất cả các trường hợp mắc bệnh ung thư) Nó là loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ cả ở các nước kém phát triển (883.000 trường hợp) và các nước phát triển (794.000) Tỉ lệ mắc bệnh rất khác nhau giữa các khu vực trên thế giới, dao động từ 27 trên 100.000 ở khu vực Trung Phi và Đông Nam Á và 96 ở khu vực Tây Âu Ung thư vú rất hiếm gặp ở nam giới nhưng lại rất phổ biến ở phụ nữ Tỷ

lệ mới mắc ung thư vú ở nam ít hơn 100 lần so với nữ [40]

Theo hồ sơ từ tổ chức Globocan về tình hình ung thư thế giới, ung thư vú là nguyên nhân tử vong đứng thứ năm do ung thư nói chung (522.000 trường hợp tử vong) và là loại ung thư hàng đầu gây tử vong ở phụ nữ ở khu vực kém phát triển (324.000 người chết, 14,3% trên tổng số) và thứ hai ở khu vực phát triển hơn (198.000 người chết, 15,4%) sau ung thư phổi [44]

1.2.1 Phân loại ung thư vú

Có nhiều loại ung thư vú phát sinh từ các dạng tế bào khác nhau, nhưng phổ biến nhất là hai loại: Ung thư biểu mô ống và ung thư biểu mô tuyến, được dặt tên

theo dạng tế bào mà chúng bắt nguồn [41]

 Ung thư biểu mô ống: Ung thư xuất phát từ tế bào biểu mô ống dẫn sữa, là dạng ung thư vú thường gặp nhất ở nữ giới, chiếm khoảng 85 - 90% Ung thư biểu

mô ống có nhiều dạng phát triển khác nhau:

- Ung thư biểu mô nội ống (ung thư tại chỗ): Ung thư thời kì đầu, chỉ giới hạn bên trong của hệ thống ống, không di căn

- Ung thư biểu mô ống xâm lấn: Dạng phổ biến nhất của ung thư vú, chiếm 80% các trường hợp ung thư vú Nó bắt đầu từ các tế bào lót nằm trong đường ống dẫn sữa của vú, phá vỡ thành ống và bắt đầu di căn đến các nơi khác của cơ thể

 Ung thư biểu mô tuyến: Ung thư xuất phát từ tế bào biểu mô tuyến sữa, chiếm khoảng 8% Nó thường xảy ra ở phụ nữ ngoài 40 và 50 tuổi:

- Ung thư biểu mô tuyến tại chỗ: Chỉ giới hạn trong hệ thống tuyến

- Ung thư biểu mô tuyến xâm lấn: Thường làm dầy lên phần vòng cung của

vú

Ngoài ra có một số loại ít gặp hơn như:

 Ung thư biểu mô tuyến hình ống: chiếm khoảng 2%, là dạng ung thư biểu mô

tế bào dạng ống có cấu trúc hình ống khi nhìn dưới kính hiển vi

 Ung thư biểu mô tiết niêm dịch: chiếm khoảng 1-2% Sự khác biệt chính đặc trưng của dạng ung thư này là sản xuất ra dịch nhầy và rất khó tìm thấy tế bào

 Ung thư vú dạng viêm: chiếm khoảng 1-3% các trường hợp ung thư vú, có biểu hiện rất rõ, gây tắc các mạch bạch huyết dưới da

 Bệnh Paget núm vú: Trông giống như bị phát ban da hoặc da thô ráp ở phần đầu vú và có thể ngứa Khi có triệu chứng ngứa và đóng vảy (nếu bị trầy xước) có thể

là dấu hiệu ung thư, có thể dưới bề mặt của da bị phá vỡ, ung thư sau đó sẽ xâm lấn các vùng khác của vú

1.2.2 Các giai đoạn của ung thư vú

Phương pháp phân giai đoạn bệnh ung thư dựa vào kích thước khối u, hạch

lympho và di căn (TNM, Tumor - Lymph Node - Metastasis) được đề xuất bởi

Clifton Mountain và đã được Liên Ủy ban ung thư Hoa Kỳ (AJCC) và Hiệp hội

chống ung thư quốc tế (UICC) thông qua năm 1974 Theo cách phân giai đoạn này, các giai đoạn T, N, M của ung thư vú được xác định như sau [42]:

 Theo yếu tố T - Tumor (u nguyên phát)

- Tx: Không thể xác định được khối u

- Tis: Ung thư biểu mô tại chỗ (bao gồm DICS, LICS hoặc bệnh Paget núm vú không có ung thư liên quan)

- T0: Không thấy được sự rõ ràng của khối u

- T1 (bao gồm T1a , T1b, T1c): kích thước khối u nhỏ hơn hoặc bằng 2cm

- T2: Kích thước khối u lớn hơn 2cm nhưng nhỏ hơn 5cm

- T3: Khối u có kích thước lớn hơn 5cm

- T4: Khối u có kích thước bất kỳ lan đến da và thành ngực

 Theo yếu tố N - lymph Node (Hạch)

- Nx: Không xác định được vùng hạch bạch huyết gần đó

- N0: Ung thư không lây lan đến các hạch bạch huyết gần đó

- N1: Ung thư đã lan rộng đến các hạch lympho vùng nách

- N2: Ung thư đã lan rộng 4 - 9 hạch bạch huyết dưới cánh tay hoặc đã mở rộng đến các hạch bạch huyết trong vú

- N3: Di căn tới hạch lympho bên trong tuyến sữa ở cùng một bên

 Theo yếu tố M - Metastasis (mức độ di căn)

- Mx: Không đánh giá được sự di căn

- M0: Không có di căn xa

- M1: Có sự di căn đến các cơ quan khác, phổ biến nhất là xương, phổi, não và gan

1.2.3 Các yếu tố nguy cơ

Nguyên nhân gây ra bệnh ung thư vú hiện giờ vẫn chưa được xác định rõ, nhưng người ta đã tìm ra các mối liên quan của một số yếu tố nguy cơ đối với bệnh ung thư vú [43]

 Giới tính: Nữ giới có nguy cơ mắc bệnh ung thư vú cao hơn 100 lần so với nam giới và nguy cơ mắc bệnh cũng tăng theo tuổi

 Các yếu tố di truyền: Khoảng từ 5% đến 10% trường hợp ung thư vú được cho là liên quan đến những thay đổi di truyền (đột biến) trong một số gen nhất định,

phổ biến nhất là của các gen BRCA1 và BRCA2 Gen nằm trên nhiễm sắc thể số 17,

đột biến gen này liên quan tới 55%-85% trường hợp mắc ung thư vú Bệnh nhân mắc

hội chứng Li-Fraumeni với đột biến gen p53, hội chứng Conden đột biến gene PTEN… cũng là yếu tố làm tăng nguy cơ ung thư vú [32]

 Tiền sử gia đình: Những phụ nữ có thân nhân cận huyết từ cả gia đình nội ngoại mắc ung thư vú có nguy cơ mắc bệnh này cao hơn Đặc biệt những người có

mẹ, chị em gái, hay con gái bị ung thư vú sẽ có nguy cơ tăng gấp đôi Tuy nhiên, hầu hết phụ nữ bị ung thư vú (trên 85%) lại không có lịch sử gia đình về bệnh này

 Ung thư vú cũng có nguy cơ tái phát bệnh, một người đã từng bị ung thư ở một vú có thể bị tái phát ở vú đó hoặc mắc ung thư ở vú còn lại Đặc biệt, ung thư biểu mô thuỳ tại chỗ có nguy cơ phát triển ung thư cao hơn 7-11 lần ở vú bên kia so với các trường hợp ung thư vú khác Những phụ nữ có u vú lành tính hay người có

mô tuyến dầy đặc cũng có nguy có mắc ung thư vú cao hơn những người khác

 Ung thư vú liên quan mật thiết đến sự thay đổi hormon trong cơ thể người phụ nữ Sự thay đổi hormon mạnh mẽ ở một số giai đoạn đặc biệt ở phụ nữ và các liệu pháp hormon làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư vú Người ta nhận thấy mối liên hệ giữa ung thư vú với các hormon estrogen và progesterone Ở những phụ nữ bắt đầu có kinh sớm (trước tuổi 12) hoặc những người mãn kinh muộn (sau tuổi 55), thời gian có kinh kéo dài tức là có sự thay đổi nhiều hơn đối với 2 hormon này và họ

có nguy cơ mắc cao hơn Liệu pháp thay thế hormon kết hợp hai hormon estrogen và progesterone được sử dụng sau thời kì mãn kinh giúp giảm các triệu chứng của mãn

kinh và giúp ngăn ngừa loãng xương và giảm nguy cơ mắc ung thư cổ tử cung nhưng lại có nguy cơ mắc ung thư vú tăng Những người có con muộn hoặc không có con và người sử dụng thuốc tránh thai cũng có nguy cơ này Một số nghiên cứu còn chỉ ra rằng nếu cho con bú từ 1,5 đến 2 năm có thể làm giảm nguy cơ mắc ung thư vú

 Ngoài ra còn có nhiều yếu tố khác: Một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến mật

độ tuyến vú như tuổi tác, tình trạng mãn kinh, một số loại thuốc (bao gồm liệu pháp hormone mãn kinh), mang thai và di truyền Những người đã từng tiếp xúc với phóng

xạ, hay từng trải qua xạ trị, người thừa cân hoặc béo phì, vận động ít, sử dụng rượu thường xuyên hay sử dụng nhiều chất béo…cũng góp phần làm tăng nguy cơ ung thư vú

1.3 NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SỐ LƯỢNG BẢN SAO ADN TI THỂ

Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ

Năm 2007, Yu và cs đã phân tích số lượng bản sao mtADN ở 59 mẫu mô u

và mô lân cận u bằng phương pháp PCR định lượng Kết quả cho thấy rằng mức độ của mtADN giảm đáng kể trong các mô u so với mô lân cận u liền kề Số lượng bản sao mtADN giảm có liên quan với nhóm tuổi từ 50 trở lên Ngoài ra, trong khối u mang đột biến ở vùng D-loop, có số lượng bản sao mtADN thấp hơn đáng kể Việc giảm số lượng bản sao mtADN có thể tham gia vào quá trình hình thành và tiến triển ở ung thư vú và có nhiều tiểm năng được sử dụng như một công cụ để chẩn đoán tiên lượng Đột biến soma ở vùng D-loop có lẽ là một trong những yếu tố góp phần quan trọng dẫn đến giảm số lượng bản sao mtADN trong các khối u vú [39]

Năm 2009, Xia và cs tiến hành nghiên cứu mẫu máu ngoại vi được thu thập

từ 60 bệnh nhân ung thư vú và 51 đối chứng là người bình thường khỏe mạnh có độ tuổi tương ứng ADN được tách chiết từ máu ngoại vi, được định lượng mtADN và nDNA bằng phương pháp PCR định lượng đa mồi (multiplex real-time PCR) để khuếch đại trình tự của gen ATP8 và gen glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Lượng mtADN được xem xét tương ứng với giai đoạn của khối u, tình trạng kinh nguyệt, tuổi, tình trạng hạch bạch huyết, các biểu hiện của thụ thể estrogen (ER), thụ thể progesterone (PR) và protein / neu-2 của bệnh nhân ung thu

vú Họ đã thu được kết quả lượng mtADN ở bệnh nhân ung thư vú giai đoạn I thấp

hơn đáng kể so với các giai đoạn khác Số lượng bản sao mtADN giảm được tìm thấy trong nhóm bệnh nhân ung thư trong giai đoạn mãn kinh Không có sự khác biệt về số lượng bản sao mtADN liên quan đến tuổi, số hạch, ER, PR, Her-2 / neu Trong nghiên cứu này, số lượng bản sao mtADN giảm trong máu ngoại vi của bệnh nhân ung thư vú được gắn liền với giai đoạn I Việc sử dụng mtADN có thể có giá trị chẩn đoán và nghiên cứu sâu hơn, có tiềm năng trở thành một chỉ thị để phát hiện sớm ung thư vú [35]

Năm 2013, Thyagarajan và cs đã nghiên cứu mối liên quan giữa số lượng bản sao mtADN trong máu ngoại vi và nguy cơ ung thư vú ở 184 bệnh nhân ung thư

vú và 529 mẫu đối chứng Số lượng bản sao mtADN được xác định bằng phương pháp PCR định lượng Các phân tích đã cho thấy rằng có mối liên hệ giữa số lượng bản sao mtADN và nguy cơ ung thư vú Nguy cơ cao đối với những bệnh nhân ung thư vú nguyên phát mắc dưới 3 năm có số lượng bản sao mtADN trong máu ngoại

vi cao Không có mối liên quan giữa số lượng bản sao mtADN và nguy cơ ung thư

vú ở phụ nữ đã cung cấp mẫu máu trên 3 năm trước khi chẩn đoán ung thư vú Nghiên cứu này cho thấy tiềm năng giữa số lượng bản sao mtADN và nguy cơ ung thư vú phụ thuộc vào thời gian lấy máu và chẩn đoán ung thư vú [30]

Hiện nay trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về biến đổi số lượng bản sao ADN ti thể, nhưng ở Việt Nam đây là một hướng nghiên cứu rất mới Cho đến nay, chúng tôi vẫn chưa tìm thấy một công bố chính thức về nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN đối với bệnh ung thư nói chung và ung thư vú nói riêng ở Việt Nam

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ADN TI THỂ

Nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN đang là một hướng nghiên cứu chỉ thị ung thư khả quan và có nhiều hứa hẹn Các phương pháp nghiên cứu được sử dụng nhiều để nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN hiện nay gồm:

Phương pháp PCR định lượng

Đây là phương pháp được phát triển dựa trên phương pháp PCR, được sử dụng để khuếch đại và định lượng một đoạn ADN đích Trong đó kết quả khuếch đại được hiển thị ngay sau mỗi chu kì phản ứng Đo đó cho phép xác định số lượng

bản ADN đích được khuếch đại với độ nhạy và độ chính xác cao kỹ thuật này được

sử dụng nhiều nhất trong nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN hiện nay

PCR định lượng sử dụng phân tử phát huỳnh quang để ghi lại quá trình tăng lượng ADN được nhân lên trong phản ứng PCR tỷ lệ thuận với sự tăng tín hiệu huỳnh quang PCR định lượng cho phép xác định số bản sao mtADN ban đầu có

trong mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao Có hai kỹ thuật hay được sử dụng:

 Kỹ thuật sử dụng chất nhuộm màu gắn với ADN: Chất nhuộm này có ái lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đôi ADN, làm cho sợi đôi ADN phát được ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích

 Kỹ thuật sử dụng đầu dò oligonucleotide có gắn phân tử huỳnh quang Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt cặp của đầu dò lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại, khi đó sẽ có sự phát huỳnh quang từ ống phản ứng khi nó nhận được nguồn sáng kích thích

 Phương pháp PCR định lượng cho phép định lượng đột biến mtADN với mức

tích các hợp chất hóa sinh học Phương pháp này có độ nhạy cao, có khả năng ứng

dụng rộng rãi, cho phép phân tích với lượng mẫu nhỏ Tuy độ nhạy và chính xác không được bằng phương pháp PCR định lượng nhưng cũng cho các kết quả định lượng đáng tin cậy Bên cạnh đó ứng dụng của HPLC rất đa dạng, có thể sử dụng phân tích protein, ADN hay các hợp chất hóa học

Phương pháp RPLC-HPLC sử dụng cột sắc ký kỵ nước trên cơ sở sắc ký lỏng pha đảo để phân tách ADN có kích thước khác nhau Nhiều nghiên cứu đã sử dụng phương pháp này để sàng lọc toàn bộ genome ti thể, hoặc một vùng nhất định của mtADN để xác định đột biến

Phương pháp DHPLC được phát triển từ phương pháp HPLC, sử dụng cột sắc ký kỵ nước trên cơ sở sắc ký lỏng pha đảo để phân tách ADN dị sợi kép

(heteroduplex) với đồng sợi kép (homoduplex) Các mạch ADN được phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau và hình thành ADN

dị sợi kép chứa các cặp ghép đôi không chính xác Các phân tử dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thường Nhiều nghiên cứu đã sử dụng phương pháp này để sàng lọc toàn bộ genome ti thể, hoặc một vùng nhất định của mtADN để xác định đột biến Phương pháp DHPLC cho phép định lượng đột biến mtADN thấp tới 1% [11]

Phương pháp định lượng bằng phần mềm phân tích hình ảnh bản gel điện di

Sự phát triển mạnh mẽ của các hệ thống phần mềm, các ứng dụng tin học đã

có nhiều đóng góp to lớn trong các ngành khoa học nói chung và ngành sinh học nói riêng Đây là phương pháp đơn giản, ít tốn kém, tiện dụng, cho kết quả nhanh và có thể áp dụng rộng rãi

Sau khi tham khảo các ưu, nhược điểm của các kỹ thuật trên và dựa trên điều kiện của phòng thí nghiệm cho phép chúng tôi ứng dụng kỹ thuật HPLC và phần mềm ImageJ để nghiên cứu biến đổi số lượng bản sao mtADN ở bệnh nhân ung thư

vú Việc kết hợp phương pháp kinh điển với độ chính xác cao trong sinh học thực nghiệm là HPLC với phương pháp ứng dụng phần mềm phân tích hình ảnh sẽ cho kết quả khách quan và toàn diện hơn để khảo sát sự biến đổi số lượng bản sao mtADN đối với bệnh nhân ung thư nói chung và bệnh nhân ung thư vú nói riêng, qua đó đánh giá được vai trò và mức độ liên quan của biến đổi đó đối với bệnh

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là mô vú tại vị trí khối u và mô vú lân cận ở rìa vị trí u của bệnh nhân ung thư vú Mẫu mô vú sử dụng trong nghiên cứu này do Khoa Tế bào

và Giải phẫu bệnh, Bệnh viện K cung cấp (danh sách bệnh nhân được trình bày ở phần phụ lục 1)

Mẫu đối chứng là mẫu máu và mô của người u xơ vú (danh sách bệnh nhân được trình bày ở phần phụ lục 2) Mẫu mô được cho vào ống eppendorf vận chuyển

về trong nitơ lỏng và bảo quản ở tủ lạnh sâu -80OC Mẫu máu được đựng trong ống đựng máu chuyên dụng có chứa chất chống đông

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất chính sử dụng cho nghiên cứu được liệt kê trong bảng 1

Bảng 1 Các hóa chất chính sử dụng cho nghiên cứu

Hóa chất tách ADN tổng số mô từ mô (QIA amp DNA mini kit)

Hóa chất thôi gel QIAGEN (Đức)

Cặp mồi gen ti thể mt và cặp mồi gen

β-actin (ACTB)

IDT (Mỹ)

Maxima Hot Start PCR MasterMix (2x) Thermo Scientific (Mỹ)

Agarose Invitrogen (Mỹ) APS, Acrylamide, Bis-Acrylamide Pharmacia, Thụy Điển GeneRuler 100 bp DNA Ladder Thermo Scientific (Mỹ)

NoLimits DNA Fragment 100bp,

200bp, 400bp

Thermo Scientific (Mỹ)

Acetonitrile, HPLC gradient grade Merk (Đức)

Acid acetic Sigma (Mỹ) Triethylamin Sigma (Mỹ)

Các hóa chất khác như isopropanol, ethanol, agarose, bạc nitrate,… đều đạt độ sạch phân tích dùng trong sinh học phân tử

2.1.3 Dụng cụ

- Bể ổn nhiêt (Julabo, Đức)

- Tủ an toàn sinh học (Nuaire, Mỹ)

- Buồng điện di Mini-Protean 3 cell (Bio-rad, Mỹ)

- Buồng điện di agarose (Bio-rad, Mỹ)

- Speed Vac (Thermo Electron, Mỹ)

- Máy nhân gen PCR 9700 system (Applied Biosystems, Mỹ)

- Máy ly tâm 5417R (Eppendorf, Đức)

- Máy đo NanoDrop 2000c (Thermo Scientific)

- Máy lắc ổn nhiệt (IKA, Đức )

- Tủ ấm (Memer, Đức )

- Tủ lạnh -20C và -80C (Nuaire, Mỹ)

- Hệ thống lọc nước loại vi khuẩn (Pyrex, Mỹ )

- Hệ thống máy microHPLC (Shimadzu, Nhật)

- Cột Hotsep PLRP-S (GTSepTech, Nauy )

- Máy scan, chụp ảnh gel cùng với phần mềm phân tích hình ảnh

- Máy tính trang bị các phần mềm tin sinh học kết nối đến các cơ sở dữ liệu trực tuyến, phần mềm thiết kế mồi Primer-BLAST

- Các dụng cụ, trang thiết bị cơ bản khác của phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu được thực hiện theo sơ đồ sau (Hình 2)

Hình 2- Sơ đồ quy trình thí nghiệm

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số

2.2.1.1 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô

- Mẫu mô u và mẫu mô mô lân cận được lấy ra từ tủ -80C, sau đó mẫu được

rã đông và chia nhỏ và tiến hành tách chiết ADN tổng số sử dụng kit tách chiết ADN từ mô QIA amp DNA minikit (Qiagen) theo quy trình của nhà sản xuất

2.2.1.2 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu

- Mẫu máu (bệnh nhân, người bình thường) được lấy ra từ tủ -80C, rã đông, lấy 200 μl cho vào ống eppendorf và tiến hành tách chiết ADN tổng số sử dụng kit tách chiết ADN từ máu- GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini KIT theo quy trình của nhà sản xuất (Thermo Scientific, Mỹ)

2.2.1.3 Kiểm tra ADN tổng số bằng điện di agarose

- Kiểm tra ADN tổng số bằng điện di trên gel agarose 0,8% và đo nồng độ ADN bằng máy NanoDrop

- Mẫu ADN sau khi được tách chiết được bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.2.2 Thiết kế các cặp mồi cho phản ứng PCR đa mồi phục vụ mục đích định lượng

2.2.2.1 Phân tích HPLC với các ADN chuẩn 100 bp, 200 bp và 400 bp

- Phân tích HPLC với ADN chuẩn 100 bp, 200bp và 400 bp để lựa chọn kích thước sản phẩm cần thiết kế cho phản ứng PCR đa mồi

- Nước sử dụng trong phân tích HPLC là nước khử ion

- Thành phần các hóa chất sử dụng trong phân tích HPLC (bảng 2)

Bảng 2: Thành phần hóa chất sử dụng trong phân tích HPLC

- Chương trình Phân tích HPLC được thực hiện theo các bước sau (Hình 3)

2.2.2.2 Thiết kế các cặp primer

Để định lượng số bản sao mtADN chúng tôi thiết kế hai cặp primer cho phản ứng PCR đa mồi để tạo sản phẩm cho các phương pháp định lượng sau đó Với mục đích định lượng số bản sao của mtADN, chúng tôi chọn gen giữ nhà trong nhân là

gen β-actin (ACTB) và đoạn gen đặc trưng cho tính bảo thủ của mtADN được lựa chọn là ở vùng gen ND1– mã hóa cho 1 tiểu phần của Ubiquinon trong phức hệ 1

của chuỗi hô hấp của ti thể Ngoài ra, để quá trình phân tích và định lượng bằng HPLC được tiến hành thuận lợi, các đoạn ADN (sản phẩm PCR định lượng) phải được lựa chọn sao cho có sự khác biệt nhất định về kích thước

Các cặp primer được thiết kế dựa trên các trình tự gen được tham khảo trên

cơ sở dữ liệu NCBI (gen β-actin: NG_007992.1; mtDNA: NC_012920.1) và phần

mềm thiết kế Primer-BLAST (NCBI)

Khuếch đại đoạn gen mt và gen ACTB bằng phương pháp PCR

- Đoạn gen mt và ACTB được khuếch đại bằng phương pháp PCR với thể tích 12,5 µl nhằm kiểm tra cặp mồi có nhân sản phẩm đúng kích thước không

- Phản ứng PCR với từng cặp primer mt và ACTB gồm các thành phần trong bảng 3

H2O siêu sạch Bổ sung đủ 12,5

µl

Bổ sung đủ 100

µl

Chu trình nhiệt được thiết lập như sau (Hình 2.2.2.3)

Hình 4- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân đoạn gen mt và ACTB

Khuếch đại đoạn gen ti thể mt và đoạn gen nhân ACTB bằng phương pháp PCR đa mồi

- Khuếch đại bằng phản ứng PCR đoạn gen mt và ACTB với thể tích 15 µl

ADN khuôn Tùy nồng độ ADN tổng số

của mẫu 2 ng

H2O siêu sạch Bổ sung đủ 15 µl Chu trình nhiệt được thiết lập như ở hình 4 ở trên

Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di

Trong đệm TBE (pH 7,5 - 8.3), các phân tử acid nucleic tích điện âm nên dưới tác dụng của dòng điện một chiều, các phân tử này sẽ chuyển động từ cực âm sang cực dương Tốc độ di chuyển của các phân tử này phụ thuộc chủ yếu vào kích

thước phân tử acid nucleic, nhờ đó mà những đoạn ADN hay ARN khác nhau có khả năng phân biệt với nhau trên gel điện di Gel điện di thường sử dụng là agarose

và polyacrylamide Tùy vào kích thước đoạn ADN muốn phân tách người ta sẽ sử dụng chúng ở những nồng độ khác nhau

Kích thước sản phẩm PCR đoạn gen mt là 433 bp và đoạn gen ACTB là 107

bp, nên có thể phân tích bằng điện di trên gel agarose 1.7%

2.2.2.3 Nhân dòng đoạn gen mt và ACTB và giải trình tự ADN

Các đoạn ADN tinh sạch được nhân dòng để giải trình tự nhằm xác định trình tự của các đoạn gen

- Tiến hành tạo đầu bằng và biến nạp đoạn mt và ACTB bằng kit CloneJET PCR Cloning Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất (vectơ được sử dụng là pJET 1.2

có kích thước 2974bp Vị trí đa điểm của vector được thiết kế nằm trong gen mã hóa cho một protein gây độc cho vi khuẩn)

- Vectơ được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α

- Các tế bào sau biến nạp thành công sẽ mọc trên môi trường LB đặc có chứa ampicillin

- Các khuẩn lạc sau khi được kiểm tra đúng bằng PCR sẽ được nuôi với thể tích lớn 5ml trong môi trường LB có chứa ampicillin ở 37oC trong 14-16h lắc 200 vòng /phút

- Sau đó các tế bào được thu và tách plasmid bằng QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)

- Kiểm tra plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8% và đo nồng độ ADN bằng máy đo quang phổ Nanodrop

- Plasmid thu được sẽ được kiểm tra bằng PCR với cặp mồi mt, ACTB và pJET, nếu đúng sẽ cho đoạn gen có kích thước tương ứng với các cặp mồi và với mồi PJet sẽ cho đoạn gen lớn hơn 120bp so với kích thước của các đoạn gen tương ứng

- Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1,7%

- Mẫu plasmid sau khi tinh sạch sẽ được giải trình tự ADN

2.2.3 Định lượng ADN bằng HPLC và phần mềm ImageJ

2.2.3.1 Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR đa mồi mt_ACTB để phục vụ mục đích định lượng:

Theo lý thuyết PCR, số bản sao đoạn gen sẽ tăng theo chu kỳ, tuy nhiên với

số chu kỳ lớn hơn 40 thì sản phẩm đạt đến tình trạng bão hòa Điều này được giải thích với các nguyên nhân chủ yếu như: nồng độ bản sao DNA tăng khiến cho lượng dNTP không đủ cung cấp; hoạt tính enzyme polymerase giảm sau nhiều chu trình thay đổi nhiệt độ Vì vậy, việc xác định các chu kỳ mà tại đó sản phẩm PCR vẫn đang thay đổi tuyến tính mang tính quyết định tới độ chính xác của kết quả định lượng sau này Đặc biệt là đối với phản ứng PCR đa mồi còn có cả sự cạnh tranh dNTP, enzyme polymerase và không loại trừ khả năng bắt cặp giữa các cặp mồi

Chính vì vậy, dựa vào các kết quả PCR đơn và đa mồi phía trên, chúng tôi tiến hành tìm các chu kỳ cho PCR đa mồi mà ở đó lượng sản phẩm vẫn đang biến đổi tuyến tính Tiến hành PCR ở các chu kì khác nhau 20, 25, 30, 35 chu kì để chọn được chu kì PCR phù hợp (nằm trong khoảng tuyến tính)

2.2.3.2 Kiểm tra sản phẩm PCR đa mồi mt_ACTB bằng điện di

Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide 10% (bảng 2.2.4.2) Điện di bằng đệm TBE 1X (pH 7,5 - 8,3) ở 175 V trong 40 phút Sau đó được nhuộm bạc và quan sát dưới ánh sáng trắng