Cellulose là một hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kết các mắt xích -D- Glucose, thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật, khó phân hủy, việc xử lý cellulose từ rá
Trang 1Luận văn tốt nghiệp ĐH Chuyên ngành CNSH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TIỀN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KHOA HỌC CÂY TRỒNG
ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Trang 2Luận văn tốt nghiệp ĐH Chuyên ngành CNSH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TIỀN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KHOA HỌC CÂY TRỒNG
ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGUYỄN DUY PHƯƠNG MSSV: 013142049
LỚP DHCNSH13
Trang 3Luận văn tốt nghiệp ĐH Chuyên ngành CNSH
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
Duyên[A2][A3]
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ KHÓA[A4] LUẬN ………
………
………
………
………
………
………
………
………
Tiền Giang, ngày tháng [A5]năm 2017
CHỦ[A6] TỊCH HỘI ĐỒNG
Trang 4Luận văn tốt nghiệp ĐH Chuyên ngành CNSH
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu đề tài 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Sơ lược về vấn đề môi trường 3
2.2 Sơ lược về các biện pháp xử lý rác thải 3
2.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước 4
2.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 4
2.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 6
2.4 Giới thiệu về cellulose 6
2.5 Tổng quan về phức hệ enzyme cellulase 7
2.6 Một số dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose 9
2.6.1 Vi khuẩn Bacillus sp. 9
2.6.2 Vi khuẩn Pseudomonas sp. 9
2.6.3 Vi khuẩn Cellulomonas sp. 10
2.6.4 Vi khuẩn Cytophara. 11
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
3.1.Phương tiện 12
3.1.1.Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose 12
3.1.2 Giả thuyết nghiên cứu 12
3.1.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 12
3.1.4 Vật liệu và hóa chất. 12
3.2 Phương pháp nghiên cứu 14
Trang 5Luận văn tốt nghiệp ĐH Chuyên ngành CNSH
3.2.1.Thí nghiệm 1: Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose.
vi khuẩn. 18
3.2.5 Thí nghiệm 5: Nhận diện một số chủng vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự. 18 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ DỰ KIẾN 20 TÀI LIỆU THAM KHẢO 22
Trang 6Luận văn tốt nghiệp ĐH Chuyên ngành CNSH
DANH SÁCH[A8] HÌNH
Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus subitilis 9
Hình 2.2 Vi khuẩn Pseudomonas sp[A9] .10
Hình 2.3 Vi khuẩn Cellumonas sp .10
Hình 2.4 Vi khuẩn Cytophaga sp .11
Hình 3.1 Quy trình phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose 12
Trang 7Luận văn tốt nghiệp ĐH Chuyên ngành CNSH
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn CMC 13
Trang 8Luận văn tốt nghiệp ĐH Chuyên ngành CNSH
[A10]
Trang 9Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang
xí nghiệp, nông nghiệp, sinh hoạt gia đình không ngừng thải ra môi trường Đến năm 2015 Việt Nam thải ra hơn 40 triệu tấn rác thải (Bộ Tài Nguyên và Môi trường) Rác thải là một trong những nguyên nhân chính gây ra biến đổi khí hậu, dịch bệnh, thủng tầng ozon… và đặc biệt ảnh hưởng trực tiếp đến nền kinh tế nước nhà và đời sống xã hội
Một trong những thành phần chủ yếu hiện diện trong phần lớn nguồn rác thải là Cellulose Cellulose thường có mặt ở các dạng như: phụ phẩm nông nghiệp (rơm, rạ, lá cây, vỏ lạc, vỏ trấu, vỏ thân ngô, xác các loại cây lương thực,…), phụ phế phẩm công nghiệp thực phẩm (vỏ và xơ quả, bã mía, bã cà phê, bã sắn, hạt sơ ri,…), phụ phế phẩm trong công nghiệp chế biến gỗ (rễ cây, mùn cưa, gỗ vụn, vỏ cây,…) và các chất thải gia đình (vải, giấy vụn, các loại thùng giấy,…)
Cellulose là một hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kết các mắt xích -D- Glucose, thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật, khó phân hủy, việc xử lý cellulose từ rác thải hữu cơ gặp nhiều khó khăn Các nhà khoa học đã và đang không ngừng tìm cách xử lý tối ưu lượng cellulose bằng các biên pháp vật lý, hóa học, sinh học nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường
Hiện nay, để xử lý rác thải hữu cơ dùng nhiều phương pháp: chôn lấp, ủ phân compost, đổ đống tự nhiên… Những phương pháp này còn nhiều hạn chế và tốn thời gian, không đạt hiệu quả cao
Vì thế việc xử lý cellulose bằng biện pháp sinh học đang được quan tâm và nghiên cứu nhiều nhất, phương pháp này sử dụng các vi sinh vật và các hệ enzyme trong vai trò là chất phân hủy rác thải thành các hợp chất đơn giản, ít độc hại, dễ xử lý, an toàn hơn Đồng thời có thể ứng dụng các vi sinh vật để sản xuất phân bón hữu co Xuất phát từ thực tế này, chúng
Trang 10Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang
Trang 11Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang
Tại thành phố Hà Nội, khối lượng rác sinh hoạt tăng trung bình 15% một năm, tổng lượng rác thải ra ngoài môi trường lên tới 5.000 tấn/ngày Thành phố Hồ Chí Minh mỗi ngày có trên 7.000 tấn rác thải sinh hoạt, mỗi năm cần tới 235 tỉ đồng để xử lý
Ô nhiễm môi trường bao gồm 3 loại chính là: ô nhiễm đất, ô nhiễm nước và ô nhiễm không khí Giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trong thời kỳ đẩy mạnh công nghiệp hóa - hiện đại hóa hiện nay không chỉ đòi hỏi
sự cấp thiết đối với các cấp quản lý, các doanh nghiệp mà đó còn là trách nhiệm của cả hệ thống chính trị và toàn xã hội
Để bảo vệ môi trường thoát khỏi các hiểm họa: thủng tầng ôzon, hiệu ứng nhà kính, ô nhiễm nguồn nước sạch, không khí, đất đai,…con người cần phải nâng cao nhận thức gìn giữ vệ sinh môi trường và hiểu rõ vai trò, vị trí của mình và xã hội trong hệ thống tự nhiên con người- xã hội Xây dựng ý thức và phát triển mọi phương pháp vật lý, hóa học, sinh học để xử
lý rác thải, nước thải môi trường Đồng thời kết hợp việc sử dụng, bảo vệ cùng với việc tái chế nguồn tài nguyên thiên nhiên
2.2 Sơ lược về các biện pháp xử lý rác thải
Rác là hiểm họa của môi trường, nhưng rác cũng là vàng nếu chúng ta biết tận dụng, khai thác và tái sử dụng Trên thực tế, nhiều công ty trên thế giới đã và đang thu được những khoản lợi nhuận khổng lồ từ rác Các nhà nghiên cứu khoa học hiện nay cũng như các trung tâm bảo vệ môi
Trang 12Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang
tái chế nguồn rác thải một cách có hiệu quả nhất dựa trên cơ sở thực tế Tất
cả ứng dụng trong sinh học, hóa học, vật lý đến các kỹ thuật máy móc thô sơ hay hiện đại đều được sử dụng để xử lý rác thải, bảo vệ môi trường xanh sạch đẹp
Tại Việt Nam, từ việc xử lý rác bằng biện pháp đơn giản là chôn lấp rác, ủ thành phân trộn đến những biện pháp khoa học: lên men phụ phẩm rác thải thành cồn, tạo sinh khối nấm men… Những loại rác hữu cơ cũng được sử dụng làm phân bón Các loại rác như nylon, bìa giấy, chai nhựa,…
sẽ được tái chế để dùng làm nguyên liệu Còn các loại rác vô cơ khác được tái chế thành vật liệu xây dựng nhẹ cấp thấp được dùng cho các công trình cảnh quan đô thị
Trên thế giới, việc xử lý rác thải đều được các nước quan tâm và thực hiện một cách nghiêm ngặt các tiêu chuẩn đối với môi trường Ở Đan
Mạch và Mỹ đang ngày đêm xây dựng các nhà máy lớn với mục đích xử lý chất thải thành điện năng Ngoài ra, ở một số nước như: Anh, Mỹ, Nhật
Bản,… đưa ra các biện pháp tối ưu, áp dụng nhiều kỹ thuật khoa học tiên tiến để tái chể các loại rác thải thành sản phẩm có giá trị sử dụng thực tế
(https://vea.gov.vn )
Ngày nay, với sự phát triển ngày một nâng cao của ngành công nghệ sinh học, đặc biệt là chuyên ngành vi sinh vật, các nhà nghiên cứu khoa học đã ứng dụng thành công một số vi sinh vật trong việc xử lý môi trường Các loại vi sinh vật được biết đến với khả năng tạo ra các hệ enzyme có thể
xử lý rác thải Các chất độc hại trong môi trường bao gồm các chất có vòng thơm như hợp chất phenol, các amin vòng, hợp chất phospho hữu cơ, Các
hệ enzyme có thể hoạt động trên các chất ô nhiễm đặc biệt khó xử lý để loại
bỏ chúng bằng cách kết tủa hoặc chuyển chúng thành dạng khác ít độc hại Hơn thế nữa, chúng có thể làm thay đổi các đặc tính của chất thải về dạng dễ
xử lý hoặc chuyển thành sản phẩm có giá trị hơn Ví dụ: enzyme protease, lipase, cellulase,
2.3 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước
2.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước
Bacillus sp là đối tượng có khả năng sản xuất enzyme cellulase có
hoạt tính cao, sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, phân bón,
Trang 13Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang
xử lý môi trường và y học Trong khảo sát các điều kiện nuôi cấy và tách
chiết enzyme cellulase từ Bacillus subtilis, kết quả cho thấy ở 40oC, pH=7,0
và thời gian nuôi là 30 giờ thì lượng enzyme sinh ra là lớn nhất và có thể thủy phân mạnh mẽ nguồn cellulose (Trần Thị Ánh Tuyết và Trương Quốc Huy, 2010)
Theo Trần Cẩm Vân (2001), cellulose được phân hủy bởi các enzyme ngoại bào cellulase Các nhóm vi khuẩn có khả năng phân hủy
cellulose là: Cytophaga, Cellulomonas, Clostridium, Pseudomonas Các
giống vi khuẩn này được nghiên cứu và ứng dụng khá phổ biến trong các quá trình làm sạch sinh học Ngoài ra, chúng còn có khả năng tái khoáng hóa nhiều chất bẩn hữu cơ (Kiều Hữu Anh và Ngô Tự Thành, 1985)
Cellulose là cơ chất khó bị phân hủy vì có cấu trúc rất bền và hoàn hoàn không tan trong cả nước nóng lẫn nước lạnh Vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose vì chúng có thể tạo ra được 3 loại enzyme phân hủy được cellulose Tuy nhiên không phải tất cả các vi khuẩn đều có khả năng cùng một lúc tổng hợp ra 3 loại enzyme Có loài tổng hợp ra enzyme này nhiều, loài khác lại tổng hợp ra enzyme khác nhiều hơn Chính vì thế, sự phân hủy các hợp chất cellulose trong thiên nhiên đòi hỏi rất nhiều loài vi khuẩn khác nhau, thay phiên nhau phân hủy từng giai đoạn trong toàn bộ chuỗi chuyển hóa các chất chứa cellulose (Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Thị Thùy Dương, 2003)
Các chủng vi sinh vật phân hủy cellulose được phân lập từ đất, bùn mía Các chủng nấm phân lập trên môi trường Czaper-Dox có bổ sung bột giấy, các chủng vi khuẩn được phân lập trên môi trường Lemberk và Colmer với giấy lọc Bằng phương pháp xác định hoạt tính cellulase ngoại bào bằng khuếch tán trên thạch và phương pháp xác định hoạt tính cellulase theo Nelson- Somogyi, Nguyễn Thị Kim Cúc (2001) đã phân lập được 6 chủng nấm và 15 chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulose
Cặp mồi được sử dụng để nhận diện một số chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose 27f: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’;
1492r: 5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’ (Akasaka et al., 2002) Võ Văn Phước QuệP0F 1 P và Cao Ngọc Điệp đã phân tích di truyền phân tử dựa trên trình tự 16S rRNA với cặp mồi trên, cho thấy 3 dòng vi khuẩn Q5, Q8
Trang 14Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang
và Q9 đồng hình 99-100% tương ứng với các dòng Bacillus megaterium
M530013, TF10 và LAMA262; Dòng vi khuẩn Q4 đồng hình 99% với dòng
Cellulomonas flavigena
2.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Cellulase, đặc biệt là EGIII và CBHI thường được dùng làm sạch vải sợi (Clarksonet et al., 2000) Những cellulase thu nhận từ những chủng
nấm mốc: Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichoderma harzianum, Humicola insolens,… hoạt động trong môi trường kiềm nhẹ
thường được ứng dụng trong công nghiệp tẩy rửa (Kottwitz và Schambil, 2005) Chúng thường được dùng kết hợp với bột giặt và chất tẩy (Uhlig, 1998)
Bakare et al (2005) đã phân lập và định tính enzyme cellulase từ một chủng hoang dại và hai chủng đã được gây đột biến của Pseudomonas fluorescens Động lực học enzyme của ba loại enzyme trên ở pH 6,5-7,0,
35oC lần lượt là 3,6; 3,1 và 5,3 mg/mL Othman et al (2011) đã tiến hành thủy phân vỏ trái ca cao thành ethanol nhiên liệu Kết quả thủy phân cao nhất khi thủy phân vỏ trái ca cao bằng acid HCl ở 75oC trong 4 giờ Lượng đường sinh ra sau quá trình thủy phân được lên men bằng nấm men
Saccharomyces cerevisiae ở 30oC Lượng ethanol thu được là 17,3% sau thời gian lên men là 26 giờ
Clostridium papyrosolvens cũng được phát hiện có khả năng tổng hợp cellulase Clostridium papyrosolvens được nuôi cấy 48 giờ trong điều
kiện kỵ khí ở 35oC cho dịch trích có hoạt tính CMCase cao CMCase có nhiệt độ tối thích là 35oC và pH tối thích là 6,5 đến 7,5 (Rani.D.Swaroopa, 2004)
2.4 Giới thiệu về cellulose
Cellulose là thành phần cơ bản của thực vật Ngoài ra người ta còn thấy chúng có mặt nhiều ở một số tế bào của một số loài vi sinh vật
Ở tế bào thực vật và ở tế bào một số loài vi sinh vật chúng tồn tại ở dạng sợi Cellulose không có trong tế bào động vật, chúng là một homopolymer mạch thẳng được cấu tạo bởi các đơn vị -D Glucose –Pyranose Các thành phần này liên kết với nhau bởi các glucose không phân nhánh, các glucose này liên kết bởi β-1,4glucosidases (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Trang 15Luận văn tốt nghiệp ĐH Trường ĐH Tiền Giang
Cellulose thường chứa 10.000-14.000 đơn vị glucose/phân tử và
có trọng lượng phân tử khoảng 50.000- 2.500.000 Dalton Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Van Der War và liên kết hydro (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Cellulose không tan trong nước Khi đun nóng với acid sulfuric, celluolose bị thủy phân thành cellubiose rồi thành - Glucose
Các phân tử glucose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi (microfibrin), các vi sợi thường tồn tại 2 vùng:
+Vùng kết tinh: Celllose có cấu trúc trật tự rất cao và rất bền vững Enzyme cellulase chỉ có tác dụng trên bề mặt hệ sợi này
+Vùng vô định hình: cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài Enzyme cellulase có thể thủy phân vùng này dễ dàng và làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng Chiều dài phân tử cellulose trong vùng này thường lớn gấp hàng chục lần so với vùng kết tinh (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
2.5 Tổng quan về phức hệ enzyme cellulase
Cellulose là định nghĩa chung để chỉ tất cả những enzyme có hoạt tính thủy phân cellulose thành các đơn vị monomeric Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng hệ enzyme có khả năng thủy phân cellulose thì cũng có hoạt tính tương tự như đối với hemicellulose (Howard et al., 2003; Lynd et al., 2002) Cellulase phân cắt các liên kết β-1,4glucosidases của mạng lưới cellulose theo cơ chế thủy phân acid (cho và nhận proton) Hệ thống enzyme cellulase được chấp nhận rộng rãi hiện nay là sự đồng hoạt động của các loại enzyme sau: endoglucanase (EC 3.2.1.4), exoglucanase hoặc cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), β-glucosidase (EC 3.2.1.21), oxidative cellulose và cellulose
Phosphorylase
Các loại enzyme trong hệ enzyme cellulase thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose Mỗi một loại enzyme chỉ tham gia thủy phân một phần phân tử cellulose
Endoglucanases : Các nhà khoa học chia chúng thành 2 loại EgI I
và EgI II EGI I chứa 418 amino acid , trọng lượng phân tử 48.212k Da Các
