Nghiên cứu điều chế Hydrogel nhạy cảm với nhiệt độ cơ thể từ dẫn xuất Gelatin để mang nhả chậm Curcumin ứng dụng trong chữa lành vết thương

Curcumin được điều chế dạng nano trong môi trường phân tán là hydrogel gelatin-pluronic F127 dưới tác dụng của sóng siêu âm để cải thiện tính tan tốt trong nước của curcumin và tạo ra hi

TÓM TẮT

Hydrogel nhạy nhiệt từ gelatin-pluronic F127 được tổng hợp thông qua việc ghép pluronic F127 đã được hoạt hóa và gelatin Curcumin được điều chế dạng nano trong môi trường phân tán là hydrogel gelatin-pluronic F127 dưới tác dụng của sóng siêu âm để cải thiện tính tan tốt trong nước của curcumin và tạo ra hiệu quả cộng hợp dẫn truyền curcumin, góp phần tăng nhanh quá trình chữa lành vết thương Cấu trúc của hydrogel được xác định bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, đặc tính nhạy nhiệt của hydrogel được xác định bằng phương pháp đảo ngược ống nghiệm (inversion tube) và nhiệt quét vi sai (DSC) Hydrogel tổng hợp có khả năng chuyển đổi trạng thái sol-gel theo nhiệt độ, khi ở nhiệt độ thấp hydrogel gelatin–pluronic F127 sẽ tồn tại ở trạng thái lỏng khi nâng nhiệt độ lên 35 oC (gần nhiệt độ cơ thể) sẽ chuyển thành màng gel Kích thước hạt nanocurcumin trong hydrogel được xác định bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và tán xạ ánh sáng động học (DLS) cho thấy hạt nano phân bố từ 7 đến 285 nm tùy hàm lượng curcumin sử dụng Khả năng mang nhả chậm nanocurcumin được xác định bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis, kết quả cho thấy hệ gel có khả mang nhả chậm nanocurcumin hiệu quả Tính chất nhạy nhiệt của hydrogel gelatin-pluronic F127 không thay đổi khi tải

thêm hạt nanocurcumin Trong nghiên cứu in vitro cho thấy rằng ở khoảng nồng độ

nanocurcumin thích hợp hệ gel composite hỗ trợ tốt cho sự tăng sinh nguyên bào sợi

Có thể kết luận rằng hydrogel gelatin-pluronic F127 nhạy nhiệt có khả năng mang nhả chậm nanocurcumin và có tiềm năng ứng dụng trong việc chữa lành vết thương

Từ khóa: Gelatin ghép pluronic F127, hydrogel nhạy nhiệt, nanocurcumin,

sóng siêu âm, trị lành vết thương

ABSTRACT

A temperature-responsive hydrogel composed of gelatin-grafting pluronic F127 was synthesized via grafting activated pluronic F127 and gelatin The nanocurcumin was created in the copolymer solution as dispersion to overcome its hydrophobicity and utilize its synergitically pharmaceutical properties for further applications The grafting efficiency was characterized by 1HNMR, thermal-transition behavior study was recorded via test Tube Inversion method and Differential Scanning Calorimetry (DSC) The synthetic copolymer underwent the thermal-transition from free-flowing sol at lower temperature and non-flowing gel when rising temperature to 35 oC (approximately physiological condition) Size distribution of nanocurcumin in the copolymer ranging from 7 to 285 nm by Transmission Electron Microscopy (TEM) and Dynamic Light Scattering (DLS) Release study measured by UV-vis spectroscopy, which showed sustainable release control of nanocurcumin in the thermogel system Thermal-sensitive characteristic of gelatin-pluronic F127 still remain efficiently with incorporation of nanocurcumin In vitro study suggested that nanocurcumin supplement supporting for the fibroblast proliferation In conclusion, synthetic thermogel prepared from nanocurcumin loaded gelatin-pluronic F127 thermogel can be potential injectable controllable release bioactive curcumin hydrogel applied for wound healing

Keywords: Gelatin-grafting pluronic F127, thermo-induced hydrogel

composite, nanocurcumin, ultrasonication, burn wound healing

MỤC LỤC

Trang tựa

Quyết định giao đề tài

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

ABSTRACT iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT x

DANH SÁCH CÁC HÌNH xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG xiv

PHẦN MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Lịch sử nghiên cứu vật liệu hydrogel chữa lành vết thương 3

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 8

4 Mục tiêu nghiên cứu 9

5 Nhiệm vụ nghiên cứu 9

6 Phương pháp nghiên cứu 10

7 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 11

8 Bố cục của luận văn 11

CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÝ THUYẾT 12

1.1 Pluronic F127 12

1.1.1 Giới thiệu pluronic F127 12

1.1.2 Tính chất của pluronic 12

1.1.3 Ứng dụng của pluronic 15

1.2 Tổng quan về gelatin 15

1.2.1 Nguồn gốc của gelatin trong tự nhiên 15

1.2.2 Phân loại gelatin 16

1.2.3 Tính chất vật lý 16

1.2.4 Tính chất hóa học 17

1.2.4.1 Cơ chế gel gelatin 17

1.2.4.2 Độ bền gel 17

1.2.4.3 Độ nhớt 17

1.2.4.4 Điểm đẳng điện (pI) 17

1.2.4.5 Tính lưỡng tính 18

1.2.4.6 Tính hòa tan 18

1.2.5 Ứng dụng của gelatin trong y sinh 18

1.3 Hydrogel 19

1.3.1 Giới thiệu về hydrogel 19

1.3.2 Phân loại hydrogel 20

1.3.3 Các tính chất đặc trưng của hydrogel 20

1.3.3.1 Tính trương nở 20

1.3.3.2 Tính phân hủy sinh học 21

1.3.3.3 Tính tương hợp sinh học 22

1.3.4 Hydrogel nhạy nhiệt [8], [13] 22

1.3.5 Ứng dụng của hydrogel 24

1.3.5.1 Truyền tải thuốc 24

1.3.5.2 Hệ thống chứa [8], [13] 24

1.3.5.3 Hệ thống nền 25

1.3.5.4 Chữa lành vết thương [8], [34] 26

1.4 Curcumin 27

1.4.1 Tổng quan về curcumin [1], [4], [46] 27

1.4.2 Một số tính chất lý hóa của curcumin [1] 28

1.4.3 Hoạt tính sinh học của curcumin 29

1.5 Cấu tạo của da [48] 30

1.5.1 Lớp biểu bì của da (Epidermis) 31

1.5.2 Lớp trung bì (Dermis) 31

1.5.3 Lớp hạ bì (hypodermis) 31

1.6 Vết thương do bỏng [47] 32

1.7 Cơ chế lành vết thương [49] 32

1.7.1 Giai đoạn cầm máu 33

1.7.2 Giai đoạn sưng viêm 33

1.7.3 Giai đoạn tái tạo 33

1.7.4 Giai đoạn tu sửa 33

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 34

2.1 Phương tiện nghiên cứu 34

2.1.1 Hóa chất 34

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 34

2.2 Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sẽ sử dụng 34

2.2.1 Tổng hợp hydrogel nhạy nhiệt trên cơ sở gelatin và pluronic F127 [12], [18], [34] 34

2.2.2 Quy trình tổng hợp gelatin-pluronic F127 nhạy nhiệt 35

2.2.3 Thuyết minh quy trình tổng hợp gelatin-pluronic F127 nhạy nhiệt 35

2.3 Tổng hợp nanocurcumin trong dung dịch copolymer bằng phương pháp đánh sóng siêu âm 37

2.4 Khảo sát hydrogel nhạy nhiệt trên cở sở gelatin-pluronic F127 và nanocurcumin trong hydrogel gelatin-pluronic F127 nhạy nhiệt 38

2.4.1 Đánh giá cấu trúc của hệ copolymer bằng 1H-NMR 38

2.4.2 Khảo sát đặc tính nhạy nhiệt của hydrogel GP, nCur-GP bằng phương pháp đảo ngược ống nghiệm (inversion tube) và nhiệt quét vi sai (DSC) 39

2.4.3 Khảo sát khối lượng suy giảm của hydrogel 40

2.4.4 Khảo sát hình dạng và kích thước hạt qua hình ảnh của TEM, DLS 41

2.5 Khảo sát đặc tính sinh học và hiệu quả chữa lành vết thương của nanocurcumine trong hydrogel gelatin–pluronic F127 nhạy nhiệt 42

2.5.1 Xác định hàm lượng nanocurcumine trong hydrogel bằng phương pháp phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis 42

2.5.2 Đánh giá hiệu quả nhả chậm nanocurcumin 43

2.5.3 Đánh giá ảnh hưởng của hệ lên sự tăng sinh nguyên bào sợi trong môi

trường nuôi cấy bằng phương pháp SRB (Sulforhodamine B) 44

2.5.4 Đánh giá hiệu quả của hydrogel nhạy nhiệt trên chuột 45

2.5.5 Đánh giá mô sinh học 47

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48

3.1 Kết quả tổng hợp NPC-F127-NPC 48

3.1.1 Phương trình phản ứng 48

3.1.2 Kết quả phổ 1H NMR của NPC-F127-NPC 49

3.2 Kết quả tổng hợp NPC-F127-OH 50

3.2.1 Phương trình phản ứng 50

3.2.2 Kết quả phổ 1HNMR của NPC-F127-OH 51

3.3 Kết quả tổng hợp F127-Gelatin 52

3.3.1 Phương trình phản ứng 52

3.3.2 Kết quả phổ 1H-NMR của F127-Gelatin 53

3.3.2.1 Kết quả phổ 1H-NMR của Gelatin 53

3.3.2.2 Kết quả phổ 1H-NMR của F127-Gelatin 54

3.4 Kết quả phổ hồng ngoại của NPC-F127-NPC, NPC-F127-OH, Gelatin-F127-OH 54

3.5 Khảo sát đặc tính nhạy nhiệt của hydrogel gelatin-pluronic F127 56

3.6 Kết quả khối lượng suy giảm sinh học của hydrogel gelatin-pluronic F127 59 3.7 Kết quả kích thước hạt nanocurcumin 60

3.8 Kết quả nhả curcumin của hydrogel 62

3.9 Kết quả độc tính tế bào của curcumin 65

3.10 Kết quả phân tích tế bào 66

3.10.1 Sự phát triển của tế bào 66

3.10.2 Đánh giá khả năng chữa lành vết thương, bỏng độ 2 trên động vật 68

3.10.3 Đánh giá cấu trúc mô học của vết thương bỏng độ 2 ở ngày thứ 14 69

KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ 72

1 Kết luận 72

2 Kiến nghị 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 PHỤ LỤC 78

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

F-127 Pluronic F-127 NPC p-nitrophenyl chloroformate

LCST Lower critical solution temperature UCS Upper critical solution temperature

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1 Những chấn thương thường gặp trong đời sống 1

Hình 3 Mô phỏng vết thương được xử lý bằng dextran hydrogel 3

Hình 5

Kết quả thử nghiệm trên chuột nhắt trắng Kết quả chữa trị cho thấy vết thương được điều trị bằng gel có tốc độ kéo da nhanh hơn

5

Hình 6

Mô hình nghiên cứu của Choi JS, và kết quả thử nghiệm in

Hình 7 Thử nghiệm tác dụng của curcumin trong chữa lành vết thương 6 Hình 8

Chuyển nhiệt của hydrogel, nanocurcumin/hydrogel composite và thử nghiệm sơ bộ hiệu quả chữa lành bỏng độ 2 8 Hình 9 Khả năng chữa lành vết thương của nCur-GP 9

Hình 1.9 Tương tác kỵ nước của polyme lưỡng tính theo nhiệt độ 23 Hình 1.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ trong hydrogel 23 Hình 1.11 Truyền tải thuốc bằng hệ thống chứa 25

Số hiệu hình Tên hình Trang

Hình 1.13 Trạng thái sol–gel của hydrogel chitosan–pluronic F127 27

Hình 3.1 Phương trình phản ứng tổng hợp NPC-F127-NPC 48 Hình 3.2 Phổ 1H-NMR của sản phẩm NPC-F127-NPC 49 Hình 3.3 Phương trình phản ứng tổng hợp NPC-F127-OH 51 Hình 3.4 Phổ 1H-NMR của sản phẩm NPC-F127-OH 51

Hình 3.5 Phương trình phản ứng tổng hợp copolymer

Số hiệu hình Tên hình Trang

Hình 3.12 Polyme nhạy nhiệt theo hiệu ứng cân bằng trong phân tử

Hình 3.13 Đường cong nhiệt DSC của coplymer GP (1:15) 20% 58 Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn % khối lượng giảm cấp sinh học theo thời gian 59 Hình 3.15 Chuyển pha sol-gel của hydrogel GP-nCur 61

Hình 3.17 Kết quả DLS của nCur trong hydrogel ở các nồng độ (a) 5%,

Hình 3.19 Kết quả nhả chậm nCur của hydrogel gelatin–pluronic F127 64

Hình 3.20 Đồ thị biểu thị sự phát triển của tế bào theo hàm lượng

Hình 3.21 Sự phát triển của nguyên bào sợi trong hydrogel 66 Hình 3.22 Kết quả sự tăng sinh tế bào của hydrogel nCur-gelatin-F12 67 Hình 3.23 Đánh giá khả năng lành trên bề mặt vết thương 68 Hình 3.24 Độ khép của vết thương theo thời gian 69 Hình 3.25 Mô của mẫu da bình thường và mẫu da bị bỏng độ 2 sau 1 ngày 69

Hình 3.26

Kết quả nhuộm hóa mô hematoxyline-eosin các mẫu mô tái tạo từ vết thương được xử lý hydrogel nCur-gelatin-F127 và các mẫu đối chứng (a) Bình thường (b) 1 ngày sau khi gây bỏng (c) không điều trị (d) điều trị bằng thuốc thương mại (e) điều trị bằng Gel-g-F127 gel và (f) điều trị bằng nCur-Gel-g-F127 gel

70

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 1.2 Các thông số hóa lý của các thành phần curcuminoid 29

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ curcumin đến sự

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ curcumin đến sự

PHẦN MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Da của chúng ta được xem như chiếc áo đặc biệt vừa bảo vệ cơ thể trước những tác động vật lý, hóa học của môi trường như: nhiệt độ, thời tiết, những va chạm trong sinh hoạt hàng ngày, vừa bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn, nấm, các loại virut…Tuy nhiên, chấn thương ngoại khoa gây tổn thương cho da là điều khó tránh khỏi Trong đó, bỏng là một trong những tai nạn thương tâm nhất và thường để lại những di chứng nặng nề về vấn đề thẩm mỹ cũng như sức khỏe của con người [6]

Hình 1: Những chấn thương thường gặp trong đời sống

(Nguồn: Vết thương, bỏng)

Mặc dù cơ thể con người có cơ chế tự chữa lành vết thương, nhưng đối với vết thương do bỏng nặng (khoảng 20% diện tích cơ thể), vết mổ bị nhiễm trùng, vết thương biến chứng thành vết loét ở những bệnh nhân đái tháo đường, viêm tỉnh mạch có quá trình làm lành vết thương bị kéo dài, gây vấn đề phức tạp trong điều trị, thêm vào đó là gánh nặng tài chính cho bệnh nhân mắc phải các loại vết thương này và thậm chí có thể dẫn đến tử vong [24]

Hiện nay, trên thế giới đã nghiên cứu sử dụng các màng da nhân tạo trong điều trị tổn thương bỏng và các loại vết thương ngoại khoa để khi lành có tính thẩm mỹ như vùng da bình thường Trong các loại màng nhân tạo đó, hydrogel đang rất được quan tâm do có thể chế tạo từ polysacharide (chitosan, hyanluronic acid,…), pluronic F127 hoặc gelatin với các đặc tính sinh hóa đáp ứng yêu cầu trên Thêm vào đó, những màng hydrogel nhân tạo này có khả năng cho hơi nước, oxy và các loại khí

khác thấm qua còn nước và các vi khuẩn thì không thấm qua được [35] Như vậy, vết thương tránh khỏi bị nhiễm khuẩn thứ phát bằng việc tạo ra một hàng rào chống lại các vi khuẩn và tiêu dịch của vết thương, tạo nền và môi trường ẩm cho tế bào phát triển, giúp hồi phục vùng mô bị tổn thương

Trong nghiên cứu này, chúng tôi hướng đến tổng hợp vật liệu hydrogel gelatin-pluronic F127 nhạy nhiệt có các đặc tính dựa trên mang thêm hoạt chất nanocurcumin để tăng cường hiệu quả chữa lành vết thương

Hình 2: Hydrogel nhạy nhiệt gelatin-pluronic F127

(Nguồn: Tác giả, năm 2016)

Việc tổng hợp ra hydrogel nhạy nhiệt trên cơ sở gelatin và pluronic kết hợp với nanocurcumin sẽ tạo ra màng băng vết thương thông minh sẽ có nhiều ý nghĩa khoa học và thực tiễn do loại dung dịch polymer này chứa các thành phần hoạt tính như collagen, curcumine có khả năng tái tạo da Thêm vào đó, vật liệu này đóng vai trò như chất hoạt động bề mặt giúp điều chế và phân tán tốt nanocurcumin ở nhiệt độ dưới 35 oC và khi áp vào vết thương ở nhiệt độ từ 35-37 oC sẽ chuyển thành màng gel dính chắc vào vết thương [5], [34] Loại hydrogel này có khả năng hút nước tốt nên có thể loại bỏ dịch do vết thương tiết ra, hoạt động như bức tường ngăn sự xâm nhập của các yếu tố ngoại vi từ bên ngoài như bụi và vi khuẩn Khi hydrogel này trương lên, tạo một sức ép lên bề mặt vết thương, cộng với thành phần là gelatin và curcumin nhả ra từ hệ hydrogel Cur-GP sẽ giúp cho việc tái tạo tế bào nhanh hơn [47] Băng hydrogel nhạy nhiệt trên cơ sở gelatin-pluronic kết hợp nanocurcumin là chất nền mềm ẩm ướt, nên sẽ có tác dụng làm mát vết thương và làm giảm các triệu

chứng đau Hơn nữa, hydrogel này còn ngăn chặn sự kết dính vào vết thương gây khó khăn khi thay băng mới cho bệnh nhân

Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực

hiện đề tài: “Nghiên cứu điều chế hydrogel nhạy cảm với nhiệt độ cơ thể từ dẫn xuất

gelatin để mang nhả chậm curcumin ứng dụng trong chữa lành vết thương”

2 Lịch sử nghiên cứu vật liệu hydrogel chữa lành vết thương

 Tình hình nghiên cứu ngoài nước:

Hiện nay trên thế giới đã nghiên cứu sử dụng các màng hydrogel, hydrogel nhạy nhiệt và curcumin trong điều trị tổn thương bỏng và các loại vết thương ngoại

mô khi lành có tính thẩm mỹ không để lại sẹo giống như vùng da bình thường

Nhiều nghiên cứu về hydrogel trên cơ sở gelatin cho nhiều triển vọng không chỉ ứng dụng màng hydrogel trị bỏng, nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy hiệu quả vượt trội của chúng khi ứng dụng trong chữa lành vết thương, tái tạo sụn, thận nhân tạo, mang thuốc, [21], [30], [41], [45]

Trong báo cáo năm 2012, các nhà nghiên cứu tại Bệnh viện Johns Hopkins (Đại học Johns Hopkins, Hoa Kỳ) cho biết phương pháp sử dụng hydrogel trong điều trị bỏng đã mang lại các kết quả khả quan hơn so với các phương pháp truyền thống

và đặc biệt không để lại sẹo với các vết bỏng ở người bị bỏng độ 3 Kết quả nghiên cứu cho rằng việc điều trị theo hướng sử dụng hydrogel đã thúc đẩy sự hình thành của các mạch máu mới và tái tạo các lớp da phức tạp bao gồm các nang tóc và các tuyến tiết dầu ở da Hydrogel có thể tạo nền tảng cho phương pháp điều trị vết bỏng với chi phí thấp có hiệu quả hơn các liệu pháp điều trị hiện có Hơn nữa, hydrogel lại

dễ dàng được sản xuất trên quy mô lớn [25]

Hình 3: Mô phỏng vết thương được xử lý bằng dextran hydrogel