Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế steviosid và rebaudiosid a từ cây cỏ ngọt stevia rebaudiana) làm chất tạo ngọt trong thực phẩm và dược phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNGNGUYỄN KIM ĐÔNG NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ STEVIOSID VÀ REBAUDIOSID A TỪ CÂY CỎ NGỌT STEVIA REBAUDIANA LÀM CHẤT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN KIM ĐÔNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ STEVIOSID VÀ

REBAUDIOSID A TỪ CÂY CỎ NGỌT (STEVIA REBAUDIANA)

LÀM CHẤT TẠO NGỌT TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC PHẨM

NĂM 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kếtquả nêu trong đề tài là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kìcông trình nào khác

Tác giả đề tài

Ký tên

Nguyễn Kim Đông

TÓM TẮT

Mục đích của nghiên cứu này là để sản xuất steviosid và rebaudiosid A có độ tinh khiết cao, chiết xuất từ lá cây làm chất tạo ngọt cho thực phẩm và dược phẩm Lá Cỏ Ngọt được sấy khô và nghiền nhỏ thành bột, bột lá Cỏ Ngọt được chiết xuất bằng nước, dịch chiết được kiềm hóa bởi canxi hydroxit và sau đó bằng sắt (III) clorua, tiến hành khử muối, khử ion, khử màu và làm bay hơi dịch lọc đến khô thu được hỗn hợp glycosid thô Hỗn hợp glycosid thô tiến hành phân lập và tinh sạch steviosid và rebaudiosid A bằng cách sử dụng metanol, etanol để kết tủa, thu được steviosid và rebaudiosid A có độ tinh khiết cao Tỷ lệ thích hợp của bột lá Cỏ Ngọt và nước trong quá trình

chiết xuất giới hạn khoảng 1:20 đến 1:25 w/v Nhiệt độ và thời gian chiết xuất tốt nhất là 75 o C trong 240 phút và 100 o C trong 30 phút Sự phân lập và tinh sạch steviosid từ hỗn hợp glycosid thô đã được tiến hành bằng cách sử dụng

metanol để kết tủa Tỷ lệ hỗn hợp glycosid thô và metanol là giữa 1:2 đến 1:7 w/v, tốt nhất là 1:5, hàm lượng steviosid thu được trong khoảng 91,1-91,5%.

Sự phân lập và tinh sạch rebaudiosid A được tiến hành bằng cách sử dụng

etanol để kết tủa Tỷ lệ xirô và etanol là 1:2 đến 1:7 w/v, tốt nhất là 1:5.

Rebaudiosid A với 90,7-90,9% độ tinh khiết thu được Steviosid và rebaudiosid A là hai chất tạo ngọt không sinh năng lượng, không đắng, áp

dụng trong thực phẩm và dược phẩm.

Từ khoá: cỏ ngọt, chiết xuất, steviosid, rebaudiosid A , tinh sạch, phân lập

The purpose of the study is to produce highly purified stevioside and rebaudioside A from the extract of Stevia rebaudiana Bertoni plant use in food and drugs Stevia rebaudiana Bertoni leaves were dried and powdered leaves being subjected to water extraction and the resulted extract is purified using treatment with a base such as calcium hydroxide and then iron chloride, desalting, decolorizing, and evaporating the filtrate to drynessobtained glycoside The mixture of glycosides, conducting isolation and purification of stevioside and rebaudioside A were developed using

rebaudioside A were obtained.The preferable ratio of leaves to water is within the limits of about 1:20 to 1:25, wt/vol.The extraction temperature and time preferably were at 75 o C for 240 min and and 100 o C for 30min The isolation and purification of Stevioside was developed using methanol precipitation The proportion of glycosides and methanol was between 1:2- 1:7 w/v, preferably 1:5, the powder contents were around 91.1-91.5% of stevioside The isolation and purification of rebaudioside A was developed using ethanol precipitation The proportion of syrup and ethanol was between 1:2-1:7 w/v, preferably 1:5 Rebaudioside A with 90.7- 90.9% purity was obtained Steviosid and rebaudiosid A are two sweeteners non-calorie, non- cariogenic, non-bitter, applied in foods and drugs.

Keywords: Stevia rebaudiana, extracts, stevioside, rebaudioside A, purification, isolation.

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ii

TÓM TẮT iii

ABSTRACT iii

MỤC LỤC v

DANH SÁCH HÌNH vi

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ix

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1

1.1Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Lịch sử về cây Cỏ Ngọt 3

2.2 Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Cỏ Ngọt 3

2.3 Thành phần hóa học của cây cỏ ngọt 7

2.4 Hoạt tính sinh học 9

2.5 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 11

CHƯƠNG III NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Nguyên liệu nghiên cứu 15

3.1.1 Nguyên liệu thí nghiệm 15

3.1.2 Hóa chất, chất chuẩn 15

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ 15

3.2 Phương pháp nghiên cứu 16

3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 16

3.2.2 Thiết kế thí nghiệm 16

3.2.3 Thời gian thực hiện đề tài 16

3.2.4 Bố trí thí nghiệm 16

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

4.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô 24

4.2 Kết quả khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô 26

4.3 Kết quả phân lập và tinh sạch hai loại chất tạo ngọt steviosid và rebaudiosid A 27

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

5.1 Kết luận 35

5.2 Đề nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHỤ LỤC 1 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOÁ LÝ 39

PHỤ LỤC 2 KẾT QUẢ THỐNG KÊ 40

PHỤ LỤC 3 MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM 50

PHỤ LỤC 4: QUY TRÌNH PHÂN LÂP, TINH SẠCH STEVIOSID VÀ REBAUDIOSIDA 54

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.2 Cây Cỏ Ngọt Error! Bookmark not defined.

Hình 2.3 Công thức hóa học của steviosid, thành phần chính được tìm thấy

trong lá của cây Cỏ Ngọtvà một số thành phần khác có liên quan 8

Hình 3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ lá nước thích hợp trong quá trình chiết 17

Hình 3.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ và thời gian thích hợp trong quá trình chiết 19

Hình 3.2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập, tinh sạch steviosid và rebaudiosid A 22

Hình 4.1 Khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu 25

Hình 4.2 Khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích 26

Hình 4.3.1 Sắc ký đồ chuẩn steviosid 28

Hình 4.3.2 Sắc ký đồ mẫu steviosid 29

Hình 4.3.3 Sắc ký đồ chuẩn rebaudiosid A 33

Hình 4.3.4 Sắc ký đồ mẫu rebaudiosid A 31

Hình 1 Lá Cỏ Ngọt 50

Hình 2 Cột Amberlite 50

Hình 3 Dịch sau khi qua Amberlite 51

Hình 4 Bếp cách thủy 51

Hình 5 Hỗn hợp glucosid 52

Hình 6 Steviosid……… 52

Hình 7 Lá Cỏ Ngọt nghiền nhỏ……… 53

Hình 8 Dung dịch Cỏ Ngọt……… 53Hình 9 Quy trình phân lập, tinh sạch steviosid và rebaudiosidA 54

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.3 Cấu trúc của các dẫn xuất steviosid và các hợp chất liên quan củacây Cỏ Ngọtvà độ ngọt so với đường sucrose 9

Bảng 4.3.1 Kết quả phân lập và tinh sạch steviosid 32

Bảng 4.3.2 Kết quả phân lập và tinh sạch rebaudiosid A 32

RPF lưu lượng huyết tương qua thận

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay trên thế giới, con người tiêu thụ một lượng đường rất đáng kể.Tuy nhiên ngoài mặt lợi đường cũng có những mặt trái của nó do cung cấpnhiều năng lượng nên có thể gây béo phì, cho dù liều lượng sử dụng khôngđáng kể Vì vậy để tránh béo phì, tiểu đường thì người ta buộc phải dùngđường ít lại hay dùng một chất tạo ngọt khác để thay thế Hiện nay, trên thịtrường đã có rất nhiều sản phẩm hoá học tạo vị ngọt dùng để thay thế đườngnhư saccharin, sodium cyclamate, sucrolose, acefulfame potassium nhưng phổbiến nhất là chất aspartame Mặc dù các loại đường này rẻ tiền và tiện dụngnhưng người ta rất e ngại khi sử dụng vì chúng có thể gây ảnh hưởng xấu đếnsức khoẻ con người về lâu về dài Qua một số nghiên cứu cho thấy saccharingây ung thư bàng quang ở chuột Vì vậy saccharin đã bị cấm sử dụng ở một

số quốc gia Trước các nguy hại của đường hoá học, tâm lý chung của ngườitiêu dùng là muốn tìm lại sản phẩm đường tự nhiên ly trích từ thực vật Cây

Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana Bertoni) là loại thảo dược có nguồn gốc từ Nam

Mỹ, lá cây Cỏ Ngọt có chứa các chất ngọt tự nhiên như steviosid (4-13% trêntrọng lượng khô), rebaudiosid A (2-4%), rebaudiosid C, rebaudiosid B (1–

2%), rebaudiosid D, rebaudiosid E và dulcosid A (0,4–0,7%) (Kinghorn et al.,

1991).Trong đó độ ngọt của rebaudiosid A gấp 250 – 450 lần so với đường

mía và steviosid khoảng 300 lần so với đường mía (Cramer et al.,1986) Chất

tạo ngọt chứa trong cây Cỏ Ngọt là loại chất tạo ngọt không sinh năng lượng.Ngoài ra, chất tạo ngọt trong cây Cỏ Ngọt còn điều trị được bệnh tiểu đường,

hạ đường huyết (Lailerd et al.,2004), béo phì, sâu răng, tăng huyết áp (Dyrskog et al., 2005), kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng viêm (Ghosh et al., 2008) Đặc biệt trong cây Cỏ Ngọt có hai loại chất tạo ngọt

steviosid và rebaudiosid A với độ ngọt cao và chiếm hàm lượng lớn nhất.Từ

những lợi ích to lớn đó đã dẫn đến nhu cầu con người muốn sử dụng sảnphẩm chất tạo ngọt tự nhiên, đặc biệt là hai loại chất tạo ngọt steviosid vàrebaudiosid A Do đó việc ly trích và tinh sạch để có hai loại chất tạo ngọtsteviosid và rebaudiosid A với độ sạch cao, an toàn cho thực phẩm và dược

phẩm là rất cần thiết Xuất phát từ thực tế này, “Nghiên cứu chiết xuất và

tinh sạch steviosid và rebaudiosid A từ cây Cỏ Ngọt (Stevia rebaudiana)

làm chất tạo ngọt trong thực phẩm và dược phẩm” được thực hiện nhằm

góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống của con người

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng quy trình chiết xuất, tinh sạch 02 hợp chất tự nhiên đặc trưng từ cây

Cỏ Ngọt là steviosid và rebaudiosid A làm chất tạo ngọt trong thực phẩm vàdược phẩm

1.3 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu trên, đề tài đã tiến hành 3 nội dung chính sau đây:

- Khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá trình ly trích hỗnhợp glucosid thô

- Khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích hỗn hợp glucosidthô

- Phân lập và tinh sạch hai loại chất tạo ngọt steviosid và rebaudiosid A

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Lịch sử về cây Cỏ Ngọt

Vào năm 1887, MS Bertoni, một nhà thực vật học là người châu Âu đầu tiênnghiên cứu về Cỏ Ngọt Sau đó vào năm 1931, nhà hóa học Pháp đã ly tríchđược steviosid Steviosid là hợp chất tinh thể màu trắng có độ ngọt rất cao.Từ

đó Cỏ Ngọt được sử dụng như một chất làm ngọt ở Anh trong thế chiến II.Nhật Bản đã sử dụng Cỏ Ngọt để thay thế cho saccharin sau khi nó bị cấm sửdụng vào những năm của thập niên 70 và chất ngọt từ Cỏ Ngọt được tiêu thụtại Nhật Bản với số lượng rất lớn so với bất kỳ quốc gia nào khác Tại Bắc

Mỹ và Châu Âu, Cỏ Ngọt bắt đầu được sử dụng như là sản phẩm thảo dược

và có sẵn trên thị trường vào những năm 1970 và 1980 Cỏ Ngọt đã đượcchiết xuất và cho phép sử dụng ở Mỹ vào năm 1994.

2.2 Đặc điểm, tính vị và công dụng của cây Cỏ Ngọt

2.2.1 Thực vật học (Đỗ Huy Bích et al., 2004)

Tên khoa học: Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley.

Hình 2.2 Cây Cỏ Ngọt

Họ: Cúc (Asteraceae).

Cây thảo nhỏ, sống nhiều năm, cao 0,5 - 0,6 m và có khi cao tới 1m Thâncứng mọc thẳng, có rãnh dọc và nhiều lông mịn, ít phân nhánh.Lá mọc đối,hình mác hoặc bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn dài 5 -7 cm, rộng 1 -

1 , 5 cm, có 3 gân, 4-6 đôi răng nhọn ở phần nửa về phía đầu lá, hai mặt cólông trắng mịn, nhấm lá thấy có vị ngọt rất đậm, cuống lá rất ngắn Hoalưỡng tính, tụ họp thành đầu màu trắng ở ngọn Quả bế, không có mào lông,hạt không có nội nhũ Mùa hoa khoảng tháng 5-9

2.2.2 Phân bố, sinh thái (Đỗ Huy Bích et al., 2004)

Chi Stevia Cav không có một đại diện nào ở vùng châu Á Cỏ Ngọt đang

được trồng phố biến ở Việt Nam hiện nay, được nhập nội từ một nước Nam

Mỹ (nguồn gốc ở Paraguay) năm 1988 Cỏ Ngọt là cây ưa ấm và ưa sáng, cóthể chịu bóng hoặc ưa bóng vào thời kỳ cây con Vốn là cây ở vùng nhiệt đới,

Cỏ Ngọt trồng ở Việt Nam sinh trưởng và phát triển tốt vào vụ xuân - hè Vềmùa đông, cây có hiện tượng rụng lá và hơi tàn lụi Cây ra hoa, quả nhiềuhàng năm Tuy nhiên, người ta thường áp dụng cách nhân giống bằng cắmcành

2.2.3 Bộ phận dùng (Đỗ Huy Bích et al., 2004)

Phần trên mặt đất của cây Cỏ Ngọt Thu hái lúc cây xum xuê

2.2.4 Tác dụng dược lý (Đỗ Huy Bích et al., 2004)

2.2.4.1 Tác dụng hạ đường huyết: thành phần steviosid trong lá cây Cỏ Ngọt

có tác dụng làm đường huyết giảm rõ rệt ở thỏ, chuột cống trắng và bệnhnhân mắc bệnh đái tháo đường

2.2.4.2 Tác dụng giãn mạch: steviosid có tác dụng làm giãn tĩnh mạch toàn

thân rõ rệt

2.2.4.3 Tác dụng trên thận và huyết áp: thành phần steviosid trong lá cây Cỏ

Ngọt có tác dụng làm tăng lưu lượng huyết tương qua thận (RPF), tăng tốc độlọc cầu thận (GFR), hạ huyết áp, tăng bài niệu và tăng thải trừ natri

2.2.4.4 Tác dụng kháng khuẩn

Cao lá Cỏ Ngọt có tác dụng đối với Pseudomonas aeruginosa và Proteus

vulgaris Chưa thấy tài liệu công bố về tác dụng trên các vi khuẩn Streptococcus inutans, Lactobacillus plantarum và Lactobacillus casei là

những vi khuẩn có liên quan đến quá trình sún răng ở trẻ em, vì hiện nay códùng steviosid thay thế đường trong chế biến bánh kẹo

2.2.4.5 Liều dùng an toàn ở người

Nồng độ steviosid trong một số nước giải khát ở Nhật Bản là 0,005 - 0,007%.Nếu một ngày uống 1 lít thì lượng steviosid đưa vào cơ thể là 0,05 - 0,07gtương ứng với khoảng lg lá Cỏ Ngọt Điều đó có thể được chấp nhận vì là liều

an toàn, đã được Nhà nước Nhật cho phép

2.2.4.6 Độc tính cấp: Cho chuột uống steviosid với liều 2g/kg không thấy có

chuột chết và cũng không thấy có biểu hiện độc sau 2 tuần theo dõi

2.2.4.7 Độc tính bán cấp: Cho chuột cống trắng ăn với liều dùng hàng ngày

0,5g/kg trong 56 ngày, các thông số theo dõi gồm cân nặng, các chỉ tiêu huyếthọc, các chỉ tiêu hoá sinh và xét nghiệm tổ chức học gan đều bình thường

2.2.4.8 Độc tính trên thận:

Thí nghiệm trên chuột cống trắng, liều cao steviosid có thể gây độc với thận,làm tăng urê và creatinin huyết thanh.Tiêm tĩnh mạch cho chuột cống trắng,liều 0,4; 0,8; 1,2; l,6g/kg rồi theo dõi độ thanh thải của một số chất có so sánhvới lô đối chứng, thấy từ liều 0,8g/kg trở lên độ thanh thải inulin không thayđổi, chứng tỏ chức năng lọc cầu thận không bị ảnh hưởng Độ thanh thải củaglucose tăng, chứng tỏ chức năng tái hấp thu của ống lượn gần bị suy giảm,

một phần glucose không được tái hấp thu và đã bị thải trừ qua nước tiểu Độthanh thải steviosid cao hơn độ thanh thải inulin, chứng tỏ steviosid còn bịthải trừ qua niêm mạc của ống thận Ngoài ra, steviosid cũng gây bài niệutăng thải natri niệu và làm tăng độ thanh thải của para-aminohippuric.

Tiêm dưới da cho chuột cống trắng với liều 1,5g/kg, kết quả thấy những thayđổi giống thí nghiệm trên là tăng nồng độ urê và creatinin trong huyết thanh,thấy glucose trong nước tiểu Ngoài ra về tổ chức bệnh học, thấy có biến đổihình thái ở tế bào niêm mạc ống lượn gần Những tổn thương này là do hoạtđộng của 2 enzym phosphatase kiềm và gama-glutamyl-transpeptidase tănglên Những enzym này khu trú chủ yếu ở điểm bàn chải của tế bào ống lượngần

2.2.4.9 Khả năng gây đột biến

Nhiều thí nghiệm nghiên cứu khả năng gây đột biến trên các chủng

Salmonella typhimurium TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1538 và TM 677,

hoặc trên chủng Escherichia coli WP2 đều xác định cao Cỏ Ngọt không gây

đột biến Có nghiên cứu cho biết một số chất chuyển hoá của steviosid lại cóthể gây đột biến Mặc dù steviosid không bị chuyển hoá trong cơ thể và thảitrừ nguyên vẹn qua nước tiểu Song người ta lo ngại một số tạp khuẩn vùngmàng tràng có thể phân giải được steviosid

2.2.5 Tính vị, công năng (Đỗ Huy Bích et al., 2004)

Cỏ Ngọt có vị ngọt rất đậm, có ích cho người đái tháo đường và người béophì, thuốc ít độc

2.2.6 Công dụng (Đỗ Huy Bích et al., 2004)

Chữa đái tháo đường: Cỏ Ngọt và steviosid có vị ngọt sẽ làm giảm nhu cầu

chất đường và chất bột của người bệnh, vì thế sẽ làm giảm đường huyết Liềudùng theo thử nghiệm ở Braxin là mỗi lần 0,25g steviosid (hoặc 2,5g lá Cỏ

Ngọt), ngày 4 lần, uống nhiều ngày Ngoài ra Cỏ Ngọt và steviosid còn chữabéo phì do có vị ngọt sẽ làm giảm nhu cầu chất đường và chất bột của cơ thể,nên cũng có tác dụng chữa béo phì Liều dùng 0,5 - lg steviosid chia ra 3 - 4lần trong ngày, uống nhiều ngày Lá Cỏ Ngọt hoặc steviosid thường dùng làmchất điều vị cho các loại trà thuốc, trà túi lọc tỷ lệ lá Cỏ Ngọt hoặc steviosidtrong đó thường thấp Tại Việt Nam, cũng đã có một số chế phẩm trà thuốc có

Cỏ Ngọt như trà actisô - stevia Trà sâm quy - stevia có sâm khu 5, tam thất,

đương quy, thục địa, táo, long nhãn, ngũ gia bì và Cỏ Ngọt.Trà nhân trần,thảo quyết minh, Cỏ Ngọt.Trà túi lọc Sotevin có dừa cạn, hoa cúc, hoa hoè và

Cỏ Ngọt Chữa cao huyết áp hàng ngày uống trà sotevin Dùng thay thếđường sacharose trong công nghiệp thực phẩm để làm chất điều vị cho bánhmứt kẹo, nước giải khát

2.3 Thành phần hóa học của cây cỏ ngọt

Trong các loại đường thay thế, chất ngọt tự nhiên đã được xem xét rất nhiềubởi các nhà nghiên cứu và đường trong cây Cỏ Ngọt được giả định là nguồnchất tạo ngọt tự nhiên chính Một loạt các loài cây Cỏ Ngọt đã được nghiêncứu bởi các nhà hóa sinh và công nghệ sinh học về các thành phần hóa họccủa cây Cỏ Ngọt và chỉ ra có khoảng 110 loài, trong đó có 18 loài có tính

năng tốt (Soejarto et al.,1982) Steviosid là một thành phần chính trong cây

Cỏ Ngọt và steviosid chứa nhiều nhất trong lá của cây Cỏ Ngọt (Geuns,2003) Cùng với steviosid, một số hợp chất ngọt khác như steviobiosid,rebaudiosid A, B, C, D, E và dulcosid A cũng đã được tìm thấy trong lá của

Cỏ Ngọt (Savita et al.,2004) Việc xây dựng cấu trúc của các dẫn xuất steviosid và vị ngọt của nó so với sucrose được nghiên cứu đầy đủ (Cramer et

al.,1986 ), (Geuns, 2003) Kết quả được ghi nhận ở Bảng 2.3 cùng với vị

ngọt, cây Cỏ Ngọt cũng có một số dư vị đắng do sự hiện diện của một số loạitinh dầu, tannin và flavonoids và đã nhận thấy rằng steviosid và rebaudiosid A

có trách nhiệm ở một mức độ cho dư vị đắng này, mặc dù vai trò củarebaudiosid A là ít hơn đáng kể so với các steviosid (Phillips, 1987).

Hình2.3 Công thức hóa học của steviosid, thành phần chính được tìm thấy trong lá

của cây Cỏ Ngọtvà một số thành phần khác có liên quan.

Bảng 2.3 Cấu trúc của các dẫn xuất steviosid và các hợp chất liên quan của cây Cỏ Ngọt và độ ngọt so với đường sucrose (Cramer et al., 1986 ), (Geuns, 2003)

1997) Sử dụngsteviol glycosidvới liều cao cho vào miệng của chuột và nuốt

vào bụng cho thấy trọng lượng cơ thể của chuột giảm (Curry et al., 2008), nhưng không có bằng chứng mạnh mẽ về độc tính (Carakostas et al., 2008),

(Hagiwara et al.,1984), nghiên cứu tác dụng gây ung thư của steviosid trên

bàng quang thấy rằng không có tiền ung thư hoặc ung thư

Dịch chiết cũng như các chất tách được từ Cỏ Ngọt có tác dụng mạnhtrong việc điều khiển quá trình chuyển hoá glucose và insulin trong cơ thế

Theo Chen et al., 2005, khi sử dụng steviosid với liều 0,5 mg/kg sẽ làm giảm

lượng đường glucose trong máu đồng thời hạn chế sự kháng insulin ở chuột

bị tiểu đường Tác giả Ferreira cũng chỉ ra rằng dịch chiết nước Cỏ Ngọt (20mg/kg/ngày) cũng có tác dụng làm ức chế quá trình chuyến hoá glucose trong

gan trên chuột thí nghiệm (Arayjo et al.,2006) Trước đó vào năm 1986, Curi

đã thử nghiệm tác dụng của dịch chiết nước Cỏ Ngọt trên một nhóm ngườitình nguyện Kết quả cho thấy với dịch chiết 5 g lá dùng liên tục trong 3 ngày,

hàm lượng đường glucose trong huyết tương giảm rõ rệt (Curi et al.,1986).

Các nghiên cứu này mở ra khả năng ứng dụng Cỏ Ngọt trong việc chữa trịbệnh tiểu đường và các bệnh liên quan đến sự chuyển hoá glucose Ngoài ra,cùng với tác dụng giảm đường huyết, steviosid còn có tác dụng hạ huyết áp

trên lô chuột bị tiểu đường (Xiao et al., 2003).

Tác dụng chống ung thư và chống viêm của Cỏ Ngọt cũng được nghiêncứu chi tiết trên mô hình chuột thí nghiệm gây u bằng 12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) Các hợp chất tách được từ cây nàygồm steviosid, rebaudiosid A và C, và dulcosid A ức chế mạnh quá trình gâyviêm đồng thời hỗn hợp các hợp chất này ngăn ngừa tốt sự hình thành ung

thư da trên chuột với liều 1,0 và 0,1 mg/con (Yasukawa et al.,2002).

Hợp chất steviosid còn được sử dụng trong trị liệu chữa tiêu chảy hiệuquả Khởi nguồn từ kết quả nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn và kháng virút

của dịch chiết nóng cây Cỏ Ngọt cho thấy tác dụng diệt mạnh chủng E coli là nguyên nhân gây ra bệnh ỉa chảy (Tomita et al.,2002) Các nghiên cứu tiếp

sau đó khẳng định tác dụng và khả năng ứng dụng rất cao của Cỏ Ngọt cũng

như nhóm chất steviosid trong việc chữa trị ỉa chảy (Pariwat et

al.,2008),(Shiozaki et al.,2006),(Takahashi et al.,2001).

Ngoài các hợp chất đitecpen, trong cây Cỏ Ngọt còn chứa nhóm chấtphenol và flavonoit Tác giả Ghanta đã định lượng được hàm lượng nhómchất này trong dịch chiết etyl axetat là tương đương 0,86 mg axit galic và0,83 mg quercetin trên 1 mg Bằng phân tích LC-MS và phổ NMR, nhóm tácgiả đó nhận dạng được sự có mặt của quercetin-3-O-arabinoside, quercitrin,apigenin, apigenin-4-O-glucoside, luteolin, and kaempferol-3-O-rhamnoside.Dịch chiết metanol và etyl axetat cho thấy có khả năng diệt các gốc tự dobằng phương pháp thử DPPH và lipid peroxidation Nghiên cứu này chứng tỏcây Cỏ Ngọt còn là một dược liệu thiên nhiên chống oxy hoá hiệu quả

(Ghanta et al., 2007).

2.5 Các phương pháp chiết mẫu thực vật

Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất

có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độphân cực trung bình ) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

2.5.1 Chọn dung môi chiết

Thông thường các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khácnhau Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm.Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ cấpđang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chấtnghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy

Những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trướckhi sử dụng Nếu chúng có lẫn các chất khác thì có thể ảnh hưởng đến hiệuquả và chất lượng của quá trình chiết Thường có một số chất dẻo lẫn trong

dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat.Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trongkhâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa.

Metanol và chloroform thường chứa dioctylphtalat [di-(2- etylhexyl)phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phânlập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thửnghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Chloroform, metylenclorit và metanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trìnhchiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa

Những tạp chất của chloroform như CH2C12, CH2ClBr có thể phản ứngvới một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩmkhác Tương tự như vậy sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng cóthể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chấtkhác Vì chloroform có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó cần đượcthao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc.Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chloroform

Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn cáchiđrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽthấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thuđược lượng lớn các thành phần trong tế bào.Trái lại, khả năng phân cực củachlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các etanolhoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phâncực trung bình và thấp Vì vậy khi chiết bằng etanol thì các chất này cũng bịhoà tan đồng thời Thông thường dung môi etanol trong nước có những đặctính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng

metanol trong suốt quá trình chiết (Goad et al.,1997) Thí dụ trechlonolid A

thu được từ Trechonaetes aciniata được chuyển thành trechonolid B bằng quátrình phân huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylumnovogranatense được chiết trong metanol nóng Người ta thường ít sử dụngnước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịchnước của metanol.

Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất

dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit

dễ nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những họp chấtkhông có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid Tiếp đến là axetoncũng có thế tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit.Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trìnhphân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit-bazơ có thểtạo thành những sản phẩm mong muốn Sự hiểu biết về những đặc tính củanhững chất chuyển hoá thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ

đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết tránh được sự phân huỷchất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn Sau khi chiết dungmôi được cất ra bằng máy cô quay ở nhiệt độ không quá 30-40ỏC, với mộthoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

2.5.2 Quá trình chi ết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

-Chiết ngâm

-Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết soxhlet

-Chiết sắc với dung môi nước

-Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhấttrong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời

gian Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy đểđiều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi, dung môi

có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn Trước đây,máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùngbình thuỷ tinh

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phươngpháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng

24 giờ rồi chất chiết được lấy ra Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉthực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa nhữngchất giá trị nữa Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cáchkhác nhau

Như vậy tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dungmôi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao.Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớpchất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết

CHƯƠNG III NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nguyên liệu nghiên cứu

3.1.1 Nguyên liệu thí nghiệm

Nguyên liệu dùng để chiết xuất các đối tượng nghiên cứu của đề tài: lá cây

Cỏ Ngọt dùng để chiết xuất steviosid và rebaudiosid A Cỏ Ngọt thuộc họ cúcđược mua tại nhà thuốc Minh Phát, 73B Hải Thượng Lãng Ông, phường 10,quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh

3.1.2 Hóa chất, chất chuẩn

- Metanol (99,99%), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)

- Acetonitrile (99,9 %), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)

- Etanol (99,9%), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)

- Steviosid hydrate (98%), (Sigma – Aldrich)

- Rebaudiosid A (96%),(Sigma – Aldrich)

- Amberlite FPC23 H(Sigma – Aldrich)

- Amberlite FPA51(Sigma – Aldrich)

- Amberlite FPA98Cl(Sigma – Aldrich)

- Ca(OH)2(96%), (Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)

- FeCl3(98%)(Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Đức)

- Nước khử ion

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ

- Sắc ký lỏng cao áp (HPLC, 20A, Shimadzu, Nhật)

- Thiết bị lọc nước khử ion (TKA, Thermo Fisher scientific, Mỹ)

- Thiết bị đun cách thuỷ (Thermo Haake V15, Mỹ)

- Cân phân tích (Sartorius, MC 210S, Đức)

- Tủ sấy (Memmert, Đức)

- Lọcpolysulfone(Liumar Technologies, Ottawa, Canađa)

- Các thiết bị thông thường khác hỗ trợ cho quá trình phân tích

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Sơ đồ nghiên cứu

3.2.2 Thiết kế thí nghiệm

- Cỡ mẫu: tùy theo hàm lượng hợp chất đặc trưng trong dược liệu, khối lượng

dược liệu (cỡ mẫu) sử dụng đủ để chiết xuất nhiều mẻ nhằm thu được 20 ghợp chất

- Chiết xuất, phân lập, tinh chế: thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí

nghiệm Khoa Sinh học Ứng dụng và phòng thí nghiệm Công nghệ Thựcphẩm Trường Đại học Tây Đô

- Phân tích và kiểm nghiệm: phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Dược và Điều

Dưỡng Trường Đại học Tây Đô

3.2.3 Thời gian thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện từ 10/2014 đến 10/2015

3.2.4 Bố trí thí nghiệm

3.2.4.1 Thí nghiệm 1: khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá

trình ly trích hỗn hợp glycosid thô

* Mục đích: tìm ra tỷ lệ chiết xuất thích hợp giữa nguyên liệu và nước mà ở

đó hàm lượng glycosid thô cao nhất

2 hợp chất đặc trưng từ dượcliệu đạt độ tinh khiết cao

Xây dựng qui trình chiết xuất,

phân lập, tinh chế steviosid &

rebaudiosid A

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố, 5 mức độ với 5nghiệm thức và 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức Kết quả phân tích hàmlượng glycosid thô được xử lý thống kê.

Dịch chiết

Cân

lạnh cho đến khi sử dụng (Abou-Arab et al., 2010) Bột lá Cỏ Ngọt cân 1g

cho vào cốc 50mL, cho thêm 6mL nước vào ta có tỷ lệ 1:6 Tương tự các cốccòn lại bố trí với tỷ lệ 1:9, 1:15, 1:20, 1:25 Sau đó cho tất cả các cốc vào bếpđun cách thủy với nhiệt độ 75oC trong vòng 120 phút, mỗi tỷ lệ được tiếnhành 3 lần lặp lại Khi kết thúc quá trình đun cách thủy, các cốc chứa dịchchiết sẽ được lọc qua giấy lọc Tách lấy phần dịch lọc cho vào tủ sấy ở nhiệt

độ 105oC Sau khi sấy xong mang cốc ra cho vào bình hút ẩm, chờ ổn định và

tiến hành cân cốc Tính được lượng glycosid thô.

3.2.4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích glycosid thô.

* Mục đích: chọn thời gian và nhiệt độ chiết xuất thích hợp để thu được hàm

lượng glycosid thô tốt nhất

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố, với 16 nghiệm thức

và 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức Kết quả phân tích glycosid thô

Nhân tố B: nhiệt độ chiết Nhân tố C: thời gian chiết

B1: 45oC B2: 75oC C1: 30 phút C2: 60 phút

B3: 10oC B4:1000C C3:120 phút C4:240 phút

+ Nghiền nhỏ + Thêm nước + Gia nhiệt

B1 B2 B3 B4 + Thời gian gia nhiệt

C1 C2 C3 C4 + Lọc

Tiến hành

Từ khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá trình ly tríchhỗn hợp glycosid thô ở trên ta chọn được tỷ lệ tốt nhất để tiến hành cho thínghiệm khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích hỗn hợpglycosid thô Cân 1g bột lá Cỏ Ngọt cho vào cốc 50mL thêm nước vào với tỷ

lệ được chọn như trên Tiến hành gia nhiệt các mẫu ở nhiệt độ 45oC, 75oC,

100oC và làm lạnh ở 10oC với thời gian lần lượt là 30, 60,120, 240 phút Cácmẫu sau đó được lọc qua giấy lọc Phần rắn bỏ đi, phần dịch lọc cho vào cốc50mL đã biết trước trọng lượng Tiếp tục cho cốc chứa dịch lọc vào tủ sấy ởnhiệt độ 105oC và sấy đến khối lượng không đổi Sau đó cân khối lượng, tínhđược hàm lượng hỗn hợp glycosid thô có trong mẫu

3.2.4.3 Thí nghiệm 3: phân lập và tinh sạch hai loại chất tạo ngọt steviosid và rebaudiosid A

* Mục đích: dùng metanol, cồn tinh sạch hai loại đường steviosid và

rebaudiosid A

+ Phân lập, tinh sạch steviosid:

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố là dung môi metanolvới 6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức Việc phân tích hàmlượng steviosid bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Nhân tố D: dung môi metanol

D1: 1:1 D2: 1:2 D3: 1:3

D4: 1:5 D5:1:6 D6: 1:7

+ Phân lập, tinh sạch rebaudiosid A:

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố là dung môi etanol với

6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức Việc phân tích hàmlượng rebaudiosid A bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Nhân tố E: dung môi etanol

E1: 1:1 E2: 1:2 E3: 1:3

E4: 1:5 E5: 1:6 E6:1:7

+ Thêm nước + Đun cách thủy + Lọc

Bả

+ Ca (OH) + FeCl 3