Nghiên cứu, tuyển chọn và khả năng lên men lactic trong quá trình tạo sản phẩm kombucha từ trà truyên quang trong các điều kiện môi trường khác nhau

Giống vi khuẩn Acetobacter Vi khuẩn Acetobacter xylinum Gluconacetobacter xylinum là vi khuẩn nhân sơ hiếm nhiều nhất trong sự cộng sinh tạo sản phẩm kombucha, nó tạo lên một màn nổi l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

LỜI CẢM ƠN

n tất ả tấm lòn kính trọn và biết ơn sâu sắ , tôi xin gửi lời cảm ơn hân thành tới ô iáo, PGS TS Đinh Thị Kim Nhung, n ười đã trực tiếp hướng dẫn, dạy bảo, độn viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin hân thành ảm ơn án bộ phòn Vi sinh trườn ĐHSP Hà Nội 2,

n h nhiệm kho Sinh – KTNN, Phòn s u đại họ , n iám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo á điều kiện thuận lợi nhất ho tôi tron quá trình làm việc

Cùn với đó là sự biết ơn hân thành tới nhữn n ười thân tron i đình, bạn

bè đã iúp đỡ và độn viên tôi tron suốt quá trình thực hiện đề tài này

Hà Nội, gà thá g 12 ăm 2016

Học viê

m

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọ đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nhi m vụ ghiê cứu 2

4 ối t g và h m vi ghiê cứu 3

5 ó g gó m i của đề tài 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Sản phẩm kombucha 4

1.1.1 c về gu gốc của sả hẩm kombucha 4

1 1 2 H vi si h v t t o g uá t h ê me kombucha 5

1 1 3 C sở khoa học về uá t h ê me kombucha 12

1.1.4 Bả chất si h hóa của uá t h t o mà g ce u ose t o g uá t h ê men kombucha 15

1.1.5 Thà h hầ của kombucha 16

1 1 6 Tác dụ g có i của kombucha 16

1.2 Tổng quan về ngu gu ê i u 17

1.2.1 Gi i thi u chu g về câ chè (t à) 17

1 2 2 Ngu gu ê i u t à Bát Tiê , Tu ê ua g 19

1 3 T h h h ghiê cứu và sản xuất kombucha ở Vi t Nam và t ê thế gi i 20

1 3 1 T ê thế gi i 20

1.3.2 Ở Vi t Nam 22

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2 1 V t i u và thiết bị ghiê cứu ghiê cứu 24

2 1 1 Vi si h v t 24

2.1.2 Thiết bị và hóa chất 24

2 1 3 Các o i môi t ờ g c bả 25

2.2 Ph g há ghiê cứu 26

2.2 1 Ph g há vi si h 26

2 2 2 Ph g há ghiê cứu đặc điểm si h ý, si h hóa của các chủ g Lactobacillus 30

2.2.3 Ph g há hóa ý 32

2 2 4 á h giá cảm ua theo h g há cho điểm 34

2 2 5 Ph g há thố g kê toá học 36

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Phâ và tu ển chọn chủng vi khuẩ actic có khả ă g ê me kombucha từ t à Tu ê ua g 38

3.1.1 Phâ chủ g vi khuẩ actic ê me kombucha từ t à Tu ê ua g 38

3 1 2 Tu ể chọ các chủ g vi khuẩ actic có khả ă g ê me kombucha từ t à Tu ê ua g 45

3.2 h h ở g của gu di h d g t i ê me kombucha từ t à Tu ê Quang 50

3.3 h h ở g của điều ki môi t ờ g t i ê me kombucha từ t à Tu ê ua g 54

3.3.1 h h ở g của hàm g giố g bổ su g 55

3.3.2 h h ở g của hi t độ ê me 58

3.3.3 h h ở g của thời gia ê me 61

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

1 Kết lu n 66

2 Kiến nghị 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

CFU: Colony Forming Unit

CS: Cộng sự

DSL: Domain specific language

FDA: U.S Food and Drug Administration

g/l: gam trên lít

GSH: Glutathione

HPLC: High Pressure Liquid Chromatography

HPLC- MS: High - performance liquid chromatography/mass mm: milimet

DANH MỤC CÁC HÌNH

H h 1 1 ản phẩm kombucha 4

H h 3 1 Chủ g vi khuẩ si h bào t 40

H h 3 2 Chủ g vi khuẩ khô g si h bào t 40

H h 3 3 Chủ g vi khuẩ khá g acid 40

H h 3 4 Chủ g vi khuẩ khô g khá g acid 40

H h 3 5 Chủ g vi khuẩ có cata ase âm tí h 41

H h 3 6 Chủ g vi khuẩ có cata ase d g tí h 41

H h 3 7 iểm t a khả ă g di động của vi khuẩn 42

H h 3 8 Chủ g vi khuẩ khô g si h acid actic 43

H h 3 9 Chủ g vi khuẩn sinh acid lactic 43

H h 3 10 Vò g hâ giải CaCO 3 của chủ g Lactobaci us 18 45

H h 3 11 Biểu đ biểu di hàm g acid tổ g số t o g kombucha đ c ê me từ 6 chủ g vi khuẩ Lactobaci us khi cộ g si h v i chủ g vi khuẩ Acetobacter X 4 và chủ g accha om ces 1 46

H h 3 12 ombucha ê me từ 6 chủ g vi khuẩ Lactobaci us khi cộ g si h v i chủ g vi khuẩ cetobacte X4 và chủ g ấm me Saccharomyces M 1 47

H h 3 13 Biểu đ biểu di giá t ị D của 6 chủ g vi khuẩ Lactobaci us 48

H h 3 14 thị biểu di n sự biế thiê H, acid tổng số và etha o ở các mức đ ờng bổ su g khác hau 51

H h 3 15 thị biểu di n sự biế thiê đ ờ g sót ở các mức đ ờng 52

H h 3 16 ombucha từ t à Tu ê ua g ở hàm g đ ờ g khác hau 54

H h 3 17 thị biểu di n sự biến thiê H, acid tổng số, ethanol ở hàm ng giố g khác hau 55

H h 3 18 ự biế thiê của hàm g đ ờ g d ở các hàm g giố g 56

H h 3 19 Biểu đ biểu di điểm cảm quan sản phẩm theo hàm ng giống bổ su g khác hau 56

H h 3 20 thị biểu di n sự biế thiê H ở các g ng nhi t độ khác hau 58

H h 3 21 thị biểu di n sự biế thiê acid tổng số ở các g ng nhi t độ

H h 3 24 ombucha ê me từ t à Tu ê ua g ở nhi t độ khác hau 60

H h 3 25 thị biểu di n sự biế thiê H, acid tổng số, đ ờ g sót, etha o

theo thời gia ê me 62

H h 3 26 Biểu đ biểu di điểm cảm quan sản phẩm theo thời gia ê me 62

DANH MỤC CÁC ẢNG

Bả g 1 1 ặc điểm si h hoá của chủng vi khuẩn G xylium 5

Bả g 1 2 Thà h hầ hóa học của á chè 18

Bả g 2.1 Bả g điểm đá h giá chất ng sản phẩm kombucha 35

Bảng 2.2 H số quan trọng của từng chỉ tiêu 36

Bảng 2.3 Phâ o i danh hi u chất ng sản phẩm 36

Bả g 3 1 H h thái khuẩ c và tế bào của 26 chủ g vi khuẩ actic 39

Bảng 3.2 Kết quả của các thí ghi m dù g để hâ vi khuẩn lactic 43

Bả g 3 3 ích th c vò g hâ giải của 6 chủ g vi khuẩn Lactobacillus 45

Bả g 3 4 á h giá khả ă g t o mà g của các chủng vi khuẩ Lactobaci us khi cộ g si h v i chủ g vi khuẩ cetobacte X 4 và chủ g ấm me Saccharomyces M 1 47

Bả g 3 5 hả ă g t o độ t o g, h g th m và mùi vị đặc t g của kombucha ê me từ 6 chủng vi khuẩ Lactobaci us khi cộ g si h v i chủ g vi khuẩ Acetobacter X4 và chủ g accha om ces 1 49

Bảng 3.6 h h ởng của hàm g saccha ose đế thà h hần dịch ê me kombucha và đá h giá cảm quan sản phẩm 51

Bảng 3.7 Sự biế đổi thà h hầ hóa học t o g uá t h ê me kombucha từ t à Tu ê ua g 61

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Uốn trà là ả một nghệ thuật, là một nét văn hó rất riên tron á h thưởng

thứ trà a n ười Á Đôn nói chung và n ười Việt Nam nói riên Uống trà là thú

vui th nh đạm, tinh tế, nhưn lại m n đến nhiều lợi í h ho sứ kh n ười thưởn thứ N ày nay văn hó uống trà ũn ó nhiều thay đổi với nhiều ch ng loại trà khá nhau, mỗi hươn vị lại ó một nét đặc trưn riên Tron đó kombucha

là một loại đồ uống, trà lên m n được sản xuất b n á h sử dụng sự cộng sinh giữa

vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic và nấm m n ( òn ọi là nấm trà h y SCO Y) tạo nên một loại đồ uốn ó rất nhiều lợi í h ho sức kh e

Tron quá trình lên m n kombucha, nấm m n huyển hó đường saccharose thành sinh và th nol và khí CO2 Một phần lượng ethanol sinh ra sẽ đượ oxi hó bởi vi khuẩn acid acetic tạo sản phẩm hính là id ti Glu os đượ vi khuẩn

l ti huyển hó thành id l ti Cá sản phẩm phụ khá đượ hình thành, b o gồm acid gluconic, á loại vitammin, phối hợp với á hợp chất thơm như

ld hyd , mino id, ùn với á poly ph nol ó tron trà tạo nên hươn vị rất đặc biệt c trà kombu h

Ở Việt Nam, việc sử dụn kombu h òn ây r rất nhiều tr nh ãi khá nhau Việ lên m n trà kombu h trướ đây mới chỉ manh nha xuất hiện ở một số

hộ i đình với qui mô nh lẻ, th ôn o n ười tiêu dùn hư hiểu rõ về thành phần và ôn dụng c a kombu h , á ơ sở sản xuất lại hư đư r được những minh chứng khoa học cho sản phẩm c mình nên rất khó khăn để n ười tiêu dùn chấp nhận Ở Việt Nam á ôn trình n hiên ứu về kombucha vẫn òn khá khiêm tốn, đặc biệt là về khu hệ vi sinh vật Tron á n hiên cứu về khu hệ vi sinh vật mới chỉ n hiên ứu về vi khuẩn axetic, nấm men chứ hư ó n hiên ứu huyên sâu nào về

vi khuẩn l ti o đó, n hiên ứu về vi khuẩn lactic trong lên m n để tạo sản phẩm

kombu h ó hươn vị thơm n on hơn, đặ trưn hơn là một hướn n hiên ứu triển vọn và mới mẻ

Trà kombu h ó tá dụng giốn như m n tiêu hó , vì id l ti tạo r t lên m n l ti tron kombu h iúp i tăn lượng vi khuẩn Bifidus ó lợi trong đường ruột Trà kombu h là n uồn cung cấp vi khuẩn lacti , hún bám vào niêm

mạ đườn tiêu hó , ạnh tranh chỗ bám và làm kìm hãm sự phát triển c a vi sinh vật ây bệnh như E oli, S lmon ll ( ây tiêu hảy), vi khuẩn Pylori ( ây viêm loét

dạ dày) và nấm C ndid Quá trình lên m n l ti òn tạo r á hất khán sinh ức chế vi khuẩn ó hại T đó, kombu h iúp n táo bón, nhiễm trùn đường ruột, kiết lỵ, rối loạn tiêu hó , hữ viêm loét ruột Vi khuẩn l ti tron trà kombu h

òn ó khả năn khán acid mật - một chất dị h tiêu hó hứa cholesterol Nếu á acid mật khôn đượ hình thành thì cholesterol sẽ khôn thể đượ ơ thể tái hấp thụ

và bị tống ra kh i hệ tiêu hó Do đó, vi khuẩn l ti òn ó tá dụng giảm hol st rol Đặ biệt, id l ti ùn với polyph nol tron trà ó tiềm năn khán

á tá nhân ây un thư do hún ức chế đột biến n, ứ hế sự phát triển á

tế bào un thư [29], [50] Chính vì vậy, tôi tiến hành n hiên ứu đề tài: “ n cứu, tuyển chọn và k ả năn l n men lact c tron quá trìn tạo sản phẩm kombucha từ trà uy n Quan tron các đ ều kiện mô trườn k ác n au”

2 Mục đ ch nghiên cứu

Phân lập, tuyển họn và n hiên ứu á h n vi khuẩn l ti ó khả năn

lên m n kombu h t trà Tuyên Qu n để tạo r sản phẩm kombu h thơm n on

đặ trưn và bổ dưỡn

3 Nhi m vụ nghiên cứu

3.1 Phân lập, tuyển chọn ch ng vi khuẩn l ti ó khả năn lên m n kombu h t

trà Tuyên Qu n

3.2 Ảnh hưởn nguồn dinh dưỡng tới lên m n kombu h t trà Tuyên Qu n 3.3 Ảnh hưởn điều kiện môi trườn tới lên m n kombu h t trà Tuyên Quang

4 Đối tư ng và ph m vi nghiên cứu

4.1 Đối tượn n hiên ứu

Ch ng vi khuẩn l ti đượ phân lập t kombu h lên m n t trà Tuyên Qu n

Ch n vi khuẩn Acetobacter X4 và h n Saccharomyces M1 tại phòn thí

n hiệm vi sinh, trườn đại họ sư phạm Hà Nội 2 do ùi Thị Th y (2015) phân lập

và tuyển họn khi n hiên ứu đề tài “ h h ởng của môi t ờng di h d ng t i

uá t h t o sản phẩm kombucha từ chè ( Camellia sinensis) PT10”

4.2 Phạm vi n hiên ứu

Ch ng vi khuẩn lactic ó khả năn lên m n kombu h t trà Tuyên Qu n

5 Đóng góp mới của đề tài

5.1 Phân lập và tuyển chọn được 02 ch ng vi khuẩn Lactobacillus: M 18 và M 26

ó khả năn lên m n kombu h tốt t trà Tuyên Qu n

5.2 Tìm đượ n uồn dinh dưỡn và một số điều kiện môi trườn thí h hợp cho lên m n kombu h t trà Tuyên Qu n là 10( ) saccharose, 10% giống tính theo

V, nhiệt độ 30 ± 2oC, thời i n lên m n 7 n ày

NỘI DUNG

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sản phẩm kombucha

1.1.1 ơ lược về nguồn gốc c a sản phẩm kombucha

Kombu h là một loại thức uống rất tốt cho sức kh , đượ làm b n á h lên m n dị h trà đường với sự cộng sinh giữa vi khuẩn (ch yếu là vi khuẩn acetic,

l ti ) và nấm men [26], [38] Trà kombu h được bắt nguồn t phươn Đôn ũn

ó thể là t Trung Quố á h đây khoản 2000 năm Nó đượ biết đến đầu tiên ở Trung Quốc t năm 221 trướ Côn N uyên, tên ọi là th y hoài sâm và được xem như một loại thần dược [39] Quy trình lên m n kombu h được biết đến ở N và Ukr in vào uối nhữn năm 1800 và trở nên phổ biến vào đầu năm 1900 Hệ vi sinh vật trong kombucha chỉ biết đến đó là một con nấm (tea mushroom) và tên ọi

c a loại đồ uốn này là kv ss trà Đối với á i đình n ười Nga t n ày đó đến

n y trà kombu h đượ x m như một loại nước uống phổ biến và dùn để chữa bệnh Một bá sĩ n ười Đại Hàn ó tên là Kombu đã sử dụng sản phẩm lên m n trà

để chữa bệnh và ái tên kombu h bắt nguồn t đó, đó là sự kết hợp giữ tên a

ôn vớí “ h ”(trà) S u đó kombu h phổ biến dần dần đến Phần L n, Đứ , Đ n

Mạ h Nhưn nó bị lãn quên tron suốt chiến tranh thế giới thứ 2 Sau chiến tranh thế giới thứ 2, nó đượ bá sĩ Rudolph Sk ln r phục hồi lại tại Đức khi ôn sử dụng

nó để thử nghiệm tron điều trị cho bệnh nhân un thư, rối loạn chứ năn , o huyết áp và đái tháo đường [37], [39], [42]

Hình 1 1 Sản phẩm kombucha

ệ v s n v t tron quá trìn l n men kom uc a

Hệ vi sinh vật lên m n kombu h là một tập đoàn vi sinh vật cộng sinh bao

gồm á loài vi khuẩn thuộc giống Acetobacter, iốn Lactobacillus, á loài nấm men Nhưn h yếu là vi khuẩn Acetobacter và nấm men [26], [31]

1.1.2.1 Giống vi khuẩn Acetobacter

Vi khuẩn Acetobacter xylinum (Gluconacetobacter xylinum) là vi khuẩn

nhân sơ hiếm nhiều nhất trong sự cộng sinh tạo sản phẩm kombucha, nó tạo lên một màn nổi llulos trên bề mặt dị h lên m n [23], [27]

* Đặ điểm phân loại

Gluconacetobacter xylium (G xylium) dạng trực khuẩn kí h thước khoảng

2µm, đứn riên rẽ hay xếp thành huỗi, ó khả năn tạo màn llulos khá dày

trên môi trườn đặ trưn Vi khuẩn G xylium thuộ nhóm vi khuẩn Gr m âm, hiếu khí bắt buộ , hó dị dưỡng G xylium sinh trưởng ở pH 5, nhiệt độ 28-320C và ó thể tí h lũy 4,5 id ti A id ti là sản phẩm sinh r tron quá trình hoạt độn vi khuẩn, nhưn khi hún vượt qu mứ ho phép, hún sẽ qu y trở lại

ứ hế hoạt độn vi khuẩn G xylium khi nuôi ấy trên môi trường thạ h đĩ

hình thành khuẩn lạc nhẵn hoặ xù xì, rì mép phẳng hoặc gợn són màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc b ng phẳng hay lồi lên dễ tá h kh i môi trường Ở điều kiện nuôi ấy tĩnh tron môi trường dịch thể, hún sẽ hình thành trên bề mặt môi trường lớp màn nhăn, dày

* Một số đặ điểm sinh lý, sinh hó a G xylium

ảng 1 1 Đặc điểm sinh hoá của chủng vi khuẩn G xylium

3 Sinh trưởn trên môi

4 Chuyển hoá ly rol thành

dihydroxyaceton

Tạo kết t đ gạch trong dị h s u lên m n

+

5

Chuyển hoá lu os thành

acid

Vòn sán xuất hiện xung quanh khuẩn lạ trên

6 Kiểm tra khả năn sinh sắc tố nâu Khôn hình thành sắc tố nâu

_

7 Kiểm tra khả năn tổng hợp cellulose Ván vi khuẩn xuất hiện màu l m

+ Ghi hú: (+) ó; (-) khôn

* Sinh trưởn và phát triển: Trong quá trình sinh trưởn và phát triển, nhu cầu

dinh dưỡng c a vi khuẩn G xylium rất phon phú N uồn rbon ó thể được cung cấp

t á hợp chất đườn , rượu tyli và á id hữu ơ Vi khuẩn G xylium ó thể sử

dụn á muối mon làm n uồn cung cấp nitơ và phân iải pepton Một số acid amin như id p ntoth ni và á hất khoán K, M , C , F , P, S… ũn ó v i trò qu n

trọn tron quá trình sinh trưởn và phát triển c a G xylium [3], [37]

1.1.2.2 Nấm men

Trên 90 h ng nấm men trong kombucha thuộc về á loại nấm men c a

Saccharomyces [39], [44] Nấm m n là nhữn ơ thể đơn bào, nhân huẩn, đ số

sinh sôi nảy nở b n á h nảy chồi hoặ phân ắt tế bào, nhiều loài ó khả năn lên

m n đường Nấm men thườn ó dạn hình ầu, lip, ov n và ó ả dạn hình trụ Kích thước tươn đối lớn: đườn kính khoảng 7μm, chiều dài: 8–12μm Hình dạng

và kích thước tế bào thay đổi, khôn đồn đều ở ác loài khác nhau, ở ác lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau Tế bào nấm men ó thành phần và ấu tạo khá phức tạp gồm thành tế bào, màn n uyên sinh hất, tế bào hất, ty thể, riboxom, nhân, khôn bào và á hạt dự trữ

Nấm m n ó h i hình thức sinh sản ch yếu: sinh sản hữu tính b n á h hình thành bào tử túi và sinh sản vô tính b ng nảy chồi [2], [5] Nấm m n là vi sinh vật hó dị dưỡn vì hún sử dụn á hợp chất hữu ơ làm n uồn cung cấp năn lượng cho sự sinh trưởn và phát triển Nấm m n ó thể tồn tại trong cả điều kiện hiếu khí và kỵ khí với khoảng nhiệt độ tươn đối rộn và pH, id thí h hợp cho sự phát triển c a nấm men [3], [5]

Phân loại: Ch yếu ó h i lớp: nấm men thật (As omy s) và nấm men giả (Fungi imperfecti) [2], [5] Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men

dùn tron ôn n hiệp thuộc lớp As omy s, đ số thuộc giống Saccharomyces; giống Endomyces; giống Schizosaccharomyces Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti):

Crytococus (toscula, tornlopsis); Mycoderma; Candida; Geotrichum (đã được xếp

vào lớp nấm mốc); Rhodotorula

1.1.2.3 Vi khuẩn lactic

* Đặ điêm sinh lý, sinh hó :

Vi khuẩn l ti là tên ọi hun nhữn vi khuẩn ó khả năn sinh tổn hợp cid l ti như là sản phẩm hính quá trình huyển hó bohydr t [19]

Vi khuẩn l ti là vi khuẩn Gr m dương, khôn sinh bào tử, khôn di động, hịu được id, huyển hó đườn thành acid lactic Chún thu nhận năn lượn nhờ phân iải hydr t bon và sinh r acid lactic A id sinh r ó thể ở dạn (-), L(+) hay L Khá với một số vi khuẩn khá như vi khuẩn đườn ruột ũng sinh ra lactic

id thì tất ả á vi khuẩn l ti đều là vi khuẩn lên m n bắt buộ khôn hứ á yto rom và nzym t l z Chún là á vi khuẩn kỵ khí khôn bắt buộ Khuẩn

lạ vi khuẩn l ti tròn nh , bón , ó màu trắn đụ hoặc vàn k m Vi khuẩn

lactic đượ xếp hun vào họ Lactobacteriaccae Cá hi b o ồm Lactobacillus,

Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus đây là hi hính vi khuẩn l ti

Vi khuẩn l ti ó khả năn sinh trưởn tốt tron môi trườn kị khí và vi hiếu khí Năn lượn dùn để tr o đổi hất ó đượ là nhờ quá trình lên m n á carbonhydrate Acid lactic luôn là sản phẩm uối ùn quá trình lên m n N oài

ra một số loài Lactobacillus, Leuconostoc hoặ Streptoccus ó khả năn tạo

hương, sinh r di x tyl hoặ x ton Ở phần lớn vi khuẩn, axeton đượ sinh r t pyruvate và vì vậy là sản phẩm quá trình trao đổi rbonhydr t Ở vi khuẩn

l ti rất ít trườn hợp x ton đượ hình thành ó n uồn ố t rbonhydr t nếu như khôn ó n uồn pyruv t bổ sun Thườn pyruv t này ó n uồn ố t xitr t đây là quá trình lên m n kị khí xitr t ở vi khuẩn l ti Tuy ọi là lên m n nhưn thự r xitr t khôn đượ sử dụn như là một n uồn năn lượn mà hỉ dùn để tạo

r á sản phẩm tr o đổi hất Một số loài Leuconostoc và Lactobacillus lên m n dị

hình tron môi trườn trun tính khôn tạo r x toin hoặ di x tyl mặ dù tron

môi trườn này hún vẫn sử dụn xitr t Tuy nhiên tron môi trườn xit á loại này lại tạo r một lượn đán kể x toin Mặ dù vi khuẩn L ti ó thể phát triển đượ trên môi trườn hiếu khí nhưn hún khôn thu nhận năn lượn nhờ quá trình hô hấp Điều này hứn t hún khôn tổn hợp đượ nhân h m, do đó khôn ó yto rom h y nhữn nzym hứ nhân h m khá Chún ó thể tiến hành một số phản ứn oxy hoá một số ít á hợp hất hữu ơ khá nhờ flavoprotein

Cá phản ứn này khôn kèm th o việ tổn hợp ATP

Riên ở vi khuẩn l ti tuy t l z âm tính son lại ó một nzym khá là peroxidaza bản hất là fl voprot in Enzym này là trun i n xú tá quá trình oxy hoá á ơ hất hữu ơ dưới tá dụn H2O2 Nhờ đó vi khuẩn l ti vẫn ó khả năn sinh trưởn tron môi trườn hiếu khí Đây ũn là đặ điểm quý báu để nhận dạn vi khuẩn l ti vì hún ần như là nhữn vi khuẩn t l z âm tính duy nhất

ó khả năn sinh trưởn khi ó mặt oxy

Nhu ầu dinh dưỡn vi khuẩn L ti ũn rất phứ tạp, tuỳ th o đặ điểm t n loài mà khá nh u o đó môi trườn để nuôi ấy vi khuẩn L ti thườn

hứ p pton ( o thịt, o nấm m n) và á dị h hiết t thự vật hoặ độn vật khá Một số đặ điểm sinh lý điển hình nữ vi khuẩn l ti là khả năn hốn hịu id rất tốt Nhữn vi khuẩn l ti hình ầu ó thể sinh trưởn tron môi trườn pH trun tính hoặ hơi kiềm, vi khuẩn hình qu khôn ó khả năn hịu môi trườn ó pH lớn hơn 6 Vi khuẩn l ti ó khả năn hịu pH môi trườn đạt iá trị

là 5 Đặ tính sinh id và hịu id rất tốt iúp vi khuẩn l ti ạnh tr nh với vi khuẩn khá tron môi trườn iàu dinh dưỡn và do đó hún là đại diện tiêu biểu nhóm vi khuẩn tron i i đoạn uối quá trình lên m n

Tuỳ thuộ phạm vi nhiệt độ sinh trưởn vi khuẩn l ti , n ười t hi hún thành h i loại:

Vi khuẩn lactic ư ấm (m sophil ): ó thể sinh trưởn trong khoản nhiệt độ

10 - 35o C

Vi khuẩn l ti ư nhiệt (th rmophil ): ó thể hịu nhiệt độ 45o C

* Phân loại vi khuẩn l ti

Nhóm vi khuẩn l ti rất đ dạn ồm nhiều iốn khá nh u Để phân loại

n ười t dự vào nhiều tiêu hí khá nh u, ăn ứ vào đặ điểm hình thái, phươn thứ lên m n, khả năn phát triển ở á nhiệt độ khá nh u, khả năn hịu muối, hịu id h y kiềm Hiện n y n uyên tắ phân loại vi khuẩn l ti dự trên sự phân

tí h trình tự 16S rARN, nó un ấp thôn tin ơ bản nhất về trình tự á nu l otit, iúp t so sánh một số đặ tính phát sinh trên ơ sở kiểu hình khôn tươn ứn với nhữn qu n hệ phát sinh h n loại Kĩ thuật phân tử, đặ biệt là phản ứn PCR là một tron nhữn phươn pháp ơ bản nhất để phân loại á h n vi khuẩn l ti [36]

Th o bản phân loại đượ sử đổi hiện n y, vi khuẩn l ti ồm khoản hơn

20 iốn thuộ họ L tob ill , hún thườn ó dạn hình ầu (hoặ ov l) và

hình qu , tron đó á iốn s u đây là h yếu nhất: Aerococcus, Carnobacterium,

Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leucnostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và Weissella Trướ đây iốn Bifidobacterium thuộ hẳn về một nhánh phát sinh h n loại khá (n ành

Actinobacteria) nhưn do đặ điểm sinh thái và khả năn lên m n l ti nên ũn đượ xếp vào nhóm vi khuẩn l ti tron khó phân loại r y 1957 [36]

Dự trên nhữn đặ điểm hình dạn tế bào á nhà kho họ đã phân hi vi khuẩn l ti thành á loại sau [5]:

Hình qu : Lactobacillus, Carnobacerium

Hình ầu: Streptococcus, Leuconotoc, Pedicoccus

N oại lệ: Weissella ( ó ả hình ầu và qu ), Bifidobacterium Phân hi vuôn ó nh u trên một mặt phẳn tạo hình tứ ầu(Aerococcus, Tetragenococcus,

Pediococcus)

* Nhu ầu dinh dưỡn vi khuẩn l ti :

Vi khuẩn l ti đòi h i nhu ầu dinh dưỡn phứ tạp, hún khôn thể sinh trưởn tron môi trườn muối khoán thuần khiết hứ lu oz và NH4+ Đ số hún ần hàn loạt vit min, xit min và nhiều hất

- Nhu ầu dinh dưỡn bon

Vi khuẩn l ti ó thể sử dụn nhiều loại hydr t bon để un ấp năn lượn , xây dựn ấu trú tế bào và làm ơ hất ho quá trình lên m n tổn hợp

á id hữu ơ t á monos rit ( lu ose, fructose, maltose), á dis rit (saccarose, lactose, maltose) ho đến á polys rit (tinh bột, dextrin [19]

- Nhu cầu dinh dưỡn nitơ

Phần lớn vi khuẩn l ti khôn tự tổng hợp đượ á hợp chất chứ nitơ, húng phải sử dụn á n uồn nitơ ó sẵn tron môi trường Cá n uồn nitơ vi khuẩn l ti ó thể sử dụn như: o thịt, cao nấm men, trypton, dịch th y phân casein t sữ , p pton,… [36]

- Nhu cầu về vitamin

Đa số á loài vi khuẩn l ti khôn ó khả năng sinh tổng hợp vit min Vì vậy cần bổ sun vào môi trườn á loại vit min Cá hất chứ vit min thường sử dụn như nước chiết t kho i tây, n ô, à rốt hay dịch tự phân nấm m n…

- Nhu cầu á hợp chất hữu ơ khá

Vi khuẩn l ti òn ần á hợp chất hữu ơ khá ho sự phát triển như á

b zơ nitơ h y á id hữu ơ Một số acid hữu ơ ó ảnh hưởng thuận lợi đến tốc

độ sinh trưởng c a vi khuẩn lacti như id xitri , id ol i , acid axetic [19]

- Nhu cầu á muối vô ơ khá

Để đảm bảo cho sinh trưởn và phát triển đày đ , vi khuẩn lactic rất cần á muối vô ơ Cá n uyên tố khoán như đồng, sắt, n tri, k li, photpho, lưu huỳnh,

m i đặc biệt là m n n, vì m n n iúp n ăn n quá trình tự phân và ổn định cấu trú tế bào

- Nhu cầu dinh dưỡng oxi

Vi khuẩn lactic v ó khả năn sốn đượ tron môi trườn ó oxy và v a sốn đượ tron môi trườn khôn ó oxy [8]

Vi khuẩn l ti phát triển tốt nhất ở môi trườn ó nồn độ oxi thấp

* Ứn dụn vi khuẩn l ti :

- dụ g vi khuẩ actic để sả uất acid actic:

Năm 1881, on n ười đã bắt đầu ứn dụn vi khuẩn l ti để sản xuất id

l ti trên quy mô ôn n hiệp A id l ti đượ sản xuất t á n uyên liệu như rỉ đườn , tinh bột, và dị h thải n ành ôn n hiệp sản xuất đườn , bánh k o [19]

Vi khuẩn l ti đượ sử dụn ho mụ đí h này là nhữn vi khuẩn lên m n

đồn hình Lactobacillus deibruckii, L bulgaricus, L leichmanii, ó nhiệt độ tăn

trưởn tối ưu t 45 – 48oC, đây là lợi thế để n ăn n sự xâm nhiễm

- S dụng vi khuẩ actic t o g ô g ghi và môi t ờng

Vi khuẩn l ti ó khả năn hạn hế sự phát triển Fusarium - loại nấm

ây bệnh điển hình tron đất Nấm Fusarium khi phát triển qu nh vùn rễ ây sẽ

làm ây yếu đi tạo điều kiên ho á bệnh ơ hội ây bệnh ho ây trồn [19]

Chế phẩm EM (Eff tiv mi roor nism) h y hế phẩm vi sinh hữu hiệu,

b o ồm 80 h n vi sinh vật tron đó ó sự óp phần vi khuẩn l ti Hiệu quả

hế phẩm này là ải tạo đất, tăn năn suất ây trồn và iải quyết vấn đề ô nhiễm môi trườn [36]

- S dụng vi khuẩ actic t o g cô g ghi p chế biến bảo quản rau quả, thịt

và thức ă gia súc

Quá trình lên m n l ti vi khuẩn l ti sinh r á cid hữu ơ ( cid lactic, acid ti ) do đó làm iảm pH môi trườn , t đó ứ hế hoặ tiêu diệt á

vsv ây bệnh, ây h n thối thự phẩm như E coli, Pseudomonas sp [3], [19]

t rio in là nhữn p ptid h y prot in, tổn hợp ở riboxom vi khuẩn ó khả năn ứ hế á vi sinh vật ó qu n hệ về h n loài ần với h n sinh r bacteriocin

Sữ hu là sản phẩm sữ lên m n l ti nhờ một hoặ vài h n vi khuẩn lactic

khá nh u H i h n : Streptococcus thermophilus và Lactobacillus bulgaricus là h i

h n vi khuẩn l ti thườn đượ sử dụn tron lên m n sữ hu

Sử dụn lên m n l ti để hế biến á sản phẩm r u, quả, thịt, á, sữ là một phươn pháp bảo quản thự phẩm phổ biến hiện n y Lên m n l ti khôn nhữn iúp kéo dài thời i n bảo quản á sản phẩm thự phẩm để un ấp ho n ười tiêu dùn ở nhữn khu vự x xôi, khi thời tiết xấu, kh n hiếm r u tươi, lú iáp

vụ, mà òn tạo r sự đ dạn về sản phẩm thự phẩm với màu sắ , độ rắn hắ và hươn vị mon muốn như: phomát, xú xí h, n m chua [3]

Lên m n l ti đượ sử dụn rộn rãi tron sản xuất á thự phẩm muối

hu truyền thốn như: n m hu , tôm hu , thịt hu , r u quả muối hu ở khắp nơi trên thế iới T á sản phẩm đặ trưn như kim hi Hàn Quố , n m hu Việt

N m, đến á sản phẩm r u quả muối hu như ải bắp S u rkr ut Đứ , r u dư muối hu vùn Đôn N m Á [8], [19] Đây là loại thự phẩm đượ sản xuất th

ôn , m n sắ thái kinh n hiệm và bản sắ riên t n dân tộ N oài r , lên

m n l ti òn đượ sử dụn để hu thứ ăn x nh ho i sú , dự trữ một n uồn thứ ăn iàu dinh dưỡn ho i sú tron suốt mù khô, mù đôn lạnh

- dụ g vi khuẩ actic t o g học

Cá vi khuẩn l ti sinh khán sinh đượ sử dụn làm hế phẩm “ m n tiêu

hó sốn ” dùn để hứ một số bệnh rối loạn tiêu hó , tiêu hảy và phụ hồi ân

b n hệ vi sinh vật đườn ruột Tron đó, nổi bật là L acidophilus khi bổ sun vào

đườn tiêu hó , tại ruột ià hún phát triển, tiết r á hất khán sinh, hất khán

độ tố, t đó ứ hế một số vi khuẩn ây bệnh đườn ruột

Cá hế phẩm hứ Lactobacillus đều ho thấy hiệu quả tron hữ trị á

bệnh rối loạn và viêm nhiễm, b o ồm: viêm ruột kết, đầy hơi, un bướu, làm hạ hol st rol tron máu, đ u đầu, viêm âm đạo khôn điển hình và ải thiện đượ tình trạn khôn sử dụn đượ l tos [3]

1.1.3 Cơ sở khoa học về quá trìn l n men kom uc a

Bản chất c quá trình lên m n kombu h b o ồm nhiều quá trình xẩy ra đồng thời là lên men th nol (lên m n rượu) và lên m n ti , lên m n l ti với sự tham gia c a cả nấm m n và vi khuẩn ti và vi khuẩn lactic

1.1 3 1 Lê me etha o ( ê me u ) nhờ nấm men

Nấm m n hính un ấp hệ enzyme đặ thù để chuyển hó đườn thành

th nol và CO2 tron điều kiện yếm khí Đườn ùn á hất dinh dưỡn khá a môi trườn lên m n, trướ tiên được hấp phụ trên bề mặt c a tế bào nấm men Tron khi nướ đượ vào r tế bào một á h tự do thì đườn và á hất dinh dưỡng

khá hỉ được màn tế bào ho đi vào mà khôn ho đi r Vì vậy, đường bị chuyển

hó qu một chuỗi phản ứn th o on đườn đườn phân để tạo ra pyruvat, pyruvat

bị d boxyl hó dưới sự xú tá a enzyme pyruvat decacboxylase tạo thành acetaldehyde giải phón CO2, acetaldehyde nhận H+ t NADH tạo ethanol [15]

Phươn trình tổn quát quá trình lên m n rượu:

C6H12O6 + 2ADP + 2H3PO4 C2H5OH+ 2CO2 + 2ATP+2H2O

Sự lên m n rượu sẽ tiến hành một á h thuận lợi khi nhiệt độ lên m n t

29-320 C Môi trường thuận lợi cho lên m n hứa 10-18( ) đường, nấm m n ó thể lên

m n được mặ dù hậm chạp ở những dung dị h ó nồn độ đường cao 25-30 (%)

vì ở nồn độ đường cao sẽ tạo áp suất thẩm thấu lớn ây phá h y trạn thái sinh lý bình thường c a nấm men Tron quá trình lên m n ethanol, nhiều acid hữu ơ được tạo thành, một số acid hữu ơ được sinh tổng hợp t hu trình Kr bs Nếu như quá trình lên m n khôn diễn r tron điều kiện kị khí n hiêm n ặt, á id hữu ơ hiếm hàm lượng cao nhất trong dị h lên m n là id itri , malic, acetic, lactic

1.1.3.2 Lê me acetic hờ vi khuẩn Acetobacter

Lên m n ti là quá trình tyl hó th nol thành id ti tron điều

kiện hiếu khí dưới tá dụng c nzym oxy hoá a vi khuẩn Acetobacter [15],

t ld hyd được chuyển hó thành hydr t t ld hyd và s u ùn hydr t acetaldehyde bị oxy hó thành id ti

C2H5OH + ½ O2 CH3CHO + H2O (acetaldehyde)

CH3CHO + H2O CH3CH(OH)2 (hydrate acetaldehyde)

CH3CH(OH)2 + O2 CH3CHOOH + H2O ( acid acetic)

Cá rượu khá nh u, đườn và một số id ũn ó thể bị vi khuẩn acetic oxy hó Chẳng hạn nó ó thể oxy hó rượu butyri thành id butyri , lu os thành lu oni

1.1 3 3 Lê me actic hờ vi khuẩn lactic

Tron quá trình phân tí h á thành phần trong dị h trà kombu h , n ười

ta nhận thấy một lượn khá lớn id l ti đượ hình thành o đó, quá trình lên m n òn b o ồm cả quá trình lên m n l ti t đường saccharose với sự tham gia c a vi khuẩn lactic [15] Lên m n l ti là một quá trình tr o đổi năn lượn Cá phân tử ATP đượ hình thành tron quá trình huyển hó ơ hất sẽ được vi khuẩn giữ lại trong tế bào, để phục vụ ho quá trình tr o đổi chất và sinh trưởng c a vi sinh vật N ượ lại, á sản phẩm như id l ti , th nol, CO2 đượ

vi khuẩn thải vào môi trườn lên m n Kết quả là hàm lượn id l ti tí h lũy trong

môi trườn lên m n n ày àn tăn , làm iảm pH môi trườn và kéo th o những biến đổi hó lý khá Bản chất là quá trình huyển hó đườn thành id l ti nhờ

vi sinh vật [50]

Tùy th o ơ hế lên m n bắt buộc hoặc ch yếu mà n ười t xá định là vi khuẩn lên m n lactic đồn hình h y vi khuẩn lên m n lactic dị hình Một số vi khuẩn lên m n đồn hình ũn ó khả năn lên m n dị hình tron nhữn điều kiện sinh trưởn khôn thuận lợi hoặ tùy thuộ vào n uồn đường sử dụng

* Lên m n l ti đồn hình: Là loại lên m n hầu như hỉ cho sản phẩm là xit

lactic Đây là á vi khuẩn thuộc á hi như Lactococcus, Streptococcus, hún

phân iải bonhydr t th o on đường EMP (Embden – Meyrhof – Parnas) và

b n on đườn này acid lactic sinh ra chiếm 90 – 98% và một lượng nh acid acetic, aceton, di- tyl…

Phươn trình tổn quát quá trình lên m n l ti đồn hình:

C6H12O6 2 CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J

* Lên m n l tic dị hình: Là quá trình lên m n, n oài xit l ti òn ó á sản phẩm khá như xit x ti , t nol, CO2,… Cá vi khuẩn th m i vào quá trình

lên m n này thuộ á hi: Leuconostoc, Bifidobacterium Do vi khuẩn lên m n

lactic dị hình thiếu hai enzyme ch yếu c on đườn EMP là ldol s và triozophosph t izom r s nên i i đoạn đầu c quá trình phân iải glucose theo

on đường PP (Pentose phosphat) [19] S u đó quá trình huyển hó triozophosph t

thành xit l ti xảy r tươn tự như lên m n đồn hình Phươn trình tổn quát a

quá trình lên m n l ti dị hình:

C6H12O6 CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +CO2 …

1.1.4 Bản chất s n óa c a quá trìn tạo màn cellulose tron quá trìn l n men kombucha

Chính sự ó mặt c a ch ng Gluconacetobacter xylinum đã hình thành nên cấu trú c a kombucha Ch n G xylinum ó khả năn tạo màn llulos khá dày

và hắc, tạo màu x nh với thuốc nhuộm Iod và H2SO4 Nên màn a kombucha giống một ái bánh d p, thườn được gọi là “ on nấm” h y “SCO Y” [26], [31]

Màn llulos là sản phẩm chuyển hó thứ cấp c quá trình lên m n kombu h và đây ũn là một đặ điểm độ đáo quá trình lên m n kombu h Chính màn llulos làm ho dị h kombu h ít bị nhiễm vi sinh lạ hơn Quá trình hình thành màn llulos , đượ nhà bá học Muhlethaler sử dụn kính hiển vi điện

tử để n hiên ứu và ho r n : đầu tiên á tế bào vi khuẩn sẽ tiết ra chất nhầy bao

qu nh hún , tiếp đó là sự hình thành á sợi llulos đượ polim r hó t á đơn phân lu os ở vị trí α-1,6 dưới tá dụng c nzym ó tron b o nhầy Cá sợi này n ày àn dày lên và được kết nối với nhau tạo thành lớp llulos bên tron

bao nhầy Lớp llulos này s u đó đượ thoát r kh i tế bào hoàn toàn Dung dịch

môi trườn b n đầu ó dạng huyền phù mịn, chuyển sang dạng rời rạ , s u đó kết lại thành khối lớn hơn dạng gel chứa cả á tế bào vi khuẩn và nấm m n tron đó

Bộ khung c l là mạn lưới llulos thành phần ch yếu là nướ Nó hình thành

tối đ s u 30 phút khi ó sự tiếp xú iữa vi khuẩn với lu os và oxy Cá

polysaccharide c a vi sinh vật thườn đượ tí h tụ đán kể tron á môi trường

l ng Tất cả á oli o và polys h rid được tổng hợp b n á h kéo dài huỗi

s h rid ó trước nhờ vào việ thêm vào đơn vị monosaccharide, đơn vị monosaccharide đượ thêm vào th m i phản ứng ở dạng nucleotide, monosaccharide được hoạt hó thườn là dẫn xuất c á uridin, diphosph t (U P-X) nhưn đôi

khi ũn với á nu l oyid , purin và á pirimidin khá

1 5 àn p ần c a kombucha

Phân tích hó họ kombucha cho thấy sự hiện diện axit hữu ơ khá nhau, hẳn hạn như acetic, gluconic, glucuronic, citric, L-lactic, malic, tartaric, malonic, oxalic, succinic, pyruvic, usnic; òn á loại đườn , hẳn hạn như sucrose, glucose, fructose; á vitamin B1, B2,B6, B12, và C; 14 axit amin, purin, bột màu, hất béo, protein, một số enzym th y phân, ethanol, carbon dioxide, phenol, ũn như một số polyphenol trong trà, khoán hất, á anion, DSL, ũn như á sản phẩm huyển hó nấm men và vi khuẩn [39]

á tá dụn ơ bản c kombu h đó là:

- T à kombucha coi h một ngu khá g si h

Trong lên men kombucha một lượn nh khán sinh đượ hình thành ó

khả năn ức chế nhiều vi sinh vật ó hại như E.coli, Pseudomonas, Samonella,

Staphylococus [24] Sự hiện diện c á id hữu ơ đặc biệt acid usic ó khả

năn ức chế nhiều loại vi khuẩn Gr m dương và Gr m âm cho thấy khả năn chống lại vi khuẩn ây bệnh c kombu h ó rất nhiều triển vọng [48]

- Khả ă g chố g o hóa của t à kobucha

Kombu h òn đượ oi như hất chốn oxy hó , nó tươn qu n nhiều đến nhữn tá dụn ó lợi c kombu h đã được tuyên bố: phòn hốn un thư, tăn ường miễn dịch, giảm viêm [38], khả năn loại b gốc tự do trên PPH và kombu h ó khả năn trun hò á th y đổi T HP (butyl hydrop roxid ) n ăn

ng á tế bào hết [28] N oài r á hoạt động chốn oxy hó a kombu h òn

do sự hiện diện c á polyph nol tron trà [50]

- Tiềm ă g chố g u g th của t à kombucha

Kombu h ó khả năn hốn un thư và được khẳn định bởi một n hiên ứu trên đ số nhữn n ười dùn kombu h ở Nga bởi “ C ntr l On olo i l R s r h Unit” và “Russi n An d my of S i n s in Mos ow” vào năm 1951 Cơ hế chống

un thư ó thể do ó hất polyph nol tron trà ó khả năn : Ức chế đột biến gen; Ức chế tăn sinh tế bào un thư; Cảm ứn á tế bào un thư poptosis và hậm sự di ăn [29], [50]

1.2 Tổng quan về nguồn nguyên li u

1.2.1 Giới thiệu chung về cây c è (trà)

1.2 1 1 ặc tí h thực v t của câ chè

Tên kho học c ây hè là Camellia sinensis thuộc giới thự vật (plantea),

n ành hạt kín (Angiospermae), l hai á mầm(Dicotyledonae), bộ Chè (Thea es),

họ Chè (Theaceae )

Cây hè ó n uồn gốc ở khu vực Đôn N m Á, nhưn n ày n y nó được trồng phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới, tron á khu vực nhiệt đới và ận nhiệt đới Chè là loài ây x nh lưu niên mọ thành bụi hoặ á ây ỗ o tới 10 m, thôn thườn đượ xén tỉ để thấp hơn 2 mét khi được trồn để lấy lá Nó ó rễ ái dài, ho màu trắn ánh vàn , đườn kính t 2,5-4cm, với 7–8 ánh ho Hạt c nó

ó thể ép để lấy dầu Cả lá và hồi c ây trà đều được sử dụn để sản xuất á sản phẩm trà x nh, trà đ n, trà đ …Lá dài t 4–15 m Lá tươi hứa khoảng 4% caffein

Lá non và á lá ó x nh lục nhạt được thu hoạ h để sản xuất trà khi mặt bên dưới

c hún òn á sợi lôn tơ n ắn màu trắn , á lá ià ó màu lục sẫm… Ở cá

độ tuổi khá nh u lá trà tạo r á sản phẩm trà khá nh u về chất lượng, do thành phần hó họ tron á lá này là khá nh u Thôn thường chỉ ó lá hồi và 2 đến 3 lá mới mọc gần thời i n đó được thu hoạ h để chế biến Việc thu hoạch th

ôn b ng tay diễn r đều đặn sau khoản 1 đến 2 tuần [14]

(+) Catechin (C) (+) Gallocatechin (GC)

8-12 3-6 3-6 1-3 1-2 3-4

A id hữu ơ ( itri , m li , ox li ) 0,5-0,6 Đườn ( lu os , fru tos , su ros ) 4-5

Chất xơ ( llulos , h mi llulos , lignin)

giải khát, ây ảm iá hưn phấn Trà òn iúp trợ lọ tiêu hó , làm ho ăn uống ngon miệng C t hin òn ó khả năn tăn ường sứ đề khán a thanh vi huyết quản, giảm hiện tượng sung huyết tron ơ thể, tăn ường sự tí h lũy và đồn hó vit min C iúp phòn n á bệnh hoại huyết Tron trà ó hứa rất nhiều loại vit min nhóm , C… iúp kí h thí h tiêu hó , và tăn ường sứ đề khán ho ơ thể Nướ trà òn ó tá dụng chốn oxy hó rất hiệu quả iúp bảo vệ ơ thể kh i

á ốc tự do, chốn lão hó ơ thể Giúp iảm ân n toàn và làm đ p da Sử dụng trà òn iảm stress, giảm lượng cholesterol hiệu quả giảm n uy ơ mắ á bệnh về tim mạ h và đột quỵ Trà òn dùn điều trị á bệnh lị, xuất huyết dạ dày, ruột, não Epigallocatechin gallate (EGCG) tron trà n ăn ản sự ảnh hưởng c a quinon oxidase, một nzym iúp tế bào tron sự phân hi , nó hỉ ó tá dụn riên với tế bào un thư mà thôi [40] N ăn ản sự phát triển c a tế bào un thư mà khôn ảnh hưởn đến á tế bào khá [10], [40]

1.2.2 Nguồn n uy n l ệu trà át n uy n Quan

1.2 2 1 ặc điểm của t à Bát Tiê , Tu ê ua g

Xã Mỹ n huyện Yên Sơn tỉnh Tuyên Qu n ó nhiều đồi núi thấp, với nhiều bãi đất b n phẳn , ó dòn sôn hảy qu Đất đ i màu mỡ h yếu là đất

F r rit ó màu đ vàn rất thí h hợp ho ây hè phát triển Khí hậu nhiệt đới ẩm

ió mù , một năm ó 4 mù rõ rệt, lượn mư trun bình tron năm khoản 1200 – 2000mm, nhiệt độ trun bình tron năm là 19 – 25o C, nhiệt độ o nhất tron năm

là 36o C…Đó là nhữn điều kiện tự nhiên rất thuận lợi ho ây hè át Tiên vốn rất kén đất phát triển Chè át Tiên ó n uồn gốc t vùn núi o Đài ắ , Đài Lo n, đượ n ười dân Tuyên Qu n m n về trồng thử nghiệm và l i tạo với giốn trà địa phươn để ây trà dễ thí h n hi với khí hậu nướ t nhưn vẫn giữ ái tên át Tiên Chè đượ thu hoạ h vào thán 3 và thán 10 [51]

Đặ điểm hình thái lá: màu x nh nhạt ó răn ư rõ, hiều dài trun bình, hóp lá hơi nhọn, bề mặt phẳng nhẵn, thế lá hơi xiên Đặ điểm hình thái búp: búp

hè khi òn non ó màu phớt tím, lôn tơ nhiều

Trà át Tiên ó ọn trà nh và hắ hơn á loại trà khá , ánh trà ũn ó mao trắng ở phần tôm nhưn mật độ khôn nhiều như Trà Sh n Tuyết Nướ trà

x nh, hươn thơm dịu mát, cả ba vị đắn hát n ọt đều ó đ và hoà quyện đều với nhau một á h v a phải nên dễ uốn hơn á iốn trà truyền thống c a nước ta Sau khi uốn ó dư vị trong miệng rất thơm và hơi ó hút n ọt dịu và òn ó đặc tính là ph được nhiều nước [51]

1.2 2 2 Ph g há sả uất và chế biế t à a h

Trà ( hè ) được chế biến t trà tươi, qu á quá trình s u:

úp hè tươi → s o hè, diệt m n → vò hè→ sàn tơi → sấy khô → phân loại → sàn phân loại → Đón ói thành phẩm [14]

1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất kombucha ở Vi t Nam và trên thế giới

1.3 r n t ế giới

Trướ năm 1990 hầu như nhữn n hiên ứu về kombu h òn rất hạn chế, chỉ bướ đầu đi n hiên ứu về khu hệ vi sinh vật, bản chất sự cộng sinh giữa vi khuẩn và nấm m n, hư ó ơ sở khoa học về lợi í h c kombu h Đến năm

1995 trong một cuốn sá h “Kombucha: Healthy Beverage and Natural Remedy

from the Fa East” tá iả Gunther W Frank, đã un ấp thôn tin ơ bản hữu í h,

á h thức sử dụn và những thắc mắ ơ bản về kombucha Cũn tron năm 1995

M ys P s tron n hiê ứu mình tron “y st spectrum of the tea fungus

kombucha”đã đư ra kết luận về hệ vi sinh vật trong kombucha bao gồm Acetobacter

xylinum và á nấm men thuộc á chi Brettanomyces, Zygosaccharomyces và Saccharomyces là 56, 29, 26 (%)[44] Khẳng định đồ uống này ó một lượng nh

rượu ,đường và axit khá nhau như acetic, gluconic và axit lactic và á chất khán sinh [44] Theo những n hiên cứu c a Reiss (1994) đã kết luận về á iá trị chữa bệnh và á hướng ứng dụng trong sản xuất c a kombucha như: hiệu lực trong điều trị á bệnh chuyển hó , hỗ trợ tiêu hó ứng dụng sản xuất enzyme và vitamin nhóm B [46] Những n hiên cứu sau đó hú trọng đến hướng phân tí h á thành phần c a kombucha, á điều kiện ảnh hưởng tới sự lên men kombucha, và đi vào tìm hiểu khu hệ vi sinh vật hay bản chất sự cộng sinh và những ôn dụng ó lợi

c a kombucha một á h huyên sâu hơn [47], [49] Năm 2000 tá giả Chen C và Liu B.Y đã đư ra kết luận: hàm lượng đường sucroza giảm tuyến tính theo thời gian, hàm lượng ethanol tăn lên, nhưn ó dấu hiệu chậm lại, hàm lượng acid acetic tăn lên đán kể và tăn chậm sau n ày thứ 7 c a quá trình lên men làm pH dịch lên men giảm đán kể [26] Cũn kể t năm 2000 trở lại đây rất nhiều n hiên cứu đi sâu vào tìm hiểu về thành phần hó học ũn như á hướng n hiên cứu về

tá dụng, ứng dụng cả về đồ uống kombucha và cả con nấm SCOBY ũn được hú trọng đ m lại ái nhìn toàn diện về kombucha Markov & cs (2001) đã phân tí h khá đầy đ á thành phần c a kombucha bao gồm acid hữu ơ á loại đường dư,

á loại vitamin nhóm B, C, và á sản phẩm chuyển hó c a cả vi khuẩn và nấm

men Còn Markov & cs 2014 chỉ ra trên 85% vi khuẩn lactic thuộc nhóm

lactobaccillus, so sánh được thành phần á hợp chất trong trà kombucha trên á

nguồn n uyên liệu khá nhau [43] Tá giả Dufresne và Farm Worth (2000) trong nghiên cứu c a mình đã cho thấy những tá dụng ó lợi c a kombucha như tăn ường miễn dịch, n ăn ng a ung thư [29] Tá giả Dipti P & cs (2003) đã đư ra kết quả cho sự chống ôxy hó , giảm GSH và tăn ường miễn dịch kombucha[28] Mới nhất hiên nay là n hiên cứu về khả năn hạ đươn huyết trong chuột bị tiểu đường Khi chuột sử dụng kombucha sẽ giảm HbA1c và tăn mức độ tổng hợp insulin huyết tươn [49] Mở ra hi vọng kombucha sẽ hỗ trợ cho quá trình điều trị tiểu đường trên n ười ên cạnh đó ó những n hiên

cứu về đặ tính màn C bởi ch ng G xylinus phân lập t kombucha [25]

Trong tươn lai ó thể thay thế cho cellulose thực vật, được ứng trong y học trị

b ng hay mặt nạ dưỡng da, bao ph vết thươn hay trong bảo quản thực phẩm [49]

Mặ dù òn nhiều tr nh ãi xun qu nh iá trị c kombu h nhưn hiện nay

nó vẫn đươ khuyến áo sử dụn như một sản phẩm chứ năn ó n uồn gốc tự nhiên, iúp hốn oxy hó và ó tiềm năn ho sức kh on n ười Nhữn n hiên cứu về tá dụn ó lợi c kombu h và ơ hế c nó vẫn tiếp tụ tăn lên tron vài năm tới Cá n hiên ứu về kombucha ở trên thế giới rất phon phú, đ dạng

Tuy nhiên, nhữn n hiên ứu về ảnh hưởng c điều kiện môi trườn lên quá trình lên m n hầu như là rất ít, khôn đầy đ

1.3.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam nhữn n hiên ứu về kombu h òn rất hạn chế o òn rất nhiều nhữn tr nh ãi trái hiều về tá dụng c a kombucha Nhữn ăn ứ khoa học

òn hư được phổ biến mặ dù kombu h đã ó mặt ở nướ t khá lâu, việ lên

m n và sử dụng vẫn theo kiểu truyền thống, nh lẻ

Theo Nguyễn Lân ũn : hiện n y, lĩnh vự n hiên ứu về kombucha ở nước

t òn khá mới, hư ó một ôn trình n hiên ứu nào về kombu h ũn như hiệu quả chữa bệnh c a loại trà này đượ ôn bố Tá dụng chữa bệnh và độ độc hại c a loại trà này ần phải đượ n hiên ứu, kiểm tr và iám định chắc chắn Tóm lại, đây là một dạng cộng sinh giữa nấm m n và vi khuẩn ti và vi khuẩn l ti , ó thể tự nhân iống b n nướ hè đườn , ó lợi cho sức kh tươn đươn như sữa chua Nhiều ôn bố nói về tá dụng chữa bệnh hiểm n hèo nhưn hư ó ơ sở khoa họ nào hứng thự như vậy Uống kombucha chỉ ó lợi cho sức kh e, nhất là

ho đườn tiêu hó , khôn ó tá hại ì

Trong nhữn năm ần đây bướ đầu xuất hiện nhữn n hiên ứu về kombucha ở nhiều trườn Đại họ Cá n hiên ứu ũn hỉ hú trọn th o hướng tìm hiểu khu hệ vi sinh vật, tạo sản phẩm giải khát kombu h , một vài đề tài nh lẻ tìm hiếu về thành phần ơ bản c kombu h và tá dụng c a kombucha thực nghiệm trên huột Năm 2012, Lê N uyễn Thị Hồng Ngọ và ộng sự đã ó ôn trình “N hiên ứu hệ vi sinh vật c trà kombu h và hiệu quả tá dụn trên một số chỉ tiêu sinh lý huột”, đã hỉ ra hệ vi sinh vật trong kombucha bao gồm: vi khuẩn acetic, vi khuẩn l ti và nấm men và sản phẩm kombu h ó tá dụn tăn ường sức kh , khôn ây ảnh hưởng xấu tới á hỉ tiêu sinh lý a chuột [30] Đến năm

2013, Tôn Nữ Liên Hươn thuộc khoa Khoa học Tự nhiên, Đại học Cần Thơ đã ó

n hiên ứu về: ảnh hưởng c a thời gian chế biến tới một số tính hất và hoạt tính sinh học c trà iấm kombucha N hiên ứu cho biết: tính hất vật lý, hó học, hàm lượng c á hợp chất hữu ơ ó hoạt tính tron trà iấm kombu h được chế

biến t trà đón ói hiệu lipton và t trà đón ói hiệu trà xanh Một số hoạt tính sinh học c a trà iấm kombu h : tính khán khuẩn, khán oxy hó , độ tính trên tế bào un thư, th o thời i n lưu mẫu, trên t ng loại trà iấm [37] Thán 3/2013 nhóm tá iả N ô Xuân Quyền & cs [15] đã bướ đầu phân tí h thành phần dị h trà, hàm lượn trà/nướ /đườn và lên m n ở nhiệt độ 25-27o

trong 3-6 n ày ho sản phẩm nước giả khát lên m n t trà x nh Tá iả Lâm Thị Hồn Liên (2013) đã phân lập và tuyển chọn được hai ch ng nấm m n M1 và M2 ó khả năn lên m n kombucha t trà x nh Thái N uyên Hàm lượng chất dinh dưỡn thí h hợp bổ sung: (NH4)2SO4 : 2 (g/l); MgSO4.7H2O: 1,5 g/l; KH2PO4: 1,5 g/l; Thời i n lên m n: 7

n ày; Hàm lượng giống bổ sung 10(%); pH: 4 – 4,5; nhiệt độ: 300C [11] Tá iả Lê Thị Huệ (2013) với đề tài “N hiên ứu một số ch ng vi khuẩn lên m n kombu h

t trà Thái N uyên” đã phân lập và n hiên ứu độn thái sinh trưởng c 2 h n vi

khuẩn Acetobacter A2 và A15 ó khả năn lên m n kombu h t trà Thái N uyên Còn tá iả Trần Thị Tâm (2014) ũn đã phân lập và n hiên ứu độn thái sinh trưởng c a ba ch ng nấm men T1, T17 và T29 Đã xá định được á h n T1, T17 và T29

sử dụn đườn lu os với hàm lượn 90 ( /l), (NH4)2SO4 ở mức 0,08 ( ) và bổ sung MgSO4.7H2O với hàm lượn 0,04 ( ) là thí h hợp nhất ho lên m n kombu h t trà Thái N uyên [17] Tá iả Lươn Thị Huyền Tr n (năm 2015) đã phân lập và

tuyển chọn được 02 ch ng vi khuẩn Acetobacter SGX1, HNX5 và 01 h ng nấm

m n TKM1 Xá định được tỉ lệ phối trộn 1SGX1:1HNX5:1TKM1(L9,2-9.5x106: 7.5-7,7x106: 8,3-8,5x106cfu/ml) tạo sản phẩm kombucha t trà Suối Giàn , Yên ái [21]

Tron á n hiên ứu về khu hệ vi sinh vật tron kombu h t trà Tuyên Qu n

thì thán 8 năm 2015 tá iả ùi Thị Th y với n hiên ứu" h h ởng của môi

t ờng di h d ng t i uá t h t o sản phẩm kombucha từ chè ( Camellia sinensis)

PT10" mới phân lập và tuyển chọn được ch ng nấm m n Saccharomyces M1 và

h n vi khuẩn Acetobacter X4, chứ hư n hiên ứu về vi khuẩn lactic [20] o đó,

n hiên ứu về vi khuẩn l ti tạo sản phẩm kombu h ó hươn vị thơm n on hơn,

đặ trưn t trà Tuyên Qu n là một hướng n hiên ứu đầy triển vọn và mới mẻ

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật li u và thiết bị nghiên cứu nghiên cứu

2.1.1 Vi sinh v t

Cá h ng vi khuẩn l ti đượ phân lập t kombu h lên m n t trà Tuyên Quang

Ch n vi khuẩn Acetobacter X4 và chủ g accha om ces M1 tại phòn thí

n hiệm vi sinh trườn đại họ sư phạm Hà Nội 2 do ùi Thị Th y (2015) phân lập

và tuyển họn khi n hiên ứu đề tài “ h h ởng của môi t ờng di h d ng t i

uá t h t o sản phẩm kombucha từ chè ( Camellia sinensis) PT10” [20]

Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)

Máy li tâm Kubot (Đức)

Máy ất nước 2 lần (Hmilton- Anh)

Máy đo qu n phổ (UV – Vis, Nhật )

2 1 2 2 Hóa chất

C o nấm m n (Mỹ) K2HPO4 (Nhật)

C o thịt (Ấn Độ) CaCO3 (Việt N m)

Acid acetic (Trun Quố ) MgSO4.7H2O (Anh) Acid lactic (Trun Quố ) CH3COONa (Trun Quố ) Thạ h A r (Việt Nam) MgSO4.4H2O (Anh)

Glucose (Việt N m) H2SO4 (Trun Quố ) Pepton (Nhật) NaCl (Việt N m) Tween 80 (Trun Quố ) (NH4)3C6H5O7 (Trun Quố )

KH2PO4 (Nhật) HCl (Trun Quố )

- Cá hó hất dùn để ph á loại thuốc nhuộm : Tím kết tinh (Crystal violet), ethanol 95%, ammonoxalat, iod, KI, thuốc nhuộm fushin, lục malachite, xanh metylen, etanol, KOH, dung dịch acid carbolic, dung dịch acid tannic, FeCL3, formalin, NaOH, AgNO3, NH4OH, H2O2

- Thuốc thử Uffelmann: Cho 2% dung dịch phenol tinh chất vào tron nước thêm dun dịch FeCl3 cho tới khi dung dịch phenol chuyển thành màu tím

- Thuốc thử xanh bromophenol (BPB): 2 g BPB, bổ sung dần 5 ml NaOH

0,1M, nghiền trong cối sứ, hò với nước cất ho đ 100 ml

2.1 3 Các loạ mô trườn cơ ản

2 1 3 1 ôi t ờ g hâ , cấ t u ề giống vi khuẩ actic: đặc (g/l)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

P ươn p áp v s n

2 2 1 1 Ph g há hâ vi khuẩ

Lê me kombucha tự hiê

N uyên liệu: Trà khô át Tiên, Tuyên Qu n loại 1, đườn su ros , nướ Tiến hành: Đun sôi 1000ml nước, bổ sun 20 trà để trong thời gian khoảng

10 phút S u đó lọc lấy dị h trà đổ vào bình th y tinh sạ h, thêm 100 đường saccharose khuấy đều, để nguội Sử dụn id ti điều chỉnh pH: 4,5 S u 7 n ày

ở 300C [36] t thu được kombucha, gồm dị h trà đườn lên m n và một SCOBY nổi lên trên bề mặt ùn vải sạch lọc lấy dịch, tiến hành phân lập vi khuẩn l ti

Ngu n v t li u: Mẫu dịch t kombu h đượ lên m n tự nhiên t trà át

Tiên, Tuyên Qu n

Tiế hà h hâ p: Môi trườn phân lập đượ khử trùn và đượ phân bố

vào á hộp lồn vô trùn P tri th o phươn pháp P st ur ị h kumbucha đượ

ph loãn t 10-1 đến 10-10 b n nướ ất ùn pip t đã vô trùn nh 1 iọt huyền phù với độ ph loãn t 10-3

– 10-7 lên bề mặt thạ h rồi dùn bàn tr n vô trùn dàn đều, b o ói ẩn thận, đư vào tron t ấm 30oC tron 3 n ày, lấy r qu n sát khuẩn

lạ ( hình thái, kí h thướ , màu sắ , độ trơn bón , viền mép khuẩn lạ ) [1], [6]

Dự vào sự khá nh u c hình thái khuẩn lạc tiến hành tá h một số khuẩn

lạ đặ trưn r kh i môi trườn phân lập, ấy huyền vào á ống thạ h n hiên đã được chuẩn bị sẵn Nuôi vi khuẩn đã được cấy chuyền sang ống thạ h n hiên tron

t ấm ở nhiệt độ 300C, s u 3 n ày, qu n sát, làm tiêu bản nhuộm tế bào b n phươn pháp nhuộm Gr m, rồi bảo quản ống giống ở nhiệt độ 40C Để tiện ho việ tuyển họn, hún tôi tạm gọi mỗi khuẩn lạ đượ tá h ở trên là một ch ng vi khuẩn

2 2 1 2 Ph g há ghiê cứu đặc điểm h h thái và cách s ế tế bào t ê tiêu bả huộm k

Mục đích: iúp t phân biệt vi khuẩn thành 2 nhóm lớn: vi khuẩn Gram

dươn (Gram-positive) bắt màu tím và vi khuẩn Gr m âm (Gram-negative) bắt màu

hồn N oài r nó òn iúp t qu n sát rõ và phân biệt về hình dạng, cấu tạo, á h phân bố c á loại vi khuẩn khá nh u

C sở khoa học: Bản chất c a hiện tượng bắt màu khá nh u này là do hất

n uyên sinh a tế bào vi khuẩn Gr m dươn được cấu tạo t một loại prot in đặc biệt, chứa muối Nu l tm i ó khả năn tạo với tím G nti n và Lu ol một loại phức chất bền, khó bị rử trôi, khi qu n sát tiêu bản trên kính hiển vi tế bào vi khuẩn Gr m dươn bắt màu tím nti n Vi khuẩn Gr m âm khôn ó khả năn iữ màu này nên dễ bị rử trôi bởi cồn Chỉ khi nh Fucshin vi khuẩn Gr m âm mới bắt màu hồng c a Fucshin [7]

Tiế hà h: Làm và ố định vết bôi: dùn qu ấy vô trùn lấy một ít vi

khuẩn t khuẩn lạ tron á ốn thạ h n hiên (s u khi ấy 24 giờ) hoà vào 1 iọt nước cất ở giữa lam kính, dàn đều m n , ố định vết bôi b n á h hơ nh trên

n ọn lử đèn ồn 2-3 lần, để khô tron khôn khí [6], [7]

Nhuộm b ng dung dị h Tím nti n trong 1- 2 phút, rử nước

Nhuộm lại b ng dung dịch Lugol trong 1- 2 phút, rửa nước

Nh ồn 95o tẩy màu, iữ khoản 30 iây ( ho đến khi v a thấy mất màu),

ết uả: Nếu sau khi nhuộm kép tế bào bắt màu hồn thì đó là vi khuẩn

Gr m âm, bắt màu tím là vi khuẩn Gr m dươn

2.2.1.3 Nhuộm bào t

* Mục đích: Dựa trên ấu trú đặc biệt c màn bào tử : dày, hắ , khó bắt

màu, hứa nhiều lipit Trước hết xử lý để tế bào hất bào tử dễ bắt màu b ng nhiệt

và xit Nhuộm màu ả tế bào hất c bào tử và tế bào b ng thuốc nhuộm ó hoạt

tính mạnh Tẩy màu tế bào hất c a tế bào và nhuộm nó b ng thuốc nhuộm khá bổ

sung Nhờ đó tế bào hất c bào tử và tế bào hất tế bào bắt màu phân biệt [1]

* Tiế hà h: dù g h g há chaeffe -Fulton: Nuôi ấy vi khuẩn ở 30o

C, 24 iờ Làm vết bôi và ố định tế bào như đối với nhuộm Gr m Nhuộm b n dun dị h lụ m l hit tron 10 phút, rử nướ Nhuộm lại b n dun dị h

S fr nin tron 30 iây, rử nướ , thấm khô Soi kính b n vật kính dầu 100

* ết uả: Bào t có màu ục, tế bào có màu đỏ

Chú ý: phân biệt bào tử với á hạt dị nhiễm ũn bắt màu lục

2.2.1.4 Nhuộm khá g acid

* ục đích: Vi khuẩn khán id ó v bên n oài hốn đượ ồn và id

nên nó vẫn iữ màu nhuộm s u khi bị xử lý với dun dị h id, vì vậy nó đượ phân loại là vi khuẩn khán id Còn nhữn vi khuẩn khôn m n đặ tính khán id màu nhuộm b n đầu sẽ bị rử trôi và bắt màu thuố nhuộm bổ sung [8]

* Tiế hà h: dùn phươn pháp nhuộm Ziehl-Neelsen

Làm vết bôi, ố định Nh dị h A lên vết bôi, đun nh dưới phiến kính ho

b y hơi nhưn khôn sôi Thườn xuyên bổ sun thêm dị h A để tránh khô vết bôi Giữ tron 5 phút Đợi nguội, đổ dị h A đi ùn dịch B rử ho đến khi thấy v a mất màu đ Rử nước kỹ Nhuộm b ng dịch C trong 2-3 phút, rử nước, thấm khô Soi kính b n vật kính dầu 100x

* ết uả:Vi khuẩn khán id bắt màu đ

Vi khuẩn khôn khán id bắt màu x nh

2.2.1.5 Ph g há ác định số ng tế bào vi si h v t

Xá định số lượng tế bào vi khuẩn b n phươn pháp đếm khuẩn lạc

Lấy 1ml dịch huyền phù ó hứa vi khuẩn 24 giờ nuôi ấy, ph loãn theo phươn pháp ph loãn iới hạn rồi dùn mi ropip t hút 0,1 ml ph loãn rồi trang đều trên môi trường thạ h đĩ [6], [7] Nuôi ở 300C sau 5 n ày đếm số khuẩn lạc (CFU) tron môi trườn đĩ p tri, t đó xá định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1

ml dị h nuôi ấy b n đầu th o ôn thức

N - Tổng số CFU trong 1 ml dịch uôi cấ ba đầu

A- Số CFU t u g b h đếm đ c t ê mỗi đĩa et i

10 -n - ộ ha oã g dịch uôi cấy

2.2.1.6 Ph g há bảo quả và ho t hóa chủng giống

a Ph g há bảo uả chủ g giố g

* Bảo quả t ê th ch ghiê g

Cá khuẩn lạ , s u khi đã phân lập và xá định là vi khuẩn l ti , đượ ấy huyền s n môi trườn iữ iốn tron á ốn thạ h n hiên S u 24 iờ bảo quản tron t lạnh ở 4o

C ho á n hiên ứu tiếp th o Cấy huyền và iữ iốn trên thạ h n hiên định kì mỗi thán một lần [7]

* Bảo uả t o g du g dịch 30% g ce i

Cá h n sinh id l ti o đượ nuôi tron môi trườn MRS dị h thể ở 30°C S u 24 iờ nuôi ấy, đ m li tâm dị h nuôi ấy tron 20 phút ở 3000 vòn /phút, tá h lấy phần sinh khối Hò đều sinh khối tron lml dun dị h 30 lix rin vô trùn và iữ ở -20°C tron á ốn eppendorf vô trùn [7]

ảo quản th o phươn pháp này ho phép iữ iốn tốt tron vòn 1 năm

b Ph g há ho t hóa chủ g giố g

Giống t ống nghiệm được bảo quản trong t lạnh, trướ khi đ m sử dụng phải hoạt hó iốn , nhân iốn đảm bảo đ số lượng tế bào vi sinh vật ho quá trình lên m n Phươn pháp hoạt hó iống sử dụn môi trường MRS dị h thể, đ m hấp thanh trùn ở 121oC tron 20 phút S u đó đ m xử lý tron đèn tím 15 phút, ấy chuyền giống t ống thạ h n hiên vào và nuôi lắ 135 vòn /phút tron 24 iờ

P ươn p áp n n cứu đặc đ ểm s n lý, s n óa c a các c ng Lactobacillus

* Kết quả: Nếu thấy s i bọt là dươn tính, khôn s i bọt là âm tính

2.2.2.2 Th nghi m khả ă g di động

* Mục đích: Xá định khả năn di động c a vi sinh vật

* Tiế hà h: ùn qu ấy ó đầu nhọn ấy vi khuẩn th o kiểu hí h sâu

vào môi trườn thạ h bán l n Đặt ốn n hiệm thẳn đứn , ở nhiệt độ thí h hợp

và qu n sát s u 1-3 n ày, ó khi lâu hơn

* ết uả:

Vi khuẩn mọc lan rộng quanh vết cấy tứ là hún ó khả năn di động

Vi khuẩn chỉ mọc theo vết cấy tứ là hún khôn ó khả năn di động

2.2.2.3 Th ghi m khả ă g si h acid actic b g thuốc th Uffe ma

* Ngu ê t c: Acid l ti khi tá dụn với ph nol ó tron thuố thử

Uffelmann sẽ làm thuố thử ó màu tím huyển s n màu vàn Sự đổi màu àn rõ thì lượn id l ti sinh r àn nhiều và n ượ lại

* Tiế hà h: ùn qu ấy tá h á h n vi khuẩn l ti thuần khiết ấy

vào á bình t m iá hứ 20 ml môi trườn MRS dị h thể, nuôi ấy tĩnh ở nhiệt