Nghiên cứu khả năng hấp thu và giải phóng thuốc Neomycin của màng Bacterial cellulose để phục vụ việc sử dụng qua da

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 --- ĐOÀN THỊ YẾN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THU VÀ GIẢI PHÓNG THUỐC NEOMYCIN CỦA MÀNG BACTERIAL CELLULOSE ĐỂ PHỤC VỤ VIỆC SỬ DỤNG QUA DA Chuyên ngành:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

-

ĐOÀN THỊ YẾN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG HẤP THU

VÀ GIẢI PHÓNG THUỐC NEOMYCIN CỦA MÀNG

BACTERIAL CELLULOSE ĐỂ PHỤC VỤ

VIỆC SỬ DỤNG QUA DA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Xuân Thành

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy: TS Nguyễn Xuân Thành, người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn vừa qua

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy, cô giáo của Trung tâm Hỗ trợ NCKH&CGCN trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm thực nghiệm hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn bộ các thầy, cô giáo và cán bộ nhân viên Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 - những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt 2 năm học tại đây

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn tới cha mẹ, chồng, người thân, bạn bè, những người luôn bên tôi, chia sẻ, động viên, giúp đỡ tôi những

lúc gặp nhiều khó khăn nhất

Hà Nội, tháng 11 năm 2016

Học viên

Đoàn Thị Yến

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật Đây là kết quả nghiên cứu của riêng tôi Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lí thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả đã công bố Trong tài liệu này tôi có sử dụng một số tài liệu của một

số tác giả, tôi xin phép các tác giả này để bổ sung cho luận văn của mình

Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm

Hà Nội, tháng 11 năm 2016

Học viên

Đoàn Thị Yến

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

4 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 3

5 Phương pháp nghiên cứu 4

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4

7 Đóng góp mới của luận văn 4

NỘI DUNG 5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Tổng quan về BC 5

1.1.1 Vi khuẩn sản sinh ra BC 5

1.1.2 Đặc điểm cấu trúc của BC 6

1.1.3 Tính chất lí hóa của BC 7

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC 9

1.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng BC làm vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc qua da 11

1.2.1 Trên thế giới 11

1.2.2 Tại Việt Nam 14

1.3 Tổng quan về neomycin 15

1.3.1 Công thức 15

1.3.2 Tính chất lí hóa 16

1.3.3 Dược lí và dược động học 16

1.3.4 Chỉ định và chống chỉ định 17

1.4 Tình hình nghiên cứu về neomycin 17

1.4.1 Trên thế giới 17

1.4.2 Tại Việt Nam 18

1.5 Sinh lý hấp thu các chất qua da 18

1.5.1.Cấu trúc và chức năng sinh lý của da 18

1.5.2 Cơ chế hấp thu các chất qua da 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Vật liệu nghiên cứu 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Chuẩn bị màng BC 25

2.2.1.1 Lên men thu màng BC thô 25

2.2.1.2 Tạo màng BC tinh chế 26

2.2.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết màng BC tinh chế 27

2.2.1.4 Xác định các tiêu chuẩn của màng BC tinh chế sử dụng chế tạo màng hấp thu thuốc 28

2.2.2 Chế tạo màng BC hấp thu neomycin 30

2.2.2.1 Chuẩn bị bộ đệm 30

2.2.2.2 Xây dựng đường chuẩn neomycin 30

2.2.2.3 Chuẩn bị môi trường cho BC hấp thu thuốc 31

2.2.2.4 Xác định lượng neomycin hấp thu vào màng BC 31

2.2.3 Xác định tỉ lệ giải phóng thuốc neomycin thông qua hệ thống được thiết kế 32

2.2.4 Phương pháp xử lí thống kê 35

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Thu màng BC và tinh chế màng 36

3.1.1 Thu màng BC từ các môi trường lên men 36

3.1.2 Tinh chế màng BC 37

3.2 Kiểm tra một số tiêu chuẩn của màng BC tinh chế 38

3.2.1 Kết quả thử độ tinh khiết của màng BC tinh chế 38

3.2.2 Kết quả đo pH của màng BC tinh chế 39

3.2.3 Kết quả khảo sát khả năng cản vi khuẩn của màng BC 40

3.3 Phương trình đường chuẩn neomycin trong dung dịch đệm PBS 43

3.4 Tỉ lệ neomycin hấp thu vào màng BC 44

3.5 Tỉ lệ neomycin giải phóng từ các hệ thống màng BC mang thuốc đã thiết kế 48

3.6 Đánh giá động học giải phóng neomycin từ màng BC mang thuốc 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

1 Kết luận 57

2 Kiến nghị 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

NCKH&CGCN Nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần của các môi trường lên men thu màng BC 26

Bảng 2.2 Môi trường đệm PBS 30

Bảng 2.3 Môi trường thử nghiệm cho màng BC hấp thu thuốc 31

Bảng 3.1 Kết quả thu màng BC tươi 37

Bảng 3.2 Kết quả đo pH ở các lô màng thí nghiệm 40

Bảng 3.3 Tốc độ mất nước của màng BC ……… 38

Bảng 3.4 Tỉ lệ hấp thu thuốc neomycin vào màng BC dày 0,5cm 44

Bảng 3.5 Tỉ lệ hấp thu thuốc neomycin vào màng BC dày 0,3cm 44

Bảng 3.6 Tỉ lệ giải phóng thuốc neomycin (%) từ màng BC lên men từ môi trường cao nấm men (màng CNM) 49

Bảng 3.7 Tỉ lệ giải phóng thuốc neomycin (%) từ màng BC lên men từ môi trường nước dừa (màng dừa) 50

Bảng 3.8 Tỉ lệ giải phóng thuốc neomycin (%) từ màng BC lên men từ môi trường nước gạo (màng gạo) 51

Bảng 3.9 Tỉ lệ giải phóng thuốc từ dung dịch neomycin đối chứng nồng độ 2mg/ml 51

Bảng 3.10 Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ màng CNM (trong môi trường pH = 7,4) theo mô hình động học 54

Bảng 3.11 Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ màng dừa (trong môi trường pH = 7,4) theo mô hình động học 50

Bảng 3.12 Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ màng gạo (trong môi trường pH = 7,4) theo mô hình động học 50

DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ

Hình 1.1 Cellulose vi khuẩn 6

Hình 1.2 Cellulose thực vật 6

Hình 1.3 Cấu trúc A – BC (a) và S – BC (b) 7

Hình 1.4 Thí nghiệm cấy BC dưới da động vật thí nghiệm 8

Hình 1.5 Ứng dụng BC bọc vết thương cho vùng da bị bỏng 12

Hình 1.6 Màng BC – lidocaine hydrochloride ứng dụng trên da 13

Hình 1.7 Sử dụng màng BC hấp thu thuốc điều trị nhiễm khuẩn 13

Hình 1.8 Công thức cấu tạo của neomycin 15

Hình 1.9 Cấu trúc siêu hiển vi của da ……….……… 20

Hình 1.10 Cấu tạo của biểu bì da người ……… 20

Hình 2.1 Quy trình tinh chế màng BC 27

Hình 2.2 Mô hình thí nghiệm khuếch tán thuốc qua da Franz 33

Hình 3.1 Nuôi cấy màng BC tại phòng thí nghiệm Trung tâm Hỗ trợ NCKH&CGCN trường ĐHSP Hà Nội 2 36

Hình 3.2 Môi trường dinh dưỡng lên men thu màng 36

Hình 3.3 Màng BC tạo ra từ vi khuẩn A xylinum 38

Hình 3.4 Kết quả tìm sự hiện diện của glucose trong dịch chiết màng BC 39

Hình 3.5 Kết quả tìm sự hiện diện của protein trong dịch chiết màng BC 39

Hình 3.6 Khả năng cản khuẩn của màng BC trong thử nghiệm 1 40

Hình 3.7 Khả năng cản khuẩn của màng BC trong thử nghiệm 2 41

Hình 3.8 Khả năng cản khuẩn của vải gạc vô trùng 42

Hình 3.9 Phương trình đường chuẩn của neomycin trong môi trường đệm 44

Hình 3.10 Tỉ lệ hấp thu thuốc neomycin của các loại màng có độ dày 0,5cm 46

Hình 3.11 Tỉ lệ hấp thu thuốc neomycin của các loại màng có độ dày 0,3 cm 47

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Trong những năm gần đây, khoa học đã có sự chú ý đặc biệt về việc sử dụng các vật liệu sinh học trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe vì khả năng tái tạo, tương thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng Một trong những vật liệu sinh học có những đặc tính trên được chú ý là cellulose Vật liệu này vượt trội so với các polyme tự nhiên và tổng hợp khác [32] Trong

đó, Bacterial Cellulose (BC) là đối tượng của nhiều nghiên cứu ứng dụng của các nhà khoa học trong nước cũng như nước ngoài Đây là một loại vật liệu mới, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, y học, mỹ phẩm, Theo một số kết quả nghiên cứu cho thấy màng BC được tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp Về mặt tính chất, BC có độ tinh sạch lớn hơn rất nhiều so với các loại cellulose khác

BC có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn Ngoài ra, BC còn có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước BC còn là một mạng polyme sinh học có khả năng giữ nước rất lớn, giải phóng nước kéo dài Đồng thời BC còn có tính xốp, độ ẩm cao, có lực bền cơ học cao Vì vậy, BC có tiềm năng cao cho các ứng dụng trong các hệ thống giải phóng thuốc qua da, qua đường miệng và mô – kĩ thuật, và một số ứng dụng y sinh học khác [6], [9], [14], [19], [20], [22], [24],…

Xét về tiềm năng làm hệ thống giải phóng thuốc qua da, ngoài những đặc điểm lợi thế trên, màng BC còn là hàng rào cản oxi và các vi sinh vật khác, ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và sự tác động của tia cực tím Đồng thời BC cũng là vật liệu không gây kích ứng da (do có bản chất là saccharide) [24]

Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC làm vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc qua da với một số loại thuốc có hiệu quả

rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường Việc sử dụng màng BC cho việc thẩm thấu qua da của nhiều thuốc, cụ thể là lidocaine [53], [54], ibuprophen [54], caffeine [49], diclofenac [50], amoxicillin [45], benzalconium chloride [19] và sulfadiazine bạc [37] cho kết quả tích cực Các kết quả nghiên cứu này đã chứng minh rằng các tính chất cơ học của BC có

độ bền và trương nở tương tự như da người; hỗ trợ sự phát triển, lây lan, và di chuyển của tế bào da người [14], [18], [19]

Lợi thế lớn nhất từ việc sử dụng màng BC hấp thu thuốc là khả năng chữa lành vết thương, đặc tính bảo vệ, không dị ứng với da và khả năng hấp thu dịch tiết với việc giải phóng các loại thuốc trị liệu có liên quan Hầu hết các chế phẩm đắp qua da được sản xuất bởi các vật liệu khác nhau Do đó, một hệ thống hấp thu và giải phóng thuốc kéo dài có ít lớp, hoặc thậm chí một lớp duy nhất có thể đơn giản hóa quy trình sản xuất và giảm chi phí [11], [53]

Trong điều trị nhiễm khuẩn trên da không có triệu chứng toàn thân, được

y học khuyến cáo tránh sử dụng các chế phẩm kháng sinh thường được dùng rộng rãi toàn thân như penicilin, sulfonamid, streptomycin, gentamicin, do

có khả năng gây mẫn cảm và tạo thuận lợi cho phát triển vi khuẩn kháng thuốc Để giảm thiểu phát triển vi khuẩn kháng thuốc, chỉ dùng các chế phẩm chứa các loại kháng sinh bôi trên da

Neomycin là một tác nhân kháng khuẩn hữu ích để điều trị vết thương do

tụ cầu và liên cầu gây ra Tuy nhiên, neomycin cũng như một số chế phẩm kháng sinh khác được khuyến cáo tránh sử dụng toàn thân do có khả năng gây mẫn cảm và tạo thuận lợi cho phát triển vi khuẩn kháng thuốc Để giảm thiểu phát triển vi khuẩn kháng thuốc, chỉ dùng các chế phẩm chứa các loại kháng sinh trên dạng bôi trên da Tuy nhiên, những phát hiện gần đây cho thấy rằng neomycin ở dạng chế phẩm dung dịch có bán trên thị trường thì khả năng hấp

thu vào da quá nhanh (trong vòng 4 giờ đầu có thể hấp thụ 85,01% ở vùng da tổn thương) dễ gây độc trên tai, suy giảm thần kinh và thận, có thể gây mẫn cảm khi điều trị lâu dài [17] Điều này không thích hợp với việc điều trị một

số bệnh viêm da mủ trên da cần điều trị kéo dài Bên cạnh đó, chế phẩm dạng dung dịch thường nhanh khô và không có khả năng cản vi khuẩn bên ngoài xâm nhập Vì vậy, giải pháp cần đặt ra cho vấn đề này là dùng một loại vật liệu có khả năng giải phóng kéo dài thuốc, có khả năng giữ ẩm vết thương và cản khuẩn,

Từ các nghiên cứu về màng BC và một số hạn chế của neomycin trong điều trị kháng khuẩn trên da, xét thấy đây là hướng nghiên cứu mới và triển

vọng Đó là lí do chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng hấp thu

và giải phóng thuốc neomycin của màng bacterial cellulose để phục vụ việc sử dụng qua da”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu tiềm năng của màng BC trong việc hấp thu và giải phóng thuốc định hướng sử dụng qua da

- Thiết kế, chế tạo màng BC hấp thu thuốc neomycin nhiều nhất Đánh giá khả năng giải phóng neomycin kéo dài từ hệ thống màng BC mang thuốc

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nghiên cứu tạo màng và xử lí màng BC có kích thước và tính chất phù hợp với việc hấp thu thuốc phục vụ việc sử dụng trên da

- Đánh giá khả năng hấp thu và giải phóng thuốc neomycin của màng

BC in vitro

4 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu

- Vật liệu nghiên cứu: Màng BC làm từ sự lên men của vi khuẩn A xylinum; thuốc neomycin tinh khiết 98% và một số chất khác

- Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu khả năng hấp thu và giải phóng thuốc

neomycin của màng BC định hướng sử dụng qua da

5 Phương pháp nghiên cứu

- Lên men thu màng BC từ một số môi trường

- Tinh chế màng BC thô

- Đánh giá độ tinh khiết của màng BC

- Chế tạo màng BC hấp thu thuốc, xác định lượng thuốc hấp thu vào màng

- Xác định lượng thuốc giải phóng từ màng BC mang thuốc

Ý nghĩa thực tiễn:

Việc sử dụng màng BC làm vật liệu để hấp thu và giải phóng thuốc kéo dài này có thể làm tăng sinh khả dụng của thuốc và khắc phục được nhược

điểm của thuốc ở dạng thông thường

7 Đóng góp mới của luận văn

Đây là đề tài đầu tiên tại Việt Nam sử dụng màng BC làm hệ thống hấp thu và giải phóng thuốc neomycin trong điều trị nhiễm khuẩn trên da

Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể định hướng tạo hệ thống giải phóng thuốc kéo dài từ đó có thể áp dụng trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn trên da

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về BC

Cellulose là đại phân tử tồn tại phổ biến nhất trên trái đất, là thành phần chính của sinh khối thực vật cũng như đại diện cho các polymer ngoại bào của

vi sinh vật Cellulose vi khuẩn (becterial cellulose – BC) là sản phẩm trao đổi chất sơ cấp và chủ yếu tạo màng bảo vệ [55]

1.1.1 Vi khuẩn sản sinh ra BC

BC là một polysaccharide được tổng hợp bởi các loài vi khuẩn khác nhau, chẳng hạn như Aerobacter, Acetobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Alacaligenes, Azotobacter, Pseudomonas, Rhizobium và Sarcina [39] Cho đến

nay, A xylinum được đánh giá là loài vi khuẩn có khả năng sinh màng BC hiệu quả nhất trong tự nhiên A xylinum là loài vi khuẩn Gram âm sống hiếu

khí bắt buộc, không sinh bào tử và là một trong những loài tiến hóa nhất của

nhóm vi khuẩn tía Mỗi tế bào A xylinum có thể chuyển hóa tới 108 phân tử

glucose và phân tử cellulose trong 1 giờ nên khả năng tổng hợp cellulose là rất lớn [3], [6], [8], [10], [27]

A xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hoặc

không và không sinh bào tử (hình 1.1) Chúng là vi khuẩn Gram âm nhưng trọng lượng của chúng có thể bị biến đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi

trường nuôi cấy A xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc vì thế

chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa môi trường lỏng và môi trường khí

và có khả năng tạo màng cellulose trên môi trường nuôi cấy [11] Trên môi

trường rắn sau khoảng 3 – 7 ngày nuôi cấy, khuẩn lạc A xylinum có dạng nhỏ,

nhày, có màu kem, hơi trong nhưng sau 1 tuần thì khuẩn lạc to, đục, màu cà phê sữa, khô dần [11] Trên môi trường lỏng sau 24 giờ nuôi cấy thì xuất hiện một lớp màng đục dày, sau 36 – 48 giờ hình thành một lớp màng trong và ngày càng dày

1.1.2 Đặc điểm cấu trúc của BC

Màng BC cấu tạo bởi những chuỗi polimer β – 1,4 – glucopyranose không phân nhánh Những nghiên cứu đã cho thấy cấu trúc hóa học cơ bản của BC giống cellulose của thực vật, tuy nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [14], [18]

Theo Brown (1999) [21], BC gồm nhiều sợi siêu nhỏ cellulose, đường kính 1,5nm, kết hợp với nhau Các sợi này kết hợp với nhau thành bó, nhiều

bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài khoảng 100nm, rộng khoảng 3 – 8nm Hình 1.2 cho thấy rõ cấu trúc này

Hình 1.1 Cellulose vi khuẩn (× 20 000 lần) [18]

Hình 1.2 Cellulose thực vật

(×200 lần) [18]

Cấu trúc của BC phụ thuộc chặt chẽ vào điều kiện nuôi cấy Khi nuôi cấy theo phương pháp tĩnh, vi khuẩn tổng hợp những miếng cellulose trên bề mặt nuôi cấy tĩnh, tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và không khí giàu oxy Màng BC thu được dẻo dai, dày, có màu trắng trong hơi ngả màu vàng BC được tạo ra từ môi trường nuôi cấy tĩnh gọi là Static – Bacterial cellulose (S – BC) còn BC tạo ra trong môi trường nuôi cấy động là Agitade – Bacterial cellulose (A – BC) Cấu trúc siêu hiển vi của BC được mô tả trong hình 1.3

Hình 1.3 Cấu trúc A – BC (a) và S – BC (b) [36]

BC được tạo ra từ phương pháp nuôi cấy tĩnh (S – B) có các bó xellulose chuỗi xếp song song quanh trục Các sợi cellulose liên tục được tạo ra từ những lỗ được xếp dọc trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết lại thành các vi sợi và bị đẩy xuống sâu hơn trong môi trường dinh dưỡng Các dải cellulose

từ môi trường tĩnh tạo nên các mặt phẳng song song, sợi S – BC kéo dài và chồng lên các sợi khác theo chiều đan chéo nhau không có tổ chức, có vai trò

chống đỡ cho quần thể tế bào A xylinum

Khi nuôi cấy động, một lượng nhỏ cellulose được hình thành dưới dạng

huyền phù phân tán trong đó chuỗi β – 1,4 glucan xếp một cách ngẫu nhiên

BC được tạo ra bằng phương pháp động (A – BC) dưới dạng các hạt nhỏ, các sợi rối rắm, cong và không trật tự do sự dao động của môi trường nuôi cấy, hoặc các hạt bông hình sao phân tán trong môi trường, tuy nhiên bề mặt cắt ngang của sợi A – BC nhỏ hơn sợi S – BC Có các nghiên cứu cho rằng, sự khác nhau giữa hai loại này ở mức độ kết tinh của nó và kích cỡ kết tinh của

A – BC nhỏ hơn S – BC

1.1.3 Tính chất lí hóa của BC

Khả năng tương thích sinh học cao

Cấu trúc sợi nano trong BC mang một số đặc điểm tương đồng với các thành phần ngoại bào, đặc biệt với collagen Các sợi collagen và BC có kích thước tương tự nhau khoảng 100nm [20] Một số nhà nghiên cứu đã chỉ ra BC

(a) (b)

như một vật liệu collagen [31] Trong y sinh ứng dụng, BC đang được tìm hiểu về vai trò sử dụng như collagen Tuy nhiên, BC có thể có lợi thế so với collagen ở đặc điểm không gây dị ứng với hệ miễn dịch Vì collagen có bản chất protein nên dễ bị nhận biết với hệ thống miễn dịch và dễ bị kích hoạt phản ứng miễn dịch, trong khi đó BC có lợi thế riêng biệt như một polysaccharide là ít miễn dịch kích thích

Khả năng tương thích sinh học của BC đã được nghiên cứu và chứng minh thành công trong các nghiên cứu trước đây [39] Khả năng tương thích sinh học của BC được nghiên cứu cho đến nay vẫn cho kết quả tương tự

Helenius và cộng sự (cs) (2006) [28] trong một nghiên cứu in vivo cấy

cellulose vi khuẩn dưới da ở chuột Kết quả cho thấy sau 12 tuần, phát hiện bằng kính hiển vi cho thấy không có viên nang hoặc các tế bào xơ cho thấy cơ thể không phản ứng với BC (Hình 1.4) Hơn nữa, quanh vết cấy không có hiện tượng bị đỏ, sưng, hoặc tiết dịch

a Một tuần sau khi cấy, BC cho thấy không có dấu hiệu phản ứng tại vị trí cấy

b Độ phóng đại cấu trúc xốp của BC cho thấy xâm nhập của nguyên bào sợi thành các mạng lưới BC sau 12 tuần cấy Đầu mũi tên là dấu hiệu của collagen được tổng hợp bởi các nguyên bào sợi

Hình 1.4 Thí nghiệm cấy BC dưới da động vật thí nghiệm [28]

Độ bền cơ học lớn: BC có độ bền dai cao, chịu lực kéo cao, trọng lượng nhẹ, độ bền đáng kể [10]

Độ tinh khiết cao: BC là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp

không có chứa lignin hay hemicellulose Do đó BC có thể bị vi khuẩn phân

hủy hoàn toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh [49], [55]

Khả năng hút nước cao ở trạng thái ẩm: BC có cấu trúc dạng xốp nên có

khả năng giữ nước đáng kể Màng BC có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút khoảng 200 lần trọng lượng của nó Bên cạnh đó BC còn có khả năng giải phóng nước kéo dài Đây cũng là đặc tính của BC mà các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng BC trong lĩnh vực giải phóng thuốc [10], [14], [19], [55]

Tính chất của BC có thể thay đổi ở mỗi quá trình tổng hợp trong những môi trường khác nhau [38] Các nghiên cứu của các nhà khoa học hiện nay là một nỗ lực để tìm kiếm các ứng dụng sáng tạo BC làm vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc điều trị nhiễm khuẩn trên da

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC

Nguồn cacbon: Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả

các phân tử enzim, axit nucleic, và các sản phẩm trao đổi chất Chính vì vậy, các nguồn hữu cơ có chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống vi sinh vật Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất BC được thể hiện ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC Nguồn cacbon

monosaccharide

Năng suất tổng hợp BC

Nguồn cacbon disaccharide

Năng suất tổng hợp BC

16

7

33

7 – 11

Nguồn nitơ: ý nghĩa chủ yếu của nguồn nitơ là cung cấp nguyên liệu

cho cơ thể sinh vật để hình thành nhóm amin (-NH2 và -NH-) trong các phân

tử aminoaxit, nucleotit, các bazơ dị vòng [46] Nguồn nitơ dễ hấp thu nhất với

vi sinh vật là NH3 và NH4+ Vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ Nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4, NH4NO3, nguồn nitơ hữu cơ là pepton, cao nấm men [46]

Nguồn dinh dưỡng khoáng: Photpho bao giờ cũng chiếm tỉ lệ cao nhất

trong số các nguyên tố khoáng của tế bào vi sinh vật Photpho có mặt trong hầu hết các thành phần của tế bào Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng photpho, người ta sử dụng các nguồn dinh dưỡng photpho vô cơ như K2HPO4,

KH2PO4, KNO3, Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng ảnh hưởng đến quá trình tạo màng BC như Mg, Fe, S, Na, Ca, Mn, Cl, Một trong số nguyên liệu chủ yếu ngày nay được sử dụng để tạo màng BC là nước dừa già, nước vo gạo, dịch hoa quả, rỉ đường, nên khi nuôi cấy không cần phải bổ sung nguyên tố vi lượng nữa [46]

Các chất kích thích sinh trưởng: các vitamin như pyridoxin, axit

nicotinic, biotin được xác định là cần thiết cho sự tăng trưởng tế bào và tổng hợp cellulose, trong khi pantothenate và riboflavin cho kết quả ngược lại [46] Nước dừa già là nguồn nguyên liệu chủ yếu được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn thu màng BC Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà các thành phần hóa học trong nước dừa có khác nhau Lượng đường khử tổng và protein trong nước dừa tăng lên khi dừa càng chín Đường ở đây có thể là glucose, fructose, sucrose hay sirbitol Ngoài ra, nước dừa còn nhiều khoáng chất, vitamin, axit amin, phù hợp cho quá trình hình thành màng BC [10] Nước gạo cũng là một trong những thành phần thích hợp để tạo màng BC vì trong

nước gạo chứa nhiều cacbonhydrat, các vitamin nhóm B, các nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, và axit amin

Ngoài ra các điều kiện nuôi cấy như độ pH, nhiệt độ, độ thông khí, thời gian nuôi cấy, cũng ảnh hưởng đến quá trình hình thành màng BC

Vi khuẩn A xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp Do

đó môi trường nuôi cấy thu màng BC cần được bổ sung thêm axit acetic nhằm axit hóa môi trường, đồng thời nó có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật có hại [6], [46]

Nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy vi sinh vật tạo màng BC là từ khoảng

250C đến 300C Ở nhiệt độ thấp quá, quá trình lên men xảy ra chậm Nếu nhiệt

độ quá cao sẽ ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của

tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm [3], [6], [8], [10]

Vi khuẩn A xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc nên điều kiện tiên

quyết, quyết định đến năng suất tạo màng BC là độ thông khí

Tùy vào thời gian nuôi cấy để người ta thu được màng với độ dày mong muốn Thường 24 giờ sau khi nuôi cấy sẽ xuất hiện lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên Sau 36 – 48 giờ sẽ hình thành lớp màng mỏng và ngày càng dày lên

1.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng BC làm vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc qua da

1.2.1 Trên thế giới

BC là vật liệu hấp dẫn cho các nhà khoa học nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có lĩnh vực dùng BC làm vật liệu hấp thu và giải

phóng thuốc qua da

Một số nghiên cứu trên thế giới về khả năng hấp thu và giải phóng thuốc của màng BC định hướng sử dụng qua da với một số loại thuốc đã cho thấy

có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được một số nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường

Một trong những ứng dụng y sinh học nổi tiếng nhất của BC là như một màng cản khuẩn cho những vết thương hở nghiêm trọng Các nghiên cứu của một số tác giả như Fontana và cs (1990) [26]; Czaja và cs (2006) [24], Czaja

và cs (2007) [25] đã chỉ ra BC có khả năng băng kín vết thương, duy trì dịch tiết, làm giảm đau vết thương, tăng tốc tái tạo tế bào, làm giảm tỉ lệ nhiễm trùng vết thương, giảm sẹo và dễ dàng tháo gỡ, kiểm tra Bên cạnh đó, với vết thương mất da, nhiễm trùng trên da, BC đáp ứng được nhu cầu giữ ẩm cho da, tránh da bị khô (hình 1.7)

Hình 1.5 Ứng dụng BC bọc vết thương cho vùng da bị bỏng [25]

Để tăng khả năng giữ ẩm cho da của BC, một số tác giả nghiên cứu về lidocaine [53], [54], ibuprophen [54], caffeine [49], diclofenac [50], amoxicillin [45], benzalconium chloride [19] và sulfadiazine bạc [37] cho thấy việc bổ sung glycerol vào màng BC giúp màng linh động hơn và tạo điều kiện giữ ẩm cho

bề mặt da Tất cả các loại thuốc trên đã được thử nghiệm in vitro cho thẩm

thấu qua da và so sánh với cách thức thông thường Kết quả cho thấy lidocaine hydrochloride (là chất tan trong nước tương tự như neomycin) giải phóng từ BC qua màng da nhân tạo chậm hơn ibuprofen (một chất ưu lipit) Kết quả này cho thấy màng BC có cấu trúc mạng không gian ba chiều phức tạp đã làm cho sự khuếch tán của thuốc được kéo dài và làm giảm tỉ lệ giải

phóng thuốc khi so sánh với các cách thức thông thường, đây là một lợi thế cho việc điều trị dài hạn của thuốc mà không gây tình trạng quá mẫn [54] Bên cạnh đó, Luan J và cs (2012) [37] đã nghiên cứu màng BC cho băng vết thương nạp sulfadiazine bạc, một loại thuốc phổ biến được sử dụng trong điều trị vết thương nhiễm khuẩn do bỏng Kết quả cho thấy sau khi sử dụng màng

BC ngâm tẩm bạc sulfadiazine đắp lên vết thương, hoạt động kháng khuẩn

đối với P aeruginosa, E coli và S aureus đạt hiệu quả tốt hơn dạng kem bôi

hay dung dịch thông thường

Hình 1.6 Màng BC- lidocaine hydrochloride ứng dụng trên da [42]

Hình 1.7 Sử dụng màng BC nạp thuốc điều trị nhiễm khuẩn [33]

Nghiên cứu của Bhavana V và cs (2016) [19] cho thấy màng khô BC thu được sau khi ngâm trong benzalkonium chloride (một tác nhân kháng khuẩn) có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đã được tìm thấy là 0,116 kg/cm2, và tác dụng của thuốc kéo dài ít nhất 24 giờ chống

lại hoạt động của S aureus và B subtilis Pinto R.J.B và cs (2009) [44] đã

tiến hành tẩm sợi BC với các hạt nano bạc đã sản xuất thành công lên đến

99,99% hoạt tính kháng khuẩn chống lại E coli và S aureus Đồng thời trong

các thí nghiệm trên vết thương hở bị nhiễm khuẩn, BC cũng có vai trò như màng cản khuẩn, giảm sự xâm nhập của vi khuẩn mới, giúp vết thương nhanh hồi phục [19] Các S – enantiomer của propranolol, một loại thuốc chống cao huyết áp, có được giải phóng từ một lớp composite của BC với methacrylate,

và đã thử nghiệm in vivo cho kết quả tốt [15], [22] Một miếng dán có thể

giải phóng thuốc enantiomeric đã được chứng minh bằng cách sử dụng một

bể chứa gel và polyme in dấu phân tử (MIP) màng Nghiên cứu về gel miếng dán gồm của chitosan và poloxamer chứng minh rằng sau 8 giờ, Cmax của S – propranolol đã đạt được (8,0 ± 1,0 microgam/ml) từ bể chứa 1,5mg propranolol racemic [39] Almeida I.F và cs (2014) [14] cũng đã nghiên cứu tiềm năng hấp thu và giải phóng thuốc của màng BC qua da thông qua việc tải tetracycline trong chùm electron mẫu chiếu xạ và không được chiếu xạ

BC không chiếu xạ cho phép giải phóng thuốc nhanh hơn so với ảnh hưởng của BC chiếu xạ Kết quả nghiên cứu này cho thấy màng BC không chỉ có khả năng hấp thu mà còn đề xuất một mô hình cho giải phóng thuốc qua màng

Các nghiên cứu thành công của các tác giả nêu trên cho thấy màng BC

có tiềm năng lớn trong việc làm vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc qua da hiệu quả

1.2.2 Tại Việt Nam

Tác giả Huỳnh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh và cs (2006) [6], [11]

đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế và thu màng BC từ A xylinum đạt hiệu quả cao Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo

trong ứng dụng màng BC điều trị bỏng da với 2 loại màng BC gồm cho thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất kháng khuẩn Kết quả cho thấy tác dụng của màng có thêm hoạt chất tái sinh mô tốt hơn hẳn dạng màng thông thường

Tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cs (2012) [8], [9] đã nghiên cứu và chế tạo thành công chế phẩm màng BC trị bỏng có tẩm dung dịch berberin clorid 0,1% có tác dụng kháng khuẩn và tái tạo mô tốt, không gây đau, dị ứng hoặc kích ứng da, không gây rối loạn toàn thân

Từ những kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học trên đã chứng minh

BC có khả năng tuyệt vời trong việc hấp thu và giải phóng một số loại thuốc qua da Đây cũng là một hướng đi khả quan trong việc nghiên cứu phát triển ứng dụng màng BC trong việc hấp thu và giải phóng thuốc neomycin mục đích giải phóng kéo dài thuốc sử dụng trên da

1.3 Tổng quan về neomycin

Neomycin là loại kháng sinh nhóm aminoglycosid được phát hiện vào năm 1949 từ phòng thí nghiệm của Waksman Neomycin được sản xuất từ môi trường nuôi cấy nấm Streptomyces fradiae [49]

1.3.1 Công thức

Tên thông thường: Neomycin Tên IUPAC: (2R,3S,4R,5R,6R) – 5 – amino – 2 – (aminomethyl) – 6 – [(1R,2R,3S,4R,6S) – 4,6 – diamino – 2 – [(2S,3R,4S,5R) – 4 –

[(2R,3R,4R,5S,6S) – 3 – amino – 6 – (aminomethyl) – 4,5 – dihydroxyoxan –2 – yl] oxy – 3 – hydroxy – 5 – (hydroxymethyl) oxolan – 2 – yl]oxy – 3 –

hydroxycyclohexyl] oxyoxane – 3,4 – diol [17]

Công thức phân tử: C23H46N6O13 Khối lượng phân tử: 614,65g/mol

Hình 1.8 Công thức cấu tạo của neomycin [17]

1.3.2 Tính chất lí hóa

Ở dạng tinh khiết, neomycin có màu trắng hoặc trắng ngà, dễ tan trong

nước, rất khó tan trong ethanol 96%, không tan trong aceton [1], [39] Quang

phổ hấp thu của neomycin ở bước sóng 277nm Định tính neomycin trong các chế phẩm (thuốc tiêm, thuốc mỡ, viên nén, dung dịch nhỏ mắt, ) sử dụng phương pháp quang phổ hấp thu hồng ngoại, sắc kí mỏng [17]

1.3.3 Dược lí và dược động học

Neomycin có tác dụng với phần lớn các vi khuẩn Gram âm và Gram dương gây nên các nhiễm khuẩn ngoài da Những vi khuẩn nhạy cảm với

neomycin như: S aureus, E coli, H influenzae,

Cơ chế hoạt động của neomycin là ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn: bằng cách gắn vào protein tiếp nhận trên đơn vị 30S của ribosome làm đọc sai thông tin của ARN, làm hình thành các protein không có hoạt tính, ngoài

ra còn làm tách các protein ở trạng thái polyme thành monome Kết quả là vi khuẩn dễ bị chết do thiếu protein chức năng

Cơ chế này gồm 4 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Thuốc gắn vào protein là thụ thể chuyên biệt ở trên tiểu

đơn vị 30S của ribosome vi khuẩn

Giai đoạn 2: Thuốc phong bế hoạt tính của phức hợp đầu tiên của quá

trình thành lập chuỗi peptit (mARN + formylmethiomine + tARN)

Giai đoạn 3: Thông tin mARN bị đọc sai ở vùng nhận diện của

ribosome, kết quả là một axit amin không phù hợp được đưa vào chuỗi peptide, tạo một protein không có chức năng

Giai đoạn 4: Sự gắn của thuốc làm vỡ các polysome thành các

monosome không có khả năng tổng hợp protein, các tác động này xảy ra ít nhiều có tính đồng thời và kết quả là tế bào vi khuẩn bị chết [16]

1.3.4 Chỉ định và chống chỉ định

Neomycin được dùng tại chỗ để điều trị các nhiễm khuẩn ngoài da, tai và mắt do tụ cầu và các vi khuẩn khác nhạy cảm [1] Neomycin hầu như không hấp thụ qua đường tiêu hóa (sinh khả dụng đạt 3 – 10% do bị gan phá hủy) Neomycin không được dùng đường tiêm hoặc toàn thân vì độc tính của thuốc Neomycin cũng được khuyến cáo tránh dùng tại chỗ lâu với liều lượng cao vì

có thể gây mẫn cảm trên da và dễ mẫn cảm chéo với các kháng sinh aminoglycosid khác [17]

Tuy nhiên neomycin ở dạng chế phẩm dung dịch có bán trên thị trường thì khả năng hấp thụ vào da quá nhanh (trong vòng 4 giờ đầu có thể hấp thụ 85,01%) dễ gây độc trên tai, suy giảm thần kinh và thận, có thể gây mẫn cảm khi điều trị lâu dài Điều này không thích hợp với việc điều trị một số bệnh viêm da mủ trên da [1], [17] Bên cạnh đó, chế phẩm dạng dung dịch thường nhanh khô và không có khả năng cản vi khuẩn bên ngoài xâm nhập vào vết thương Vì vậy, giải pháp cần đặt ra cho vấn đề này là dùng một loại vật liệu

có khả năng giải phóng kéo dài thuốc, có khả năng giữ ẩm vết thương và cản khuẩn Chúng tôi chọn màng BC hấp thu neomycin để thực hiện khắc phục các vấn đề trên

1.4 Tình hình nghiên cứu về neomycin

Tiếp đó, năm 2015 Jong S C và cs [30] đã tiến hành nghiên cứu neomycin sulfate nạp hydrogel với khả năng cản khuẩn và giải phóng thuốc trong việc điều trị vết thương mô ở chuột nhắt mắc bệnh tiểu đường Kết quả cho thấy khả năng chữa lành vết thương của neomycin sulfate bọc hydrogel cải thiện hơn so với hiệu quả sản phẩm thương mại Tuy nhiên chi phí sản xuất để đưa sản phẩm này ra thị trường khá cao

Ngoài ra nhóm nghiên cứu của Blanchard C (2015) [20] cũng chỉ ra rằng neomycin sulfate cải thiện hoạt động kháng khuẩn của neomycin đơn thuần, do neomycin sulfate ở dạng muối ít gây dị ứng với cơ thể hơn Alguacil J và cs (2015) [13] cũng đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của các dạng thế hệ của neomycin Amita H và cs (2015) [13] nghiên cứu và tìm ra công thức chế tạo gel chứa neomycin hướng điều trị viêm giác mạc mắt mục đích tăng thời gian cư trú và cũng duy trì cơ chế giải phóng của thuốc tại mắt Điều đó giúp tăng cường sinh khả dạng tại chỗ cũng như hiệu quả giải phóng kéo dài tại chỗ của neomycin trong mắt

1.4.2 Tại Việt Nam

Neomycin có trong danh mục thuốc thiết yếu Việt Nam ban hành lần thứ

4 năm 1999 [1] Neomycin được bào chế dạng kem, dung dịch pha chế với một số hoạt chất khác Tuy nhiên hướng nghiên cứu sử dụng màng BC để vận

tải và phân phối thuốc neomycin thì chưa có công trình nào nghiên cứu

1.5 Sinh lý hấp thu các chất qua da

1.5.1 Cấu trúc và chức năng sinh lý của da

Da là hàng rào ngăn cách giữa môi trường bên trong cơ thể và môi trường ngoài Da có diện tích khoảng 2m2, cân nặng bằng 1/6 trọng lượng cơ thể (tính trung bình ở người trưởng thành) Da hoạt động như một rào cản đầu tiên của cơ thể chống lại vi khuẩn, virut, bảo vệ cơ thể khỏi điều kiện bên

ngoài khắc nghiệt và ngăn ngừa sự mất mát các thành phần cơ thể quan trọng, đặc biệt là nước

Cấu trúc da gồm 3 lớp chính: biểu bì, hạ bì và mô dưới da, mỗi lớp lại bao gồm nhiều lớp thay thế (hình 1.9) Các phần phụ của da như các nang và các tuyến mồ hôi, tuyến bã nhờn cũng đóng những vai trò khác nhau trong chức năng tổng thể của da [21]

Hình 1.9 Cấu trúc siêu hiển vi của da

Biểu bì:

Biểu bì là lớp ngoài cùng của da, có độ dày khoảng 0,1mm, vùng biểu

bì xung quanh mắt mỏng hơn (0,05mm) và dưới bàn chân thì dày hơn (1 –3mm) Da ở các phần khác nhau của cơ thể và da của nam và nữ thì khác nhau

Hình 1.10 Cấu tạo của biểu bì da người

Biểu bì có vai trò bảo vệ cơ thể tránh khỏi các độc tố, vi khuẩn là tránh mất các chất lỏng cần thiết Biểu bì bao gồm 4 – 5 lớp tế bào (hình 1.10) Các

tế bào được sản sinh ở lớp trong cùng (lớp tế bào đáy), di chuyển đến bề mặt

da Từ đó, chúng phát triển và trải qua nhiều sự thay đổi Đây chính là quá trình được biết như là quá trình sừng hóa (hay sự hình thành sừng ở biểu bì), khiến mỗi lớp của tầng biểu bì trở nên khác biệt

Lớp tế bào đáy là lớp trong cùng của biểu bì, nơi các tế bào keratin được sản sinh Lớp tế bào này nằm sát hạ bì Tiếp đến là lớp tế bào gai Các tế bào keratin sản sinh chất sừng (các sợi protein), chúng gắn chặt với nhau trông như những cái gai nhô lên bề mặt Lớp tế bào hạt nằm trên lớp tế bào gai Ở đây các tế bào bắt đầu quá trình sừng hóa: các tế bào sản sinh ra các hạt nhỏ và các hạt này di chuyển lên trên, biến đổi thành chất sừng và các lipit biểu bì Ở bàn tay, chân có thêm lớp tế bào trong suốt, lớp tế bào này khá mỏng nằm dưới lớp sừng Lớp sừng là lớp ngoài cùng của biểu bì gồm các tế bào chết đã được dát mỏng Độ dày của lớp sừng phụ thuộc vào vùng da của

cơ thể Những tế bào chết này bong ra thường xuyên trong quá trình tróc vảy Lớp sừng là nơi cư trú của các tuyến mồ hôi và các tuyến bã nhờn Các tế bào

ở lớp sừng thì được gắn kết với nhau bởi các lipit biểu bì Những lipit này thì

rất quan trọng để tạo nên một làn da khỏe mạnh: chúng tạo nên hàng rào bảo

vệ và giữ được độ ẩm cho da Khi các lipit bị mất đi, da trở nên khô hơn và cảm giác bị căng và sần sùi

Biểu bì được bao phủ bởi chất nhũ tương gồm nước và lipit (chất béo) được biết như các màng hydrolipit Lớp màng này giúp duy trì sự tiết mồ hôi

và bã nhờn, giúp làn da được mềm hơn và hoạt động giống như hàng rào chống lại vi khuẩn và nấm Phần nước của màng này, như là các axit bảo vệ bao gồm: axit lactic, một số các amino axit từ mồ hôi, các axit tự do từ dầu, các amino axit, axit cacboxilic và các nhân tố tạo độ ẩm tự nhiên khác Các axit bảo vệ giúp da khỏe mạnh là các loại axit nhẹ và có độ pH nằm trong khoảng từ 5,4 đến 5,9 Đây là môi trường lý tưởng cho các vi sinh vật có ích cho da có thể phát triển mạnh và các vi sinh vật có hại sẽ bị tiêu diệt, bên cạnh

đó giúp cho sự hình thành các lipit biểu bì tốt hơn, đồng thời lớp sừng dễ dàng tự phục hồi khi nó bị tổn thương

Hạ bì:

Lớp hạ bì nằm bên dưới lớp biểu bì bao gồm 2 lớp Phần cấu trúc chính của lớp hạ bì là sợi collagen, sợi đàn hồi và các mô liên kết Các cấu trúc này thì gắn chặt với một chất như gel (có chứa axit hyaluronic), có khả năng cao trong việc liên kết với phân tử nước giúp duy trì được thể tích của da

Lớp hạ bì đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể khỏi ảnh hưởng của các nhân tố bên ngoài cũng như nuôi dưỡng lớp ngoài cùng Lớp

hạ bì dày, có cấu trúc giúp làm nhẹ đi các tác động từ bên ngoài và khi tổn thương xảy ra, chúng có chứa các mô liên kết giúp làm lành vết thương như nguyên bào sợi và dưỡng bào Lớp này có chứa nhiều mao mạch máu giúp nuôi dưỡng biểu bì và loại bỏ chất thải

Mô dưới da:

Lớp da ở phía trong cùng là nơi tạo ra năng lượng của cơ thể, đồng thời hoạt động như một tấm đệm và cách nhiệt cho cơ thể Chúng bao gồm các tế bào mỡ, các sợi collagen đặc biệt và mạch máu

Số lượng các tế bào chất béo ở mô dưới da thì khác nhau ở các vùng trên cơ thể Hơn nữa, sự tạo thành các tế bào này cũng khác nhau giữa nam

và nữ, cũng như cấu trúc của các bộ phận khác của da

Chức năng của da:

Một làn da khỏe hoạt động như một rào cản giữa môi trường bên ngoài

và bên trong cơ thể, và là hàng rào miễn dịch không đặc hiệu bảo vệ cơ thể đầu tiên Da có vai trò ngăn cản vi khuẩn, vi rút và các chất lạ từ môi trường ngoài cơ thể (trong trường hợp da không bị tổn thương); hấp thụ một số chất, điều tiết mồ hôi, thân nhiệt và ngăn cản tác động của tia bức xạ với cơ thể

Vùng da bị tổn thương dễ bị vi khuẩn, vi rút xâm nhập làm tăng tổn thương da Vì vậy, vấn đề đặt ra với việc điều trị các vết thương nhiễm khuẩn trên da là làm sao tạo được màng chắn vừa mang thuốc giải phóng kéo dài vừa có khả năng ngăn vi khuẩn và các chất lạ xâm nhập từ môi trường

1.5.2 Cơ chế hấp thu các chất qua da

Da có khả năng hấp thu một số chất Tuy nhiên trong phạm vi đề tài luận văn, chúng tôi đề cập ở đây một số chất hấp thu vào da là thuốc

Hấp thu là sự vận chuyển thuốc từ nơi dùng thuốc (uống, tiêm, đắp trên da) vào máu để rồi đi khắp cơ thể, tới nơi tác dụng Như vậy sự hấp thu sẽ phụ thuộc vào:

- Độ hòa tan của thuốc (thuốc dùng dưới dạng dung dịch nước dễ hấp thu hơn dạng dầu, dịch treo hoặc dạng cứng)

- pH tại chỗ hấp thu (vì có ảnh hưởng đến độ ion hóa và độ tan của thuốc)

- Nồng độ của thuốc (nồng độ càng cao càng hấp thu nhanh)

- Tuần hoàn tại vùng hấp thu (càng nhiều mạch, càng hấp thu nhanh)

Trên thực tế có rất ít thuốc hấp thu qua da lành tính Do da lành tính có lớp sừng bảo vệ tránh sự xâm nhập của các vi sinh vật và chất lạ vào cơ thể nếu chưa được sự cho phép Lớp sừng khá dày chứa các lipit (giống như lớp sáp) ngăn cản sự thấm của các chất lỏng trên bề mặt da Vì vậy, các nhà khoa học chế tạo một số loại thuốc dán, thuốc bôi trên da thường cho thêm chất tăng thấm giúp cho việc thẩm thấu một số hoạt chất khác vào da đạt hiệu quả hơn [2]

Tuy nhiên, khi da bị tổn thương trong một số trường hợp như viêm nhiễm, bỏng, làm mất đi lớp biểu bì của da, hoặc trường hợp sâu hơn có thể mất đi cả lớp hạ bì của da thì việc một số thuốc có thể thấm vào da dễ dàng hơn

Một số hoạt chất/ thuốc có thể thấm vào các lớp tế bào của da thuộc phần hạ bì hay phần mô mỡ dưới da theo 2 cơ chế chính:

Cơ chế vận chuyển thụ động: thuốc đi vào tế bào, mô theo cơ chế khuếch tán dựa trên sự chênh lệch nồng độ các chất hai phía màng tế bào Thuốc đi từ nơi có nồng độ cao (bên ngoài tế bào) đến nơi có nồng độ thấp

(bên trong tế bào) cho tới khi đạt một nồng độ nhất định Các thuốc này thường đi qua lớp photpholipit trên màng tế bào Các loại thuốc có thể đi theo con đường trên thường có bản chất là không phân cực, kích thước nhỏ

Cơ chế vận chuyển chủ động: Các hóa chất đi vào tế bào (có thể đi từ nơi có nồng độ thấp đến nơi có nồng độ cao) theo nhu cầu của tế bào Các loại thuốc này thường đi qua kênh protein trên màng tế bào Các kênh protein này

có tính chọn lọc – có nghĩa là màng tế bào chỉ cho một số chất nhất định đi vào trong tế bào Cơ chế này đòi hỏi tiêu tốn năng lượng ATP của tế bào

Một con đường nhanh nhất mà một số thuốc đi qua các lớp tế bào là con đường gian bào (qua khe giữa các tế bào) Thuốc hấp thu vào mạch máu tại vùng da tổn thương chủ yếu qua con đường này Một số thuốc tan trong nước đi qua con đường này thường nhanh hơn các thuốc tan trong lipit [35]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Neomycin (98%) và glycerol (99,5%) được mua từ Trung Quốc

- Dung môi và chất phản ứng khác được mua từ Đức

- Màng BC (99% hàm lượng nước) được sản xuất bằng cách sử dụng vi

khuẩn A xylinum (Phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh – KTNN, Trường

ĐHSP Hà Nội 2) lên men trong môi trường dinh dưỡng

- Máy đo quang phổ UV – 2450 (Shimadzu – Nhật Bản); Cân phân tích (Sartorius – Thụy sỹ); Nồi hấp khử trùng HV-110/HIRAIAMA; Kính hiển vi điện tử quét; Buồng cấy vô trùng (Haraeus); Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức); Máy ép màng; Khuấy từ gia nhiệt (IKA – Đức) kính hiển vi quang học (Carl Zeiss – Đức); Kính lúp soi nổi STEMI 2000 – C; Máy lắc tròn tốc độ chậm (Orbital Shakergallenkump - Anh); Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác

- Vật liệu làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật tạo màng BC: Đường glucose, cao nấm men, nước dừa, nước vo gạo, axit acetic, axit citric, peptone, diamoni photphat, HCl, NaOH,… đạt tiêu chuẩn phân tích

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Chuẩn bị màng BC

2.2.1.1 Lên men thu màng BC thô

Quá trình lên men thu màng BC thô được thực hiện theo các bước sau [6]:

- Bước 1: Chuẩn bị môi trường theo bảng 2.1 [5]

- Bước 2: Hấp khử trùng các môi trường đó ở 1130C trong 15 phút

- Bước 3: Lấy các môi trường ra khử trùng bằng tia cực tím trong 15 phút rồi để nguội môi trường

- Bước 4: Bổ sung 10% dịch giống và 2% axit acetic, lắc đều tay cho giống phân bố đều trong dung dịch

- Bước 5: Dùng gạc vô trùng bịt miệng lọ, ủ tĩnh trong khoảng 6 – 8 ngày ở 260C

- Bước 6: Thu màng BC thô, rửa sạch chúng dưới vòi nước

Bảng 2.1 Thành phần của các môi trường lên men tạo màng BC Môi trường

có độ dày 0,3 – 0,5cm, chúng tôi tiến hành thu màng từ dịch nuôi cấy tĩnh A xylinum sau 6 – 8 ngày.

2.2.1.2 Tạo màng BC tinh chế

Màng BC thô thu được đem ngâm vào nước cất trong 2 ngày Tiếp theo, các màng BC được tinh chế theo quy trình hình 2.1 [6]:

Hình 2.1 Quy trình tinh chế màng BC

2.2.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết màng BC tinh chế

Kiểm tra độ tinh khiết của màng nhằm đảm bảo màng BC sau khi xử lí

đã được loại các tạp chất Các tạp chất được khảo sát là glucose, protein của

vi khuẩn và dư lượng pepton trong môi trường nuôi cấy

Tìm sự hiện diện của glucose trong màng BC sau khi tinh chế

Định tính glucose trong màng BC bằng thuốc thử Fehling Màng BC tinh chế được cắt nhỏ, cho vào 50ml nước cất, lắc kỹ với máy lắc trong 3 giờ Dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện glucose trong dịch chiết màng

Mẫu chứng âm là nước cất và mẫu chứng dương là dung dịch D – glucose

Phản ứng dương tính với sự xuất hiện tủa nâu đỏ trong ống nghiệm [6]

Tìm sự hiện diện của protein trong màng BC tinh chế

Định tính protein còn lại trong màng bằng phản ứng tạo tủa của protein với acid triclor acetic Màng BC tinh chế được cắt nhỏ, cho vào 50ml nước cất, lắc kỹ với máy lắc trong 3 giờ Dùng dung dịch acid triclor acetic 1% để phát hiện sự hiện diện của protein trong dịch chiết màng Mẫu chứng âm là nước cất và mẫu chứng dương là dung dịch pepton 1% (pepton đã sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn) và màng BC thô Phản ứng dương tính khi cho tủa đục So sánh với mẫu chứng âm không chứa protein [6]

Xác định pH của màng BC tinh chế

Sau khi tinh chế pH của màng phải nằm trong khoảng pH trung tính Đo

pH dịch chiết màng bằng máy đo pH Cân và cho màng BC vào 1 bình nón chứa nước khử khoáng theo tỉ lệ màng và nước là 1:100 (khối lượng/thể tích) Đặt bình vào máy lắc ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ Lấy dịch chiết và đo pH dung dịch ở mỗi bình bằng pH kế, chỉnh pH điện cực ở 2 khoảng pH là pH =

- Độ ẩm thích hợp, có khả năng hút nước và dịch mô

Để đạt các tiêu chuẩn này cần khảo sát:

- Độ dày thích hợp của lớp màng BC thô: chúng tôi chọn màng BC có độ dày 0,3cm và 0,5cm để tiến hành thực nghiệm

- Khả năng cản vi khuẩn của màng BC tinh chế

- Khả năng cho thoát hơi nước của màng BC tinh chế

Tất cả các thông số này sẽ được khảo sát đồng thời để xác định thông số

thích hợp nhất, [6], [9]

Khảo sát khả năng cản vi khuẩn của màng BC tinh chế

Khảo sát khả năng cản khuẩn của màng BC và so sánh với vải gạc vô trùng Sử dụng các bản thạch dinh dưỡng là môi trường thuận lợi cho các vi khuẩn và nấm mốc phát triển Chia các hộp petri chứa môi trường thạch dinh

dưỡng tiêu chuẩn (môi trường Soybean – casein) thành 3 lô Chọn màng BC

tinh chế ngẫu nhiên từ các lô thí nghiệm khác nhau Dùng các loại màng thử nghiệm che phủ bề mặt các bản thạch:

Lô 1: Sử dụng gạc vô trùng

Lô 2: Sử dụng màng BC

Lô 3: Lô đối chứng, không phủ màng

Sau đó, các bản thạch đã phủ màng này được dùng thử nghiệm trong 2 điều kiện [6], [9]:

Thử nghiệm 1: Sử dụng 1ml dung dịch huyền phù các vi khuẩn S hemolyticus, E coli trải lên bề mặt của mỗi loại màng ở các lô trên và giữ

trong tủ ấm 370C trong 24 giờ Sau đó màng được lấy ra và quan sát lượng vi khuẩn mọc bên dưới màng

Thử nghiệm 2: Để hở các hộp thạch có phủ màng ngoài không khí trong

24 giờ, nơi có nhiều người qua lại, sau đó một nửa số hộp được đưa vào tủ

ấm 37oC ủ trong 48 giờ Quan sát kết quả bằng cách lật màng và quan sát sự phát triển của vi khuẩn trên bản thạch Một nửa số bản thạch còn lại để ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày để quan sát khả năng phát triển của nấm mốc

Khả năng cho thoát hơi nước của màng BC tinh chế (tính thông thoáng của màng BC)

Điều kiện thử nghiệm: để các màng thử nghiệm lên bề mặt bản thạch bán lỏng trong 12 giờ, sau đó lấy các màng đặt trong hộp petri (không đậy nắp,